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Department of Food Environmental   Consorzio per la tutela            Consorzio Tutela Vini
    and Nutritional Sciences         del Franciacorta                   Oltrepò Pavese




                                                             www.regione.lombardia.it



 VALORIZZAZIONE DELLE D.O.C.G. FRANCIACORTA
    ED OLTREPÒ PAVESE METODO CLASSICO
    MEDIANTE IMPIEGO DI LIEVITI AUTOCTONI
   PER IL MIGLIORAMENTO DELLE PRODUZIONI
         E COME MARCATORI DI TIPICITÀ




 Quaderni della Ricerca
 n. 148 - novembre 2012
Sperimentazione condotta nell’ambito del progetto di ricerca n. 1315
“Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico
  mediante impiego di lieviti autoctoni per il miglioramento delle produzioni e
come marcatori di tipicità” (d.g.r. 30/3/2009 n. VIII/9182 - Piano per la ricerca e
                                lo sviluppo 2009).




                     Hanno realizzato le attività sperimentali:
                           Università degli Studi di Milano
       Dipartimento di Scienze per gli Alimenti, la Nutrizione e l’Ambiente
                            via Celoria, 2 - 20133 Milano
           referente: prof. Roberto Foschino, roberto.foschino@unimi.it
                       Consorzio per Tutela del Franciacorta
                         Via Verdi, 53 - 25030 Erbusco (BS)
     referente: dr.ssa Monica Faccincani, ufficio.tecnico@franciacorta.net
                       Consorzio Tutela Vini Oltrepò Pavese
                    piazza Vittorio Veneto, 24 - 27043 Broni (PV)
          referente: dr.ssa Alice Colombo, ufficio.tecnico@vinoltrepo.it




                                  Per Informazioni:
              Regione Lombardia - Direzione Generale Agricoltura
       U.O. Innovazione, cooperazione e valorizzazione delle produzioni
        Struttura Ricerca, innovazione tecnologica e servizi alle imprese
                    Piazza Città di Lombardia 1 - 20124 Milano
                    tel: +39.02.6765.3790 fax: +39.02.6765.8056
                    e-mail: agri_ricerca@regione.lombardia.it
                 referente: Rossana Tonesi - tel: +39.02.6765.3737
                   e-mail: rossana_tonesi@regione.lombardia.it




                        © Copyright Regione Lombardia
VALORIZZAZIONE DELLE D.O.C.G.
Department of Food Environmental       Consorzio per la tutela   Consorzio Tutela Vini
    and Nutritional Sciences             del Franciacorta          Oltrepò Pavese




VALORIZZAZIONE DELLE D.O.C.G. FRANCIACORTA
   ED OLTREPÒ PAVESE METODO CLASSICO
   MEDIANTE IMPIEGO DI LIEVITI AUTOCTONI
  PER IL MIGLIORAMENTO DELLE PRODUZIONI
        E COME MARCATORI DI TIPICITÀ


                                        A cura di:
                                    Roberto Foschino
                                     Ileana Vigentini
                                 Gabriella De Lorenzis
                                     Claudia Picozzi
                               Shirley Barrera Cardenas
                                    Vincenzo Fabrizio




                               Quaderni della Ricerca
                               n. 148 - novembre 2012
VALORIZZAZIONE DELLE D.O.C.G.
Indice




Indice

Presentazione	7

Capitolo 1. Analisi dei fabbisogni,                                  5
stato dell’arte e obiettivi	                                     9

Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici
in Franciacorta ed Oltrepò Pavese	                              17

Capitolo 3. Tipizzazione molecolare dei ceppi
di S. cerevisiae per il riconoscimento di ecotipi autoctoni	    47

Capitolo 4. Selezione dei ceppi
e prove di microvinificazione	                                  64

Capitolo 5. Il destino del DNA nello spumante	                  95

Capitolo 6. Considerazioni finali	                             120



Bibliografia	                                                  125

Ringraziamenti	134
VALORIZZAZIONE DELLE D.O.C.G.
Presentazione




Presentazione

                                La Lombardia è regione leader nel-
                             la produzione di vino spumante di alta
                             qualità rappresentando oltre il 60% del
                             prodotto nazionale realizzato con me-
                             todo classico. Nel settore vitivinicolo le
                             bollicine lombarde sono da anni in co-
                             stante crescita, grazie al continuo mi-
                             glioramento del livello qualitativo e al
                             trainante successo imprenditoriale del       7

                             “modello” Franciacorta. Con il recen-
                             te riconoscimento della Denominazio-
                             ne d’Origine Controllata e Garantita
                             conferito all’Oltrepò Pavese Metodo
                             Classico la Lombardia può vantare una
produzione di eccellenza negli spumanti D.O.C.G. con un poten-
ziale di oltre 13 milioni di bottiglie.
    Occorre tuttavia riconoscere che il mondo dell’enologia ita-
liana sta attraversando una fase di forte trasformazione e crisi,
determinata un profondo cambiamento delle preferenze e del-
le abitudini al consumo e accompagnata da una importante
riduzione delle disponibilità economiche del pubblico. Inoltre
l’ingresso di nuovi Paesi produttori ha ulteriormente innalzato la
competizione commerciale, soprattutto sul mercato estero. Per
contro, con tendenza positiva, si va affermando tra i consumato-
ri una maggior attenzione alla qualità, alla tipicità del vino e agli
aspetti sensoriali ed emozionali della degustazione.
    È tempo dunque di riflettere, progettare e reagire per indiriz-
zare le risorse, da un lato, verso il miglioramento e la differenzia-
zione qualitativa, valorizzando soprattutto vini che esprimano un
legame con il territorio di appartenenza, dall’altro lato verso la
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…


    penetrazione dei nostri prodotti nei mercati emergenti incremen-
    tando l’attività di promozione all’estero.
       Su questa linea strategica si inserisce il progetto di ricerca Eno-
    track che, a tre anni dal suo avvio, presenta in questo volume i
    suoi risultati, frutto della fattiva collaborazione tra il Dipartimento
    di Scienze per gli Alimenti, la Nutrizione e l’Ambiente dell’Universi-
    tà degli Studi di Milano, il Consorzio per Tutela del Franciacorta e
    il Consorzio Tutela Vini Oltrepò Pavese.
       Per valorizzare le D.O.C.G. metodo classico della Franciacor-
    ta e dell’Oltrepò Pavese la ricerca ha sperimentato l’impiego di
    lieviti autoctoni per il miglioramento qualitativo delle produzioni e
    come marcatori della tipicità.


                                                                Giuseppe Elias
                                                       Assessore all’Agricoltura
                                                           Regione Lombardia
8
Capitolo 1. Analisi dei fabbisogni, stato dell’arte e obiettivi




Capitolo 1. Analisi dei fabbisogni, stato dell’arte
e obiettivi


   All’interno della regione Lombardia, Franciacorta ed Oltrepò
Pavese costituiscono le aree geografiche trainanti la produzione
di vino spumante realizzato con metodo classico, rappresentan-
do quasi due terzi dei “bollicine” a marchio D.O.C.G. fabbricati
sul territorio nazionale. Il continuo miglioramento del livello qua-
litativo del prodotto lombardo e l’attenzione alla promozione
dell’immagine, sapientemente considerati come obiettivi fon-                 9

damentali da entrambi i Consorzi e dalla maggioranza dei pro-
duttori, sono comprovati dall’incremento costante delle vendite,
anche in questi anni di crisi economica. La valorizzazione dei pro-
dotti di origine, realizzati e percepiti come meglio legati al territo-
rio, può emergere come linea strategica di successo, soprattutto
per le attività rivolte al rafforzamento della comunicazione e alla
penetrazione del mercato estero, naturale destino di uno svilup-
po commerciale futuro.


1.1 Analisi dei fabbisogni

  Il Franciacorta D.O.C.G., viene preparato a partire da uve
Chardonnay e/o Pinot bianco e/o Pinot nero coltivate in provin-
cia di Brescia su una superficie di circa 2000 ettari; 160 sono gli
aderenti al Consorzio di Tutela del Franciacorta, 74 le aziende di
imbottigliamento. L’ Oltrepò Pavese Metodo Classico, è prodot-
to da uve Pinot Nero in purezza o in miscela con Chardonnay
coltivate in provincia di Pavia per un’estensione di circa 2000 et-
tari; il Consorzio Tutela Vini Oltrepò Pavese conta 250 associati,
con 1300 viticoltori conferenti, 6 le cantine sociali.
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…


        Gli areali della Franciacorta e dell’Oltrepò Pavese rappresen-
     tano zone di particolare interesse per l’applicazione di nuove tec-
     nologie nel settore viti-vinicolo come effetto della convergenza
     di fattori positivi e strategici per il successo delle innovazioni quali,
     la grande perizia tecnica ed il buon livello socio-culturale degli
     operatori, l’atteggiamento di apertura verso la sperimentazione
     senza tralasciare il valore della tradizione, l’elevata vocazionalità
     dei territori, l’orientamento della filiera verso produzioni vinicole di
     pregio.
        Entrambi i vini , Franciacorta D.O.C.G. e Oltrepò Pavese Me-
     todo Classico, si ottengono da una lavorazione che dura non
     meno di 2 anni dalla vendemmia, di cui almeno 15 mesi (per la
     denominazione Oltrepò Pavese) e 18 mesi (per la denominazio-
     ne Franciacorta) di lenta rifermentazione in bottiglia a contatto
     con cellule di lievito.
        L’utilizzo di preparati commerciali di lievito è una pratica ormai
     universalmente diffusa presso le cantine della nostra Regione
10   poiché offre garanzie di una conduzione ininterrotta e completa
     della fermentazione e della rifermentazione. Tuttavia le colture
     di Saccharomyces attualmente utilizzate per le spumantizzazioni
     (starter) sono in numero ridotto, talvolta lo stesso ceppo assume
     sigle diverse perché attribuito a marchi diversi, e comunque trat-
     tasi di ceppi isolati e selezionati in territorio francese sulla base
     delle caratteristiche qualitative dello Champagne o per adat-
     tarsi alla produzione di una ampia gamma di preparazioni vina-
     rie, non tenendo conto delle specifiche proprietà sensoriali dei
     prodotti lombardi. La sostituzione dei ceppi starter d’oltralpe con
     ceppi di nuovo isolamento in territorio lombardo, appositamente
     selezionati per caratteri tecnologici e di qualità, può condurre
     alla produzione di vini con proprietà sensoriali migliorate e co-
     munque valorizzanti il prodotto finito, attraverso il riconoscimento
     di una relazione diretta con l’area geografica di produzione. Nel-
     lo specifico caso degli spumanti fatti secondo il metodo classico,
     la tecnica di rifermentazione in bottiglia comporta il vantaggio
     che i residui cellulari permangono nel prodotto fino al consumo.
     Per conseguenza il DNA di lievito, grazie alla sua natura di mole-
     cola informativa, può costituire un idoneo bersaglio analitico e la
     sua decodificazione può risultare un potente strumento per l’indi-
     viduazione e la certificazione dell’origine territoriale del prodotto.
Capitolo 1. Analisi dei fabbisogni, stato dell’arte e obiettivi


   Il crescente e continuato utilizzo di starter commerciali costituiti
da un esiguo numero di ceppi per la rifermentazione tende ad
uniformare le caratteristiche sensoriali dei vini omologando i pro-
dotti di Franciacorta e di Oltrepò Pavese agli spumanti di altre
zone produttive. Infatti, il dominio fermentativo e la dispersione
ambientale delle colture starter selezionate di provenienza este-
ra conducono sostanzialmente a due conseguenze:
•	 la prima, di tipo enologico, è legata al fatto che i lieviti autoc-
   toni, a seguito della loro inferiore concentrazione iniziale e/o
   della competizione nutrizionale, non riescono ad apportare il
   loro contributo metabolico alla qualità del prodotto finale;
•	 la seconda, di tipo ecologico, è che le forme indigene pos-
   sono scomparire dall’habitat del vigneto e della cantina, pur
   possedendo caratteristiche elettive in termini di apporto sen-
   soriale verso i prodotti.
   Il recupero di tali ceppi, mediante una campagna program-
mata ed estesa di campionamento sui territori coinvolti, viene
proposto per salvaguardare le forme microbiche rimaste che                   11

possono essere impiegate nella valorizzazione e tutela dei pro-
dotti attuali e che, in futuro, potrebbero venire utilizzate per nuo-
ve applicazioni.
   Il terzo problema che l’idea progettuale si propone di affronta-
re è quello di fornire un potente strumento di verifica per i sistemi
di tracciabilità adottati a garanzia della qualità ed autenticità
del prodotto lombardo. L’impegno è quello di sviluppare un pro-
tocollo analitico, in tecnica qPCR basato sull’analisi del DNA e al
suo utilizzo per la tutela delle produzioni di spumante D.O.C.G..
Attraverso l’analisi della sequenza nucleotidica o la determina-
zione di alcuni target genici specifici, questo metodo consen-
tirebbe di individuare il ceppo di lievito che è stato impiegato
nella rifermentazione, rappresentando un vero e proprio “mes-
saggio nella bottiglia” per la durata della vita commerciale del
prodotto.


1.2 Stato dell’arte

   Lo spumante è un vino che forma spuma all’atto della mescita
in conseguenza della liberazione di anidride carbonica ottenuta
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…


     da fermentazione operata da lieviti. Da un punto di vista tec-
     nologico la produzione dei vini spumanti può essere suddivisa in
     due fasi: la formulazione del vino base, realizzata allestendo una
     miscela di differenti vini preparati con tecnica di vinificazione
     in bianco, e la spumantizzazione, ottenuta per rifermentazione
     di zuccheri da parte di ceppi di Saccharomyces in contenitori
     chiusi. Nel metodo classico (metodo champenoise) la presa di
     spuma avviene direttamente in bottiglia, inoculando il vino base
     con idoneo innesto microbico (> 106 UFC/ml) e sciroppo zucche-
     rino (20-24 g/L) in modo da raggiungere una sovrappressione di
     CO2 di 5-6 atmosfere. La maturazione del prodotto sulle fecce
     avviene a basse temperature (a circa 12°C-14°C) e si protrae per
     un tempo prolungato (≥ 15 mesi); in questo periodo avvengono
     trasformazioni biochimiche operate da enzimi sintetizzati dai lie-
     viti, fenomeni di diffusione di sostanze tra cellule e mezzo, lisi delle
     cellule, che permettono il conferimento delle peculiari caratteri-
     stiche aromatiche. Nel metodo Charmat la spumantizzazione del
12   vino base, addizionato di zucchero e lieviti, avviene in autocla-
     vi a temperature più elevate (20-25°C) e per tempi brevi (pochi
     giorni) che non consentono l’ottenimento delle qualità sensoriali
     che si raggiungono mediante l’affinamento in bottiglia.
        In effetti è proprio nel metodo classico per la produzione di
     spumanti, più che in ogni altra tecnica enologica, che l’azione
     dei lieviti non si esaurisce con il compimento della sola fermenta-
     zione alcolica, ma si esalta con la formazione di composti secon-
     dari (es. alcoli superiori e loro esteri, esteri etilici di acidi grassi, po-
     lisaccaridi parietali), con la modifica di composti nativi dell’uva
     (es. acido malico, glicosidi, tioli alifatici ramificati, acidi fenolici)
     (Lambrechts e Pretorius, 2000) e prosegue con la cessione di so-
     stanze attraverso il fenomeno dell’autolisi cellulare (aminoacidi,
     oligopeptidi). La quantità di ciascuno di questi composti è spes-
     so difficilmente correlabile al gradimento finale, che è funzione
     della percezione complessiva che offre il vino, ed è dipendente
     in larga misura dal ceppo di Saccharomyces utilizzato oltre che
     dalle condizioni ambientali di sviluppo del lievito (Ribereau-Ga-
     yon, 1998).
        La possibilità di selezionare ceppi autoctoni con proprietà tec-
     nologiche utili e caratteristiche di qualità idonee al tipo di pro-
     dotto (potere fermentativo, purezza fermentativa, flocculenza,
Capitolo 1. Analisi dei fabbisogni, stato dell’arte e obiettivi


profilo aromatico) soddisfa l’obiettivo della difesa della comuni-
tà microbica indigena e contemporaneamente suggella la va-
lorizzazione del prodotto tipico attraverso l’evidenza del legame
tra territorio e prodotto finito. L’isolamento e l’identificazione di
lieviti è oggi facilitata dallo disponibilità di tecniche molecola-
ri sufficientemente rapide ed affidabili (Eigel e Feldmann, 1982;
Querol, 1992; Granchi,1999; Mannazzu et al., 2002; Marinangeli
et al. 2004a; Marinangeli et al. 2004b; Foschino e Vigentini, 2006).
Saccharomyces cerevisiae è stata la prima specie eucariota il cui
genoma è stato sequenziato totalmente (Goffeau et al., 1996) e
tuttavia il settore enologico non ha ancora sfruttato pienamen-
te questa enorme potenzialità informativa. Le moderne tecni-
che di analisi genetica forniscono dunque adeguati strumenti
scientifici per individuare nuovi ceppi autoctoni (Ayoub, 2006,
Baleiras Couto, 1996; Egli, 1998; Pretorius, 2000; Ciani, 2004) le cui
proprietà tecnologiche e metaboliche hanno già consentito il
miglioramento qualitativo del vino e la salvaguardia delle popo-
lazioni autoctone in alcune regioni italiane, quali il Veneto (Ciani,        13

1997; Torriani, 1999; Zilio, 2000; Bocca, 2004; Zilio, 2004), le Marche
(Guerra, 1999), la Toscana (Rosi,1998) e la Sicilia (Giudici, 1997).
I parametri analitici adottati per la selezione di ceppi enologici
di lievito fra quelli di nuovo isolamento sono stati ampiamente
descritti (Giudici e Zambonelli, 1992; Steger e Lambrechts, 2000;
Masneuf , 2003; Cavazza, 2006) per gli aspetti metabolici (vigore
fermentativo, completezza della fermentazione degli zuccheri,
resa in alcol, metabolismo dell’acido malico, formazione di com-
posti secondari della fermentazione, metabolismi degli ammino-
acidi, dei grassi e dei fenoli) e tecnologici generali (tolleranza
all’alcol e al biossido di zolfo, criotolleranza, produzione/sensibi-
lità al “fattore killer”) o specifici per l’impiego nella spumantiz-
zazione (attitudine alla flocculazione, potere schiumogeno, ca-
pacità autolitica). Tuttavia, solo valutando il comportamento del
ceppo in vinificazione è possibile garantire che il vino possa trarre
giovamento dal nuovo agente biologico fermentativo ritrovato
(Rosi, 2005). Pertanto l’introduzione di una valutazione sensoriale
di vinificazioni e spumantizzazioni ad-hoc rappresenta un fattore
determinante per una conclusione positiva ed efficace in questo
ambito di ricerca.
   Allo stato delle conoscenze non sono noti studi di selezione di
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…


     Saccharomyces autoctoni per la produzione di spumante lom-
     bardi benché questi prodotti rappresentino in Italia una quota di
     mercato preponderante tra le D.O.G.C. Anche lavori sperimen-
     tali riguardanti la condizione e lo stato degli acidi nucleici nei
     vini e in generale nelle matrici enologiche (Savazzini e Martinelli,
     2006; Vigentini, 2007), non sono numerosi sebbene tali molecole
     costituiscano un interessante componente biologica, assai utile
     per il riconoscimento delle specie. Il caso specifico dello spuman-
     te fatto con metodo classico rappresenta un ottimo modello per
     l’applicazione di sistemi di tracciabilità che sfruttano la presen-
     za ed il ruolo dei microrganismi nel processo produttivo. Infatti
     poiché la rifermentazione avviene in bottiglia, e cioè nell’ultimo
     contenitore ermetico che non subisce ulteriori trattamenti tecno-
     logici, è assai probabile che il DNA sia presente nelle poche cel-
     lule residue o sia fuoriuscito nel mezzo in seguito alla lisi cellulare,
     rimanendo nel prodotto finito in quantità e qualità utili per l’ese-
     cuzione di saggi molecolari. L’idea originale di questo program-
14   ma di ricerca è quella di sfruttare questa frazione di acidi nucleici
     come marcatori molecolari per individuare il ceppo rifermentan-
     te e indirettamente “tracciare” le produzioni.
        Infine si ricorda come il dibattito sui lieviti autoctoni è tuttora
     aperto e che, in ogni caso, la messa a punto di protocolli analiti-
     ci per l’individuazione accurata di ceppi costituenti le comunità
     microbiche che intervengono nel processo fermentativo, costitu-
     isce il presupposto metodologico per la dimostrazione oggettiva
     di un eventuale legame esistente tra prodotto e territorio.


     1.3 Obiettivi del progetto e risultati attesi

        Il progetto si è prefisso i seguenti obiettivi:
     •	 isolare, caratterizzare e conservare in maniera stabile i ceppi di
        Saccharomyces “ecotipi-specifici” delle zone vitivinicole della
        Lombardia vocate alla produzione di spumanti;
     •	 identificare, fra i ceppi riconosciuti come autoctoni sia dell’a-
        rea Franciacorta che dell’area Oltrepò, quelli con adeguata
        attitudine alla vinificazione e spumantizzazione sulla base di
        caratteristiche tecnologiche ed aromatiche;
     •	 formulare starter di rifermentazione con ceppi autoctoni, re-
Capitolo 1. Analisi dei fabbisogni, stato dell’arte e obiettivi


   lativi a ciascuna area di produzione, la cui idoneità sia stata
   validata mediante vinificazioni e spumantizzazioni secondo la
   prassi produttiva prevista dai rispettivi disciplinari di produzione
   di Franciacorta ed Oltrepò Pavese;
•	 definire protocolli di estrazione ed amplificazione del DNA fun-
   gino da spumante per l’identificazione delle specie ed even-
   tuale riconoscimento del ceppo utilizzato in rifermentazione.

   I risultati attesi dall’esecuzione del progetto sono stati rispettati;
in particolare sono stati ottenuti i seguenti prodotti:
•	 Allestimento e disponibilità di una collezione di ceppi autoc-
   toni lombardi a vocazione enologica. Le colture sono conser-
   vate allo stato congelato presso il DeFENS dell’Università degli
   Studi di Milano.
•	 Preparazione di starter costituiti da colture di lieviti autoctoni da
   impiegare per i vini spumanti. La formulazione dello starter è un
   punto chiave per la fase di rifermentazione in bottiglia poiché
   le cellule del lievito inserite nel liqueur de tirage sono gli agenti     15

   biologici per l’ottenimento di profili aromatici nuovi e peculiari
   nonché costituiranno il materiale bersaglio per l’applicazione
   delle tecniche molecolari utili alla verifica della tracciabilità.
   Sono state preparate otto differenti colture starter, quattro per
   ciascuna area di produzione, Franciacorta e Oltrepò Pavese.
•	 Produzione, affinamento e valutazione sensoriale di vino speri-
   mentale prodotto con spumantizzazioni in scala ridotta per la
   verifica della performance delle colture starter sopra citate.
   La produzione dello spumante è stata realizzata presso otto
   strutture produttive, cinque per il Consorzio per la Tutela del
   Franciacorta e tre per il Consorzio Tutela Vini Oltrepò Pavese.
   Sono state previste diverse sedute di degustazione a differenti
   età del prodotto in affinamento, organizzate dai Consorzi e re-
   alizzate da panel di assaggiatori esperti.
•	 Protocollo sperimentale per l’estrazione ed amplificazione di
   DNA da vino spumante e riconoscimento della specie utilizza-
   ta in rifermentazione. L’idea era quella di realizzare un meto-
   do che potesse impiegarsi come strumento per identificare il/i
   ceppo/i impiegato/i in rifermentazione e dunque per verificare
   la presenza di un elemento oggettivo al fine di garantire il mar-
   chio di denominazione.
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…


     •	 Attività di divulgazione tecnica e scientifica attraverso pubbli-
        cazioni su riviste di settore a livello nazionale e internazionale,
        siti internet, per l’aumento delle conoscenze in enologia, ed
        ecologia microbica e a tutela della fruibilità universale dei risul-
        tati. Organizzazione di un convegno al termine della sperimen-
        tazione atto a divulgare i risultati del progetto presso le imprese
        della Regione, gli enologi, i tecnici dei servizi agricoli regionali
        al fine di diffondere l’innovazione introdotta.

        I destinatari diretti dei risultati sono gli operatori della filiera
     enologica in Lombardia, con particolare riguardo ai produtto-
     ri di D.O.C.G. Franciacorta e D.O.C.G. Oltrepò Pavese Metodo
     Classico, per i quali l’innovazione tecnologica adottata potreb-
     be comportare un vantaggio competitivo in termini di migliora-
     mento qualitativo e raggiungimento dell’evidenza di una relazio-
     ne diretta tra prodotto finito e territorio, fattori determinanti per il
     successo commerciale del prodotto.
16      Altri destinatari potranno essere le aziende di produzione di fer-
     menti per l’industria enologica, anch’esse diffusamente presenti
     in Lombardia, qualora si assumano l’incarico di rendere dispo-
     nibili commercialmente le formulazioni di starter prodotte dalla
     ricerca, previo accordo con i partner del progetto.
        I destinatari indiretti sono i consumatori finali del vino e più in
     generale il sistema economico regionale che si avvantaggia nel
     fornire al mercato prodotti tipici e di qualità superiore con riper-
     cussioni positive anche nel comparto turistico.
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese




Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti
enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese


2.1 Introduzione

   Nel corso di una vinificazione sono molteplici i fattori che posso-
no influenzare la qualità del vino; tra questi, la gestione del vigne-
to, le tecniche enologiche e le specie di lievito utilizzate (Ciani,
2009). In particolare, per quanto riguarda l’aspetto microbiologi-
co, oggigiorno vi è un notevole interesse a migliorare la cono-                             17

scenza di base riguardante la biodiversità dei lieviti a vocazione
enologica che possono propagarsi durante la fermentazione al-
colica (Agnolucci, 2007; Cappello, 2004; Guerra, 1999; Mercado,
2007; Vilanova, 2003). I lieviti vinari vengono classificati tra gli asco-
miceti (Tabella 2.1) e comprendono sia i lieviti sporigeni capaci di
formare meiospore (teleomorfici) che i lieviti asporigeni (anamorfi-
ci), di cui non si conosce la fase sessuata. Saccharomyces cerevi-
siae, sebbene rappresenti l’attore principale della fermentazione
alcolica, non è l’unica specie riscontrata in vinificazione; infatti
le principali forme di interesse enologico si ricordano quelle ap-
partenenti ai generi: Candida (C. stellata, C. vini), Debaryomyces
(D. hansenii, Candida famata), Dekkera (D. anomala, D. bruxel-
lensis, B. bruxellensis), Issatchenkia (I. orientalis, I.terricola, Candida
krusei), Hanseniaspora (H. uvarum, K. apiculata), Kluyveromyces
(K. lactis, K. marxianus), Metschnikowia (M. pulcherrima, Candida
pulcherrima), Pichia (P. anomala, P. fermentans, Candida pelli-
culosa, C. valida) Saccharomyces (S. bayanus, S. cerevisiae, S.
paradoxus, S. pastorianus, Candida robusta), Saccharomycodes
(S. ludwigii) Schizosaccharomyces (S. pombe), Torulaspora (T.
delbrueckii, Candida colliculosa), Zygosaccharomyces (Z. bailii).
Quando si parla di “biodiversità” bisogna tener presente che essa
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…

     può riguardare sia la “biodiversità interspecifica”, che comporta
     lo studio dell’ecologia dei microrganismi a livello di specie, che la
     “biodiversità intraspecifica”, dedicata al riconoscimento dei diver-
     si ceppi microbici appartenenti alla medesima specie. La compo-
     sizione della popolazione di lieviti associata ad un ambiente eno-
     logico può variare notevolmente a causa di diversi fattori quali, le
     condizioni climatiche, la varietà d’uva e la posizione geografica
     (Guillamon, 1996; Martinez, 2007). In particolare, la valutazione
     della biodiversità inter-specifica dei lieviti è rilevante per compren-
     dere l’evoluzione nel processo di vinificazione e di conseguenza
     aumentare la capacità di controllo del processo fermentativo.


                                       Divisione Ascomycota

               Classe: Archiascomycetes
               Ordine: Schizosaccharomycetales
               Famiglia: Schizosaccharomycetaceae              Genere:
                                                               Schizosaccharomyces
18



               Classe: Hemiascomycetes                         Genere:
               Ordine: Saccharomycetales                       Metschnikowia
               Famiglia: Metschnikowiaceae

               Famiglia: Saccharomycetaceae                    Genere:
                                                               Debaryomyces
                                                               Dekkera
                                                               Issatchenkia
                                                               Kluyveromyces
                                                               Pichia
                                                               Saccharomyces
                                                               Torulaspora
                                                               Zygosaccharomyces

               Famiglia: Saccharomycodaceae                    Genere:
                                                               Hanseniaspora
                                                               Saccharomycodes

               Famiglia: Candidaceae                           Genere:
                                                               Brettanomyces
                                                               Candida
                                                               Kloeckera



     Tabella 2.1 I lieviti di interesse enologico (Kurtzman e Fell, 1998).
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese


   Lo sviluppo ed il miglioramento delle tecniche di biologia mo-
lecolare hanno contribuito in modo significativo allo studio della
biodiversità e delle caratteristiche genetiche dei lieviti. Attual-
mente, le sequenze di DNA che vengono analizzate per l’identi-
ficazione dei lieviti vinari sono sequenze geniche o intergeniche
soggette a polimorfismi di lunghezza o di sequenza. Tra le tecni-
che utilizzate vi sono:
•	 Amplificazione degli spaziatori interni trascritti (Internal Transcri-
   bed Spacers, ITS) del DNA ribosomiale (rDNA);
•	 Analisi RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) degli
   ITS (PCR-RFLP);
•	 Analisi della sequenza dei domini D1/D2 del 26S rDNA.
•	 Il DNA ribosomiale (rDNA) rappresenta un target ideale per l’i-
   dentificazione molecolare di una vasta gamma di organismi; il
   processo evolutivo che lo caratterizza è relativamente lento e
   consente la presenza al suo interno sia di sequenze altamente
   conservate, anche in specie molto diverse, sia di sequenze va-
   riabili, utili per confrontare specie più strettamente correlate. In-                    19

   dividui della stessa specie si caratterizzano per una sostanziale
   identità di sequenza dell’rDNA (limitato polimorfismo intraspe-
   cifico) mentre individui appartenenti a specie diverse presen-
   tano un’identità di sequenza tanto minore quanto maggiore è
   la loro distanza evolutiva (elevato polimorfismo interspecifico).
   In S. cerevisiae, l’rDNA è localizzato sul XII° cromosoma, dove
   sono presenti fino a circa 120 unità ripetute ciascuna costituita
   da quattro differenti geni: 18S, 5,8S, 26S e 5S. Le sequenze 18S
   e 26S sono separate dalla sequenza 5,8S dagli spaziatori interni
   trascritti (Internal Transcribed Spacers, ITS) come si può osserva-
   re in Figura 2.1 (Vincenzini, 2005).




              Figura 1.8 Rappresentazione schematica di un’unità di DNA ribosomiale
Figura 2.1 Rappresentazione schematica di un’unità di DNA ribosomiale di lievito (Vin-
cenzini, 2005).
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…


        L’analisi PCR-RFLP degli ITS impiega dei primers disegnati sulla
     porzione 5’ del 18S rDNA e sulla porzione 3’ del 26S rDNA. Que-
     sti oligonucleotidi sono quindi disegnati su sequenze altamente
     conservate ed esterne alle regioni ITS variabili. Quest’ultima ca-
     ratteristica li rende universali, ossia consente il loro allineamento
     sul DNA stampo ad un numero elevato di specie. Il confronto dei
     prodotti di PCR, differenti tra le diverse specie per lunghezza e/o
     sequenza ne permette l’identificazione. Gli ampliconi possono
     essere lunghi da un minimo di 380 bp in Yarrowia lipolytica e Pi-
     chia pastoris ed un massimo di 1050 bp in Schizosaccharomyces
     pombe (Esteve- Zarzoso, 1999). Tuttavia, due o più specie
     possono essere caratterizzate da prodotti di amplificazione della
     medesima lunghezza ma di diversa sequenza; in questo caso il
     metodo prevede che gli amplificati vengano digeriti con enzimi
     di restrizione quali CfoI, HaeIII e HinfI che riconoscono sequen-
     ze specifiche sul DNA bersaglio e generano profili di restrizione
     caratteristici per ogni specie di lievito. Per accertare l’apparte-
20   nenza ad una specie nel caso in cui la restrizione delle ITS non
     sia sufficiente ci si avvale del sequenziamento del dominio D1/
     D2 del gene 26S rDNA. Questa sequenza, che misura circa 600
     bp, viene riconosciuta come il principale bersaglio per l’identifi-
     cazione di quasi tutti gli ascomiceti attualmente noti (Kurtzman e
     Robnett, 1998). Il sequenziamento di questa regione e la compa-
     razione della sequenza ottenuta con quelle disponibili in banche
     dati (GenBank o EMBL), mediante l’impiego gratuito on-line di
     algoritmi specifici (Basic Local Alignment Search Tool), consento-
     no l’attribuzione della specie al ceppo indagato. Secondo un’o-
     pinione correntemente accettata, differenze in più di sei basi su
     600 indicano che i lieviti confrontati non appartengono alla stes-
     sa specie (Vincenzini, 2005).
        Sebbene ad oggi la ricerca scientifica si è concentrata princi-
     palmente sul controllo della fermentazione alcolica, molti lavo-
     ri affrontano lo studio dell’ecologia di lieviti sulle uve, sul mosto
     e anche nell’aria della cantina. In particolare, è stato eviden-
     ziato che il succo d’uva appena pressato ospita un’ampia va-
     rietà di specie di lieviti, soprattutto del genere Hanseniaspora,
     Pichia, Candida, Metschnikowia e Kluyveromyces. Di tanto in
     tanto, specie di altri generi come Cryptococcus, Rhodotorula,
     Debaryomyces, Issatchenkia, Zygosaccharomyces, Saccha-
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese


romycodes, Torulaspora, Dekkera, Schizosaccharomyces e Sac-
charomyces sono stati isolati dalle uve (Jolly, 2006; Fleet, 2003,
2008; Prakitchaiwattana, 2004; Ribéreau-Gayon, 2000). Una fer-
mentazione spontanea si caratterizza per la crescita di differenti
specie di lievito che provengono dall’uva. Infatti, analisi micro-
biologiche sulla flora dei lieviti associate a fermentazioni spon-
tanee hanno permesso di stabilire che nella maggior parte dei
casi avviene un sequenziale uso del substrato: inizialmente i lieviti
presenti in numero maggiore sono gli apiculati (Hanseniaspora
e Kloeckera), che, dopo tre-quattro giorni lasceranno il posto a
S. cerevisiae (Martini, 1996; Pretorius, 2000). Il metabolismo di S.
cerevisiae porta ad un accumulo di sostanze come etanolo, aci-
di grassi a media catena e acetaldeide, che inibiscono le altre
specie (Edwards, 1990; Bisson, 1999; Ludovico, 2001; Fleet, 2003).
L’utilizzo di colture starter è un fattore fondamentale per la con-
duzione di una fermentazione controllata e per l’inibizione dei
lieviti indigeni. Tuttavia, diversi studi degli ultimi venticinque anni
dimostrano che la crescita di K. apiculata e C. stellata non sono                           21

completamente inibite nel corso di una fermentazione inoculata
con culture starter (Heard e Fleet, 1985; Martinez, 1989). Infine,
Garijo et al. (2008) hanno studiato la presenza di microrganismi
di interesse enologico (lieviti, batteri e muffe) e la loro evoluzio-
ne in aria di una cantina. In questo studio i lieviti isolati dall’aria
appartenevano sia al genere Saccharomyces che al gruppo dei
non-Saccharomyces.
   Il presente lavoro ha valutato la biodiversità dei lieviti coinvolti
nel processo di produzione di vino spumante in Franciacorta ed
Oltrepò Pavese durante le annate 2009, 2010 e 2011, dall’aria
del vigneto, da mosto allo sgrondo (prima dell’aggiunta di SO2)
e in vino base. Le caratteristiche dei lieviti selezionati per l’otte-
nimento di un vino base spumante non differiscono da quelle
dei lieviti utilizzati per la vinificazione di altri vini. Tuttavia, ceppi
particolari possono essere selezionati e utilizzati per esaltare ca-
ratteristiche aromatiche attraverso la scelta di specifiche attività
enzimatiche. I lieviti utilizzati per la produzione di spumanti otte-
nuti secondo il Metodo Classico devono però possedere uno svi-
luppo di tipo flocculante e capacità di autolisarsi. La floccula-
zione è un processo di auto-aggregazione tra le cellule di lievito
che porta alla formazione di masse multicellulari (fiocchi), che
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…


     sedimentano velocemente nei mezzi liquidi in cui sono sospese o
     galleggiano (“flottano”), a seconda delle dimensioni e della for-
     ma del fiocco. Lo sviluppo in aggregati accelera la separazione
     spontanea delle due fasi, per questo è preferibile utilizzare lieviti
     flocculanti per la rifermentazione in bottiglia: in questo modo le
     cellule depositandosi e non disperdendosi, sono più facilmen-
     te eliminate durante la seconda fermentazione e nella fase di
     sboccatura o dégorgement. La capacità delle cellule di autoli-
     sare e la conseguente liberazione nel vino di mannoproteine e
     acidi grassi è fondamentale sia per il conferimento di specifiche
     peculiarità sensoriali, sia per la stabilità proteica e anche per le
     caratteristiche del “perlage” (Vincenzini, 2005).


     2.2 Materiali e Metodi

     2.2.1 Campionamento e tecniche colturali
22      Lo studio è stato condotto durante le vendemmie 2009, 2010 e
     2011 nei territori vitivinicoli lombardi di Franciacorta (Brescia) ed
     Oltrepò Pavese (Pavia). Per ogni anno, i campionamenti sono
     avvenuti nel mese di Luglio, Agosto ed Ottobre in corrispondenza
     con l’inizio della invaiatura dell’uva, il tempo della vendemmia e
     la produzione del vino base. Il piano di campionamento ha coin-
     volto: 13 vigneti e 8 cantine per la Franciacorta, e 11 vigneti e 11
     cantine per l’Oltrepò Pavese.

     Campionamento dell’aria
        I campionamenti dell’aria sono stati realizzati durante il mese
     di Luglio e/o comunque quando il processo di invaiatura, con il
     quale inizia la maturazione delle bacche, era già abbastanza
     avanzato. Si ricordi che gli insetti sono i principali vettori di funghi.
     I campionamenti sono stati effettuati tramite l’utilizzo del cam-
     pionatore d’aria “SAS SUPER IAQ”, (Figura 2.2) con cui è possibile
     eseguire prove di tipo microbiologico, essendo dotato di suppor-
     to per piastra Petri.
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese




Figura 2.2 Air Sampler “MAS 100 Eco” di VWR International utilizzato per il campiona-
mento.



   La piastra viene posta nell’apposito supporto, priva di coper-
chio, con il terreno colturale rivolto verso la parte forata dell’ap-
parecchio. Da quest’ultima, costruita in acciaio e disinfettata
prima di ciascun campionamento con alcol etilico, si effettua l’a-
spirazione dell’aria che andrà ad impattare, con quanto in essa
eventualmente disperso (microrganismi, spore) sul terreno nutriti-                          23

vo della piastra. Questo campionatore permette il prelevamen-
to di precisi volumi, quindi l’ottenimento di risultati non soltanto
qualitativi, ma anche quantitativi. Durante il campionamento lo
strumento veniva trasportato manualmente tra i filari mantenen-
dolo ad una distanza di circa 30 cm dalle piante e di 1-1,20 m
dal suolo (in corrispondenza dei grappoli). Per ogni anno, gli stessi
vigneti (tredici in Franciacorta e undici in Oltrepò Pavese) sono
stati analizzati e, in ogni vigneto, due aliquote da 100 e 500 litri
di aria ciascuno, replicate per due volte sono stati raccolti per le
successive analisi microbiologiche. L’isolamento dei lieviti è stato
effettuato utilizzando il terreno colturale YEPD [1% (w/v) Estratto di
lievito, 2% (w/v) Peptone, 2% (w/v) Glucosio] addizionato con 2%
agar e modificato nelle seguenti caratteristiche: pH 3,6, 200 mg/L
K2S2O5 e 100 mg/L cloramfenicolo. Le piastre, ottenute dal cam-
pionamento dell’aria, sono state incubate a 25°C in condizioni
anaerobiche (Microbiologie Anaerocult®A; Merck, Darmstadt,
Germania) per 5 giorni. Questa modifica è stata effettuata per
evitare la crescita di muffe.
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…


     Campionamento del mosto
        Il campionamento del mosto è stato eseguito a partire da metà
     del mese di Agosto, ed è proseguito fino ai primi giorni del mese
     successivo, in funzione dei diversi tempi di raccolta. I campioni
     sono stati prelevati, quando possibile, direttamente dalla pressa
     con l’ausilio di pipette sterili, altrimenti dalle vasche di raccolta
     poco dopo la pressatura, in entrambi i casi sempre prima che ve-
     nisse effettuato qualsiasi tipo di trattamento, solfitazione in parti-
     colare. Le aliquote prelevate, due da 50 mL ciascuna, sono state
     conservate in beute sterili e mantenute a 2-4°C fino al momento
     dell’analisi. Queste beute erano dotate di un tappo in silicone
     forato per permettere l’inserimento di un puntale, sterile e dotato
     di filtro a porosità 0,22 μm, al fine di consentire lo scambio gasso-
     so (liberazione della CO2 eventualmente formatasi in caso di fer-
     mentazione della matrice) mantenendo le condizioni di sterilità,
     quindi impedendo la contaminazione da parte di microrganismi
     esterni. I campioni di mosto sono quindi stati opportunamente
24   diluiti e piastrati su una piastra precedentemente preparata con
     terreno Wallerstein Laboratory Nutrient Agar (WL) (Merck, Ger-
     mania). Le analisi sono state eseguite in doppio. Successivamen-
     te un’aliquota di mosto (5 mL) è stata prelevata e trasferita in una
     beuta contenente 45 mL di brodo “YEPD selettivo” e l’insieme è
     stato messo ad incubare ad una temperatura di 25°C per 72-96
     h in aerobiosi.

     Campionamento del vino base
        Il campionamento del vino base è stato eseguito approssimati-
     vamente verso la seconda metà del mese di Ottobre; il prodotto
     è stato prelevato (per ciascun campione sono state acquisite due
     aliquote da 10 mL ognuna) dalle vasche nelle quali ha fermenta-
     to ed è stato trasferito in provette sterili con tappo a vite per poter
     essere trasportato, previa refrigerazione e mantenimento a 2-4°C.
     Da ogni campione è stata allestita una serie di opportune dilui-
     zioni decimali in acqua peptonata che sono poi state piastrate
     su agar WL e messe ad incubare a 25°C per 72-96 h in aerobiosi.

     Conta in piastra
        I campioni di mosto e vino base sono stati opportunamente
     diluiti con acqua peptonata e 0,1 mL delle diluizioni sono stati se-
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese




minati, per spatolamento, in piastre contenenti terreno agar WL.
Le piastre sono state poi messe ad incubare a 25° C per 72-96 h
per permettere il completo sviluppo delle colonie. Il numero del-
le unità formanti colonia (UFC) si ottiene applicando la formula
della media ponderale:

                                                  ∑c
                UFC/mL =
                                       ( 1 x n1 + 0.1 x n2) x d1


  dove:
  c: numero di colonie delle piastre contabili;
  n1: numero di piastre della prima diluizione considerata contabile;
  n2: numero di piastre della seconda diluizione considerata con-
tabile;
  d1: fattore di diluizione relativo alla prima diluizione considerata                      25

contabile;
  Si considerano contabili le piastre che presentano tra 10 e 300
UFC.

Allestimento della collezione di lievito
   Dopo un un primo striscio della colonia interessata e succes-
siva incubazione a 25°C per 3 giorni, si è effettuato un secon-
do striscio per assicurarsi della purezza della coltura e succes-
siva incubazione a 25°C per 3 giorni. Tutti gli isolati così ottenuti
sono allora stati preparati per la conservazione in modo stabi-
le a -80°C inoculando una colonia isolata dal secondo striscio
in brodo YEPD a 25°C per 48-72 h. Verificata l’uniformità delle
colonie e l’assenza di contaminazione al microscopio, e quindi
l’effettiva purezza della coltura, si è centrifugato a 3500 g per 15
minuti (Hettich Zentrifugen, rotina 380r), eliminato il surnatante,
risospeso con brodo YEPD addizionato con 20% (v/v) di glice-
rolo. Si è quindi in ultimo distribuito in provette e conservate a
-80°C.
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…


     2.2.2 Tecniche molecolari

     Estrazione del DNA genomico
         Il protocollo per l’estrazione degli acidi nucleici da lievito utiliz-
     zato in questo lavoro è stato quello proposto da Querol (1992). In
     breve, le cellule sono state coltivate overnight in YEPD aggiunto
     di 0,1 g/Ll di cloramfenicolo. La coltura è stata centrifugata a
     3500 rpm (Zentrifugen Hettich, Rotina 380r, Germania) per 15 min.
     Il pellet è stato sospeso in 500 μL di una soluzione contenente 0,9
     M sorbitolo-EDTA 0,1 M, pH 7,5 a cui sono stati aggiunti 500 mg/
     mL di zymolyase 100T (USBiological, USA) e 14mM ß-mercapto-
     etanolo. Le provette sono state incubate a 37°C per 60 min per
     lisare la parete cellulare. Gli sferoplasti così ottenuti sono stati
     centrifugati a 3500 g (Hettich Zentrifugen, Mikro 200, Germania)
     per 15 min e il pellet è stato sospeso in 0,5 mL di Tris-HCl 0,05 M,
     0,02M EDTA pH 7,5. Dopo risospensione, 0,05 mL di sodio dodecil
     solfato (SDS) al 10% stato aggiunto e la miscela è stata incubata
26   a 65°C per 30 min. Subito dopo, 0,2 mL di acetato di potassio 5
     M è stato aggiunto e le provette sono state poste in ghiaccio
     per 30 min. Il lisato è stato quindi centrifugato a 14000 g in una
     per 5 min. I surnatanti sono stati trasferiti in provette nuove ed il
     DNA è stato precipitato mediante aggiunta di 1 volume di iso-
     propanolo. Le provette sono state nuovamente centrifugate a
     14000 g per 10 min. Il DNA è stato lavato con etanolo al 70%, e
     poi centrifugato a 14000 g per 5 min. Il pellet è stato essiccato a
     50°C per 15 min, dissolto in 50 μL di TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA,
     pH 7,5) e mantenuto a 4°C per 12 h. L’estratto è stato trattato
     con 0,5 mg/mL RNasi (Fermentas, Lituania) a 37°C per 30 min.
     Infine, il DNA è stato conservato a -20°C. La concentrazione e
     la purezza di DNA è stata determinata misurando l’A260nm e
     l’A280nm.

     Amplificazione delle regione ribosomiale ITS1-5.8S-ITS2
        L’amplificazione degli spaziatori interni (Internal Transcribed
     Spacer) compresi tra i geni 18S e 26S rDNA (ITS1-5.8S-ITS2) è stata
     eseguita in una miscela di 25 μL di reazione contenente: 1X di
     tampone (5 Prime, Amburgo), 2,5 mM di MgCl2 (5 Prime, Ambur-
     go), 200 mM di dNTPs (Fermentas, Lituania), 0,5 μM dei primers
     ITSL1 (5’GTTTCCGTAGGTGAACCTGC3’) e ITSL2 (5’ ATATGCTTA-
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese


AGTTCAGCGG-GT 3’) (Montrocher, 1998), 2 U di Taq DNA poli-
merasi (5 Prime, Amburgo) e 80 ng di DNA. Dopo una fase iniziale
di denaturazione del DNA a 95°C per 5 min, sul termociclatore
(Eppendorf,) è stato impostato il seguente ciclo termico che
veniva ripetuto per 35 cicli: denaturazione del DNA a 95°C per
5 min, appaiamento a 50°C per 1 min, estensione della doppia
elica di DNA a 72°C per 1 min. Al termine dell’amplificazione è
stata effettuata una fase di estensione finale a 72°C per 5 min
al fine di permettere alla polimerasi di terminare le reazioni. Gli
amplificati sono quindi stati controllati in elettroforesi su gel di
agarosio 1% (w/v) in tampone TAE 1X (40 mM Tris-acetato, pH
8,2, 1 mM EDTA), 0,4 μg/mL di bromuro di etidio. Le immagini
sono state acquisite con un transilluminatore UV GelDoc (Bio-
Rad, Hercules, CA, USA).

Analisi di restrizione delle ITS (ITS-RFLP)
   Successivamente, i prodotti di PCR sono stati sottoposti ad
analisi di restrizione al fine di valutare i possibili polimorfismi ge-                     27

netici (ITS-RFLP). Il protocollo utilizzato è stato quello descritto da
Esteve-Zarzoso (1999) dove l’enzima CfoI è stato sostituito dall’i-
soenzima di restrizione Hin6I (Fermentas, Lituania). I profili di re-
strizione sono stati separati e visualizzati su gel di agarosio 1,5%
(w/v) in tampone TAE 1X, 0,4 μg/mL di bromuro di etidio. Gli isolati
che mostravano lo stesso profilo genetico sono stati raggruppati
e circa il 10% di isolati di ogni cluster è stato sottoposto ad ampli-
ficazione e parziale sequenziamento del dominio D1/D2 del 26S
rDNA.

Analisi di sequenza del dominio D1/D2 del 26S rDNA
   Le reazioni di amplificazione sono state effettuate in una mi-
scela di 25 μL contenente 1X tampone (5 Prime, Amburgo), 2,5
mM di MgCl2 (5 Prime, Amburgo), 200 mM di dNTPs (Fermentas,
Lituania), 0,1μM dei primers NL1 (5’GCATATCAATAAG-CGGAG-
GAAAAG3’) e NL4 (5’GGTCCGTGTTTCAAGACGG3’) (Kurtzman,
1998), 2 U di Taq DNA polimerasi (5 Prime, Amburgo) e 80 ng di
DNA. Dopo la fase di denaturazione iniziale a 94°C per 5 min, il
profilo di temperatura è stato ripetuto per 35 cicli: denaturazio-
ne a 94°C per 1 min, appaiamento a 52°C per 1 min, ed esten-
sione a 72°C per 2 min. Al termine dell’amplificazione è stata ef-
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…


     fettuata una fase di estensione finale a 72°C per 5 min. I prodotti
     di amplificazione sono stati controllati tramite elettroforesi in gel
     di agarosio 1.0% (w/v), in tampone di TAE 1X, 0,4 μg/mL di bro-
     muro di etidio e visualizzati con un transilluminatore UV GelDoc
     (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). I prodotti di PCR sono quindi stati
     sottoposti a sequenziamento (Primm srl Milano, Italia) e le strin-
     ghe nucleotidiche sono state confrontate mediante algoritmo
     BLAST con le sequenze parziali del 26 rDNA delle specie depo-
     sitate nei databases dell’NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
     L’attribuzione di un microrganismo ad una specie tiene in consi-
     derazione due percentuali risultanti dal confronto: la copertura
     e l’identità. Quando questi parametri sono pari o superiori al
     97% può avvenire il riconoscimento a livello di specie.

     Discriminazione tra le specie S. cerevisiae, S. bayanus e S. pasto-
     rianus
        Un’ulteriore analisi è stata condotta su tutti gli isolati di lievito
28   identificati come appartenenti alla specie S. cerevisiae tramite
     l’impego delle tecniche ITS-RFLP e l’analisi della sequenza del
     gene 26S rDNA. Questa attività si è resa necessaria in quanto
     queste tecniche potrebbero erroneamente classificare come S.
     cerevisiae alcuni isolati invece appartenenti alla specie S. ba-
     yanus o S. pastorianus. Infatti, essendo queste specie filogene-
     ticamente molto vicine a S. cerevisiae e comprese nel gruppo
     dei S. cerevisiae sensu stricto, esse mostrano caratteristiche me-
     taboliche tali da permettere loro la crescita e sopravvivenza in
     vino. Per l’amplificazione sono stati utilizzati i primers costruiti sul
     gene HO e descritti da De Melo Pereira (2010). La singola colo-
     nia è stata dissolta direttamente nella miscela di reazione ed è
     stato effettuato un trattamento di rottura cellulare a 95°C per
     30 min. La reazione di PCR per la discriminazione di S. cerevi-
     siae da S. pastorianus è stata condotta in una miscela di 25 μL
     contenente 1X tampone (5 Prime, Amburgo), 2,5 mM di MgCl2
     (5 Prime, Amburgo), 200 μM di dNTPs (Fermentas, Lituania), 0,5
     μM dei primers ScHO-F (5’GTTAGATCCCAGGCGTAGAACAG3’)
     e ScHO-R (5’GCGAGTACTGGACCAAATCTTATG3’), 1 U di Taq-
     DNA polimerasi (5 Prime, Amburgo). Dopo una denaturazione
     iniziale del DNA a 94°C per 5 min, il ciclo termico è stato ripe-
     tuto per 35 cicli e prevedeva: 94°C per 30 sec, 61°C per 30 (S.
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese


cerevisiae)/55°C (S. pastorianus) sec e 72°C per 2 min. Un’ul-
teriore step di estensione finale a 72°C per 7 min è stata effet-
tuata. La reazione di PCR per l’identificazione di S. bayanus è
stata condotta nelle medesime condizioni sopra descritte ma
impiegando i primers LgHO-F (5’TGGAAAGTCTACGAGAACA-
AGCC3’) e LgHO-R (5’CCTCTATGTGAAGTCCGTATACTG3’) con
temperatura di appaiamento a 55°C. L’elettroforesi è stata ese-
guita in 0,8% (p/v) su gel di agarosio in TAE 1X tampone trattata
con 0,4 ug/mL di bromuro di etidio. I prodotti di PCR sono stati
fotografati sotto transilluminatore UV GelDoc (Bio-Rad, Hercules,
CA, USA).


2.3 Risultati e Discussione

2.3.1 Collezione di ceppi di lievito
    Nel corso di questo studio è stato possibile creare una col-
lezione di colture di lievito composta da 493 isolati riscontrati                           29

e coinvolti nel processo di vinificazione nei territori lombardi di
Franciacorta (Brescia) ed Oltrepò Pavese (Pavia) nelle anna-
te 2009, 2010, 2011 e provenienti da aria, mosto e vino base
(Tabella 2.2). Attualmente, questi lieviti sono conservati a -80°C
presso i laboratori del Dipartimento di Scienze per gli Alimenti,
la Nutrizione e l’Ambiente (DeFENS) dell’Università degli Studi di
Milano.
    I risultati riguardanti il campionamento dell’aria del vigneto
hanno mostrato che, sebbene il prelievo sia stato effettuato du-
rante la maturazione dell’uva quando la circolazione degli inset-
ti in vigneto era presente e assai favorita dalle condizioni clima-
tiche, le percentuali di isolamento raggiungevano valori molto
bassi e compresi tra 0-2% per entrambi i territori analizzati. Il cam-
pionamento dell’aria presso i vigneti non trova molti precedenti
in bibliografia: un recente lavoro svolto nella regione spagnola
della Rioja nel 2006 ha previsto, tra gli altri, il campionamento di
aria per verificare la presenza di lieviti batteri e muffe, ma all’in-
terno della cantina. Nel lavoro citato è stata rilevata la presenza
di molte muffe mentre lieviti e batteri in minore quantità e non
prima dell’inizio della prima fermentazione alcolica e malolatti-
ca, rispettivamente (Garijo, 2008).
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…

            Vendemmia e Origine         Numero di isolati       Percentuale di isola-
                                                                      mento
                     2009                      178                      36%
                 Franciacorta                   95                      19%
                     ARIA                       8                        2%
                    MOSTO                       39                       8%
                  VINO BASE                     48                      10%
                Oltrepò Pavese                  83                      17%
                     ARIA                       9                        2%
                    MOSTO                       22                       4%
                  VINO BASE                     52                      11%
                     2010                      186                      38%
                 Franciacorta                  112                      23%
                    MOSTO                       91                      18%
                  VINO BASE                     21                       4%
                Oltrepò Pavese                  74                      15%
                     ARIA                       3                        1%
30                  MOSTO                       56                      11%
                  VINO BASE                     15                       3%
                     2011                      129                      26%
                 Franciacorta                   58                      12%
                    MOSTO                       35                       7%
                  VINO BASE                     23                       5%
                Oltrepò Pavese                  71                      14%
                     ARIA                       6                        1%
                    MOSTO                       42                       9%
                  VINO BASE                     23                       4%
                     Totale                    493                      100%

     Tabella 2.2 Lieviti isolati nel corso di 3 annate in Franciacorta (FCR) ed Oltrepò Pavese
     (OLT).



        I campioni di mosto sono stati raccolti allo sgrondo e prima
     dell’aggiunta di solforosa. Questi criteri sono stati adottati al fine
     di valutare la biodiversità interspecifica dei lieviti presenti sui due
     territori. Perché l’isolamento fosse rappresentativo del microbiota
     presente sull’uva, le colonie di lievito crescite dopo l’incubazione
     sono state isolate previa osservazione microscopica cellulare e
     macroscopica della forma e colore delle colonie. Quest’ultima
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese


operazione era facilitata dall’uso del terreno colturale WL (Wal-
lerstein Laboratory Nutrient Agar) (Green e Grey, 1950) che, sep-
pur non selettivo, consente di ottenere informazioni utili attraverso
le variazioni di colore assunte dalle colonie. Infatti, esso contiene
verde di bromocresolo, un indicatore di pH in grado di mettere in
evidenza la capacità di acidificazione, e quindi le caratteristiche
dei prodotti finali del metabolismo primario, in relazione alle diver-
se specie di lievito (Figura 2.3).




                                                                                            31

Figura 2.3 Tipica morfologia e colorazione delle colonie di S. cerevisiae in crescita su
terreno WL Agar.


   Le maggiori percentuali di isolamento da campioni di mosto
derivano dalla vendemmia 2010 dove è stato raggiunto un va-
lore del 18% per la Franciacorta e del 11% per l’Oltrepò Pavese.
E’ stato invece il 2009 l’anno in cui sono stati raccolti più isolati
da vino base (10% in Franciacorta e 11% in Oltrepò Pavese). Le
colonie riscontrate durante l’isolamento presentavano morfolo-
gie differenti: la forma è risultata generalmente tondeggiante e
la colorazione, per gran parte delle colonie, variava dal bianco,
al bianco a punta verde, al verde chiaro fino al verde scuro. Nel
maggior numero degli isolati l’aspetto era liscio, seppur in qual-
che situazione siano state osservate colonie dall’apparenza rugo-
sa. Alcuni isolati presentavano una consistenza farinosa, mentre
la maggior parte figuravano cremosi. Le colonie di colorazione
rosa-lucide hanno consentito un’identificazione diretta dell’isola-
to come appartenente al genere Rhodotorula. I dati riguardanti
la carica microbica riscontrata dalle piastre di mosto tal quale
indicano una concentrazione che si aggirava mediamente at-
torno alle 105-106 UFC/mL. Il campionamento e l’isolamento di mi-
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…


     crorganismi dal vino base è stato eseguito nel mese di Ottobre.
     Per alcune cantine la percentuale di isolamento è risultata molto
     bassa e la concentrazione cellulare risultava < 103 UFC/mL con
     campioni talvolta intorno a10 UFC/mL. Questo risultato era dovu-
     to al fatto che il prelievo, per ragioni tecniche, veniva realizzato
     dall’alto delle vasche senza agitazione e a fine fermentazione
     alcolica la massa cellulare risultava ormai decantata sul fondo.
        In generale, per quanto riguarda il numero totale di lieviti otte-
     nuti da aria, mosto e vino base, è stata osservata una differenza
     sia temporale (2009, 2010, 2011) che geografica (Franciacorta
     ed Oltrepò Pavese). L’annata 2011 è risultata quella durante la
     quale è stato isolato il minor numero di lieviti (26%), infatti per
     entrambi i territori si è registrata una diminuzione del numero di
     isolati del 10% rispetto al 2009 e del 12% nel 2010. L’area francia-
     cortina ha maggiormente contribuito a questo decremento; in
     particolare, la maggiore diminuzione nel numero di isolamenti è
     stato ottenuta dal campionamento del mosto. La scarsa quan-
32   tità e diversità di isolati di lievito raccolti potrebbe essere stata
     causata dalle negative condizioni meteorologiche che hanno
     caratterizzato il periodo precedente il campionamento.
        Di seguito è riportata la distribuzione degli isolati prelevati nei
     mosti e nei vini base per tutte le cantine e suddivisi per territorio
     (Figura 2.4)




     Figura 2.4 Numero di lieviti isolati (n) collezionati durante le annate 2009-2010-2011 a)
     nella zona di Franciacorta; b) nella zona dell’Oltrepò Pavese.
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese


2.3.2 Biodiversità interspecifica
   L’identificazione di tutti e 493 isolati di lievito è stata ottenuta
effettuando in sequenza:
1.	 Amplificazione delle regioni ITS1-5.8S-ITS2 (Internal Transcribed
    Spacers) (Figura 2.5);
2.	 Digestione degli amplificati con enzima Hin6I (Figura 2.5);
3.	 Costituzione di cluster in base ai profili di restrizione ottenuti;
4.	 Conferma dei cluster attraverso una seconda digestione con
    enzima HaeIII di circa il 25% degli isolati di ciascun gruppo;
5.	 Sequenziamento del gene 26S rDNA di circa il 10% degli isolati
    di ciascun cluster.




                                                                                                  33




Figura 2.5 Esempio di corsa elettroforetica in gel di agarosio: a) dei prodotti di amplifi-
cazione delle regioni ITS1-5.8S-ITS2 di alcuni isolati da mosto (sopra). M: Marker 100 bp
(5 Prime, Amburgo); 1: Metschnikowia pulcherrima - Controllo positivo; 2: Hanseniaspo-
ra spp. - Controllo positivo; 3: Schizosaccharomyces pombe - Controllo positivo; 4: Rho-
dotorula spp. - Controllo positivo; 5: Zygosaccharomyces bailii - Controllo positivo; 6:
Saccharomyces cerevisiae - Controllo positivo; 7: Issatchenkia spp. - Controllo positivo;
8: Saccharomyces bayanus – Controllo positivo; 9: Dekkera spp. - Controllo positivo;
10: Controllo negativo; 11-22: campioni da mosto. b) dei prodotti di digestione con
enzimi di restrizione specifici (RFLP, enzima Hin6I) degli ampliconi ITS1-5.8S-ITS2 (sotto). M:
Marker 100 bp (5 Prime, Amburgo); 1: Metschnikowia pulcherrima - Controllo positivo;
2: Hanseniaspora spp. - Controllo positivo; 3: Schizosaccharomyces pombe - Controllo
positivo; 4: Rhodotorula spp. - Controllo positivo; 5: Zygosaccharomyces bailii - Con-
trollo positivo; 6: Saccharomyces cerevisiae - Controllo positivo; 7: Issatchenkia spp.
- Controllo positivo; 8: Saccharomyces bayanus – Controllo positivo; 9: Dekkera spp.
- Controllo positivo; 10: pozzetto vuoto; 11-22: campioni da mosto; 23: pozzetto vuoto.
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…


         L’attribuzione della specie per il gruppo S. cerevisiae sensu
     stricto si è conclusa con la verifica di una specifica tecnica PCR
     proposto da De Melo Pereira et al. (2010). Il protocollo è rapido
     e semplice ed è in grado di discriminare S. cerevisiae da S. ba-
     yanus e S. pastorianus. Tutti gli isolati di lievito che venivano clas-
     sificati come S. cerevisiae tramite ITS-RFLP e analisi del 26S rDNA
     dunque sono stati anche sottoposti ad identificazione attraverso
     l’amplificazione del gene HO.
         La Figura 2.6 mostra un esempio del prodotto di PCR per al-
     cuni isolati; l’amplicone caratteristico per S. cerevisiae ha una
     lunghezza di 400 bp.




34




     Figura 2.6 Gel di agarosio 0,8% del amplificazione usando i primers specifici del gene
     HO di S. cerevisiae ScHO-F/ScHO-R. M: peso molecolare del DNA (GeneRuler 100 bp
     DNA Ladder, Fermentas, Italia); 1: S. cerevisiae (Institut Œnologique de Champagne;
     Collection de Levures d’intérêt Biotechnologique IOC 18-2007); 2-18: isolati di S. cere-
     visiae.



        Per quanto riguarda il campionamento dell’aria è stato possi-
     bile collezionare 26 isolati in tutto suddivisi in 6 differenti specie di
     lievito (Tabella 2.3). La più alta percentuale di isolati da aria, du-
     rante l’intero progetto triennale, è stata ottenuta dal prelievo del
     2009 (65%). In Figura 2.7 e Figura 2.8 sono mostrate le percentuali
     di isolamento delle diverse specie di lievito e la loro distribuzione
     nelle tre annate. Il dato più interessante del campionamento ri-
     guarda il ritrovamento di S. cerevisiae (35% del totale degli isolati
     raccolti) nei campioni d’aria analizzati per le tre annate conse-
     cutive dallo stesso territorio. Inoltre, altre specie ambientali come
     Aureobasidium pullulans, Cryptococcus laurentii. Issatchenkia
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese


terricola e Rhodotorula glutinis vengono isolate con percentua-
li tra il 19-8%. Pichia fermentans e Rhodotorula nothofagy sono
state singolarmente isolate da campioni d’aria del 2010 e 2011.
In particolare, nella zona di Franciacorta l’isolamento di lieviti è
stato possibile solo nel corso del 2009.


      Vendemmia e Origine          Numero di lieviti (n)         Percentuale (%)
                2009                        17                          65
           Franciacorta                      8                          31
            A. pullulans                     4                          15
            C. laurentii                     4                          15
          Oltrepò Pavese                     9                          35
           S. cerevisiae                     7                          27
            A. pullulans                     1                           4
             I. terricola                    1                           4
                2010                         3                          12
                                                                                               35
          Oltrepò Pavese                     3                          12
           S. cerevisiae                     1                           4
             I. terricola                    1                           4
           P. fermentans                     1                           4
                2011                         6                          23
          Oltrepò Pavese                     6                          23
           S. cerevisiae                     1                           4
             R. glutinis                     4                          15
           R. nothofagi                      1                           4
               Totale                       26                        100%

Tabella 2.3 Identificazione degli isolati di lievito ottenuti dal campionamento dell’aria in
Franciacorta (FCR) e Oltrepò Pavese (OLT), nel corso di tre annate.
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…




36   Figura 2.7 Biodiversità osservata nei campioni di aria in Franciacorta e Oltrepò Pavese
     nel corso di tre annate.




     Figura 2.8 Distribuzione di isolamento e permanenza delle diverse specie di lievito isola-
     te da aria in Franciacorta ed Oltrepò Pavese nel corso di tre annate.
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese


    Il campionamento del mosto ha portato all’isolamento di sva-
riate specie di lievito. In totale, sono stati collezionati 285 isola-
ti suddivisi in 25 differenti specie (Figura 2.9). I dati riguardanti
la loro identificazione genetica sono presentati in Tabella 2.4.
L’annata 2010 è stata quella durante la quale è stato raccolto
il maggior numero di isolati da mosto con un totale di 147 lieviti,
pari al 52% del totale, raccolti durante le tre annate su entrambi
i territori analizzati. E’ stato proprio durante questo campiona-
mento, inoltre, che si è potuta osservare la più alta biodiversità
in termini di specie di lievito collezionate; 19 diverse specie sono
state isolate, tra cui S. cerevisiae corrispondeva alla più alta per-
centuale (44 isolati, circa 40% del totale dei S. cerevisiae isoal-
ti da mosto nel triennio). Metschnikowia fructicola e Candida
railenensis, con il 10% ed il 9% rispettivamente, raggiungevano
la seconda e la terza maggiore incidenza percentuale. In par-
ticolare, S. cerevisiae, Torulaspora delbrueckii ed Issatchenkia
terricola erano specie presenti su entrambe le aree, mentre
Metschnikowia fructicola, Hanseniaspora uvarum, Issatchenkia                                37

occidentalis, Pichia anomala, Rhodotorula spp, Pichia ku-
driavzevii, Pichia kluyveri, Zygoascus spp, Candida zemplinina,
Candida parapsilosis, Cryptococcus flavescens e Pichia guillier-
mondii erano specie presenti solo nella zona della Franciacorta.
Invece, Candida railenensis, Pichia fermentans, Hanseniaspora
uvarum, Issatchenkia terricola, Metschnikowia pulcherrima e Pi-
chia membranifaciens erano ritrovate solo in Oltrepò Pavese.
Infine, delle 19 specie identificate nel 2010, 8 specie venivano
isolate solamente durante questa annata (Candida parapsi-
losis, Candida railenensis, Cryptococcus flavescens, Pichia fer-
mentans, Pichia guilliermondii, Pichia kudriavzevii, Rhodotorula
spp, Zygoascus spp).
    Altre specie di lieviti, diversi rispetto a quelli già noti, sono sta-
ti isolati nel corso della vendemmia 2009: Zygosaccharomyces
bailii, comunemente presente in entrambe le aree e Candida
diversa isolata solo in Oltrepò Pavese. Inoltre, entrambe queste
specie si ritrovavano solamente nei mosti del 2009. Per quanto ri-
guarda gli isolati del 2011, Kluyveromyces thermotolerans è stato
per la prima volta isolato da entrambi i territori con una percen-
tuale del 1,5%, Hanseniaspora vineae (1,8%) e Candida oleophi-
la (0,4%) rappresentavano anch’esse nuovi isolamenti della sola
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…


     Franciacorta, mentre Pichia fluxum (0,6%) è stato un nuovo isola-
     mento per l’Oltrepò Pavese.
         Per quanto riguarda la permanenza di specie di lievito in cam-
     pioni di mosto nel corso dei tre anni sui due territori, solo poche
     specie sono state riscontrate in annate successive. In particolare,
     il solo S. cerevisiae in Franciacorta e S. cerevisiae e H. uvarum in
     Oltrepò Pavese, si sono dimostrate specie stabilmente presenti
     sulle aree (Figura 2.10).

         Come riportato da Jolly (2003) i lieviti presenti nel mosto pos-
     sono essere suddivisi in due gruppi: uno rappresentato dai “lie-
     viti vinari” del genere Saccharomyces, l’altro comprendente i
     non-Saccharomyces. I lieviti Saccharomyces sono presenti, seb-
     bene in basso numero, anche sui grappoli, ma derivano prin-
     cipalmente dalle attrezzature di cantina (Vaughan-Martini &
     Martini, 1995; Boulton, 1996; Martini, 1996), e vengono trasferi-
     ti al mosto durante la pressatura (Peynaud e Domercq, 1959;
38   Lonvaud-Funel, 1996; Török, 1996; Mortimer e Polsinelli, 1999). Un’
     ulteriore fonte di Saccharomyces, può essere data dalle colture
     starter addizionate dall’enologo. I lieviti non-Saccharomyces, si
     ritrovano abbondantemente sui grappoli (Martini, 1996) e pri-
     ma dell’inoculo con uno starter: sono i lieviti presenti in mag-
     gior misura nel mosto. La popolazione di non-Saccharomyces
     presente sui grappoli risulta molto variabile: sono stati ritrovati
     isolati appartenenti ai generi Brettanomyces, Candida, Cryp-
     tococcus, Hanseniaspora, Kloeckera, Kluyveromyces, Pichia,
     Rhodotorula, Torulaspora (Ribéreau-Gayon, 1985; Fleet e Heard,
     1993; Pretorius, 1999; Pramateftaki, 2000; Clemente-Jiménez,
     2004; Chavan, 2009). I risultati ottenuti sono in disaccordo con
     quanto ritrovato da Ocón (2010) indagando la presenza di lieviti
     non-Saccharomyces sulle superfici e sulle strumentazioni della
     cantina e nel mosto. L’elevata variabilità di specie ascrivibili ai
     generi Candida, Cryptococcus, Pichia, Zygosaccharomyces,
     Torulaspora e Rhodotorula da loro rilevata su superfici e attrez-
     zature è stata qui invece osservata nel mosto. Non essendo stati
     effettuati campionamenti per indagare eventuale microflora
     presente sulle superfici delle strutture e delle attrezzature, non
     si può essere certi della reale provenienza degli isolati ricono-
     sciuti: essi potrebbero essere indigeni del mosto, quindi derivare
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese


dai grappoli, oppure frutto della contaminazione di quest’ulti-
mo con la microflora presente in cantina, per fermentazioni già
avviate, o perché comunque presenti sulle attrezzature (presse
e pompe in particolare) (Phaff e Knapp, 1956; Lachance, 1994;
Mortimer e Polsinelli, 1999). Complessivamente l’analisi del mo-
sto ha portato all’isolamento di 285 colonie di lievito, di cui solo
il 32% risultate appartenenti alla specie S. cerevisiae. In accordo
con quanto riportato in bibliografia, la maggior parte della po-
polazione micetica rilevata nel mosto, apparteneva al gruppo
non-Saccharomyces (68%). Di particolare interesse risulta l’isola-
mento della specie I. terricola che raramente è stata isolata da
mosto o vino in fermentazione (Sabate, 2002; Di Maro, 2007) ed
è stata associata ad una bassa capacità fermentativa ed ele-
vata produzione di acetato d’etile, determinando la formazio-
ne di off-flavours (Clemente-Jimenez, 2004). Le minori citazioni in
bibliografia riguardo la specie C. zemplinina sono da attribuire
alla sua recente descrizione (Sipiczki, 2003) e distinzione da C.
stellata. Entrambi sono lieviti “fruttosofili”, ma la maggior espres-                       39

sione di tale caratteristica in C. zemplinina ha indotto un più
approfondito studio riguardo al suo sviluppo per una potenziale
riconsiderazione della specie per il controllo delle fermentazioni.
Ciò sarebbe particolarmente interessante per la produzione di
vini ottenuti da uve botritizzate, sulle quali queste specie sono
spesso ritrovate (Magyar e Tóth, 2011). Alcuni autori (Csoma e
Sipiczki, 2008) ritengono che sia Candida zemplinina invece di
Candida stellata a trovarsi sui grappoli e nelle fermentazioni dei
mosti, e suggeriscono che le due specie potrebbero essere state
spesso confuse nelle prime pubblicazioni; in effetti, le pubblica-
zioni più recenti sulla microflora vinaria, e come anche risultato
in questo studio, riportano soltanto la presenza di C. zemplinina,
senza rilevare popolazioni di C. stellata (Nisiotou, 2007; Lopan-
dic, 2008; Tofalo, 2009).
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…

          Vendemmia e Origine        Numero di isolati (n)      Percentuale (%)
                    2009                     61                      21,4
                Franciacorta                 39                      13,7
                S. cerevisiae                22                       7,7
        Zygosaccharomyces bailii             11                       3,9
        Issatchenkia occidentalis             6                       2,1
               Oltrepò Pavese                22                       7,7
                S. cerevisiae                14                       4,9
        Zygosaccharomyces bailii              4                       1,4
           Issatchenkia terricola             1                       0,4
            Candida zemplinina                1                       0,4
              Candida diversa                 1                       0,4
          Hanseniaspora uvarum                1                       0,4
                    2010                    147                      51,6
                Franciacorta                 91                      31,9
                S. cerevisiae                27                       9,5
        Metschnikowia fructicola             15                       5,3
          Hanseniaspora uvarum               13                       4,6
               Pichia kluyveri               10                       3,5
        Issatchenkia occidentalis             5                       1,8
           Issatchenkia terricola             5                       1,8
          Torulaspora delbrueckii             4                       1,4
40            Pichia anomala                  3                       1,1
             Pichia kudriavzevii              2                       0,7
              Rhodotorula spp                 2                       0,7
           Candida parapsilosis               1                       0,4
            Candida zemplinina                1                       0,4
               Zygoascus spp                  1                       0,4
            Pichia guilliermondii             1                       0,4
        Cryptococcus flavescens               1                       0,4
               Oltrepò Pavese                56                      19,6
                S. cerevisiae                17                       6,0
            Candida railenensis              14                       4,9
          Torulaspora delbrueckii             6                       2,1
             Pichia fermentans                5                       1,8
          Hanseniaspora uvarum                4                       1,4
           Issatchenkia terricola             4                       1,4
       Metschnikowia pulcherrima              3                       1,1
        Issatchenkia occidentalis             2                       0,7
         Pichia membranifaciens               1                       0,4
                    2011                     77                      27,0
                Franciacorta                 35                      12,3
                S. cerevisiae                16                       5,6
          Torulaspora delbrueckii             6                       2,1
          Hanseniaspora vineae                5                       1,8
     Kluyveromyces thermotolerans             3                       1,1
       Metschnikowia pulcherrima              2                       0,7
             Candida oleophila                1                       0,4
          Hanseniaspora uvarum                1                       0,4
            Candida zemplinina                1                       0,4
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese

         Oltrepò Pavese                        42                       14,7
           S. cerevisiae                       16                        5,6
    Metschnikowia fructicola                    8                        2,8
     Hanseniaspora uvarum                       5                        1,7
      Candida zemplinina                        3                        1,0
     Torulaspora delbrueckii                    3                        1,0
          Pichia fluxum                         2                        0,6
         Pichia anomala                         1                        0,4
          Pichia kluyveri                       1                        0,4
    Pichia membranifaciens                      1                        0,4
       Candida glabrata                         1                        0,4
 Kluyveromyces thermotolerans                   1                        0,4
               Totale                         285                      100,0%

Tabella 2.4 Identificazione genetica degli isolati da mosto in Franciacorta (FCR) ed
Oltrepò Pavese (OLT), nel corso delle tre annate.




                                                                                            41




Figura 2.9 Biodiversità osservata nei campioni di mosto in Franciacorta ed Oltrepò Pa-
vese nel corso delle tre annate.
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…




42




     Figura 2.10 Permanenza delle specie di lievito in campioni di mosto, durante le tre an-
     nate a) in Franciacorta; b) in Oltrepò Pavese.


        Dal campionamento del vino base sono stati ottenuti 182 iso-
     lati di lievito (circa il 37% della collezione totale di lievito); i risultati
     della loro identificazione genetica sono mostrati in Tabella 2.5.
        In totale sono state identificate 10 diverse specie di lievito (Fi-
     gura 2.11). Come previsto, S. cerevisiae ha rappresentato la spe-
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese


cie dominante in vino base, a fine fermentazione alcolica, sia in
Franciacorta (35%) che in Oltrepò Pavese (41%).
   In letteratura si riporta che questa specie, infatti, rappresenta la
quasi totalità di lieviti in vino a fine fermentazione alcolica, mentre
le specie H. uvarum e Zygosaccharomyces (non corrispondente
al qui ritrovato Z. bailii) risultano solo raramente isolabili (Gonzales,
2007). Al termine della fermentazione alcolica anche in questo
caso la popolazione di S. cerevisiae era prevalente (76%), anche
se non al livello presentato da Gonzales (99%). Il secondo genere
più rappresentativo è risultato Pichia (20%), seguita dalle specie
H. uvarum e Z. bailii (3%), quest’ultima una specie che può essere
riscontrata a fine fermentazione più facilmente rispetto ad altre,
grazie alla sua elevata alcol-tolleranza (Fleet, 2003).
   L’annata 2009 è stata quella in cui è stato isolato il maggior
numero lieviti; 100 isolati, di cui il 27% dal campionamento di
vino base della Franciacorta e 29% per Oltrepò Pavese. Durante
questa annata, un totale di 6 differenti specie di lieviti sono state
isolate (Tabella 2.5). Questo risultato potrebbe derivare dal fat-                          43

to che in realtà la biodiversità interspecifica più elevata è stata
ottenuta dal campionamento del 2010, dove sono state isola-
te 8 differenti specie di lievito (Tabella 2.5). In generale, occorre
notare che in alcuni campioni di vino base è stata rilevata la
presenza di una sola specie; le condizioni del mezzo, con basso
pH, presenza di SO2 ed elevata concentrazione di etanolo, costi-
tuiscono fattori selettivi importanti soprattutto per le specie non-
Saccharomyces. Tuttavia alcuni studi hanno dimostrato da parte
di alcuni ceppi una maggior tolleranza all’etanolo; la loro con-
seguente maggior persistenza nel mezzo può influenzare l’impat-
to sensoriale del prodotto finale (Pramateftaki, 2000; Combina,
2005; Gonzáles, 2007).
   Per quanto riguarda la permanenza di specie di lievito in cam-
pioni di vino base nel corso delle tre annate sui due territori, solo
poche specie sono state re-isolate. In particolare, S. cerevisiae e
P. membranifaciens in Franciacorta ed il solo S. cerevisiae in Ol-
trepò Pavese, si sono mostrate specie stabilmente presenti sulle
aree analizzate (Figura 2.12).
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…



             Vendemmia e Origine                Numero di isolati         Percentuale
                        2009                         100                      55
                   Franciacorta                       48                      27
                   S. cerevisiae                      32                      18
            Pichia membranifaciens                     9                       5
                   Pichia fluxum                       3                       2
           Zygosaccharomyces bailii                    2                       1
           Issatchenkia occidentalis                   1                       1
             Torulaspora delbrueckii                   1                       1
                 Oltrepò Pavese                       52                      29
                   S. cerevisiae                      52                      29
                        2010                          36                      20
                   Franciacorta                       21                      12
                   S. cerevisiae                      11                       6
             Hanseniaspora uvarum                      3                       2
            Pichia membranifaciens                     3                       2
                    Pichia spp                         2                       1
           Zygosaccharomyces bailii                    1                       1
           Issatchenkia occidentalis                   1                       1
                 Oltrepò Pavese                       15                       8
                   S. cerevisiae                       6                       3
44             Candida railenensis                     4                       2
                Pichia fermentans                      3                       2
             Hanseniaspora uvarum                      2                       1
                        2011                          45                      25
                   Franciacorta                       23                      13
                   S. cerevisiae                      20                      11
            Pichia membranifaciens                     3                       2
                 Oltrepò Pavese                       23                      25
                   S. cerevisiae                      16                      17
                   Pichia fluxum                       5                       5
            Pichia membranifaciens                     1                       1
           Zygosaccharomyces bailii                    1                       1
                       Totale                        182                     100%

     Tabella 2.5 Identificazione genetica degli isolati da vino base in Franciacorta (FCR) ed
     Oltrepò Pavese (OLT), nel corso delle tre annate.
Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese




Figura 2.11 Biodiversità interspecifica osservata nei campioni di vino base in Francia-
corta ed Oltrepò Pavese nel corso delle tre annate.
                                                                                            45
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico…




46




     Figura 2.12 Permanenza delle specie di lievito in campioni di vino base, durante le tre
     annate a) in Franciacorta; b) in Oltrepò Pavese.
Capitolo 3. Tipizzazione molecolare dei ceppi di S. cerevisiae …




Capitolo 3. Tipizzazione molecolare dei ceppi
di S. cerevisiae per il riconoscimento di ecotipi
autoctoni


3.1 Introduzione

    Le caratteristiche sensoriali di un vino possono dipendere dalle
diverse tipologie di lieviti coinvolte nel processo di fermentazio-
ne, ed in particolare dai differenti ceppi di S. cerevisiae che si
succedono durante la vinificazione (Agnolucci, 2007; Capece,                47

2010; Guerra, 1999, Mercado, 2007, Vilanova 2003). Lo studio
della biodiversità dei ceppi di lievito appartenenti alla stessa spe-
cie ci permette di capire l’evoluzione delle popolazioni presenti
nel mosto durante la vinificazione per incrementarne il controllo,
inoltre i ceppi autoctoni caratterizzati da tipici tratti enologici po-
trebbero essere caratteristici di una particolare zona vitivinicola.
La presenza di questi lieviti determina un aumento della tipicità di
un vino, promuovendo la diversificazione dei prodotti vitivinicoli e
della zona di origine. La maggior parte delle ricerche condotte
fino ad ora hanno concentrato il loro studio sul controllo della
fermentazione alcolica (Caruso, 2002; Redz epovic 2002; Versa-
                                                ˇ       ´,
vaud, 1995), anche se non sono mancate le indagini sullo studio
dell’ecologia dei lieviti delle uve, del mosto e dell’aria presente
nella cantina di vinificazione (Jolly, 2006; Fleet, 2002; Fleet, 2003;
Fleet, 2008; Prakitchaiwattana, 2004; Ribéreau-Gayon, 2000; Ga-
rijo, 2008).
    Per quanto riguarda la tipizzazione dei lieviti, sono state svilup-
pate differenti metodologie, basate sullo studio dei polimorfismi
del DNA, al fine di discriminare tra ceppi appartenenti alla stessa
specie (Querol, 1992, Ness, 1993; Schuller, 2004). Essendo S. cere-
visiae il lievito enologico più importante, i ricercatori hanno fina-
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico …




     lizzato le loro attività sullo studio di questa specie, evidenziando
     significativi polimorfismi in ceppi di S. cerevisiae indigeni prove-
     nienti da differenti regioni vitivinicole ed una forte correlazione
     tra genotipo e proprietà fenotipiche (Esteve-Zarzoso, 2000; Na-
     dal, 1996).
         Nel tempo sono state sviluppate alcune tecniche molecola-
     ri tra cui RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA; McGrath,
     1998; Perez, 2001), l’analisi dei loci SSR (Single Sequence Repe-
     at; Ayoub, 2006) e l’analisi delle sequenze interdelta (Ness, 1993).
     Queste tecniche si sono rivelate utili per lo studio dell’evoluzione
     di popolazioni di lieviti nel corso di un processo fermentativo, per
     l’identificazione di un ceppo con caratteristiche peculiari e per la
     valutazione della biodiversità all’interno di un’area geografica.
         L’analisi delle sequenze interdelta è stata proposta per la pri-
     ma volta da Ness (1993) per la tipizzazione di ceppi di S. cerevi-
     siae tramite l’analisi del polimorfismo interdelta (IDM, interdelta
48   marker). Il genoma di S. cerevisiae contiene sequenze ripetute
     di DNA, le sequenze delta, associate al trasposone Ty1 (Came-
     ron, 1979). Gli elementi trasponibili o trasposoni sono frammenti
     di DNA che hanno in comune la capacità di muoversi da un
     punto all’altro del genoma e di amplificare il proprio numero di
     copie all’interno dell’ospite. Gli elementi delta costituiscono le
     ripetizioni terminali (LTR) della sequenza dei trasposoni Ty1 e Ty2
     in lievito; questi si possono trovare sia associati al retrotrasposo-
     ne, sia dispersi nel genoma, in questo caso prendono il nome di
     “elementi delta” (Legras e Karst, 2003). Eventi di ricombinazio-
     ne possono espellere la sequenza centrale del retrotrasposone
     lasciando nella posizione originaria una singola LTR, spiegando
     la presenza di molte copie di LTR, prive del trasposone, disper-
     se nel genoma. Il genoma di S. cerevisiae è caratterizzato dalla
     presenza di 5 famiglie di retrotrasposoni, di cui quattro rientrano
     nella categoria degli elementi di tipo “Ty1-copia” (Ty1, Ty2, Ty4,
     Ty5) ed uno (Ty3) nella categoria degli elementi di tipo “gypsy”.
     Entrambe le classi presentano un’organizzazione simile a quella
     dei retrovirus (Boeke e Corces, 1989; Doolittle, 1989), ma differi-
     scono tra loro per la disposizione dei geni: mentre negli elementi
     tipo “gypsy” la funzione integrasica (INT, importante per l’integra-
     zione del trasposone nell’ospite) è localizzata all’estremità di Pol
Capitolo 3. Tipizzazione molecolare dei ceppi di S. cerevisiae …


(parte della sequenza che codifica gli enzimi implicati nel ciclo
vitale del trasposone), preceduta dall’RNAasiH, in Ty1-copia INT si
trova all’interno del gene Pol, seguito dalla sequenza codifican-
te per la retrotrascrittasi (RT) e da quella per l’RNAsiH (Figura 3.1).
Tra queste famiglie solo Ty1, Ty2 e Ty3 risultano essere attive nella
trasposizione all’interno del genoma.




Figura 3.1 Struttura del retrotrasposone di tipoTy1-copia (INT prima di RT) e Ty3-gypsy
(INT dopo RH).

                                                                                          49

   Come dimostrato da diversi autori (Legras e Karst, 2003; Schul-
ler, 2004), il numero (S. cerevisiae può contenere da 2 a 30 co-
pie dei 5 elementi trasponibili) e la posizione di questi elementi
hanno una certa variabilità intraspecifica che può essere utiliz-
zato come un’impronta digitale genetica per identificare i cep-
pi di S. cerevisiae (Xufre, 2011). I marcatori Interdelta sfruttano
questo polimorfismo. Si tratta di una metodica che prevede una
amplificazione mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) di
frammenti di DNA situati tra due trasposoni (Ness, 1993). Ai fini
dell’amplificazione, è necessario progettare dei primers (sequen-
ze omologhe al DNA) che si appaino ad entrambe le estremità
delta (δ).
   L’amplificazione delle sequenze interdelta è conosciuta per
essere altamente specifica per l’identificazione di ceppi di S.
cerevisiae rispetto ad altri lieviti (Ness, 1993). Pramateftaki (2000)
analizzando le sequenze δ di 500 isolati di un’area vitivinicola del-
la Grecia ha ottenuto dei profili di amplificazione esclusivamente
da isolati di S. cerevisiae.
   Poiché l’amplificazione delle sequenze inter-δ sembra essere
efficace per la tipizzazione, molti studi ne sono seguiti per otti-
mizzare la tecnica. Infatti, Legras e Karst (2003) progettando una
Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico …


     nuova coppia di primers hanno ottenuto un netto miglioramento
     del polimorfismo dei profili genetici. Tristezza (2009) ha adottato
     la tecnica dell’elettroforesi capillare ai marcatori Interdelta per
     la genotipizzazione di ceppi di S. cerevisiae, ottenendo un miglio-
     ramento nella sensibilità e precisione della tecnica.
        Un ampio studio delle biodiversità intraspecifica di S. cerevisiae
     porta alla possibilità di isolare nuovi ceppi indigeni che potreb-
     bero sostituire quelli attualmente in commercio impiegati nella
     produzione di vino, considerando che quelli indigeni risultano più
     adatti alla crescita in uno specifico mosto e riflettono maggior-
     mente la biodiversità di una regione vitivinicola. Per questo mo-
     tivo, nazioni come Argentina (Combina, 2005; Mercado, 2007),
     Spagna (Blanco, 2006; Garijo, 2008; Gonzales, 2007; Torija, 2001;
     Sabate, 2002), Francia (Valero, 2007), Austria (Lopandic, 2007),
     Croazia (Redz epovic 2002), Slovenia (Raspor, 2006), Ungheria
                       ˇ       ´,
     (Csoma, 2010), Grecia (Nikolaou, 2007; Nisiotou e Nychas, 2007),
     Sud Africa (Jolly, 2003; Pretorius, 1999), India (Chavan, 2009) e
50   Giappone (Shinohara, 2003) hanno condotto ricerche volte a
     valutare la biodiversità dei lieviti da vino in alcune delle principali
     regioni vitivinicole. In Italia, medesimi studi sono stati condotti nel-
     le regioni Marche (Guerra, 1999), Basilicata (Caruso, 2002), Puglia
     (Cappello, 2004) e Sicilia (Romancino, 2000).
        Dal momento che la regione Lombardia è una delle più impor-
     tanti regioni italiane per la produzione di vino spumante, lo scopo
     di questo lavoro è stato la valutazione della biodiversità intraspe-
     cifica degli isolati di S. cerevisiae raccolti durante il processo di
     produzione del vino in Franciacorta (Brescia) ed Oltrepò Pavese
     (Pavia). Una caratterizzazione molecolare a livello di ceppo è
     stata condotta tramite l’utilizzo della tecnica molecolare IDM per
     gli isolati di S. cerevisiae campionati da aria, mosto e vino duran-
     te le stagioni produttive del 2009, 2010 e 2011.


     3.2 Materiale e Metodi

     Isolamento dei campioni
        La tipizzazione è stata condotta per tutti i 272 isolati di S. cerevi-
     siae collezionati nel corso del progetto (Tabella 3.1). Nello studio
     è stata inclusa l’analisi di 48 lieviti commerciali, alcuni dei quali
VALORIZZAZIONE DELLE D.O.C.G.
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VALORIZZAZIONE DELLE D.O.C.G.

  • 1. Department of Food Environmental Consorzio per la tutela Consorzio Tutela Vini and Nutritional Sciences del Franciacorta Oltrepò Pavese www.regione.lombardia.it VALORIZZAZIONE DELLE D.O.C.G. FRANCIACORTA ED OLTREPÒ PAVESE METODO CLASSICO MEDIANTE IMPIEGO DI LIEVITI AUTOCTONI PER IL MIGLIORAMENTO DELLE PRODUZIONI E COME MARCATORI DI TIPICITÀ Quaderni della Ricerca n. 148 - novembre 2012
  • 2. Sperimentazione condotta nell’ambito del progetto di ricerca n. 1315 “Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico mediante impiego di lieviti autoctoni per il miglioramento delle produzioni e come marcatori di tipicità” (d.g.r. 30/3/2009 n. VIII/9182 - Piano per la ricerca e lo sviluppo 2009). Hanno realizzato le attività sperimentali: Università degli Studi di Milano Dipartimento di Scienze per gli Alimenti, la Nutrizione e l’Ambiente via Celoria, 2 - 20133 Milano referente: prof. Roberto Foschino, roberto.foschino@unimi.it Consorzio per Tutela del Franciacorta Via Verdi, 53 - 25030 Erbusco (BS) referente: dr.ssa Monica Faccincani, ufficio.tecnico@franciacorta.net Consorzio Tutela Vini Oltrepò Pavese piazza Vittorio Veneto, 24 - 27043 Broni (PV) referente: dr.ssa Alice Colombo, ufficio.tecnico@vinoltrepo.it Per Informazioni: Regione Lombardia - Direzione Generale Agricoltura U.O. Innovazione, cooperazione e valorizzazione delle produzioni Struttura Ricerca, innovazione tecnologica e servizi alle imprese Piazza Città di Lombardia 1 - 20124 Milano tel: +39.02.6765.3790 fax: +39.02.6765.8056 e-mail: agri_ricerca@regione.lombardia.it referente: Rossana Tonesi - tel: +39.02.6765.3737 e-mail: rossana_tonesi@regione.lombardia.it © Copyright Regione Lombardia
  • 4. Department of Food Environmental Consorzio per la tutela Consorzio Tutela Vini and Nutritional Sciences del Franciacorta Oltrepò Pavese VALORIZZAZIONE DELLE D.O.C.G. FRANCIACORTA ED OLTREPÒ PAVESE METODO CLASSICO MEDIANTE IMPIEGO DI LIEVITI AUTOCTONI PER IL MIGLIORAMENTO DELLE PRODUZIONI E COME MARCATORI DI TIPICITÀ A cura di: Roberto Foschino Ileana Vigentini Gabriella De Lorenzis Claudia Picozzi Shirley Barrera Cardenas Vincenzo Fabrizio Quaderni della Ricerca n. 148 - novembre 2012
  • 6. Indice Indice Presentazione 7 Capitolo 1. Analisi dei fabbisogni, 5 stato dell’arte e obiettivi 9 Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese 17 Capitolo 3. Tipizzazione molecolare dei ceppi di S. cerevisiae per il riconoscimento di ecotipi autoctoni 47 Capitolo 4. Selezione dei ceppi e prove di microvinificazione 64 Capitolo 5. Il destino del DNA nello spumante 95 Capitolo 6. Considerazioni finali 120 Bibliografia 125 Ringraziamenti 134
  • 8. Presentazione Presentazione La Lombardia è regione leader nel- la produzione di vino spumante di alta qualità rappresentando oltre il 60% del prodotto nazionale realizzato con me- todo classico. Nel settore vitivinicolo le bollicine lombarde sono da anni in co- stante crescita, grazie al continuo mi- glioramento del livello qualitativo e al trainante successo imprenditoriale del 7 “modello” Franciacorta. Con il recen- te riconoscimento della Denominazio- ne d’Origine Controllata e Garantita conferito all’Oltrepò Pavese Metodo Classico la Lombardia può vantare una produzione di eccellenza negli spumanti D.O.C.G. con un poten- ziale di oltre 13 milioni di bottiglie. Occorre tuttavia riconoscere che il mondo dell’enologia ita- liana sta attraversando una fase di forte trasformazione e crisi, determinata un profondo cambiamento delle preferenze e del- le abitudini al consumo e accompagnata da una importante riduzione delle disponibilità economiche del pubblico. Inoltre l’ingresso di nuovi Paesi produttori ha ulteriormente innalzato la competizione commerciale, soprattutto sul mercato estero. Per contro, con tendenza positiva, si va affermando tra i consumato- ri una maggior attenzione alla qualità, alla tipicità del vino e agli aspetti sensoriali ed emozionali della degustazione. È tempo dunque di riflettere, progettare e reagire per indiriz- zare le risorse, da un lato, verso il miglioramento e la differenzia- zione qualitativa, valorizzando soprattutto vini che esprimano un legame con il territorio di appartenenza, dall’altro lato verso la
  • 9. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… penetrazione dei nostri prodotti nei mercati emergenti incremen- tando l’attività di promozione all’estero. Su questa linea strategica si inserisce il progetto di ricerca Eno- track che, a tre anni dal suo avvio, presenta in questo volume i suoi risultati, frutto della fattiva collaborazione tra il Dipartimento di Scienze per gli Alimenti, la Nutrizione e l’Ambiente dell’Universi- tà degli Studi di Milano, il Consorzio per Tutela del Franciacorta e il Consorzio Tutela Vini Oltrepò Pavese. Per valorizzare le D.O.C.G. metodo classico della Franciacor- ta e dell’Oltrepò Pavese la ricerca ha sperimentato l’impiego di lieviti autoctoni per il miglioramento qualitativo delle produzioni e come marcatori della tipicità. Giuseppe Elias Assessore all’Agricoltura Regione Lombardia 8
  • 10. Capitolo 1. Analisi dei fabbisogni, stato dell’arte e obiettivi Capitolo 1. Analisi dei fabbisogni, stato dell’arte e obiettivi All’interno della regione Lombardia, Franciacorta ed Oltrepò Pavese costituiscono le aree geografiche trainanti la produzione di vino spumante realizzato con metodo classico, rappresentan- do quasi due terzi dei “bollicine” a marchio D.O.C.G. fabbricati sul territorio nazionale. Il continuo miglioramento del livello qua- litativo del prodotto lombardo e l’attenzione alla promozione dell’immagine, sapientemente considerati come obiettivi fon- 9 damentali da entrambi i Consorzi e dalla maggioranza dei pro- duttori, sono comprovati dall’incremento costante delle vendite, anche in questi anni di crisi economica. La valorizzazione dei pro- dotti di origine, realizzati e percepiti come meglio legati al territo- rio, può emergere come linea strategica di successo, soprattutto per le attività rivolte al rafforzamento della comunicazione e alla penetrazione del mercato estero, naturale destino di uno svilup- po commerciale futuro. 1.1 Analisi dei fabbisogni Il Franciacorta D.O.C.G., viene preparato a partire da uve Chardonnay e/o Pinot bianco e/o Pinot nero coltivate in provin- cia di Brescia su una superficie di circa 2000 ettari; 160 sono gli aderenti al Consorzio di Tutela del Franciacorta, 74 le aziende di imbottigliamento. L’ Oltrepò Pavese Metodo Classico, è prodot- to da uve Pinot Nero in purezza o in miscela con Chardonnay coltivate in provincia di Pavia per un’estensione di circa 2000 et- tari; il Consorzio Tutela Vini Oltrepò Pavese conta 250 associati, con 1300 viticoltori conferenti, 6 le cantine sociali.
  • 11. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… Gli areali della Franciacorta e dell’Oltrepò Pavese rappresen- tano zone di particolare interesse per l’applicazione di nuove tec- nologie nel settore viti-vinicolo come effetto della convergenza di fattori positivi e strategici per il successo delle innovazioni quali, la grande perizia tecnica ed il buon livello socio-culturale degli operatori, l’atteggiamento di apertura verso la sperimentazione senza tralasciare il valore della tradizione, l’elevata vocazionalità dei territori, l’orientamento della filiera verso produzioni vinicole di pregio. Entrambi i vini , Franciacorta D.O.C.G. e Oltrepò Pavese Me- todo Classico, si ottengono da una lavorazione che dura non meno di 2 anni dalla vendemmia, di cui almeno 15 mesi (per la denominazione Oltrepò Pavese) e 18 mesi (per la denominazio- ne Franciacorta) di lenta rifermentazione in bottiglia a contatto con cellule di lievito. L’utilizzo di preparati commerciali di lievito è una pratica ormai universalmente diffusa presso le cantine della nostra Regione 10 poiché offre garanzie di una conduzione ininterrotta e completa della fermentazione e della rifermentazione. Tuttavia le colture di Saccharomyces attualmente utilizzate per le spumantizzazioni (starter) sono in numero ridotto, talvolta lo stesso ceppo assume sigle diverse perché attribuito a marchi diversi, e comunque trat- tasi di ceppi isolati e selezionati in territorio francese sulla base delle caratteristiche qualitative dello Champagne o per adat- tarsi alla produzione di una ampia gamma di preparazioni vina- rie, non tenendo conto delle specifiche proprietà sensoriali dei prodotti lombardi. La sostituzione dei ceppi starter d’oltralpe con ceppi di nuovo isolamento in territorio lombardo, appositamente selezionati per caratteri tecnologici e di qualità, può condurre alla produzione di vini con proprietà sensoriali migliorate e co- munque valorizzanti il prodotto finito, attraverso il riconoscimento di una relazione diretta con l’area geografica di produzione. Nel- lo specifico caso degli spumanti fatti secondo il metodo classico, la tecnica di rifermentazione in bottiglia comporta il vantaggio che i residui cellulari permangono nel prodotto fino al consumo. Per conseguenza il DNA di lievito, grazie alla sua natura di mole- cola informativa, può costituire un idoneo bersaglio analitico e la sua decodificazione può risultare un potente strumento per l’indi- viduazione e la certificazione dell’origine territoriale del prodotto.
  • 12. Capitolo 1. Analisi dei fabbisogni, stato dell’arte e obiettivi Il crescente e continuato utilizzo di starter commerciali costituiti da un esiguo numero di ceppi per la rifermentazione tende ad uniformare le caratteristiche sensoriali dei vini omologando i pro- dotti di Franciacorta e di Oltrepò Pavese agli spumanti di altre zone produttive. Infatti, il dominio fermentativo e la dispersione ambientale delle colture starter selezionate di provenienza este- ra conducono sostanzialmente a due conseguenze: • la prima, di tipo enologico, è legata al fatto che i lieviti autoc- toni, a seguito della loro inferiore concentrazione iniziale e/o della competizione nutrizionale, non riescono ad apportare il loro contributo metabolico alla qualità del prodotto finale; • la seconda, di tipo ecologico, è che le forme indigene pos- sono scomparire dall’habitat del vigneto e della cantina, pur possedendo caratteristiche elettive in termini di apporto sen- soriale verso i prodotti. Il recupero di tali ceppi, mediante una campagna program- mata ed estesa di campionamento sui territori coinvolti, viene proposto per salvaguardare le forme microbiche rimaste che 11 possono essere impiegate nella valorizzazione e tutela dei pro- dotti attuali e che, in futuro, potrebbero venire utilizzate per nuo- ve applicazioni. Il terzo problema che l’idea progettuale si propone di affronta- re è quello di fornire un potente strumento di verifica per i sistemi di tracciabilità adottati a garanzia della qualità ed autenticità del prodotto lombardo. L’impegno è quello di sviluppare un pro- tocollo analitico, in tecnica qPCR basato sull’analisi del DNA e al suo utilizzo per la tutela delle produzioni di spumante D.O.C.G.. Attraverso l’analisi della sequenza nucleotidica o la determina- zione di alcuni target genici specifici, questo metodo consen- tirebbe di individuare il ceppo di lievito che è stato impiegato nella rifermentazione, rappresentando un vero e proprio “mes- saggio nella bottiglia” per la durata della vita commerciale del prodotto. 1.2 Stato dell’arte Lo spumante è un vino che forma spuma all’atto della mescita in conseguenza della liberazione di anidride carbonica ottenuta
  • 13. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… da fermentazione operata da lieviti. Da un punto di vista tec- nologico la produzione dei vini spumanti può essere suddivisa in due fasi: la formulazione del vino base, realizzata allestendo una miscela di differenti vini preparati con tecnica di vinificazione in bianco, e la spumantizzazione, ottenuta per rifermentazione di zuccheri da parte di ceppi di Saccharomyces in contenitori chiusi. Nel metodo classico (metodo champenoise) la presa di spuma avviene direttamente in bottiglia, inoculando il vino base con idoneo innesto microbico (> 106 UFC/ml) e sciroppo zucche- rino (20-24 g/L) in modo da raggiungere una sovrappressione di CO2 di 5-6 atmosfere. La maturazione del prodotto sulle fecce avviene a basse temperature (a circa 12°C-14°C) e si protrae per un tempo prolungato (≥ 15 mesi); in questo periodo avvengono trasformazioni biochimiche operate da enzimi sintetizzati dai lie- viti, fenomeni di diffusione di sostanze tra cellule e mezzo, lisi delle cellule, che permettono il conferimento delle peculiari caratteri- stiche aromatiche. Nel metodo Charmat la spumantizzazione del 12 vino base, addizionato di zucchero e lieviti, avviene in autocla- vi a temperature più elevate (20-25°C) e per tempi brevi (pochi giorni) che non consentono l’ottenimento delle qualità sensoriali che si raggiungono mediante l’affinamento in bottiglia. In effetti è proprio nel metodo classico per la produzione di spumanti, più che in ogni altra tecnica enologica, che l’azione dei lieviti non si esaurisce con il compimento della sola fermenta- zione alcolica, ma si esalta con la formazione di composti secon- dari (es. alcoli superiori e loro esteri, esteri etilici di acidi grassi, po- lisaccaridi parietali), con la modifica di composti nativi dell’uva (es. acido malico, glicosidi, tioli alifatici ramificati, acidi fenolici) (Lambrechts e Pretorius, 2000) e prosegue con la cessione di so- stanze attraverso il fenomeno dell’autolisi cellulare (aminoacidi, oligopeptidi). La quantità di ciascuno di questi composti è spes- so difficilmente correlabile al gradimento finale, che è funzione della percezione complessiva che offre il vino, ed è dipendente in larga misura dal ceppo di Saccharomyces utilizzato oltre che dalle condizioni ambientali di sviluppo del lievito (Ribereau-Ga- yon, 1998). La possibilità di selezionare ceppi autoctoni con proprietà tec- nologiche utili e caratteristiche di qualità idonee al tipo di pro- dotto (potere fermentativo, purezza fermentativa, flocculenza,
  • 14. Capitolo 1. Analisi dei fabbisogni, stato dell’arte e obiettivi profilo aromatico) soddisfa l’obiettivo della difesa della comuni- tà microbica indigena e contemporaneamente suggella la va- lorizzazione del prodotto tipico attraverso l’evidenza del legame tra territorio e prodotto finito. L’isolamento e l’identificazione di lieviti è oggi facilitata dallo disponibilità di tecniche molecola- ri sufficientemente rapide ed affidabili (Eigel e Feldmann, 1982; Querol, 1992; Granchi,1999; Mannazzu et al., 2002; Marinangeli et al. 2004a; Marinangeli et al. 2004b; Foschino e Vigentini, 2006). Saccharomyces cerevisiae è stata la prima specie eucariota il cui genoma è stato sequenziato totalmente (Goffeau et al., 1996) e tuttavia il settore enologico non ha ancora sfruttato pienamen- te questa enorme potenzialità informativa. Le moderne tecni- che di analisi genetica forniscono dunque adeguati strumenti scientifici per individuare nuovi ceppi autoctoni (Ayoub, 2006, Baleiras Couto, 1996; Egli, 1998; Pretorius, 2000; Ciani, 2004) le cui proprietà tecnologiche e metaboliche hanno già consentito il miglioramento qualitativo del vino e la salvaguardia delle popo- lazioni autoctone in alcune regioni italiane, quali il Veneto (Ciani, 13 1997; Torriani, 1999; Zilio, 2000; Bocca, 2004; Zilio, 2004), le Marche (Guerra, 1999), la Toscana (Rosi,1998) e la Sicilia (Giudici, 1997). I parametri analitici adottati per la selezione di ceppi enologici di lievito fra quelli di nuovo isolamento sono stati ampiamente descritti (Giudici e Zambonelli, 1992; Steger e Lambrechts, 2000; Masneuf , 2003; Cavazza, 2006) per gli aspetti metabolici (vigore fermentativo, completezza della fermentazione degli zuccheri, resa in alcol, metabolismo dell’acido malico, formazione di com- posti secondari della fermentazione, metabolismi degli ammino- acidi, dei grassi e dei fenoli) e tecnologici generali (tolleranza all’alcol e al biossido di zolfo, criotolleranza, produzione/sensibi- lità al “fattore killer”) o specifici per l’impiego nella spumantiz- zazione (attitudine alla flocculazione, potere schiumogeno, ca- pacità autolitica). Tuttavia, solo valutando il comportamento del ceppo in vinificazione è possibile garantire che il vino possa trarre giovamento dal nuovo agente biologico fermentativo ritrovato (Rosi, 2005). Pertanto l’introduzione di una valutazione sensoriale di vinificazioni e spumantizzazioni ad-hoc rappresenta un fattore determinante per una conclusione positiva ed efficace in questo ambito di ricerca. Allo stato delle conoscenze non sono noti studi di selezione di
  • 15. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… Saccharomyces autoctoni per la produzione di spumante lom- bardi benché questi prodotti rappresentino in Italia una quota di mercato preponderante tra le D.O.G.C. Anche lavori sperimen- tali riguardanti la condizione e lo stato degli acidi nucleici nei vini e in generale nelle matrici enologiche (Savazzini e Martinelli, 2006; Vigentini, 2007), non sono numerosi sebbene tali molecole costituiscano un interessante componente biologica, assai utile per il riconoscimento delle specie. Il caso specifico dello spuman- te fatto con metodo classico rappresenta un ottimo modello per l’applicazione di sistemi di tracciabilità che sfruttano la presen- za ed il ruolo dei microrganismi nel processo produttivo. Infatti poiché la rifermentazione avviene in bottiglia, e cioè nell’ultimo contenitore ermetico che non subisce ulteriori trattamenti tecno- logici, è assai probabile che il DNA sia presente nelle poche cel- lule residue o sia fuoriuscito nel mezzo in seguito alla lisi cellulare, rimanendo nel prodotto finito in quantità e qualità utili per l’ese- cuzione di saggi molecolari. L’idea originale di questo program- 14 ma di ricerca è quella di sfruttare questa frazione di acidi nucleici come marcatori molecolari per individuare il ceppo rifermentan- te e indirettamente “tracciare” le produzioni. Infine si ricorda come il dibattito sui lieviti autoctoni è tuttora aperto e che, in ogni caso, la messa a punto di protocolli analiti- ci per l’individuazione accurata di ceppi costituenti le comunità microbiche che intervengono nel processo fermentativo, costitu- isce il presupposto metodologico per la dimostrazione oggettiva di un eventuale legame esistente tra prodotto e territorio. 1.3 Obiettivi del progetto e risultati attesi Il progetto si è prefisso i seguenti obiettivi: • isolare, caratterizzare e conservare in maniera stabile i ceppi di Saccharomyces “ecotipi-specifici” delle zone vitivinicole della Lombardia vocate alla produzione di spumanti; • identificare, fra i ceppi riconosciuti come autoctoni sia dell’a- rea Franciacorta che dell’area Oltrepò, quelli con adeguata attitudine alla vinificazione e spumantizzazione sulla base di caratteristiche tecnologiche ed aromatiche; • formulare starter di rifermentazione con ceppi autoctoni, re-
  • 16. Capitolo 1. Analisi dei fabbisogni, stato dell’arte e obiettivi lativi a ciascuna area di produzione, la cui idoneità sia stata validata mediante vinificazioni e spumantizzazioni secondo la prassi produttiva prevista dai rispettivi disciplinari di produzione di Franciacorta ed Oltrepò Pavese; • definire protocolli di estrazione ed amplificazione del DNA fun- gino da spumante per l’identificazione delle specie ed even- tuale riconoscimento del ceppo utilizzato in rifermentazione. I risultati attesi dall’esecuzione del progetto sono stati rispettati; in particolare sono stati ottenuti i seguenti prodotti: • Allestimento e disponibilità di una collezione di ceppi autoc- toni lombardi a vocazione enologica. Le colture sono conser- vate allo stato congelato presso il DeFENS dell’Università degli Studi di Milano. • Preparazione di starter costituiti da colture di lieviti autoctoni da impiegare per i vini spumanti. La formulazione dello starter è un punto chiave per la fase di rifermentazione in bottiglia poiché le cellule del lievito inserite nel liqueur de tirage sono gli agenti 15 biologici per l’ottenimento di profili aromatici nuovi e peculiari nonché costituiranno il materiale bersaglio per l’applicazione delle tecniche molecolari utili alla verifica della tracciabilità. Sono state preparate otto differenti colture starter, quattro per ciascuna area di produzione, Franciacorta e Oltrepò Pavese. • Produzione, affinamento e valutazione sensoriale di vino speri- mentale prodotto con spumantizzazioni in scala ridotta per la verifica della performance delle colture starter sopra citate. La produzione dello spumante è stata realizzata presso otto strutture produttive, cinque per il Consorzio per la Tutela del Franciacorta e tre per il Consorzio Tutela Vini Oltrepò Pavese. Sono state previste diverse sedute di degustazione a differenti età del prodotto in affinamento, organizzate dai Consorzi e re- alizzate da panel di assaggiatori esperti. • Protocollo sperimentale per l’estrazione ed amplificazione di DNA da vino spumante e riconoscimento della specie utilizza- ta in rifermentazione. L’idea era quella di realizzare un meto- do che potesse impiegarsi come strumento per identificare il/i ceppo/i impiegato/i in rifermentazione e dunque per verificare la presenza di un elemento oggettivo al fine di garantire il mar- chio di denominazione.
  • 17. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… • Attività di divulgazione tecnica e scientifica attraverso pubbli- cazioni su riviste di settore a livello nazionale e internazionale, siti internet, per l’aumento delle conoscenze in enologia, ed ecologia microbica e a tutela della fruibilità universale dei risul- tati. Organizzazione di un convegno al termine della sperimen- tazione atto a divulgare i risultati del progetto presso le imprese della Regione, gli enologi, i tecnici dei servizi agricoli regionali al fine di diffondere l’innovazione introdotta. I destinatari diretti dei risultati sono gli operatori della filiera enologica in Lombardia, con particolare riguardo ai produtto- ri di D.O.C.G. Franciacorta e D.O.C.G. Oltrepò Pavese Metodo Classico, per i quali l’innovazione tecnologica adottata potreb- be comportare un vantaggio competitivo in termini di migliora- mento qualitativo e raggiungimento dell’evidenza di una relazio- ne diretta tra prodotto finito e territorio, fattori determinanti per il successo commerciale del prodotto. 16 Altri destinatari potranno essere le aziende di produzione di fer- menti per l’industria enologica, anch’esse diffusamente presenti in Lombardia, qualora si assumano l’incarico di rendere dispo- nibili commercialmente le formulazioni di starter prodotte dalla ricerca, previo accordo con i partner del progetto. I destinatari indiretti sono i consumatori finali del vino e più in generale il sistema economico regionale che si avvantaggia nel fornire al mercato prodotti tipici e di qualità superiore con riper- cussioni positive anche nel comparto turistico.
  • 18. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese 2.1 Introduzione Nel corso di una vinificazione sono molteplici i fattori che posso- no influenzare la qualità del vino; tra questi, la gestione del vigne- to, le tecniche enologiche e le specie di lievito utilizzate (Ciani, 2009). In particolare, per quanto riguarda l’aspetto microbiologi- co, oggigiorno vi è un notevole interesse a migliorare la cono- 17 scenza di base riguardante la biodiversità dei lieviti a vocazione enologica che possono propagarsi durante la fermentazione al- colica (Agnolucci, 2007; Cappello, 2004; Guerra, 1999; Mercado, 2007; Vilanova, 2003). I lieviti vinari vengono classificati tra gli asco- miceti (Tabella 2.1) e comprendono sia i lieviti sporigeni capaci di formare meiospore (teleomorfici) che i lieviti asporigeni (anamorfi- ci), di cui non si conosce la fase sessuata. Saccharomyces cerevi- siae, sebbene rappresenti l’attore principale della fermentazione alcolica, non è l’unica specie riscontrata in vinificazione; infatti le principali forme di interesse enologico si ricordano quelle ap- partenenti ai generi: Candida (C. stellata, C. vini), Debaryomyces (D. hansenii, Candida famata), Dekkera (D. anomala, D. bruxel- lensis, B. bruxellensis), Issatchenkia (I. orientalis, I.terricola, Candida krusei), Hanseniaspora (H. uvarum, K. apiculata), Kluyveromyces (K. lactis, K. marxianus), Metschnikowia (M. pulcherrima, Candida pulcherrima), Pichia (P. anomala, P. fermentans, Candida pelli- culosa, C. valida) Saccharomyces (S. bayanus, S. cerevisiae, S. paradoxus, S. pastorianus, Candida robusta), Saccharomycodes (S. ludwigii) Schizosaccharomyces (S. pombe), Torulaspora (T. delbrueckii, Candida colliculosa), Zygosaccharomyces (Z. bailii). Quando si parla di “biodiversità” bisogna tener presente che essa
  • 19. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… può riguardare sia la “biodiversità interspecifica”, che comporta lo studio dell’ecologia dei microrganismi a livello di specie, che la “biodiversità intraspecifica”, dedicata al riconoscimento dei diver- si ceppi microbici appartenenti alla medesima specie. La compo- sizione della popolazione di lieviti associata ad un ambiente eno- logico può variare notevolmente a causa di diversi fattori quali, le condizioni climatiche, la varietà d’uva e la posizione geografica (Guillamon, 1996; Martinez, 2007). In particolare, la valutazione della biodiversità inter-specifica dei lieviti è rilevante per compren- dere l’evoluzione nel processo di vinificazione e di conseguenza aumentare la capacità di controllo del processo fermentativo. Divisione Ascomycota Classe: Archiascomycetes Ordine: Schizosaccharomycetales Famiglia: Schizosaccharomycetaceae Genere: Schizosaccharomyces 18 Classe: Hemiascomycetes Genere: Ordine: Saccharomycetales Metschnikowia Famiglia: Metschnikowiaceae Famiglia: Saccharomycetaceae Genere: Debaryomyces Dekkera Issatchenkia Kluyveromyces Pichia Saccharomyces Torulaspora Zygosaccharomyces Famiglia: Saccharomycodaceae Genere: Hanseniaspora Saccharomycodes Famiglia: Candidaceae Genere: Brettanomyces Candida Kloeckera Tabella 2.1 I lieviti di interesse enologico (Kurtzman e Fell, 1998).
  • 20. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese Lo sviluppo ed il miglioramento delle tecniche di biologia mo- lecolare hanno contribuito in modo significativo allo studio della biodiversità e delle caratteristiche genetiche dei lieviti. Attual- mente, le sequenze di DNA che vengono analizzate per l’identi- ficazione dei lieviti vinari sono sequenze geniche o intergeniche soggette a polimorfismi di lunghezza o di sequenza. Tra le tecni- che utilizzate vi sono: • Amplificazione degli spaziatori interni trascritti (Internal Transcri- bed Spacers, ITS) del DNA ribosomiale (rDNA); • Analisi RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) degli ITS (PCR-RFLP); • Analisi della sequenza dei domini D1/D2 del 26S rDNA. • Il DNA ribosomiale (rDNA) rappresenta un target ideale per l’i- dentificazione molecolare di una vasta gamma di organismi; il processo evolutivo che lo caratterizza è relativamente lento e consente la presenza al suo interno sia di sequenze altamente conservate, anche in specie molto diverse, sia di sequenze va- riabili, utili per confrontare specie più strettamente correlate. In- 19 dividui della stessa specie si caratterizzano per una sostanziale identità di sequenza dell’rDNA (limitato polimorfismo intraspe- cifico) mentre individui appartenenti a specie diverse presen- tano un’identità di sequenza tanto minore quanto maggiore è la loro distanza evolutiva (elevato polimorfismo interspecifico). In S. cerevisiae, l’rDNA è localizzato sul XII° cromosoma, dove sono presenti fino a circa 120 unità ripetute ciascuna costituita da quattro differenti geni: 18S, 5,8S, 26S e 5S. Le sequenze 18S e 26S sono separate dalla sequenza 5,8S dagli spaziatori interni trascritti (Internal Transcribed Spacers, ITS) come si può osserva- re in Figura 2.1 (Vincenzini, 2005). Figura 1.8 Rappresentazione schematica di un’unità di DNA ribosomiale Figura 2.1 Rappresentazione schematica di un’unità di DNA ribosomiale di lievito (Vin- cenzini, 2005).
  • 21. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… L’analisi PCR-RFLP degli ITS impiega dei primers disegnati sulla porzione 5’ del 18S rDNA e sulla porzione 3’ del 26S rDNA. Que- sti oligonucleotidi sono quindi disegnati su sequenze altamente conservate ed esterne alle regioni ITS variabili. Quest’ultima ca- ratteristica li rende universali, ossia consente il loro allineamento sul DNA stampo ad un numero elevato di specie. Il confronto dei prodotti di PCR, differenti tra le diverse specie per lunghezza e/o sequenza ne permette l’identificazione. Gli ampliconi possono essere lunghi da un minimo di 380 bp in Yarrowia lipolytica e Pi- chia pastoris ed un massimo di 1050 bp in Schizosaccharomyces pombe (Esteve- Zarzoso, 1999). Tuttavia, due o più specie possono essere caratterizzate da prodotti di amplificazione della medesima lunghezza ma di diversa sequenza; in questo caso il metodo prevede che gli amplificati vengano digeriti con enzimi di restrizione quali CfoI, HaeIII e HinfI che riconoscono sequen- ze specifiche sul DNA bersaglio e generano profili di restrizione caratteristici per ogni specie di lievito. Per accertare l’apparte- 20 nenza ad una specie nel caso in cui la restrizione delle ITS non sia sufficiente ci si avvale del sequenziamento del dominio D1/ D2 del gene 26S rDNA. Questa sequenza, che misura circa 600 bp, viene riconosciuta come il principale bersaglio per l’identifi- cazione di quasi tutti gli ascomiceti attualmente noti (Kurtzman e Robnett, 1998). Il sequenziamento di questa regione e la compa- razione della sequenza ottenuta con quelle disponibili in banche dati (GenBank o EMBL), mediante l’impiego gratuito on-line di algoritmi specifici (Basic Local Alignment Search Tool), consento- no l’attribuzione della specie al ceppo indagato. Secondo un’o- pinione correntemente accettata, differenze in più di sei basi su 600 indicano che i lieviti confrontati non appartengono alla stes- sa specie (Vincenzini, 2005). Sebbene ad oggi la ricerca scientifica si è concentrata princi- palmente sul controllo della fermentazione alcolica, molti lavo- ri affrontano lo studio dell’ecologia di lieviti sulle uve, sul mosto e anche nell’aria della cantina. In particolare, è stato eviden- ziato che il succo d’uva appena pressato ospita un’ampia va- rietà di specie di lieviti, soprattutto del genere Hanseniaspora, Pichia, Candida, Metschnikowia e Kluyveromyces. Di tanto in tanto, specie di altri generi come Cryptococcus, Rhodotorula, Debaryomyces, Issatchenkia, Zygosaccharomyces, Saccha-
  • 22. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese romycodes, Torulaspora, Dekkera, Schizosaccharomyces e Sac- charomyces sono stati isolati dalle uve (Jolly, 2006; Fleet, 2003, 2008; Prakitchaiwattana, 2004; Ribéreau-Gayon, 2000). Una fer- mentazione spontanea si caratterizza per la crescita di differenti specie di lievito che provengono dall’uva. Infatti, analisi micro- biologiche sulla flora dei lieviti associate a fermentazioni spon- tanee hanno permesso di stabilire che nella maggior parte dei casi avviene un sequenziale uso del substrato: inizialmente i lieviti presenti in numero maggiore sono gli apiculati (Hanseniaspora e Kloeckera), che, dopo tre-quattro giorni lasceranno il posto a S. cerevisiae (Martini, 1996; Pretorius, 2000). Il metabolismo di S. cerevisiae porta ad un accumulo di sostanze come etanolo, aci- di grassi a media catena e acetaldeide, che inibiscono le altre specie (Edwards, 1990; Bisson, 1999; Ludovico, 2001; Fleet, 2003). L’utilizzo di colture starter è un fattore fondamentale per la con- duzione di una fermentazione controllata e per l’inibizione dei lieviti indigeni. Tuttavia, diversi studi degli ultimi venticinque anni dimostrano che la crescita di K. apiculata e C. stellata non sono 21 completamente inibite nel corso di una fermentazione inoculata con culture starter (Heard e Fleet, 1985; Martinez, 1989). Infine, Garijo et al. (2008) hanno studiato la presenza di microrganismi di interesse enologico (lieviti, batteri e muffe) e la loro evoluzio- ne in aria di una cantina. In questo studio i lieviti isolati dall’aria appartenevano sia al genere Saccharomyces che al gruppo dei non-Saccharomyces. Il presente lavoro ha valutato la biodiversità dei lieviti coinvolti nel processo di produzione di vino spumante in Franciacorta ed Oltrepò Pavese durante le annate 2009, 2010 e 2011, dall’aria del vigneto, da mosto allo sgrondo (prima dell’aggiunta di SO2) e in vino base. Le caratteristiche dei lieviti selezionati per l’otte- nimento di un vino base spumante non differiscono da quelle dei lieviti utilizzati per la vinificazione di altri vini. Tuttavia, ceppi particolari possono essere selezionati e utilizzati per esaltare ca- ratteristiche aromatiche attraverso la scelta di specifiche attività enzimatiche. I lieviti utilizzati per la produzione di spumanti otte- nuti secondo il Metodo Classico devono però possedere uno svi- luppo di tipo flocculante e capacità di autolisarsi. La floccula- zione è un processo di auto-aggregazione tra le cellule di lievito che porta alla formazione di masse multicellulari (fiocchi), che
  • 23. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… sedimentano velocemente nei mezzi liquidi in cui sono sospese o galleggiano (“flottano”), a seconda delle dimensioni e della for- ma del fiocco. Lo sviluppo in aggregati accelera la separazione spontanea delle due fasi, per questo è preferibile utilizzare lieviti flocculanti per la rifermentazione in bottiglia: in questo modo le cellule depositandosi e non disperdendosi, sono più facilmen- te eliminate durante la seconda fermentazione e nella fase di sboccatura o dégorgement. La capacità delle cellule di autoli- sare e la conseguente liberazione nel vino di mannoproteine e acidi grassi è fondamentale sia per il conferimento di specifiche peculiarità sensoriali, sia per la stabilità proteica e anche per le caratteristiche del “perlage” (Vincenzini, 2005). 2.2 Materiali e Metodi 2.2.1 Campionamento e tecniche colturali 22 Lo studio è stato condotto durante le vendemmie 2009, 2010 e 2011 nei territori vitivinicoli lombardi di Franciacorta (Brescia) ed Oltrepò Pavese (Pavia). Per ogni anno, i campionamenti sono avvenuti nel mese di Luglio, Agosto ed Ottobre in corrispondenza con l’inizio della invaiatura dell’uva, il tempo della vendemmia e la produzione del vino base. Il piano di campionamento ha coin- volto: 13 vigneti e 8 cantine per la Franciacorta, e 11 vigneti e 11 cantine per l’Oltrepò Pavese. Campionamento dell’aria I campionamenti dell’aria sono stati realizzati durante il mese di Luglio e/o comunque quando il processo di invaiatura, con il quale inizia la maturazione delle bacche, era già abbastanza avanzato. Si ricordi che gli insetti sono i principali vettori di funghi. I campionamenti sono stati effettuati tramite l’utilizzo del cam- pionatore d’aria “SAS SUPER IAQ”, (Figura 2.2) con cui è possibile eseguire prove di tipo microbiologico, essendo dotato di suppor- to per piastra Petri.
  • 24. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese Figura 2.2 Air Sampler “MAS 100 Eco” di VWR International utilizzato per il campiona- mento. La piastra viene posta nell’apposito supporto, priva di coper- chio, con il terreno colturale rivolto verso la parte forata dell’ap- parecchio. Da quest’ultima, costruita in acciaio e disinfettata prima di ciascun campionamento con alcol etilico, si effettua l’a- spirazione dell’aria che andrà ad impattare, con quanto in essa eventualmente disperso (microrganismi, spore) sul terreno nutriti- 23 vo della piastra. Questo campionatore permette il prelevamen- to di precisi volumi, quindi l’ottenimento di risultati non soltanto qualitativi, ma anche quantitativi. Durante il campionamento lo strumento veniva trasportato manualmente tra i filari mantenen- dolo ad una distanza di circa 30 cm dalle piante e di 1-1,20 m dal suolo (in corrispondenza dei grappoli). Per ogni anno, gli stessi vigneti (tredici in Franciacorta e undici in Oltrepò Pavese) sono stati analizzati e, in ogni vigneto, due aliquote da 100 e 500 litri di aria ciascuno, replicate per due volte sono stati raccolti per le successive analisi microbiologiche. L’isolamento dei lieviti è stato effettuato utilizzando il terreno colturale YEPD [1% (w/v) Estratto di lievito, 2% (w/v) Peptone, 2% (w/v) Glucosio] addizionato con 2% agar e modificato nelle seguenti caratteristiche: pH 3,6, 200 mg/L K2S2O5 e 100 mg/L cloramfenicolo. Le piastre, ottenute dal cam- pionamento dell’aria, sono state incubate a 25°C in condizioni anaerobiche (Microbiologie Anaerocult®A; Merck, Darmstadt, Germania) per 5 giorni. Questa modifica è stata effettuata per evitare la crescita di muffe.
  • 25. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… Campionamento del mosto Il campionamento del mosto è stato eseguito a partire da metà del mese di Agosto, ed è proseguito fino ai primi giorni del mese successivo, in funzione dei diversi tempi di raccolta. I campioni sono stati prelevati, quando possibile, direttamente dalla pressa con l’ausilio di pipette sterili, altrimenti dalle vasche di raccolta poco dopo la pressatura, in entrambi i casi sempre prima che ve- nisse effettuato qualsiasi tipo di trattamento, solfitazione in parti- colare. Le aliquote prelevate, due da 50 mL ciascuna, sono state conservate in beute sterili e mantenute a 2-4°C fino al momento dell’analisi. Queste beute erano dotate di un tappo in silicone forato per permettere l’inserimento di un puntale, sterile e dotato di filtro a porosità 0,22 μm, al fine di consentire lo scambio gasso- so (liberazione della CO2 eventualmente formatasi in caso di fer- mentazione della matrice) mantenendo le condizioni di sterilità, quindi impedendo la contaminazione da parte di microrganismi esterni. I campioni di mosto sono quindi stati opportunamente 24 diluiti e piastrati su una piastra precedentemente preparata con terreno Wallerstein Laboratory Nutrient Agar (WL) (Merck, Ger- mania). Le analisi sono state eseguite in doppio. Successivamen- te un’aliquota di mosto (5 mL) è stata prelevata e trasferita in una beuta contenente 45 mL di brodo “YEPD selettivo” e l’insieme è stato messo ad incubare ad una temperatura di 25°C per 72-96 h in aerobiosi. Campionamento del vino base Il campionamento del vino base è stato eseguito approssimati- vamente verso la seconda metà del mese di Ottobre; il prodotto è stato prelevato (per ciascun campione sono state acquisite due aliquote da 10 mL ognuna) dalle vasche nelle quali ha fermenta- to ed è stato trasferito in provette sterili con tappo a vite per poter essere trasportato, previa refrigerazione e mantenimento a 2-4°C. Da ogni campione è stata allestita una serie di opportune dilui- zioni decimali in acqua peptonata che sono poi state piastrate su agar WL e messe ad incubare a 25°C per 72-96 h in aerobiosi. Conta in piastra I campioni di mosto e vino base sono stati opportunamente diluiti con acqua peptonata e 0,1 mL delle diluizioni sono stati se-
  • 26. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese minati, per spatolamento, in piastre contenenti terreno agar WL. Le piastre sono state poi messe ad incubare a 25° C per 72-96 h per permettere il completo sviluppo delle colonie. Il numero del- le unità formanti colonia (UFC) si ottiene applicando la formula della media ponderale: ∑c UFC/mL = ( 1 x n1 + 0.1 x n2) x d1 dove: c: numero di colonie delle piastre contabili; n1: numero di piastre della prima diluizione considerata contabile; n2: numero di piastre della seconda diluizione considerata con- tabile; d1: fattore di diluizione relativo alla prima diluizione considerata 25 contabile; Si considerano contabili le piastre che presentano tra 10 e 300 UFC. Allestimento della collezione di lievito Dopo un un primo striscio della colonia interessata e succes- siva incubazione a 25°C per 3 giorni, si è effettuato un secon- do striscio per assicurarsi della purezza della coltura e succes- siva incubazione a 25°C per 3 giorni. Tutti gli isolati così ottenuti sono allora stati preparati per la conservazione in modo stabi- le a -80°C inoculando una colonia isolata dal secondo striscio in brodo YEPD a 25°C per 48-72 h. Verificata l’uniformità delle colonie e l’assenza di contaminazione al microscopio, e quindi l’effettiva purezza della coltura, si è centrifugato a 3500 g per 15 minuti (Hettich Zentrifugen, rotina 380r), eliminato il surnatante, risospeso con brodo YEPD addizionato con 20% (v/v) di glice- rolo. Si è quindi in ultimo distribuito in provette e conservate a -80°C.
  • 27. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… 2.2.2 Tecniche molecolari Estrazione del DNA genomico Il protocollo per l’estrazione degli acidi nucleici da lievito utiliz- zato in questo lavoro è stato quello proposto da Querol (1992). In breve, le cellule sono state coltivate overnight in YEPD aggiunto di 0,1 g/Ll di cloramfenicolo. La coltura è stata centrifugata a 3500 rpm (Zentrifugen Hettich, Rotina 380r, Germania) per 15 min. Il pellet è stato sospeso in 500 μL di una soluzione contenente 0,9 M sorbitolo-EDTA 0,1 M, pH 7,5 a cui sono stati aggiunti 500 mg/ mL di zymolyase 100T (USBiological, USA) e 14mM ß-mercapto- etanolo. Le provette sono state incubate a 37°C per 60 min per lisare la parete cellulare. Gli sferoplasti così ottenuti sono stati centrifugati a 3500 g (Hettich Zentrifugen, Mikro 200, Germania) per 15 min e il pellet è stato sospeso in 0,5 mL di Tris-HCl 0,05 M, 0,02M EDTA pH 7,5. Dopo risospensione, 0,05 mL di sodio dodecil solfato (SDS) al 10% stato aggiunto e la miscela è stata incubata 26 a 65°C per 30 min. Subito dopo, 0,2 mL di acetato di potassio 5 M è stato aggiunto e le provette sono state poste in ghiaccio per 30 min. Il lisato è stato quindi centrifugato a 14000 g in una per 5 min. I surnatanti sono stati trasferiti in provette nuove ed il DNA è stato precipitato mediante aggiunta di 1 volume di iso- propanolo. Le provette sono state nuovamente centrifugate a 14000 g per 10 min. Il DNA è stato lavato con etanolo al 70%, e poi centrifugato a 14000 g per 5 min. Il pellet è stato essiccato a 50°C per 15 min, dissolto in 50 μL di TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) e mantenuto a 4°C per 12 h. L’estratto è stato trattato con 0,5 mg/mL RNasi (Fermentas, Lituania) a 37°C per 30 min. Infine, il DNA è stato conservato a -20°C. La concentrazione e la purezza di DNA è stata determinata misurando l’A260nm e l’A280nm. Amplificazione delle regione ribosomiale ITS1-5.8S-ITS2 L’amplificazione degli spaziatori interni (Internal Transcribed Spacer) compresi tra i geni 18S e 26S rDNA (ITS1-5.8S-ITS2) è stata eseguita in una miscela di 25 μL di reazione contenente: 1X di tampone (5 Prime, Amburgo), 2,5 mM di MgCl2 (5 Prime, Ambur- go), 200 mM di dNTPs (Fermentas, Lituania), 0,5 μM dei primers ITSL1 (5’GTTTCCGTAGGTGAACCTGC3’) e ITSL2 (5’ ATATGCTTA-
  • 28. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese AGTTCAGCGG-GT 3’) (Montrocher, 1998), 2 U di Taq DNA poli- merasi (5 Prime, Amburgo) e 80 ng di DNA. Dopo una fase iniziale di denaturazione del DNA a 95°C per 5 min, sul termociclatore (Eppendorf,) è stato impostato il seguente ciclo termico che veniva ripetuto per 35 cicli: denaturazione del DNA a 95°C per 5 min, appaiamento a 50°C per 1 min, estensione della doppia elica di DNA a 72°C per 1 min. Al termine dell’amplificazione è stata effettuata una fase di estensione finale a 72°C per 5 min al fine di permettere alla polimerasi di terminare le reazioni. Gli amplificati sono quindi stati controllati in elettroforesi su gel di agarosio 1% (w/v) in tampone TAE 1X (40 mM Tris-acetato, pH 8,2, 1 mM EDTA), 0,4 μg/mL di bromuro di etidio. Le immagini sono state acquisite con un transilluminatore UV GelDoc (Bio- Rad, Hercules, CA, USA). Analisi di restrizione delle ITS (ITS-RFLP) Successivamente, i prodotti di PCR sono stati sottoposti ad analisi di restrizione al fine di valutare i possibili polimorfismi ge- 27 netici (ITS-RFLP). Il protocollo utilizzato è stato quello descritto da Esteve-Zarzoso (1999) dove l’enzima CfoI è stato sostituito dall’i- soenzima di restrizione Hin6I (Fermentas, Lituania). I profili di re- strizione sono stati separati e visualizzati su gel di agarosio 1,5% (w/v) in tampone TAE 1X, 0,4 μg/mL di bromuro di etidio. Gli isolati che mostravano lo stesso profilo genetico sono stati raggruppati e circa il 10% di isolati di ogni cluster è stato sottoposto ad ampli- ficazione e parziale sequenziamento del dominio D1/D2 del 26S rDNA. Analisi di sequenza del dominio D1/D2 del 26S rDNA Le reazioni di amplificazione sono state effettuate in una mi- scela di 25 μL contenente 1X tampone (5 Prime, Amburgo), 2,5 mM di MgCl2 (5 Prime, Amburgo), 200 mM di dNTPs (Fermentas, Lituania), 0,1μM dei primers NL1 (5’GCATATCAATAAG-CGGAG- GAAAAG3’) e NL4 (5’GGTCCGTGTTTCAAGACGG3’) (Kurtzman, 1998), 2 U di Taq DNA polimerasi (5 Prime, Amburgo) e 80 ng di DNA. Dopo la fase di denaturazione iniziale a 94°C per 5 min, il profilo di temperatura è stato ripetuto per 35 cicli: denaturazio- ne a 94°C per 1 min, appaiamento a 52°C per 1 min, ed esten- sione a 72°C per 2 min. Al termine dell’amplificazione è stata ef-
  • 29. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… fettuata una fase di estensione finale a 72°C per 5 min. I prodotti di amplificazione sono stati controllati tramite elettroforesi in gel di agarosio 1.0% (w/v), in tampone di TAE 1X, 0,4 μg/mL di bro- muro di etidio e visualizzati con un transilluminatore UV GelDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). I prodotti di PCR sono quindi stati sottoposti a sequenziamento (Primm srl Milano, Italia) e le strin- ghe nucleotidiche sono state confrontate mediante algoritmo BLAST con le sequenze parziali del 26 rDNA delle specie depo- sitate nei databases dell’NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). L’attribuzione di un microrganismo ad una specie tiene in consi- derazione due percentuali risultanti dal confronto: la copertura e l’identità. Quando questi parametri sono pari o superiori al 97% può avvenire il riconoscimento a livello di specie. Discriminazione tra le specie S. cerevisiae, S. bayanus e S. pasto- rianus Un’ulteriore analisi è stata condotta su tutti gli isolati di lievito 28 identificati come appartenenti alla specie S. cerevisiae tramite l’impego delle tecniche ITS-RFLP e l’analisi della sequenza del gene 26S rDNA. Questa attività si è resa necessaria in quanto queste tecniche potrebbero erroneamente classificare come S. cerevisiae alcuni isolati invece appartenenti alla specie S. ba- yanus o S. pastorianus. Infatti, essendo queste specie filogene- ticamente molto vicine a S. cerevisiae e comprese nel gruppo dei S. cerevisiae sensu stricto, esse mostrano caratteristiche me- taboliche tali da permettere loro la crescita e sopravvivenza in vino. Per l’amplificazione sono stati utilizzati i primers costruiti sul gene HO e descritti da De Melo Pereira (2010). La singola colo- nia è stata dissolta direttamente nella miscela di reazione ed è stato effettuato un trattamento di rottura cellulare a 95°C per 30 min. La reazione di PCR per la discriminazione di S. cerevi- siae da S. pastorianus è stata condotta in una miscela di 25 μL contenente 1X tampone (5 Prime, Amburgo), 2,5 mM di MgCl2 (5 Prime, Amburgo), 200 μM di dNTPs (Fermentas, Lituania), 0,5 μM dei primers ScHO-F (5’GTTAGATCCCAGGCGTAGAACAG3’) e ScHO-R (5’GCGAGTACTGGACCAAATCTTATG3’), 1 U di Taq- DNA polimerasi (5 Prime, Amburgo). Dopo una denaturazione iniziale del DNA a 94°C per 5 min, il ciclo termico è stato ripe- tuto per 35 cicli e prevedeva: 94°C per 30 sec, 61°C per 30 (S.
  • 30. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese cerevisiae)/55°C (S. pastorianus) sec e 72°C per 2 min. Un’ul- teriore step di estensione finale a 72°C per 7 min è stata effet- tuata. La reazione di PCR per l’identificazione di S. bayanus è stata condotta nelle medesime condizioni sopra descritte ma impiegando i primers LgHO-F (5’TGGAAAGTCTACGAGAACA- AGCC3’) e LgHO-R (5’CCTCTATGTGAAGTCCGTATACTG3’) con temperatura di appaiamento a 55°C. L’elettroforesi è stata ese- guita in 0,8% (p/v) su gel di agarosio in TAE 1X tampone trattata con 0,4 ug/mL di bromuro di etidio. I prodotti di PCR sono stati fotografati sotto transilluminatore UV GelDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). 2.3 Risultati e Discussione 2.3.1 Collezione di ceppi di lievito Nel corso di questo studio è stato possibile creare una col- lezione di colture di lievito composta da 493 isolati riscontrati 29 e coinvolti nel processo di vinificazione nei territori lombardi di Franciacorta (Brescia) ed Oltrepò Pavese (Pavia) nelle anna- te 2009, 2010, 2011 e provenienti da aria, mosto e vino base (Tabella 2.2). Attualmente, questi lieviti sono conservati a -80°C presso i laboratori del Dipartimento di Scienze per gli Alimenti, la Nutrizione e l’Ambiente (DeFENS) dell’Università degli Studi di Milano. I risultati riguardanti il campionamento dell’aria del vigneto hanno mostrato che, sebbene il prelievo sia stato effettuato du- rante la maturazione dell’uva quando la circolazione degli inset- ti in vigneto era presente e assai favorita dalle condizioni clima- tiche, le percentuali di isolamento raggiungevano valori molto bassi e compresi tra 0-2% per entrambi i territori analizzati. Il cam- pionamento dell’aria presso i vigneti non trova molti precedenti in bibliografia: un recente lavoro svolto nella regione spagnola della Rioja nel 2006 ha previsto, tra gli altri, il campionamento di aria per verificare la presenza di lieviti batteri e muffe, ma all’in- terno della cantina. Nel lavoro citato è stata rilevata la presenza di molte muffe mentre lieviti e batteri in minore quantità e non prima dell’inizio della prima fermentazione alcolica e malolatti- ca, rispettivamente (Garijo, 2008).
  • 31. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… Vendemmia e Origine Numero di isolati Percentuale di isola- mento 2009 178 36% Franciacorta 95 19% ARIA 8 2% MOSTO 39 8% VINO BASE 48 10% Oltrepò Pavese 83 17% ARIA 9 2% MOSTO 22 4% VINO BASE 52 11% 2010 186 38% Franciacorta 112 23% MOSTO 91 18% VINO BASE 21 4% Oltrepò Pavese 74 15% ARIA 3 1% 30 MOSTO 56 11% VINO BASE 15 3% 2011 129 26% Franciacorta 58 12% MOSTO 35 7% VINO BASE 23 5% Oltrepò Pavese 71 14% ARIA 6 1% MOSTO 42 9% VINO BASE 23 4% Totale 493 100% Tabella 2.2 Lieviti isolati nel corso di 3 annate in Franciacorta (FCR) ed Oltrepò Pavese (OLT). I campioni di mosto sono stati raccolti allo sgrondo e prima dell’aggiunta di solforosa. Questi criteri sono stati adottati al fine di valutare la biodiversità interspecifica dei lieviti presenti sui due territori. Perché l’isolamento fosse rappresentativo del microbiota presente sull’uva, le colonie di lievito crescite dopo l’incubazione sono state isolate previa osservazione microscopica cellulare e macroscopica della forma e colore delle colonie. Quest’ultima
  • 32. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese operazione era facilitata dall’uso del terreno colturale WL (Wal- lerstein Laboratory Nutrient Agar) (Green e Grey, 1950) che, sep- pur non selettivo, consente di ottenere informazioni utili attraverso le variazioni di colore assunte dalle colonie. Infatti, esso contiene verde di bromocresolo, un indicatore di pH in grado di mettere in evidenza la capacità di acidificazione, e quindi le caratteristiche dei prodotti finali del metabolismo primario, in relazione alle diver- se specie di lievito (Figura 2.3). 31 Figura 2.3 Tipica morfologia e colorazione delle colonie di S. cerevisiae in crescita su terreno WL Agar. Le maggiori percentuali di isolamento da campioni di mosto derivano dalla vendemmia 2010 dove è stato raggiunto un va- lore del 18% per la Franciacorta e del 11% per l’Oltrepò Pavese. E’ stato invece il 2009 l’anno in cui sono stati raccolti più isolati da vino base (10% in Franciacorta e 11% in Oltrepò Pavese). Le colonie riscontrate durante l’isolamento presentavano morfolo- gie differenti: la forma è risultata generalmente tondeggiante e la colorazione, per gran parte delle colonie, variava dal bianco, al bianco a punta verde, al verde chiaro fino al verde scuro. Nel maggior numero degli isolati l’aspetto era liscio, seppur in qual- che situazione siano state osservate colonie dall’apparenza rugo- sa. Alcuni isolati presentavano una consistenza farinosa, mentre la maggior parte figuravano cremosi. Le colonie di colorazione rosa-lucide hanno consentito un’identificazione diretta dell’isola- to come appartenente al genere Rhodotorula. I dati riguardanti la carica microbica riscontrata dalle piastre di mosto tal quale indicano una concentrazione che si aggirava mediamente at- torno alle 105-106 UFC/mL. Il campionamento e l’isolamento di mi-
  • 33. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… crorganismi dal vino base è stato eseguito nel mese di Ottobre. Per alcune cantine la percentuale di isolamento è risultata molto bassa e la concentrazione cellulare risultava < 103 UFC/mL con campioni talvolta intorno a10 UFC/mL. Questo risultato era dovu- to al fatto che il prelievo, per ragioni tecniche, veniva realizzato dall’alto delle vasche senza agitazione e a fine fermentazione alcolica la massa cellulare risultava ormai decantata sul fondo. In generale, per quanto riguarda il numero totale di lieviti otte- nuti da aria, mosto e vino base, è stata osservata una differenza sia temporale (2009, 2010, 2011) che geografica (Franciacorta ed Oltrepò Pavese). L’annata 2011 è risultata quella durante la quale è stato isolato il minor numero di lieviti (26%), infatti per entrambi i territori si è registrata una diminuzione del numero di isolati del 10% rispetto al 2009 e del 12% nel 2010. L’area francia- cortina ha maggiormente contribuito a questo decremento; in particolare, la maggiore diminuzione nel numero di isolamenti è stato ottenuta dal campionamento del mosto. La scarsa quan- 32 tità e diversità di isolati di lievito raccolti potrebbe essere stata causata dalle negative condizioni meteorologiche che hanno caratterizzato il periodo precedente il campionamento. Di seguito è riportata la distribuzione degli isolati prelevati nei mosti e nei vini base per tutte le cantine e suddivisi per territorio (Figura 2.4) Figura 2.4 Numero di lieviti isolati (n) collezionati durante le annate 2009-2010-2011 a) nella zona di Franciacorta; b) nella zona dell’Oltrepò Pavese.
  • 34. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese 2.3.2 Biodiversità interspecifica L’identificazione di tutti e 493 isolati di lievito è stata ottenuta effettuando in sequenza: 1. Amplificazione delle regioni ITS1-5.8S-ITS2 (Internal Transcribed Spacers) (Figura 2.5); 2. Digestione degli amplificati con enzima Hin6I (Figura 2.5); 3. Costituzione di cluster in base ai profili di restrizione ottenuti; 4. Conferma dei cluster attraverso una seconda digestione con enzima HaeIII di circa il 25% degli isolati di ciascun gruppo; 5. Sequenziamento del gene 26S rDNA di circa il 10% degli isolati di ciascun cluster. 33 Figura 2.5 Esempio di corsa elettroforetica in gel di agarosio: a) dei prodotti di amplifi- cazione delle regioni ITS1-5.8S-ITS2 di alcuni isolati da mosto (sopra). M: Marker 100 bp (5 Prime, Amburgo); 1: Metschnikowia pulcherrima - Controllo positivo; 2: Hanseniaspo- ra spp. - Controllo positivo; 3: Schizosaccharomyces pombe - Controllo positivo; 4: Rho- dotorula spp. - Controllo positivo; 5: Zygosaccharomyces bailii - Controllo positivo; 6: Saccharomyces cerevisiae - Controllo positivo; 7: Issatchenkia spp. - Controllo positivo; 8: Saccharomyces bayanus – Controllo positivo; 9: Dekkera spp. - Controllo positivo; 10: Controllo negativo; 11-22: campioni da mosto. b) dei prodotti di digestione con enzimi di restrizione specifici (RFLP, enzima Hin6I) degli ampliconi ITS1-5.8S-ITS2 (sotto). M: Marker 100 bp (5 Prime, Amburgo); 1: Metschnikowia pulcherrima - Controllo positivo; 2: Hanseniaspora spp. - Controllo positivo; 3: Schizosaccharomyces pombe - Controllo positivo; 4: Rhodotorula spp. - Controllo positivo; 5: Zygosaccharomyces bailii - Con- trollo positivo; 6: Saccharomyces cerevisiae - Controllo positivo; 7: Issatchenkia spp. - Controllo positivo; 8: Saccharomyces bayanus – Controllo positivo; 9: Dekkera spp. - Controllo positivo; 10: pozzetto vuoto; 11-22: campioni da mosto; 23: pozzetto vuoto.
  • 35. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… L’attribuzione della specie per il gruppo S. cerevisiae sensu stricto si è conclusa con la verifica di una specifica tecnica PCR proposto da De Melo Pereira et al. (2010). Il protocollo è rapido e semplice ed è in grado di discriminare S. cerevisiae da S. ba- yanus e S. pastorianus. Tutti gli isolati di lievito che venivano clas- sificati come S. cerevisiae tramite ITS-RFLP e analisi del 26S rDNA dunque sono stati anche sottoposti ad identificazione attraverso l’amplificazione del gene HO. La Figura 2.6 mostra un esempio del prodotto di PCR per al- cuni isolati; l’amplicone caratteristico per S. cerevisiae ha una lunghezza di 400 bp. 34 Figura 2.6 Gel di agarosio 0,8% del amplificazione usando i primers specifici del gene HO di S. cerevisiae ScHO-F/ScHO-R. M: peso molecolare del DNA (GeneRuler 100 bp DNA Ladder, Fermentas, Italia); 1: S. cerevisiae (Institut Œnologique de Champagne; Collection de Levures d’intérêt Biotechnologique IOC 18-2007); 2-18: isolati di S. cere- visiae. Per quanto riguarda il campionamento dell’aria è stato possi- bile collezionare 26 isolati in tutto suddivisi in 6 differenti specie di lievito (Tabella 2.3). La più alta percentuale di isolati da aria, du- rante l’intero progetto triennale, è stata ottenuta dal prelievo del 2009 (65%). In Figura 2.7 e Figura 2.8 sono mostrate le percentuali di isolamento delle diverse specie di lievito e la loro distribuzione nelle tre annate. Il dato più interessante del campionamento ri- guarda il ritrovamento di S. cerevisiae (35% del totale degli isolati raccolti) nei campioni d’aria analizzati per le tre annate conse- cutive dallo stesso territorio. Inoltre, altre specie ambientali come Aureobasidium pullulans, Cryptococcus laurentii. Issatchenkia
  • 36. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese terricola e Rhodotorula glutinis vengono isolate con percentua- li tra il 19-8%. Pichia fermentans e Rhodotorula nothofagy sono state singolarmente isolate da campioni d’aria del 2010 e 2011. In particolare, nella zona di Franciacorta l’isolamento di lieviti è stato possibile solo nel corso del 2009. Vendemmia e Origine Numero di lieviti (n) Percentuale (%) 2009 17 65 Franciacorta 8 31 A. pullulans 4 15 C. laurentii 4 15 Oltrepò Pavese 9 35 S. cerevisiae 7 27 A. pullulans 1 4 I. terricola 1 4 2010 3 12 35 Oltrepò Pavese 3 12 S. cerevisiae 1 4 I. terricola 1 4 P. fermentans 1 4 2011 6 23 Oltrepò Pavese 6 23 S. cerevisiae 1 4 R. glutinis 4 15 R. nothofagi 1 4 Totale 26 100% Tabella 2.3 Identificazione degli isolati di lievito ottenuti dal campionamento dell’aria in Franciacorta (FCR) e Oltrepò Pavese (OLT), nel corso di tre annate.
  • 37. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… 36 Figura 2.7 Biodiversità osservata nei campioni di aria in Franciacorta e Oltrepò Pavese nel corso di tre annate. Figura 2.8 Distribuzione di isolamento e permanenza delle diverse specie di lievito isola- te da aria in Franciacorta ed Oltrepò Pavese nel corso di tre annate.
  • 38. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese Il campionamento del mosto ha portato all’isolamento di sva- riate specie di lievito. In totale, sono stati collezionati 285 isola- ti suddivisi in 25 differenti specie (Figura 2.9). I dati riguardanti la loro identificazione genetica sono presentati in Tabella 2.4. L’annata 2010 è stata quella durante la quale è stato raccolto il maggior numero di isolati da mosto con un totale di 147 lieviti, pari al 52% del totale, raccolti durante le tre annate su entrambi i territori analizzati. E’ stato proprio durante questo campiona- mento, inoltre, che si è potuta osservare la più alta biodiversità in termini di specie di lievito collezionate; 19 diverse specie sono state isolate, tra cui S. cerevisiae corrispondeva alla più alta per- centuale (44 isolati, circa 40% del totale dei S. cerevisiae isoal- ti da mosto nel triennio). Metschnikowia fructicola e Candida railenensis, con il 10% ed il 9% rispettivamente, raggiungevano la seconda e la terza maggiore incidenza percentuale. In par- ticolare, S. cerevisiae, Torulaspora delbrueckii ed Issatchenkia terricola erano specie presenti su entrambe le aree, mentre Metschnikowia fructicola, Hanseniaspora uvarum, Issatchenkia 37 occidentalis, Pichia anomala, Rhodotorula spp, Pichia ku- driavzevii, Pichia kluyveri, Zygoascus spp, Candida zemplinina, Candida parapsilosis, Cryptococcus flavescens e Pichia guillier- mondii erano specie presenti solo nella zona della Franciacorta. Invece, Candida railenensis, Pichia fermentans, Hanseniaspora uvarum, Issatchenkia terricola, Metschnikowia pulcherrima e Pi- chia membranifaciens erano ritrovate solo in Oltrepò Pavese. Infine, delle 19 specie identificate nel 2010, 8 specie venivano isolate solamente durante questa annata (Candida parapsi- losis, Candida railenensis, Cryptococcus flavescens, Pichia fer- mentans, Pichia guilliermondii, Pichia kudriavzevii, Rhodotorula spp, Zygoascus spp). Altre specie di lieviti, diversi rispetto a quelli già noti, sono sta- ti isolati nel corso della vendemmia 2009: Zygosaccharomyces bailii, comunemente presente in entrambe le aree e Candida diversa isolata solo in Oltrepò Pavese. Inoltre, entrambe queste specie si ritrovavano solamente nei mosti del 2009. Per quanto ri- guarda gli isolati del 2011, Kluyveromyces thermotolerans è stato per la prima volta isolato da entrambi i territori con una percen- tuale del 1,5%, Hanseniaspora vineae (1,8%) e Candida oleophi- la (0,4%) rappresentavano anch’esse nuovi isolamenti della sola
  • 39. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… Franciacorta, mentre Pichia fluxum (0,6%) è stato un nuovo isola- mento per l’Oltrepò Pavese. Per quanto riguarda la permanenza di specie di lievito in cam- pioni di mosto nel corso dei tre anni sui due territori, solo poche specie sono state riscontrate in annate successive. In particolare, il solo S. cerevisiae in Franciacorta e S. cerevisiae e H. uvarum in Oltrepò Pavese, si sono dimostrate specie stabilmente presenti sulle aree (Figura 2.10). Come riportato da Jolly (2003) i lieviti presenti nel mosto pos- sono essere suddivisi in due gruppi: uno rappresentato dai “lie- viti vinari” del genere Saccharomyces, l’altro comprendente i non-Saccharomyces. I lieviti Saccharomyces sono presenti, seb- bene in basso numero, anche sui grappoli, ma derivano prin- cipalmente dalle attrezzature di cantina (Vaughan-Martini & Martini, 1995; Boulton, 1996; Martini, 1996), e vengono trasferi- ti al mosto durante la pressatura (Peynaud e Domercq, 1959; 38 Lonvaud-Funel, 1996; Török, 1996; Mortimer e Polsinelli, 1999). Un’ ulteriore fonte di Saccharomyces, può essere data dalle colture starter addizionate dall’enologo. I lieviti non-Saccharomyces, si ritrovano abbondantemente sui grappoli (Martini, 1996) e pri- ma dell’inoculo con uno starter: sono i lieviti presenti in mag- gior misura nel mosto. La popolazione di non-Saccharomyces presente sui grappoli risulta molto variabile: sono stati ritrovati isolati appartenenti ai generi Brettanomyces, Candida, Cryp- tococcus, Hanseniaspora, Kloeckera, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Torulaspora (Ribéreau-Gayon, 1985; Fleet e Heard, 1993; Pretorius, 1999; Pramateftaki, 2000; Clemente-Jiménez, 2004; Chavan, 2009). I risultati ottenuti sono in disaccordo con quanto ritrovato da Ocón (2010) indagando la presenza di lieviti non-Saccharomyces sulle superfici e sulle strumentazioni della cantina e nel mosto. L’elevata variabilità di specie ascrivibili ai generi Candida, Cryptococcus, Pichia, Zygosaccharomyces, Torulaspora e Rhodotorula da loro rilevata su superfici e attrez- zature è stata qui invece osservata nel mosto. Non essendo stati effettuati campionamenti per indagare eventuale microflora presente sulle superfici delle strutture e delle attrezzature, non si può essere certi della reale provenienza degli isolati ricono- sciuti: essi potrebbero essere indigeni del mosto, quindi derivare
  • 40. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese dai grappoli, oppure frutto della contaminazione di quest’ulti- mo con la microflora presente in cantina, per fermentazioni già avviate, o perché comunque presenti sulle attrezzature (presse e pompe in particolare) (Phaff e Knapp, 1956; Lachance, 1994; Mortimer e Polsinelli, 1999). Complessivamente l’analisi del mo- sto ha portato all’isolamento di 285 colonie di lievito, di cui solo il 32% risultate appartenenti alla specie S. cerevisiae. In accordo con quanto riportato in bibliografia, la maggior parte della po- polazione micetica rilevata nel mosto, apparteneva al gruppo non-Saccharomyces (68%). Di particolare interesse risulta l’isola- mento della specie I. terricola che raramente è stata isolata da mosto o vino in fermentazione (Sabate, 2002; Di Maro, 2007) ed è stata associata ad una bassa capacità fermentativa ed ele- vata produzione di acetato d’etile, determinando la formazio- ne di off-flavours (Clemente-Jimenez, 2004). Le minori citazioni in bibliografia riguardo la specie C. zemplinina sono da attribuire alla sua recente descrizione (Sipiczki, 2003) e distinzione da C. stellata. Entrambi sono lieviti “fruttosofili”, ma la maggior espres- 39 sione di tale caratteristica in C. zemplinina ha indotto un più approfondito studio riguardo al suo sviluppo per una potenziale riconsiderazione della specie per il controllo delle fermentazioni. Ciò sarebbe particolarmente interessante per la produzione di vini ottenuti da uve botritizzate, sulle quali queste specie sono spesso ritrovate (Magyar e Tóth, 2011). Alcuni autori (Csoma e Sipiczki, 2008) ritengono che sia Candida zemplinina invece di Candida stellata a trovarsi sui grappoli e nelle fermentazioni dei mosti, e suggeriscono che le due specie potrebbero essere state spesso confuse nelle prime pubblicazioni; in effetti, le pubblica- zioni più recenti sulla microflora vinaria, e come anche risultato in questo studio, riportano soltanto la presenza di C. zemplinina, senza rilevare popolazioni di C. stellata (Nisiotou, 2007; Lopan- dic, 2008; Tofalo, 2009).
  • 41. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… Vendemmia e Origine Numero di isolati (n) Percentuale (%) 2009 61 21,4 Franciacorta 39 13,7 S. cerevisiae 22 7,7 Zygosaccharomyces bailii 11 3,9 Issatchenkia occidentalis 6 2,1 Oltrepò Pavese 22 7,7 S. cerevisiae 14 4,9 Zygosaccharomyces bailii 4 1,4 Issatchenkia terricola 1 0,4 Candida zemplinina 1 0,4 Candida diversa 1 0,4 Hanseniaspora uvarum 1 0,4 2010 147 51,6 Franciacorta 91 31,9 S. cerevisiae 27 9,5 Metschnikowia fructicola 15 5,3 Hanseniaspora uvarum 13 4,6 Pichia kluyveri 10 3,5 Issatchenkia occidentalis 5 1,8 Issatchenkia terricola 5 1,8 Torulaspora delbrueckii 4 1,4 40 Pichia anomala 3 1,1 Pichia kudriavzevii 2 0,7 Rhodotorula spp 2 0,7 Candida parapsilosis 1 0,4 Candida zemplinina 1 0,4 Zygoascus spp 1 0,4 Pichia guilliermondii 1 0,4 Cryptococcus flavescens 1 0,4 Oltrepò Pavese 56 19,6 S. cerevisiae 17 6,0 Candida railenensis 14 4,9 Torulaspora delbrueckii 6 2,1 Pichia fermentans 5 1,8 Hanseniaspora uvarum 4 1,4 Issatchenkia terricola 4 1,4 Metschnikowia pulcherrima 3 1,1 Issatchenkia occidentalis 2 0,7 Pichia membranifaciens 1 0,4 2011 77 27,0 Franciacorta 35 12,3 S. cerevisiae 16 5,6 Torulaspora delbrueckii 6 2,1 Hanseniaspora vineae 5 1,8 Kluyveromyces thermotolerans 3 1,1 Metschnikowia pulcherrima 2 0,7 Candida oleophila 1 0,4 Hanseniaspora uvarum 1 0,4 Candida zemplinina 1 0,4
  • 42. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese Oltrepò Pavese 42 14,7 S. cerevisiae 16 5,6 Metschnikowia fructicola 8 2,8 Hanseniaspora uvarum 5 1,7 Candida zemplinina 3 1,0 Torulaspora delbrueckii 3 1,0 Pichia fluxum 2 0,6 Pichia anomala 1 0,4 Pichia kluyveri 1 0,4 Pichia membranifaciens 1 0,4 Candida glabrata 1 0,4 Kluyveromyces thermotolerans 1 0,4 Totale 285 100,0% Tabella 2.4 Identificazione genetica degli isolati da mosto in Franciacorta (FCR) ed Oltrepò Pavese (OLT), nel corso delle tre annate. 41 Figura 2.9 Biodiversità osservata nei campioni di mosto in Franciacorta ed Oltrepò Pa- vese nel corso delle tre annate.
  • 43. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… 42 Figura 2.10 Permanenza delle specie di lievito in campioni di mosto, durante le tre an- nate a) in Franciacorta; b) in Oltrepò Pavese. Dal campionamento del vino base sono stati ottenuti 182 iso- lati di lievito (circa il 37% della collezione totale di lievito); i risultati della loro identificazione genetica sono mostrati in Tabella 2.5. In totale sono state identificate 10 diverse specie di lievito (Fi- gura 2.11). Come previsto, S. cerevisiae ha rappresentato la spe-
  • 44. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese cie dominante in vino base, a fine fermentazione alcolica, sia in Franciacorta (35%) che in Oltrepò Pavese (41%). In letteratura si riporta che questa specie, infatti, rappresenta la quasi totalità di lieviti in vino a fine fermentazione alcolica, mentre le specie H. uvarum e Zygosaccharomyces (non corrispondente al qui ritrovato Z. bailii) risultano solo raramente isolabili (Gonzales, 2007). Al termine della fermentazione alcolica anche in questo caso la popolazione di S. cerevisiae era prevalente (76%), anche se non al livello presentato da Gonzales (99%). Il secondo genere più rappresentativo è risultato Pichia (20%), seguita dalle specie H. uvarum e Z. bailii (3%), quest’ultima una specie che può essere riscontrata a fine fermentazione più facilmente rispetto ad altre, grazie alla sua elevata alcol-tolleranza (Fleet, 2003). L’annata 2009 è stata quella in cui è stato isolato il maggior numero lieviti; 100 isolati, di cui il 27% dal campionamento di vino base della Franciacorta e 29% per Oltrepò Pavese. Durante questa annata, un totale di 6 differenti specie di lieviti sono state isolate (Tabella 2.5). Questo risultato potrebbe derivare dal fat- 43 to che in realtà la biodiversità interspecifica più elevata è stata ottenuta dal campionamento del 2010, dove sono state isola- te 8 differenti specie di lievito (Tabella 2.5). In generale, occorre notare che in alcuni campioni di vino base è stata rilevata la presenza di una sola specie; le condizioni del mezzo, con basso pH, presenza di SO2 ed elevata concentrazione di etanolo, costi- tuiscono fattori selettivi importanti soprattutto per le specie non- Saccharomyces. Tuttavia alcuni studi hanno dimostrato da parte di alcuni ceppi una maggior tolleranza all’etanolo; la loro con- seguente maggior persistenza nel mezzo può influenzare l’impat- to sensoriale del prodotto finale (Pramateftaki, 2000; Combina, 2005; Gonzáles, 2007). Per quanto riguarda la permanenza di specie di lievito in cam- pioni di vino base nel corso delle tre annate sui due territori, solo poche specie sono state re-isolate. In particolare, S. cerevisiae e P. membranifaciens in Franciacorta ed il solo S. cerevisiae in Ol- trepò Pavese, si sono mostrate specie stabilmente presenti sulle aree analizzate (Figura 2.12).
  • 45. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… Vendemmia e Origine Numero di isolati Percentuale 2009 100 55 Franciacorta 48 27 S. cerevisiae 32 18 Pichia membranifaciens 9 5 Pichia fluxum 3 2 Zygosaccharomyces bailii 2 1 Issatchenkia occidentalis 1 1 Torulaspora delbrueckii 1 1 Oltrepò Pavese 52 29 S. cerevisiae 52 29 2010 36 20 Franciacorta 21 12 S. cerevisiae 11 6 Hanseniaspora uvarum 3 2 Pichia membranifaciens 3 2 Pichia spp 2 1 Zygosaccharomyces bailii 1 1 Issatchenkia occidentalis 1 1 Oltrepò Pavese 15 8 S. cerevisiae 6 3 44 Candida railenensis 4 2 Pichia fermentans 3 2 Hanseniaspora uvarum 2 1 2011 45 25 Franciacorta 23 13 S. cerevisiae 20 11 Pichia membranifaciens 3 2 Oltrepò Pavese 23 25 S. cerevisiae 16 17 Pichia fluxum 5 5 Pichia membranifaciens 1 1 Zygosaccharomyces bailii 1 1 Totale 182 100% Tabella 2.5 Identificazione genetica degli isolati da vino base in Franciacorta (FCR) ed Oltrepò Pavese (OLT), nel corso delle tre annate.
  • 46. Capitolo 2. Indagine sull’ecologia di lieviti enologici in Franciacorta ed Oltrepò Pavese Figura 2.11 Biodiversità interspecifica osservata nei campioni di vino base in Francia- corta ed Oltrepò Pavese nel corso delle tre annate. 45
  • 47. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico… 46 Figura 2.12 Permanenza delle specie di lievito in campioni di vino base, durante le tre annate a) in Franciacorta; b) in Oltrepò Pavese.
  • 48. Capitolo 3. Tipizzazione molecolare dei ceppi di S. cerevisiae … Capitolo 3. Tipizzazione molecolare dei ceppi di S. cerevisiae per il riconoscimento di ecotipi autoctoni 3.1 Introduzione Le caratteristiche sensoriali di un vino possono dipendere dalle diverse tipologie di lieviti coinvolte nel processo di fermentazio- ne, ed in particolare dai differenti ceppi di S. cerevisiae che si succedono durante la vinificazione (Agnolucci, 2007; Capece, 47 2010; Guerra, 1999, Mercado, 2007, Vilanova 2003). Lo studio della biodiversità dei ceppi di lievito appartenenti alla stessa spe- cie ci permette di capire l’evoluzione delle popolazioni presenti nel mosto durante la vinificazione per incrementarne il controllo, inoltre i ceppi autoctoni caratterizzati da tipici tratti enologici po- trebbero essere caratteristici di una particolare zona vitivinicola. La presenza di questi lieviti determina un aumento della tipicità di un vino, promuovendo la diversificazione dei prodotti vitivinicoli e della zona di origine. La maggior parte delle ricerche condotte fino ad ora hanno concentrato il loro studio sul controllo della fermentazione alcolica (Caruso, 2002; Redz epovic 2002; Versa- ˇ ´, vaud, 1995), anche se non sono mancate le indagini sullo studio dell’ecologia dei lieviti delle uve, del mosto e dell’aria presente nella cantina di vinificazione (Jolly, 2006; Fleet, 2002; Fleet, 2003; Fleet, 2008; Prakitchaiwattana, 2004; Ribéreau-Gayon, 2000; Ga- rijo, 2008). Per quanto riguarda la tipizzazione dei lieviti, sono state svilup- pate differenti metodologie, basate sullo studio dei polimorfismi del DNA, al fine di discriminare tra ceppi appartenenti alla stessa specie (Querol, 1992, Ness, 1993; Schuller, 2004). Essendo S. cere- visiae il lievito enologico più importante, i ricercatori hanno fina-
  • 49. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico … lizzato le loro attività sullo studio di questa specie, evidenziando significativi polimorfismi in ceppi di S. cerevisiae indigeni prove- nienti da differenti regioni vitivinicole ed una forte correlazione tra genotipo e proprietà fenotipiche (Esteve-Zarzoso, 2000; Na- dal, 1996). Nel tempo sono state sviluppate alcune tecniche molecola- ri tra cui RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA; McGrath, 1998; Perez, 2001), l’analisi dei loci SSR (Single Sequence Repe- at; Ayoub, 2006) e l’analisi delle sequenze interdelta (Ness, 1993). Queste tecniche si sono rivelate utili per lo studio dell’evoluzione di popolazioni di lieviti nel corso di un processo fermentativo, per l’identificazione di un ceppo con caratteristiche peculiari e per la valutazione della biodiversità all’interno di un’area geografica. L’analisi delle sequenze interdelta è stata proposta per la pri- ma volta da Ness (1993) per la tipizzazione di ceppi di S. cerevi- siae tramite l’analisi del polimorfismo interdelta (IDM, interdelta 48 marker). Il genoma di S. cerevisiae contiene sequenze ripetute di DNA, le sequenze delta, associate al trasposone Ty1 (Came- ron, 1979). Gli elementi trasponibili o trasposoni sono frammenti di DNA che hanno in comune la capacità di muoversi da un punto all’altro del genoma e di amplificare il proprio numero di copie all’interno dell’ospite. Gli elementi delta costituiscono le ripetizioni terminali (LTR) della sequenza dei trasposoni Ty1 e Ty2 in lievito; questi si possono trovare sia associati al retrotrasposo- ne, sia dispersi nel genoma, in questo caso prendono il nome di “elementi delta” (Legras e Karst, 2003). Eventi di ricombinazio- ne possono espellere la sequenza centrale del retrotrasposone lasciando nella posizione originaria una singola LTR, spiegando la presenza di molte copie di LTR, prive del trasposone, disper- se nel genoma. Il genoma di S. cerevisiae è caratterizzato dalla presenza di 5 famiglie di retrotrasposoni, di cui quattro rientrano nella categoria degli elementi di tipo “Ty1-copia” (Ty1, Ty2, Ty4, Ty5) ed uno (Ty3) nella categoria degli elementi di tipo “gypsy”. Entrambe le classi presentano un’organizzazione simile a quella dei retrovirus (Boeke e Corces, 1989; Doolittle, 1989), ma differi- scono tra loro per la disposizione dei geni: mentre negli elementi tipo “gypsy” la funzione integrasica (INT, importante per l’integra- zione del trasposone nell’ospite) è localizzata all’estremità di Pol
  • 50. Capitolo 3. Tipizzazione molecolare dei ceppi di S. cerevisiae … (parte della sequenza che codifica gli enzimi implicati nel ciclo vitale del trasposone), preceduta dall’RNAasiH, in Ty1-copia INT si trova all’interno del gene Pol, seguito dalla sequenza codifican- te per la retrotrascrittasi (RT) e da quella per l’RNAsiH (Figura 3.1). Tra queste famiglie solo Ty1, Ty2 e Ty3 risultano essere attive nella trasposizione all’interno del genoma. Figura 3.1 Struttura del retrotrasposone di tipoTy1-copia (INT prima di RT) e Ty3-gypsy (INT dopo RH). 49 Come dimostrato da diversi autori (Legras e Karst, 2003; Schul- ler, 2004), il numero (S. cerevisiae può contenere da 2 a 30 co- pie dei 5 elementi trasponibili) e la posizione di questi elementi hanno una certa variabilità intraspecifica che può essere utiliz- zato come un’impronta digitale genetica per identificare i cep- pi di S. cerevisiae (Xufre, 2011). I marcatori Interdelta sfruttano questo polimorfismo. Si tratta di una metodica che prevede una amplificazione mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) di frammenti di DNA situati tra due trasposoni (Ness, 1993). Ai fini dell’amplificazione, è necessario progettare dei primers (sequen- ze omologhe al DNA) che si appaino ad entrambe le estremità delta (δ). L’amplificazione delle sequenze interdelta è conosciuta per essere altamente specifica per l’identificazione di ceppi di S. cerevisiae rispetto ad altri lieviti (Ness, 1993). Pramateftaki (2000) analizzando le sequenze δ di 500 isolati di un’area vitivinicola del- la Grecia ha ottenuto dei profili di amplificazione esclusivamente da isolati di S. cerevisiae. Poiché l’amplificazione delle sequenze inter-δ sembra essere efficace per la tipizzazione, molti studi ne sono seguiti per otti- mizzare la tecnica. Infatti, Legras e Karst (2003) progettando una
  • 51. Valorizzazione delle D.O.C.G. Franciacorta ed Oltrepò Pavese metodo classico … nuova coppia di primers hanno ottenuto un netto miglioramento del polimorfismo dei profili genetici. Tristezza (2009) ha adottato la tecnica dell’elettroforesi capillare ai marcatori Interdelta per la genotipizzazione di ceppi di S. cerevisiae, ottenendo un miglio- ramento nella sensibilità e precisione della tecnica. Un ampio studio delle biodiversità intraspecifica di S. cerevisiae porta alla possibilità di isolare nuovi ceppi indigeni che potreb- bero sostituire quelli attualmente in commercio impiegati nella produzione di vino, considerando che quelli indigeni risultano più adatti alla crescita in uno specifico mosto e riflettono maggior- mente la biodiversità di una regione vitivinicola. Per questo mo- tivo, nazioni come Argentina (Combina, 2005; Mercado, 2007), Spagna (Blanco, 2006; Garijo, 2008; Gonzales, 2007; Torija, 2001; Sabate, 2002), Francia (Valero, 2007), Austria (Lopandic, 2007), Croazia (Redz epovic 2002), Slovenia (Raspor, 2006), Ungheria ˇ ´, (Csoma, 2010), Grecia (Nikolaou, 2007; Nisiotou e Nychas, 2007), Sud Africa (Jolly, 2003; Pretorius, 1999), India (Chavan, 2009) e 50 Giappone (Shinohara, 2003) hanno condotto ricerche volte a valutare la biodiversità dei lieviti da vino in alcune delle principali regioni vitivinicole. In Italia, medesimi studi sono stati condotti nel- le regioni Marche (Guerra, 1999), Basilicata (Caruso, 2002), Puglia (Cappello, 2004) e Sicilia (Romancino, 2000). Dal momento che la regione Lombardia è una delle più impor- tanti regioni italiane per la produzione di vino spumante, lo scopo di questo lavoro è stato la valutazione della biodiversità intraspe- cifica degli isolati di S. cerevisiae raccolti durante il processo di produzione del vino in Franciacorta (Brescia) ed Oltrepò Pavese (Pavia). Una caratterizzazione molecolare a livello di ceppo è stata condotta tramite l’utilizzo della tecnica molecolare IDM per gli isolati di S. cerevisiae campionati da aria, mosto e vino duran- te le stagioni produttive del 2009, 2010 e 2011. 3.2 Materiale e Metodi Isolamento dei campioni La tipizzazione è stata condotta per tutti i 272 isolati di S. cerevi- siae collezionati nel corso del progetto (Tabella 3.1). Nello studio è stata inclusa l’analisi di 48 lieviti commerciali, alcuni dei quali