Tìm hiểu báo cáo về nghiên cứu tách dòng biểu hiện gen XynB từ A.niger trong nấm men Pichia Pastoris

1. Nghiên cứu sản xuất Xylanase tái tổ hợp
HVTH: Hoàng Nữ Lệ Quyên
Cao Xuân Bách
-------------------------------------- --------------------------------------
XinRanLi,HuiXu,JieXie,QiaoFuYi,WeiLi,DaiRongQiao,YiCao, andYuCao.
ThermostableSitesandCatalyticCharacterizationofXylanaseXYNBofAspergillusnigerS
CTCC400264, J. Microbiol. Biotechnol. (2014),24(4), 483–488

2. Nội dung
1. Tổng quan
2. Nguồn gen và vector tách dòng
3. Vector và vật chủ biểu hiện
4. Kết luận

3. Tổng quan
 Xylan là thành phần chính cấu tạo nên hemicellulose của
thành tế bào thực vật.
 Xylan là polymer bao gồm các đơn phân D – xylose liên kết
với nhau bằng liên kết ß – 1,4 – glycoside.

4. Xylanase
 Xylanase là enzyme tham gia thủy phân xylan.
 Hai nhóm enzyme chủ yếu phân hủy xylan:
+ endo – 1,4 – ß - xylanase, enzyme này thủy phân liên
kết 1,4 – ß - Glucosid.
+ ß – xylosidases; enzyme này thủy phân xylobiose và
xylooligosaccharid.
- Các enzyme (debranching enzyme): α – glucuronidase;
acetylxylan… loại bỏ mạch nhánh acetyl và mạch nhánh
phenol.

5. Xylanase
 Dựa trên trình tự tương đồng của amino acid chia enzyme
xylanase thành 2 họ chính:
+ Họ 10 (KLPT > 30 kDa)
+ Họ 11 (KLPT khoảng 20kDa)

6. Xylanase
 Xylanase có nguồn gốc thực vật:
+ sinh tổng hợp endo-xylanase trong quả lê Nhật Bản trong giai
đoạn chín.
+ sinh tổng hợp endo-xylanase (klpt 55 kDa) từ lúa mì.
 Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu từ các vi sinh vật:
+ sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn: Bacillus SSP; Bacillus
circulans…
+ sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc: Trichoderma sp;
A.niger;…

7. Nguồn gen và vector tách dòng
 Nguồn gen: Aspergillus Niger
 Gen: xynB chịu nhiệt
(FJ772090).
 Trong bộ sưu tập chủng giống
Tứ Xuyên – Trung Quốc.
 Dựa trên trình tự nucleotide của
XynB:
Aspergillus Niger
 P1: 5'-GGAATTCTCGACCCCGACCGGCGAGAA-3 ';
 P2: 5'-ATAGCGGCCGCTTACTGAACAGTGATGGAGGAAGA-3 '.

8. Nguồn gen và vector tách dòng
 Vector tách dòng: pMD19-T
 Vật chủ tách dòng:
Escherichia Coli

9. Vector và vật chủ biểu hiện
 Vector tái tổ hợp: pPIC9K
 Vật chủ biểu hiện: Pichia Pastoris
Pichia Pastoris

10. Vector pPIC9K
 Là vector biểu hiện trong nấm
men Pichia pastoris
 Kết hợp gen AOX cảm ứng
methanol tạo protein tái tổ hợp
 Cấu trúc vector:
- Ori
- AOX3
- AOX1 promoter
- Điểm polylinker MSC
- AOX1 terminator
- Gen kháng Kanamycin, Ampi

11. Vật chủ biểu hiện: Pichia Pastoris
 Nấm men: eukaryote
 Ưu điểm:
- Tốc độ sinh trưởng cao,
- Môi trường đơn giản không tốn kém
- Có thể phù hợp quy mô lớn hay nhỏ
- Môi trường tự bảo vệ

12. Kết quả nghiên cứu
Hình. 3. Nhiệt độ tối ưu của xylanase tái tổ hợp. Nhiệt
độ tối ưu được xác định bằng phương pháp Ghose: ủ
các enzyme trong 0,1 M citrate đệm, pH 5,0, trong 10
phút ở nhiệt độ khác nhau.
Hình 6. Sự ảnh hưởng của các Hoạt độ của enzym tái
tổ hợp của các ion kim loại khác nhau. Cơ chất bao
gồm K+, Mg2+, Fe2+, Mn2+, Cu2+, Ca2+, Fe3+, Co2+,
Zn2+.
Hình 5. Ổn định nhiệt của xylanase tái tổ hợp.
Protein tái tổ hợp được xác định bằng ủ ở 80 ° C
trong 10 phút.
Hình 4. pH tối ưu độ bền của xylanase tái tổ hợp. pH
tối ưu được xác định bằng cách ủ ở 50 ° C trong 10
phút ở pH khác nhau bằng phương pháp của Ghose;
pH 2-10.

13. So sánh điểm khác biệt trình tự gen XynB
 Sriprang và cộng sự đã xây dựng lại XYLB
(AY551187) của Aspergillus BCC14405, thay thế Arg
cho Ser/Thr, và thu được hai đột biến, ST4 và ST5, do
đó tạo độ bền nhiệt cao hơn
 Hình 7. Các chuỗi liên kết của xynB trong Aspergillus
niger. I: Tín hiệu peptide, 1-37; II-IV: vị trí khác nhau.

14. Phân tích lựu van der Waals và liên kết H
 Hình 8A và 8B: phân tích lực vander Waals
trong XYNB (ACN89393 và AAS67299),
cho thấy có thêm một gốc oxy tự do trong
AAS67299 tại vị trí trung tâm xúc tác cho
thấy ái lực tốt hơn, vận chuyển proton,…,
và làm tăng hoạt động của enzyme.
 Hình 8C và 8D: Phân tích liên kết H trong
XYNB chỉ ra rằng có nhiều hơn hai liên
kết H tại 33 Ser của XYNB (AAS67299)
so với Ala 33 (ACN89393), và hai H-liên
kết giữa Ser70 và Asp67.
Ser ưa nước hơn Ala, và gần khu vực vị trí
thứ 70, có nhiều các axit amin ưa nước hơn
axit amin kỵ nước, nơi chỉ có hai Ala68 và
Ile222 là kỵ nước trong chín axit amin. Do
đó tương tác kỵ nước tăng làm duy trì cấu
trúc hai lớp và cải thiện tính bền nhiệt.
Hình 8. Phân tích Lực Van der
Waals và liên kết Hydro của xynB
(ACN89393 và AAS67299) trong
Aspergillus niger. (A, B) phân tích
lựcVan der Waals cho XYNB (A:
ACN89393; B: AAS67299); (C, D),
phân tích liên kết hydro cho XYNB
(C: ACN89393 D: AAS67299).

15. Kết luận
 Enzyme tái tổ hợp có nhiều ưu điểm:
- Có khả năng cải tạo nâng cao khả năng bền nhiệt, chịu pH,
nâng cao hoạt tính
- Dễ dàng áp dụng trong quy mô nhỏ, lớn
- Có thể cải thiện tính chất để dễ thu nhận enzyme
- Mở rộng lĩnh vực ứng dụng
 Những điểm cần lưu ý:
- Kiểm soát an toàn sinh học
- Tính ổn định về di truyền

16. Tài liệu tham khảo
 XinRanLi,HuiXu,JieXie,QiaoFuYi,WeiLi,DaiRongQiao,YiCao,
andYuCao.
ThermostableSitesandCatalyticCharacterizationofXylanaseXYNBofA
spergillusnigerSCTCC400264, J. Microbiol. Biotechnol.
(2014),24(4), 483–488
 Guanhua Fu, Yongtao Wang, [...], and Chenyan Zhou.
Cloning, Expression, and Characterization of an GHF 11 Xylanase
from Aspergillus niger XZ-3S, Indian J Microbiol (Oct–Dec 2012)
52(4):682–688
 Yui Takahashi, Hiroaki Kawabata, and Shuichiro Murakami.Analysis
of functional xylanases in xylan degradation by Aspergillus niger E-
1 and characterization of the GH family 10 xylanase XynVII,
Takahashi et al. SpringerPlus 2013, 2:447