Mise au point et évaluation de
performances d’une méthode
de dosage de dix anions par
chromatographie ionique
Laboratoire d’Étude et de
Recherche en Environnement et
Santé
 Intégré à l’ENSP
 Analyse de divers paramètres de qualité...
LA CHROMATOGRAPHIE
IONIQUE
 Technique de séparation des composés

d’un mélange

 Appartient à la famille des

Chromatogr...
Principe :
 Séparation par rapport

aux différences d’affinité
des ions et de la phase
mobile pour la phase
stationnaire
...
 Les composés de charge opposé aux groupements

s’y fixent par des interactions électrostatiques

 Respect de l’électron...
Élution en mode isocratique (préparation manuelle) :
 Inconvénients :
Éléments fortement et faiblement retenus dans

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Gradient d’élution (génération automatique):
 Remède à ces problèmes par l’installation d’un

générateur automatique d’él...
Description de
l’appareillage
Le générateur automatique
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•Rôle :
Préparation d’éluant

très pur en ligne

•Principe :
Réduction d...
 Concentration :
 Proportionnelle

courant appliqué
 Inversement
proportionnelle
au débit d’eau
CR-ATC Colonne de piégeage
régénérée en continue
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anioniques de l’eau
déionisée

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Le suppresseur (électrolytique)
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l’éluant

 Augmenter la

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•Principe :

Circulation à contrecourant de l’éluant /
régénérant
 Les flux sont séparés
par une membrane
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Le CRD (Carbonate Removal
Device)

Rôle :
 Diminuer le pic des
carbonates présents dans
l’échantillon
 Principe :
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Optimisation de la
méthode
Présentation de l’analyse
 Méthode actuelles des 10 anions :
 Mode isocratique
 Différentes colonnes et phases mobiles ...
 Méthode à mettre en place :
 Les 10 anions dans la même analyse avec un

gradient d’élution

 Critères à respecter pou...
Paramètres à modifier
 Concentrations initiale et finale
 Temps de départ
 Durée rampe
 Capacité de la boucle d’inject...
Préparation des essais
 Les solutions utilisées :
Étalon de plus faible concentration

de la gamme

Étalon de plus fort...
Réglage des paramètres
 Boucle d’injection :
 Différents essais : 25, 100, 200, 300 µL
 25 et 100µL : mauvaise quantifi...
 Gradient :
 Point de départ : exemple de DIONEX

10 – 25 minutes avec 10 – 45 mM KOH
 Plusieurs possibilités :
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To (min)

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Chromatogramme
Conditions chromatographiques
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Débit : 1.00 mL/min

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Boucle d’injection : 200µL

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Précolonne :
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Évaluation de
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 Méthode étudiée = méthode

normalisée

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APPLICATION
 10 gammes d’étalonnage préparées

indépendamment
 Normalité :
vérifier la concordance des résultats
test de Shapiro
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

Limite de quantification

Il existe 3 méthodes :


Issue de l’étude de la linéarité



Issue de l’étude du blanc de m...
Résultats
CONCLUSION
Les critères sont bien respectés
La méthode est validée
Merci pour votre
attention!
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Présentation de mon stage de licence

  1. 1. Mise au point et évaluation de performances d’une méthode de dosage de dix anions par chromatographie ionique
  2. 2. Laboratoire d’Étude et de Recherche en Environnement et Santé  Intégré à l’ENSP  Analyse de divers paramètres de qualité des : Eaux Effluents Boues et sédiments  Accrédité COFRAC depuis septembre 2000 en ISO 17025
  3. 3. LA CHROMATOGRAPHIE IONIQUE  Technique de séparation des composés d’un mélange  Appartient à la famille des Chromatographies liquides d’adsorption
  4. 4. Principe :  Séparation par rapport aux différences d’affinité des ions et de la phase mobile pour la phase stationnaire  Phase stationnaire : résine porteuse de groupements chargés
  5. 5.  Les composés de charge opposé aux groupements s’y fixent par des interactions électrostatiques  Respect de l’électroneutralité de l’éluant : Les ions éliminés sont remplacés par autant d’ions de même charge provenant de la phase stationnaire
  6. 6. Élution en mode isocratique (préparation manuelle) :  Inconvénients : Éléments fortement et faiblement retenus dans une même analyse est difficile à éluer Risque de pollutions lors de la préparation
  7. 7. Gradient d’élution (génération automatique):  Remède à ces problèmes par l’installation d’un générateur automatique d’éluant : Augmentation répétabilité, reproductibilité, linéarité, sensibilité… Facilité d’utilisation
  8. 8. Description de l’appareillage
  9. 9. Le générateur automatique d’éluant (EGC II KOH) •Rôle : Préparation d’éluant très pur en ligne •Principe : Réduction de l’eau à la cathode 2H2O + 2 e- = 2OH- + H2 Migration de K+ dans le connecteur échangeur d’ion K+ + OH- = KOH
  10. 10.  Concentration :  Proportionnelle courant appliqué  Inversement proportionnelle au débit d’eau
  11. 11. CR-ATC Colonne de piégeage régénérée en continue  Rôle :   Éliminer les impuretés anioniques de l’eau déionisée Principe :  Anions retenus par résine et traversent la membrane  OH- régénèrent en continu la résine  H3O+ se combinent avec les anions
  12. 12. Le suppresseur (électrolytique)  Rôle :  Diminuer la conductivité de l’éluant  Augmenter la conductivité de l’analyte  Augmenter le rapport signal sur bruit
  13. 13. •Principe : Circulation à contrecourant de l’éluant / régénérant  Les flux sont séparés par une membrane échangeuse de cation  Électrolyse de l’eau aux électrodes 
  14. 14. Le CRD (Carbonate Removal Device) Rôle :  Diminuer le pic des carbonates présents dans l’échantillon  Principe :  Naturellement l’équilibre suivant existe : H2CO3 = H2O + CO2  CO2 traverse la membrane perméable  Déplacement de l’équilibre vers la droite 
  15. 15. Optimisation de la méthode
  16. 16. Présentation de l’analyse  Méthode actuelles des 10 anions :  Mode isocratique  Différentes colonnes et phases mobiles selon le groupe d’anions à analyser  NO2-, NO3- et PO43- dosés au flux
  17. 17.  Méthode à mettre en place :  Les 10 anions dans la même analyse avec un gradient d’élution  Critères à respecter pour optimiser la méthode:  résolution >1.3  Durée acquisition courte  LQ similaires à celles déjà appliquées  Domaine linéarité le plus grand possible
  18. 18. Paramètres à modifier  Concentrations initiale et finale  Temps de départ  Durée rampe  Capacité de la boucle d’injection
  19. 19. Préparation des essais  Les solutions utilisées : Étalon de plus faible concentration de la gamme Étalon de plus forte concentration de la gamme  Ordre d’élution : F- <ClO2-<BrO3-<Cl-<NO2-<ClO3-<Br-<NO3-<SO42<PO43-
  20. 20. Réglage des paramètres  Boucle d’injection :  Différents essais : 25, 100, 200, 300 µL  25 et 100µL : mauvaise quantification des faibles concentrations  300µL : saturation et mauvaise résolution pour les fortes concentrations  200µL : OK!
  21. 21.  Gradient :  Point de départ : exemple de DIONEX 10 – 25 minutes avec 10 – 45 mM KOH  Plusieurs possibilités :  Différents gradients en fonction des groupes d’anions à analyser  Un seul gradient pour tous les anions
  22. 22. gradient résolution To (min) Tf (min) Co (mM) Cf (mM) ClO2-/BrO3- Br-/NO3- Temps d’acquisition (min) 0 20 2 35 1.60 1.44 25.63 0 20 2 45 1.28 0.74 21.15 0 15 10 45 1.34 1.41 16.39 0 15 5 45 1.22 0.69 16.98 5 25 2 35 Non résolus Non résolus >25 5 25 2 45 1.31 0.73 25.88 6 21 10 45 1.60 1.48 23.98 8 23 10 45 1.61 1.52 24.77 8 23 5 45 1.34 0.72 24.90 8 28 2 45 1.34 0.71 28.82 10 25 10 45 1.57 1.54 26.51 10 30 2 45 1.34 0.70 30.63 15 30 20 45 1.48 1.73 26.76
  23. 23. Chromatogramme
  24. 24. Conditions chromatographiques  Débit : 1.00 mL/min  Boucle d’injection : 200µL  Précolonne : Ionpac AG19 4*50 mm  Colonne analytique : Ionpac AS19 4*250 mm Groupe fonctionnel : alkanol ammonium quaternaire  Détecteur : conductimétrique  Gradient d’élution : 6-21 minutes 10-45mM de KOH
  25. 25. Évaluation de performances
  26. 26.  Norme XP T 90-210 « Protocole d’évaluation d’une méthode alternative d’analyse physico-chimique quantitative par rapport à une méthode de référence »  4 plans d’expériences :  Type A : linéarité + limite de quantification  Type B : spécificité  Type C : répétabilité + justesse  Type D : reproductibilité interne (en option)
  27. 27.  Méthode étudiée = méthode normalisée Selon le COFRAC plan type A uniquement
  28. 28. APPLICATION
  29. 29.  10 gammes d’étalonnage préparées indépendamment  Normalité : vérifier la concordance des résultats test de Shapiro W>0,781  Linéarité : 5 gammes analysées variance due erreur modèle <variance due erreur expérimentale Vérification par test Fisher
  30. 30.  Limite de quantification Il existe 3 méthodes :  Issue de l’étude de la linéarité  Issue de l’étude du blanc de matrice  Par vérification d’une limite choisie : Une concentration choisie 10 prises d’essais identiques Dans des conditions de répétabilité Vérification de la normalité, justesse et fidélité par calculs statistiques  Répétabilité 10 gammes analysées Coefficient de variance CV < 20%
  31. 31. Résultats
  32. 32. CONCLUSION Les critères sont bien respectés La méthode est validée
  33. 33. Merci pour votre attention!

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