CARACTÉRISATION
DE MÉTHODES
D’ANALYSES SUR
LES PRODUITS
LAITIERS
LABORATOIRE
DÉPARTEMENTAL
VÉTÉRINAIRE DU
FINISTÈRE
• Création en 1961
• Accrédité COFRAC
• Une centaine d’employés
• Locau...
LES DIFFÉRENTS SECTEURS
D’ACTIVITÉ
• Santé Animale
• Microbiologie des aliments et de l’eau
• Chimie Alimentaire, eau, env...
LE SERVICE
CHROMATOGRAPHIE
Analyses pour la qualité des :
• Eaux naturelles et de
traitement
• Animaux d’élevage
• Produit...
ANALYSES SUR LES
PRODUITS LAITIERS
• Teneur en eau
• Matière sèche non grasse
• pH
• Acidité oléique
• Indice de peroxyde
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LES TRACEURS DANS LES
PRODUITS LAITIERS
• La CE vend des produits à prix réduits
• Marque de reconnaissance : ajout de tra...
LES MÉTHODES
D’ANALYSES
ÉTUDIÉES
DOSAGE DU CAROTÈNE
•

Détermination de la pureté du carotène

• Gamme d’étalon
• Mesure des échantillons par un spectropho...
PRINCIPE DU DOSAGE
• Mesure de l’absorbance
• Loi de Beer Lambert :
A=ElC
Avec E le coefficient d’extinction
DOSAGE DE LA VANILLINE

Principe :
• Extraction
• Détermination
RP-HPLC

Conditions chromato :
 Pompe : débit 1.0mL/min
...
PRINCIPE DE LA HPLC

• Séparation des
constituants
d’un mélange
LES DIFFÉRENTS TYPES DE
HPLC
1 - chromatographie d'adsorption
2 - chromatographie de partage
(en phase directe(2A) ou
inve...
HPLC en phase inversée
• En phase inverse l’éluant est plus polaire
que la phase stationnaire
• Donc silice greffée dans l...
PHASE MOBILE
Deux possibilité :
Gradient d’élution : variation de la
concentration de l’éluant
(utilisé pour les mélanges...
VALIDATION ET
CARACTÉRISATION
DE MÉTHODES
• Méthode validation basée sur
la Norme XPT 90-210 AFNOR de décembre 1999
« Protocole d’évaluation d’une méthode alternati...
PLAN DE TYPE A
Il permet de caractériser :
La linéarité
La limite de quantification
La limite de détection
LA LINÉARITÉ
• Connaître jusqu’où la mesure est linéaire
• Caractérisation de l’étalonnage
• Réalisation d’un plan à 5 niv...
LIMITES DE
QUANTIFICATION ET DE
DÉTECTION
• Il existe 3 méthodes :
 Issue de l’étude de la linéarité
 Issue de l’étude d...
PLAN DE TYPE B
• Il permet de contrôler les effets de la matrice sur la
mesure
• Réalisation d’ajouts dosés
• Vérification...
PLAN DE TYPE C
• Il permet d’estimer la répétabilité et la justesse de
la méthode
• Comparaison
méthode de référence/métho...
LA CARACTÉRISATION
• Valider une méthode de référence
• Les étapes à suivre :
 Linéarité
 Limites de détection et de qua...
APPLICATIONS
LE CAROTÈNE
• La linéarité de
l’appareil:

Etude de la linéarité des traceurs A2 dans le beurre par
spectroscopie
1,000

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•

Limites de détection et de quantification :

1) Essais à 0.1µg/mL
Limite non vérifiée
2) Essais à 0.2µg/mL
Limite de qu...
• Répétabilité :

Etude de la linéarité des traceurs A2 dans le beurre par
spectroscopie

10 mesures avec des
ajouts de 21...
LA VANILLINE
Etude de la linéarité des traceurs A0 dans le beurre par
chromatographie

•Linéarité de l’appareil:

1500000
...
•

Limites de détection et de quantification :

1) Essais à 0.2µg/mL
Limite non vérifiée
2) Essais à 0.25µg/mL
Limite de q...
Etude de la linéarité des traceurs A0 dans le beurre par
chromatographie
2000000

y = 610624x
R2 = 0,9712

1500000
Aire du...
CONCLUSION
Les méthodes d’analyses du carotène et de la
vanilline sont caractérisées
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Présentation de mon stage de dut

  1. 1. CARACTÉRISATION DE MÉTHODES D’ANALYSES SUR LES PRODUITS LAITIERS
  2. 2. LABORATOIRE DÉPARTEMENTAL VÉTÉRINAIRE DU FINISTÈRE • Création en 1961 • Accrédité COFRAC • Une centaine d’employés • Locaux de 4300m2
  3. 3. LES DIFFÉRENTS SECTEURS D’ACTIVITÉ • Santé Animale • Microbiologie des aliments et de l’eau • Chimie Alimentaire, eau, environnement • Administratif
  4. 4. LE SERVICE CHROMATOGRAPHIE Analyses pour la qualité des : • Eaux naturelles et de traitement • Animaux d’élevage • Produits laitiers Les principaux clients : • DDASS • DSV • Industriels privés
  5. 5. ANALYSES SUR LES PRODUITS LAITIERS • Teneur en eau • Matière sèche non grasse • pH • Acidité oléique • Indice de peroxyde • Dosage carotène, acide énantique, sitostérol
  6. 6. LES TRACEURS DANS LES PRODUITS LAITIERS • La CE vend des produits à prix réduits • Marque de reconnaissance : ajout de traceurs • Il existe 2 catégories :  Chimique : acide énantique (B0) sitostérol (B1)  Physique : vanilline (A0) carotène (A2)
  7. 7. LES MÉTHODES D’ANALYSES ÉTUDIÉES
  8. 8. DOSAGE DU CAROTÈNE • Détermination de la pureté du carotène • Gamme d’étalon • Mesure des échantillons par un spectrophotomètre à 440nm
  9. 9. PRINCIPE DU DOSAGE • Mesure de l’absorbance • Loi de Beer Lambert : A=ElC Avec E le coefficient d’extinction
  10. 10. DOSAGE DE LA VANILLINE Principe : • Extraction • Détermination RP-HPLC Conditions chromato :  Pompe : débit 1.0mL/min  Injecteur : 20µL  Détecteur : UV à 306nm  Colonne : RP18 (merck 5µm)  Phase mobile : eau (dont 3%acide acétique) -méthanol (70:30, v/v)
  11. 11. PRINCIPE DE LA HPLC • Séparation des constituants d’un mélange
  12. 12. LES DIFFÉRENTS TYPES DE HPLC 1 - chromatographie d'adsorption 2 - chromatographie de partage (en phase directe(2A) ou inverse(2B)) 3 - chromatographie d'échange d'ions (+ chromatographie ionique) 4 - chromatographie de paires d'ions 5 - chromatographie d'exclusion 6 - chromatographie d'affinité 7 - chromatographie adaptée à la séparation d'énantiomères
  13. 13. HPLC en phase inversée • En phase inverse l’éluant est plus polaire que la phase stationnaire • Donc silice greffée dans la colonne
  14. 14. PHASE MOBILE Deux possibilité : Gradient d’élution : variation de la concentration de l’éluant (utilisé pour les mélanges complexes) Mode isocratique : concentration constante
  15. 15. VALIDATION ET CARACTÉRISATION DE MÉTHODES
  16. 16. • Méthode validation basée sur la Norme XPT 90-210 AFNOR de décembre 1999 « Protocole d’évaluation d’une méthode alternative d’analyse physico-chimique quantitative par rapport à une méthode de référence » • Trois plans à suivre de type A, B et C
  17. 17. PLAN DE TYPE A Il permet de caractériser : La linéarité La limite de quantification La limite de détection
  18. 18. LA LINÉARITÉ • Connaître jusqu’où la mesure est linéaire • Caractérisation de l’étalonnage • Réalisation d’un plan à 5 niveaux de concentration et 5 répétitions • Vérification par des calculs statistiques
  19. 19. LIMITES DE QUANTIFICATION ET DE DÉTECTION • Il existe 3 méthodes :  Issue de l’étude de la linéarité  Issue de l’étude du blanc de matrice  Par vérification d’une limite choisie : Une concentration choisie 10 prises d’essais identiques Dans des conditions de répétabilité Vérification par calculs statistiques • Limite de détection = LQ/3
  20. 20. PLAN DE TYPE B • Il permet de contrôler les effets de la matrice sur la mesure • Réalisation d’ajouts dosés • Vérification de la présence d’interférences • C’est la spécificité de la méthode
  21. 21. PLAN DE TYPE C • Il permet d’estimer la répétabilité et la justesse de la méthode • Comparaison méthode de référence/méthode alternative
  22. 22. LA CARACTÉRISATION • Valider une méthode de référence • Les étapes à suivre :  Linéarité  Limites de détection et de quantification  Répétabilité et reproductibilité • Les facteurs étudiés dépendent de la manipulation
  23. 23. APPLICATIONS
  24. 24. LE CAROTÈNE • La linéarité de l’appareil: Etude de la linéarité des traceurs A2 dans le beurre par spectroscopie 1,000 Gamme d’essais de 0.55 à 2.75 µg/mL en étalon de carotène 0,900 0,800 Absorbance 0,700 0,600 y = 0,3061x R2 = 0,9977 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 0,5 1 1,5 Concentration A2 (µg/mL) La linéarité est validée 2 2,5 3
  25. 25. • Limites de détection et de quantification : 1) Essais à 0.1µg/mL Limite non vérifiée 2) Essais à 0.2µg/mL Limite de quantification à 0.2µg/mL validée Limite de détection est 0.067µg/mL
  26. 26. • Répétabilité : Etude de la linéarité des traceurs A2 dans le beurre par spectroscopie 10 mesures avec des ajouts de 21µg de carotène dans le beurre non tracé • Linéarité de la manipulation : Gamme de 0.55 à 2.75 µg/mL par ajouts 1,100 1,000 0,900 0,800 0,700 Absorbance Rendement de 99% 1,200 0,600 y = 0,334x R2 = 0,9369 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 0,5 1 1,5 Concentration A2 (µg/mL) 2 2,5 3
  27. 27. LA VANILLINE Etude de la linéarité des traceurs A0 dans le beurre par chromatographie •Linéarité de l’appareil: 1500000 Aire du pic Gamme d’étalons de 0.25 à 2 µg/mL 2000000 1000000 y = 819571x R2 = 0,9901 500000 0 0 La linéarité est validée 0,5 1 1,5 Concentration A0 (µg/mL) 2 2,5
  28. 28. • Limites de détection et de quantification : 1) Essais à 0.2µg/mL Limite non vérifiée 2) Essais à 0.25µg/mL Limite de quantification à 0.25µg/mL validée Limite de détection est 0.083µg/mL
  29. 29. Etude de la linéarité des traceurs A0 dans le beurre par chromatographie 2000000 y = 610624x R2 = 0,9712 1500000 Aire du pic • Répétabilité et reproductibilité : 10 échantillons mesuré avec 2 répétitions pour une concentration de 0.5µg/mL Rendement de 107% • Linéarité de la manipulation : Gamme de 0.25 à 2 µg/mL avec des ajouts dans le beurre 1000000 500000 0 0 0,5 1 1,5 Concentration A0 (µg/mL) 2 2,5
  30. 30. CONCLUSION Les méthodes d’analyses du carotène et de la vanilline sont caractérisées

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