El tratamiento prolongado con morfina altera la expresión de proteínas en el miocardio de la rata. El estudio evaluó el efecto de la morfina en dosis altas administradas durante 10 días en ratas macho sobre la expresión de proteínas miocárdicas. Los resultados mostraron que la morfina induce estrés oxidativo pero también un efecto cardioprotector al unirse a los receptores opioides. Se identificaron varias proteínas con un papel protector cuya síntesis aumentó en respuesta al estrés oxidativo.

1. Prolonged morphine
administration alters protein
expression in the rat myocardium
Juliana Molina
Carolina Madrid
Tercer semestre

2. INTRODUCTION
 Morphine: is a potent opiate analgesic medication. agonist at μ opioid receptors
coupled to G protein
Acts opening voltage-dependent potassium channel and closing calcium-
dependent causing hyperpolarization and reduced excitability of the neuron.
Analgesia is due to changes in the perception of pain at the spinal level
 Miocardyum: involuntary striated muscle
• Protein expression: DNA RNA Protein
Morphine can induce changes in cell metabolism that coudl eventualy modify the
expression of certain proteins, in this particular case, myocardium.

3. GENERAL OBJETIVE
The main aim of the study
was to asses the
presumed effect of
prolonged treatment with
high dosis of morphine in
male rast on myocardial
protein expression

4. METODOLIGÍA
MATERIALES
• acrilamida y bis-acrilamida
• SYPRO: ruby stain from molecular probes
• Membrana de nitrocelulosa
• Inmobilune DryStrips
• Buffer de pharmalyte
• Anticuerpos secundarios anti-rabbit marcados con peroxidasa de rabano
• Anticuerpos primarios rabbit

5. METODOLIGÍA
ANIMALES Y TRATAMIENTO CON MORFINA
Cámaras
de Inyección intramuscular
plexiglas
•Grupo CON: solución
salina
Ratas •Grupo MOR: morfina-
3a4 Ciclo de 12
10mg/Kg por 10 dias
por albinas horas
camara luz/oscuridad •Naloxona: 10mg/Kg por
adultas 10 dias
•Naxolona + morfina:
10mg/Kg por 10 dias
Agua y
comida

6. METODOLIGÍA
ANIMALES Y TRATAMIENTO CON MORFINA
Sacrificio de animales Dislocación cervical- 24 horas después ultima dosis
Extirpación- disección corazón
Congelamiento en nitrógeno liquido y almacenado a -80°C
Experimento con retiro de la dosis Animales sacrificados 3 días después de
ultima dosis

7. METODOLIGÍA
FRACCIONAMIENTO DE TEJIDO CARDIACO
Muestras congeladas
de ventrículo izquierdo 10 volúmenes de TMES buffer+ coctel inhibidor de proteasa
Corte en pedazos y homogenización Suspensión
homogenización
Centrifugación Para remover tejidos y fragmentos nucleares
Supernadante postnuclear (PNS)

8. METODOLIGÍA
FRACCIONAMIENTO DE TEJIDO CARDIACO
PNS Aplicado a solución percoll 18% en buffer TMES
Centrifugación Parte opaca
parte translucida centrifugación
mitocondria Membrana del plasma
Fracción citosolica
Dilución en buffer TME
Centrifugación
Resuspensión
Congelado
Almacén alícuotas

9. METODOLIGÍA
ELECTROFORESIS E INMUNOBLOT
Muestras de proteína Solubilizadas en laemmli buffer
Gel de poliacrilamida 10%
Transferencia a membranas de nitrocelulosa
Bloqueo de membranas con leche descremada seca al 3%
Sonda con anticuerpos Inmunoblot- análisis y cuantificación

10. METODOLIGÍA
ELECTROFORESIS E INMUNOBLOT
inmunoblot:
las proteínas de extractos
celulares son separadas por
electroforesis en gel según
tamaño por medio de SDS-
PAGE poliacrilamida gel
electroforesis cargado
negativamente.
Después las proteínas van a
un filtro incubado con
anticuerpos que reaccionan
con la proteína especifica. El
anticuerpo unido al filtro se
detecta.

11. METODOLIGÍA
ANALISIS PROTEOMICO
Precipitación de la fracción citosolica, mitocondrial, membrana
Proteínas se pusieorn en gradientes lineares de pH 4-7
Se separaron con multiphor apparatus
2 equilibrios con buffer EQ
Separación 2D en gel poliacrilamida 10% teñidos con SYPRO ruby
cuantificación de la densidad de los puntos con software PDQuest
Proteínas alteradas se identificaron con 4800 plus MALDI TOF/TOF análisis

12. METODOLIGÍA
MISCELANEA
La concentración de proteínas fue determinada por método BCA
Los geles proteomicos de referencia 2D se establecieron haciendo un por medio de 12
replicas de cada grupo

13. RESULTADOS

14. RESULTADOS

15. RESULTADOS

16. RESULTADOS

17. RESULTADOS

18. RESULTADOS

19. DISCUSSION
AUTHOR YES NO
G. Ferns X
J. Ikeda X
GS. Murphy X
JN. Peart x

20. CONCLUSIONS
• Prolonged Morphine administration can caused oxidative stress and cardioprotective effect
by binding with opioid receptor. The mechanism of action would be important at the time to
seek for drug interactions that may increase or reduce the benefit.
• the myocardium responds to oxidative stress by increasing the synthesis
of several proteins with a protective role.
• Morphine is used for treatment in many diseases, molecular studies provide insights into the
behavior and cellular response of different tissues of the body in a prolonged administration,
this knowledge allows a better approach in the treatment of patients.
• Molecular studies should be made in order to find a way to induce the same protective
response in the cell without the need of the constant stim from the drug. this would be really
important in the treatment of some patients beacuse dosis decreases or may even disappear