REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE POPULAIRE                       Ministère de Lenseignement et de Recherche             ...
Espace réservé du contenu 3                                         Thème :                              L’éléctrophorése ...
Plan de travail   1/ Généralité sur l’éléctrophorése et les protéines2/ Matériels et méthodes 3/ Les applications de l’éle...
Introduction :     Comme il est possible de séparer les types cellulaires vivants    qui constituent un tissu, il est poss...
Historique:ar S.E. Linder et H. Picton qui se sont inspirés des travaux d’Herman, Tiselius introduit l’éléctrophorése pour...
Définition:             •L’électrophorèse en grec => transportme l’une des méthodes d’analyse les plus avantageuses de la ...
But:    - séparer les protéines.- déterminer les fractions protéiques.
Principe:Figure n°1: schéma représente le Principe d’éléctrophorése verticale
Les montages::en acétate de cellulose ou en en papier. Le support se présente sous forme dplongent dans un tampon délectro...
structure des protéinesFigure°2: les différents structure des protéines
Matériels1/ Appareillage:
Les produits chimiques et réactifs: Solvant usuels: acide acétique, méthanol, glycérol, isopropanol, 2-marcaptoéthanol, …e...
Les gels delectrphorese ;Gel de polyacrélamide ou PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis):           Figure n°3 : struc...
Gel d’agarose:ose formé par l’hydrogène non covalente et hydrophobe liens entre les polym
Préparation de l’échantillon1-Extraction des protéines (sériques)
*on prend 1ml de l ’ extrait de protéine par une pipette ,on le met dans un eppendorf    *on le placé dans un VORTEX ( 15 ...
tation (15scd)-incubation a t° ambiante (10min)-centrifugation (10min)-jeter le surnagage par l’acétone froid (vortex 1min...
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Applications En médecine : le Test délectrophorèse des protéines est utilisés pour évaluer, et contrôler une grande variét...
En pharmacie : Permettant la découverte de nouveaux médicaments et la validation des cibles pour la conception de médicame...
En immunologie, notamment pour confirmerle diagnostic de certaines atteintes du système immunitaire.                      ...
2- Exemple d’utilisation d’électrophorèse :La séparation et lidentification de protéines par électrophorèse de liquides bi...
Lexamen visuel des profils électrophorétiques complétér lanalyse densitométrique permet didentifier certaines anomalies : ...
Avantage : - la quantité de produit nécessaire est très petite- des protéines ne différant que par un seul acide aminé peu...
Conclusion :La masse moléculaire et la composition des  sous-unités  d’une protéine, même présent en petites quantités, pe...
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Republique algerienne democratique populaire 1

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Republique algerienne democratique populaire 1

  1. 1. REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE POPULAIRE Ministère de Lenseignement et de Recherche Université Mohamed Khidher BISKRA Faculté des sciences exacte et des sciences de la nature et de la vie Département des sciences de la nature et de la vie 1ère Année Master Biochimie et Biologie Moléculaire Module : notion de gêné génétique groupe : 01 Présenté par: -AOUN DALLAL -BACHIR Besma -Ben abbes kaltoume hanane -BOUGHDIRI HINDhargé de module :BENCHARIF -Boukhalfa Achouak -Lebbal Moufida -OULD AMMAR Soumia
  2. 2. Espace réservé du contenu 3 Thème : L’éléctrophorése et ses application sur les protéines
  3. 3. Plan de travail 1/ Généralité sur l’éléctrophorése et les protéines2/ Matériels et méthodes 3/ Les applications de l’électrophorèse sur les protéines
  4. 4. Introduction : Comme il est possible de séparer les types cellulaires vivants qui constituent un tissu, il est possible de séparer les organites fonctionnels et les macromolécules d’une cellule.Dans notre exposé, on va vous expliquer les méthodes qui permettent de séparer et analyser biochimiquement les protéines, alors comment réaliser la séparation des protéines ?
  5. 5. Historique:ar S.E. Linder et H. Picton qui se sont inspirés des travaux d’Herman, Tiselius introduit l’éléctrophorése pour séparer les protéines eelm Kaurin Tiselius, met au point la première électrophorèse: lé •En 1959, Raymond introduit les gels de polyacrylamide
  6. 6. Définition: •L’électrophorèse en grec => transportme l’une des méthodes d’analyse les plus avantageuses de la chimèse verticale le déplacement de l’ion dans un champ électrique pour séparer
  7. 7. But: - séparer les protéines.- déterminer les fractions protéiques.
  8. 8. Principe:Figure n°1: schéma représente le Principe d’éléctrophorése verticale
  9. 9. Les montages::en acétate de cellulose ou en en papier. Le support se présente sous forme dplongent dans un tampon délectrode, créant une mince couche deau à sa sut souvent préparé peu avant usage en le coulant entre 2 plaques de verre. Du
  10. 10. structure des protéinesFigure°2: les différents structure des protéines
  11. 11. Matériels1/ Appareillage:
  12. 12. Les produits chimiques et réactifs: Solvant usuels: acide acétique, méthanol, glycérol, isopropanol, 2-marcaptoéthanol, …etc. Sels et tampons : glycine,trishydroxyméthyl aminaminométhane (Tris).Réactifs spécifiques : acrylamide, N, N-méthylène-bis acrylamide, N, N, N, N-tétraméthyléthylène-diamine (TEMED), dodécyl sulfate de sodium (SDS),Blue de Coomassie R250…etc
  13. 13. Les gels delectrphorese ;Gel de polyacrélamide ou PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis): Figure n°3 : structure de gel de polyacrélamide
  14. 14. Gel d’agarose:ose formé par l’hydrogène non covalente et hydrophobe liens entre les polym
  15. 15. Préparation de l’échantillon1-Extraction des protéines (sériques)
  16. 16. *on prend 1ml de l ’ extrait de protéine par une pipette ,on le met dans un eppendorf *on le placé dans un VORTEX ( 15 min).er dans une centrifugeuse ( 10 min) a 4°C.ait transférer le surnageant dans un nouveau tube dans lequel on ajout 0.2ml de chlorofor *on agit c tube( 15 scd) –incuber à température ambiante( 3 min). *une 2 eme centrifugation (15 min). *on obtient un contenu en 3 phases (aqueuse-interphase et organique). *le surnageant sera jeté. *on ajout 0.3ml de l’éthanol. *agitation (15 scd)-incubation(3min). *3 eme centrifugation (05min). *Le surnageant sera réparti dans 2 tubes d’une façon équivalente. *ajouter 0.75ml de l’isopropanol dans chaque tube
  17. 17. tation (15scd)-incubation a t° ambiante (10min)-centrifugation (10min)-jeter le surnagage par l’acétone froid (vortex 1min-centrifugation 10min –jeter l’acétone)étition de lavage.vrir les bouchons des tubes pour l’évaporation des résidus de l’acetone.
  18. 18. La préparation des gels :st une matrice de séparation utilisée en électrophorèse de biomopeuvent varier en composition.ux types de gels : Un gel de séparation et un gel de concentration
  19. 19. 1/Un gel de séparation :arer 10 ml (par exp) d’une solution mère à 10 % de polyacrylamide (en sépar Composant Volume ddH20 4,0 ml mélange dacrylamide 30 % 3,3 ml 1,5M Tris pH 8.8 2,5 ml 10 % SDS 0,1 ml 10 % ammonium persulfate 0,1 ml TEMED 0,004 ml
  20. 20. 2/Un gel de concentration :préparer 10 ml dune solution mère à 5 % de polyacrylamide (sta Composant Volume ddH20 4,0 ml mélange à 30 % dacrylamide 3,3 ml 1,0M Tris pH 6.8 2,5 ml 10 % SDS 0,1 ml 10 % ammonium persulfate 0,1 ml TEMED 0,004 ml met le polyacrylamide dans la cuve. met le peigne dans le gel délicatement pour réaliser les puits.rès polymérisation ; l’insertion de la plaque dans l’appareil de l’électrophorè
  21. 21. Elle nécessite une cuve à électrophorèse et une alimentation continue la moins coûteuse Le protocole de gel d’agarose =de polyacrélam Gel la plus aisée d’agarose à une meilleure sensibilité peu utilisée dans une meilleure résolution le cas des protéinesdes fractions protéiques. 20/04/12
  22. 22. á PH discontinu tampon du réservoir supérieur contient un acide faible: Glycine pH près du PH de réservoir inférieurgel de concentration PH du tampon du gel de concentration < 2 gel de séparation PH de gel de séparation Tampon du réservoir du bas = tampon du gel de séparation 20/04/12
  23. 23. 20/04/12
  24. 24. 20/04/12
  25. 25. s séparation par électrophorèse en gel, les bandes obtenues peuvenisées par différentes techniques.Les protéines sont souvent révélées 2 / C o m p t/ ig em u n o t r a n s f 3 a m/ C o lo r a t io n r a d i o a c «t  fw e s t e r n b l o t i B l et u ad e Ni r tf lu o r e s c a m in e c o o mg e n ti e d’ ar as s 20/04/12
  26. 26. immunotransfert « western blot » a- Saturation de la membrane (blocage) Fixationdes protéines de façon non spécifique sur la membrane b- Incubation avec Anticorps primaires c- Incubation avec Anticorps secondaires 20/04/12
  27. 27. d- Détection Autoradiographie 20/04/12
  28. 28. Applications En médecine : le Test délectrophorèse des protéines est utilisés pour évaluer, et contrôler une grande variété de maladies et de conditions grâce à lexamen des quantités et des types  de protéines dans un sang, durine, Identification des phénotypes moléculaires et des génotypes par électrophorèse de lhémoglobine.En génétique:La variation génétique peut aussi être identifiée en examinant la variation au niveau des  et  la vérification des études dexpression des protéines in vivo et in vitro  20/04/12
  29. 29. En pharmacie : Permettant la découverte de nouveaux médicaments et la validation des cibles pour la conception de médicaments.En biochimie : pour Fournit des informations sur la structure la taille moléculaire, le paramètre physico-chimique,  la quantité et la pureté dun échantillon de protéine.En biotechnologie : Lindustrie des biotechnologies a connu une croissance rapide ces dernières années en grande partie attribuable au développement et au succès de base de protéines thérapeutiques pour un large éventail de troubles. Similaires aux produits pharmaceutiques traditionnels, la caractérisation dune protéine thérapeutique pour ses propriétés physico-chimiques, la surveillance du processus et lémission de lots est essentielle.  20/04/12
  30. 30. En immunologie, notamment pour confirmerle diagnostic de certaines atteintes du système immunitaire. 20/04/12
  31. 31. 2- Exemple d’utilisation d’électrophorèse :La séparation et lidentification de protéines par électrophorèse de liquides biologiques Des pathologies rares affectant la production des anticorps comme lagammaglobulinémie,absence de sécrétion des gammaglobulines et lhypogamma globulinémie, sécrétion insuffisante des gammaglobulines, peuvent être détectées par électrophorèse des protéines sériques.Dans le but didentifier la nature de leur pathologie, on a soumis à lélectrophorèse le sérum de deux patients atteints de dysfonctionnements du système immunitaire.  Outre le sérum des deux patients (pistes 2 et 3), on a également soumis à lélectrophorèse deux échantillons de sérum normal (pistes 1 et 5) ainsi quun échantillon dimmunoglobulines pour servir de référence (piste 4). Les résultats obtenus et le profil densitométrique des pistes sont présentés ci-dessous à droite. 20/04/12
  32. 32. Lexamen visuel des profils électrophorétiques complétér lanalyse densitométrique permet didentifier certaines anomalies :  Lindividu 2 présente un sérum particulièrement concentrén immunoglobulines mais les autres protéines sériques présentent une concentration inférieure à la normale.ersement, le sérum de lindividu 3 est dépourvu de gamma globulines tandis que les autres bandes sont normales.  Dans le premier cas, il sagit dune hypergammaglobulinémie tandis que dans le second, il sagit dune agammaglobulinémie. Cinq pistes délectrophorèse Profils densitométriques correspondants 20/04/12
  33. 33. Avantage : - la quantité de produit nécessaire est très petite- des protéines ne différant que par un seul acide aminé peuvent être séparées- des méthodes enzymatiques et immunologiques permettent la révélation des substances- il est possible de quantifier les différentes fractions séparées - cette méthode est extrêmement simple, La simplicité et les performances de cette méthode lui valent dêtre utilisée quotidiennement.  Inconvénient :-Les bandes de protéines sont larges (à cause du dépôt).-On ne peut pas déterminer la masse moléculaire des protéines.-Réfléchir sur la polarité de lélectrophorèse (en fonction du pH).  20/04/12
  34. 34. Conclusion :La masse moléculaire et la composition des  sous-unités  d’une protéine, même présent en petites quantités, peuvent être déterminées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide  SDS. Lors d’électrophorèse bidimensionnelle sur gel, les protéines sont séparées sous forme de taches par la focalisation isoélectrique dans une dimension suivie de l’électrophorèse sur gel  de polyacrylamide SDS dans la deuxième dimension. Cette séparation électro phorétique peut aussi être appliquée à des protéines  normalement insolubles dans l’eau. 20/04/12

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