O documento discute a metaplasia e o gene CDX2 no contexto do cancro gástrico. Apresenta várias técnicas como imunohistoquímica, imunofluorescência e RT-PCR usadas para detectar a presença de metaplasia intestinal e a expressão do gene CDX2 em amostras de tecido gástrico. Discute também o papel da bactéria H. pylori na indução da metaplasia e subsequente desenvolvimento de cancro gástrico.
Rna E SíNtese ProteíNas.Ppt Modo De Compatibilidade
Patologia GáStrica
1. PATOLOGIA GÁSTRICA
METAPLASIA E CDX2
Ana Mariz
27 Julho – 7 Agosto 2009 Cláudia Correia
2. Tipo difuso Tipo intestinal
Aproximadamente 95% dos casos são
esporádicos
«Já estávamos contentíssimos com a repercussão do trabalho e tivemos agora a
cereja em cima do bolo.»
3. Cancro gástrico do tipo difuso –
tem tendência para se estender
por outras regiões
5. PORTUGAL
80%
Têm a bactéria
30%
Robin Warren e Barry Marshall Apresenta metaplasia
intestinal
7%
Desenvolve cancro gástrico
6. H.pylori consegue desenvolver-se A urease converte ureia em amoníaco e
graças à enzima urease dióxido de carbono
Do amoníaco resulta um género de auréola que cria um micro ambiente favorável à bactéria
http://www.sumanasinc.com/scienceinfocus/helicobacter/helicobacter_fla.html
A bactéria desloca-se com a ajuda da sua “cauda”
Liberta compostos que causam a
Propulsiona-se através do muco que protege as célulasdeteorização das células
epiteliais do estômago
Agrega-se às células epiteliais e usa a urease para
desacidificar o micro ambiente destas
7. Aparecimento de células intestinais ao nível de
tecido gástrico
Fase que antecede o cancro e resulta da inflamação das
células devido à presença de H.pylori
8. Gene que normalmente se expressa
apenas em células intestinais
Factor de transcrição intestinal
Expressão anormal no estômago - metaplasia intestinal
9. Estudo da expressão do CDX2 ao nível
de mRNA e proteína em tecidos
gástricos e em linhas celulares de
carcinoma
Técnicas utilizadas
Imunohistoquímica RT-PCR
Imunofluorescência
10. Método Directo Método Indirecto
Interacção anticorpo antigénio
Utilização de anticorpo
Utilização de um só primário e anticorpo
anticorpo secundário
Permite determinar a presença de proteínas
Maior Amplificação do sinal
11. • Desparafinação e hidratação • Fixação
• Recuperação antigénica
• Bloqueio da peroxidase endógena
• Soro Normal
• Anticorpo primário
• Anticorpo secundário biotinilado • Anticorpo Secundário conjugado
com FITC
• Sistema de Amplificação ABC
• Substracto cromogénico
• Contraste nuclear
• Desidratação • Montagem Vectashield
• Montagem Entellan
Resultados
12. Antes de começar a técnica de RT-PCR o RNA tem que ser extraído.
As principais etapas são:
Centrifugação
• Provoca a lise
Clorofórmio • Usado para
celular e é inibidor precipitar o RNA
de RNAses • Separa as 3 fases:
aquosa – RNA;
interfase – DNA;
orgânica - proteínas
TRI reagent Isopropanol
Deixa-se secar para completa evaporação de resíduos indesejáveis e, após a
resuspensão, congela-se para depois ser usado para a técnica de RT-PCR.
14. O RT-PCR utiliza RNA que, com a ‘ajuda’ da enzima transcriptase reversa, vai originar uma
cadeia de DNA complementar, o cDNA.
Esta técnica baseia-se nos seguintes passos:
1. Num eppendorf junta-se:
RNA
RH
Água
RT
Buffer – solução
“tampão”
RNAse out
DTT
2. Vai para o termociclador onde a enzima vai originar cDNA a partir do RNA.
15. O PCR é um método de amplificação do DNA obtido na técnica anterior, o RT-PCR.
Buffer
“solução
tampão”
Cloreto de
cDNA magnésio
MgCl2
Eppendorf
Enzima
Taq dNTPs
polimerase
Primer Primer
reverse forward
16. Leva-se ao termociclador onde vai ser submetido a diversas temperaturas:
95ºC
Desnaturação e separação da molécula de DNA em duas cadeias
simples
52ºC
Cada primer liga-se a uma das cadeias, um no inicio (primer forward) e
o outro no final (primer reverse)
72ºC
Temperatura óptima para a enzima actuar e sintetizar as cadeias
complementares das duas simples existentes
Ao fim de 25/35 ciclos obteve-se uma replicação exponencial das cadeias de DNA.
O produto foi visto após realizar a técnica de electroforese em gel de agarose.
22. • O estudo da metaplasia é essencial para a compreensão do cancro gástrico.
• Não se pode ignorar o papel do gene CDX2 e da sua proteína como localizadores de
metaplasia.
• Utilizando técnicas como a imunohistoquímica, a imunofluorescência e o RT-PCR/PCR
é possível detectar a existência ou não de metaplasia num determinado tecido.
Esta experiência foi bastante enriquecedora uma vez que contribuiu para a nossa
cultura cientifica e fez-nos despertar para a importância da investigação.