IHQ

1. ELISA
Enzyme-Liked
Immunosorbent Assay
Prueba Inmunoadsorbente Ligado a Enzimas
Realizado por: Cristina Barón Lozano

2. Antes de nada
quería recordaros
que…

ANTÍGENO (Ag):
Molécula exógena, que se encuentra
en la superficie de un agente patógeno,
y que al entrar en contacto con el
organismo, induce la producción de una
respuesta del Sistema Inmune específica
(formación de Acs)

ANTICUERPO (Ac):
Proteína producida como respuesta a una sustancia “extraña” (Ag)
y que tiene la capacidad de combinarse con él (complejo Ag-Ac).

3. ¿Qué es un INMUNOENSAYO?

Es una prueba que usan complejos antígeno:anticuerpo
(también denominados inmunocomplejos) para medir la
presencia de un analito¹ específico en una muestra.
“Inmuno” se refiere a una respuesta inmunológica que hace
¹Analito es todo
que el cuerpo genere anticuerpos, y “ensayo” se refiere a una que se mide en
lo
prueba de
prueba. Entonces, un inmunoensayo es una prueba que utilizaunalaboratorio.
inmunocomplejos cuando hay una unión Ag-Ac.
En el
inmunoensayo, el
analito puede ser
tanto un Ac como
pruebas
un Ag.

Los Inmunoensayos se diferencian de otros tipos de
de laboratorio (como las pruebas colorimétricas) ya que usan
complejos Ac-Ag para generar una señal que pueda medirse.

Los Acs son la base de los inmunoensayos, ya que poseen
una alta especificada y afinidad para un Ag específico. Es
esta unión lo que permite la detección de analitos por medio
de una variedad de técnicas de inmunoensayo.

4. INTRODUCCIÓN:

El método ELISA, se basa en el uso de Ags o Acs
marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto
inmunológica como enzimática.

Al estar uno de los componentes (Ag o Ac) marcado
con una enzima e insolubilizado sobre un soporte o
pocillo (inmunoadsorbente) la reacción Ag-Ac quedará
inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada
mediante la adición de un substrato especifico que al
actuar, la enzima producirá un color observable a
simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotómetro o un colorímetro.

5. TIPOS:

ELISA no competitivo:
Consiste en enfrentar la muestra con el Ag o Ac que está en la
fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo AgAc, y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato
desarrollando color.
 Directo: Detectan Ag
 Indirecto: Detectan Ac
 ELISA Sandwich



Doble (DAS)
Heterólogo (HADAS)
ELISA competitivo:
El Ac de la muestra va a competir con el conjugado por un
número limitado de sitios de unión del Ag. Habrá ausencia de color en
una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la

6. Pasos generales…
El primero es el
ELISA directo,
seguido del indirecto
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Tapizado del pocillo con el Ag o
Ac.
Adición de la muestra problema
con la mezcla de Ags o Acs.
Unión del Ag o Ac específico al Ag
o Ac tapizado en el pocillo.
Lavado del pocillo para eliminar el
exceso de Ag o Ac no unido.
Adición del Ac secundario
marcado con la enzima.
Unión del Ac secundario al Ag o
Ac.
Lavado del pocillo para eliminar el
exceso de enzima no unida.
Adición del sustrato.
Unión del sustrato a la enzima.
Coloración.

7. ELISA directo
Consta de las siguientes etapas:
1.
2.
3.
4.
Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Acs específicos.
Lavado con solución salinaTween 20 como agente tensioactivo
(ph-7,2) para eliminar los Acs fijados deficientemente o no fijados.
Adición de Ags marcados (“conjugados”) con una enzima; si los
Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedará solubilizado.
Lavado para eliminar los Ags marcados que no hayan
reaccionado.

8. ELISA directo
5.
Adición de un substrato sobre el que sea capaz
de actuar la enzima marcadora.
6.
Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
Los lectores ELISA
se llaman
espectrofómetros!
!

9. ELISA indirecto
Consta de las siguientes etapas:
1.
2.
3.
4.
Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Ags específicos.
Lavado con solución salina Tween 20 como agente tensioactivo
(ph-7,2) para eliminar los Ags fijados deficientemente o no fijados.
Adición de Acs marcados (“conjugados”) con una enzima; si los
Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedará solubilizado.
Lavado para eliminar los Acs marcados que no hayan
reaccionado.

10. ELISA indirecto
5.
Adición de un substrato sobre el que sea capaz
de actuar la enzima marcadora.
6.
Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

11. ELISA indirecto
Por si no les ha
quedado claro…

12. LECTURA E INTERPRETACIÓN
DE RESULTADOS:

Una de las grandes ventajas de la técnica
ELISA es la posible automatización de la
lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha
automatización se puede conseguir con un
simple colorímetro o espectrofotómetro de
cubeta o con sofisticados equipos de
lectura automática de microplacas.

Los resultados finales de la lectura
colorimétrica se reflejan numéricamente
mediante valores de absorbancia o
densidad óptica que se obtendrán a la
longitud de onda más adecuada para la
coloración final alcanzada.

13. APLICACIONES CLÍNICAS:

Enfermedades producidas por parásitos



Enfermedades producidas por Micoplasmas
Enfermedades producidas por bacterias


Mycobacterium tuberculosis, brucelas, Estreptococos, Salmonelas…
Enfermedades producidas por virus


Toxoplasmosis, Triquinosis, Tripanosomas…
Enfermedad de Newcastle, Peste porcina, Rotavirus, artritis vírica, Leucemia
felina…
Otras aplicaciones



Hormonas (GCH, Progesterona, Testosterona..)
Cuantificación de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA)
Inmunopatología (Ac anti-DNA, Factor reumatoide, Inmunocomplejos
circulantes)

14. Bibliografía:

Palacios, L. (2012). E.L.I.S.A Enzime Linked Inmuno Sorbent
Assay. http://www.slideshare.net/lexass/presentacion-elisa13245114

Cultek (2006). Fundamentos y Tipos de ELISAs.
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISAprotocolos.pdf

Dra. Fernández, N. (2007). E.L.I.S.A Enzime Linked Inmuno
Sorbent Assay. http://www.slideshare.net/aselle/elisa14876995?from_search=2

Jose, M. (2009). Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno
Sorbent Assay) http://es.scribd.com/doc/15834994/Tecnica-deELISA-Enzyme-Linked-Inmuno-Sorbent-Assay

Escobedo, J., Bautista, A., Correa, P., Mier, J., Pam, W., Valladar
es, J. (2012). Técnicas aplicadas a la Proteómica.
http://www.slideshare.net/angelicashantay/elisa-pasos-

15. 2º Anatomía Patológica y Citología