Ribozyme Catalytic RNA molecule

1. Ribozyme 核酶
(Catalytic RNA molecule)
制作：cz12062008
制作：cz12062008

3. 1.What is a Ribozyme?
1.What
Ribozymes are true enzymes.
enzymes.
A ribozyme is an RNA molecule
（分子） that is capable
capable（能力）
of catalyzing （催化）a chemical
a
reaction.
NOT PROTEIN
PROTEIN（蛋白）

4. First Ribozyme discovered
上世纪80 80
80年代，美国科罗拉多大学博尔德分校的
Thomas Cech（The intron in the pre-rRNA of Tetrahemena is
self-spliced 和美国耶鲁大学的Sidnery Altan（The M1
self-spliced） Sidnery Altan The
RNA in ribonuclease P is catalytic 各自独立地发现RNA
catalytic） RNA
RNA具有
生物催化功能.从而改变了生物催比剂的传统概念。
.
1989 Nobel Prize
In Chemistry
Sid Altman Tom Cech

5. 2.
2.核酶的分类
I型内含子
剪接型核酶
通过既剪又接 II型内含子
的方式除去内
含子（Intron)
Intron)
锤头核酶
剪切型核酶 发夹核酶 自体催化
自身催化的 丁型肝炎病毒（HDV)核酶
反应是只切
不接。
RNaseP 异体催化
异体催化能
剪切所tRNA
tRNA
前体的5‘端
5

6. How many ribozyme ?
the hammerhead ribozyme (plant virus)
锤头状核酶（来源：植物病毒）
- the hairpin ribozyme (plan virus)
发夹状核酶
- hepatitis delta ribozyme (human virus)
丁型肝炎核酶（来源：人类病毒）
- neurospora VS ribozyme (mitochondrial RNA)
孢VS
VS
VS核酶（来源：线粒体RNA RNA
RNA）
- group I and group II intron ribozyme (rRNA and mt RNA)
内含子I和II
I II
II核酶（来源：rRNA MT RNA
rRNA
rRNA和MT RNA）
- RNAse P (tRNA maturation)
核糖核酸酶P（来源：tRNA
P tRNA
tRNA的成熟）
- Ribosome (translation)
核糖体（翻译）
- Spliceosome (splicing)
剪接 （拼接）

7. 天然核酶及核糖酶
Ribozym Sequenced Size (nt) Activity Source
（核酶） （测序） （大小） （功能） （来源）
Group I intron >1’500
>1’ 210 self-splicing via 3’-OH
3’ eukayotic pre-mRNA,
of G; transesterification organelles, few bacteria
Group II intron >700 500 self-splicing via 3’-OH
3’ organelles, few prokaryotes
of A; transesterification
Hammerhead 11 40 self-cleavage via plant viruses
Hepatitis delta virus 2 90 transesterification hepatitis B virus (RNAgen.)
Hairpin 1 70 (2’,3’-cyclic phosphate)
(2’ ,3’ satellite RNA of plant virus
RNAse P >500 300 pre-tRNA processing prokaryotes and organelles
via hydrolysis (3 ’-OH)
(3’ of eukaryotes
Spliceosome pre-mRNA splicing via eukaryotic pre-mRNAs
(U2 + U6 snRNAs) 70; 50 180; 100 ransesterification (3 ’OH)
(3’
Ribosome >900 2’600
2’ peptidyl transfer (amide) prokaryotes and eukaryotes
(23S rRNA)
Naturally occurring ribozymes and ribonucleoprotein enzymes (2002)
peptidyl transfer (amide)
(amide)转移肽（酰胺） self-splicing
self-splicing自我剪接 self-cleavage
self-cleavage自我裂解 2’,3’-cyclic phosphate 2' 3' -
,3’ 2'，3' -环磷酸
transesterification酯交换 prokaryotes and eukaryotes 原核生物和真核生物
transesterification
pre-tRNA processing via hydrolysis (3 ’-OH) 处理经水解的前氨酰- tRNA 3' - OH
(3’ - tRNA（3' OH）

8. 3.结构（Structure ）
3.
consider...
As with proteins, we consider...
Primary: GGCCGAACUGGUA
一级
Secondary
二级:
Tertiary
三级:

9. 3.1 Primary Structure
Structure一级结构
ribonucleotides核苷酸 (base
Limited to ribonucleotides base碱基 + ribose
ribose核糖 + phosphate
phosphate磷酸):
Common Bases: N O N O
常见碱基 N
N
N
N N N
N N N N N N O N O
A G C U
Uncommon Bases: O O
罕见碱基 N N
N
N
O N N
Pseudouridine Inosine
假尿苷 肌苷 etc...

10. 3.2 Secondary Structure
Structure（二级结构）
Watson-Crick Base Pairing Helix Formation
沃森-克里克碱基配对
- 螺旋形成
B-DNA A-DNA RNA
RNA usually assumes
A-form helices…
helices…
DNA
DNA常常假设A- A-
A-型螺旋
Small pore along helical axis
沿螺旋轴形成个小孔
“Rungs” stack obliquely to axis
Rungs”
阶梯式的斜上升的中心轴

11. I
-5 -5
CU G
3′ B YB
50
5′ V GV
GA A
10
20 C
A
G U
U
A A
H 40
A A
A
C
30
2-2
发卡型核酶二级结构

13. Secondary Structure
Structure（二级结构）
Conserved base-pairing interactions result in...
保守的碱基配对相互作用的导致：
• Three “stem” regions
stem”
三个结构域
• Uridine-containing turn
旋转而封闭的尿苷
• An “augmenting helix”
helix”
joining stems II and III
结构域II 与 III
II III连接形成的增强螺旋结构

14. Ribozyme vs. tRNAPhe
核酶 苯丙氨酸tRNA
tRNA
folding
folding折叠

15. The hammerhead ribozyme ( )
(锤头状核酶)
- discovered in small RNA satellites of small viruses (1986)
是小病毒携带的小的RNA RNA
- replication by rolling circle mechanism
通过不断循环机制进行复制折叠
Secondary structure

16. RNAse P（核糖核酸酶P） is a ribozyme
P
RNAse P cleaves the 5’ end of pre-
5’
tRNAs
（核糖核酸酶P切割5' P 5' tRNA
5'前体tRNAtRNA的末段）
It is composed of 12 kDa P protein and
about 400 nt long RNA
（它是由12 kDa
12 kDa蛋白质和长约400 400
400元的RNARNA
RNA组
成）
The catalytic activity lies entirely within
RNA part
（催化活性中心位于RNA RNA
RNA上）

17. RNAse P（核糖核酸酶P） is a ribozyme
P
Enzyme is efficient without P protein but
in high salt conditions
（在高的盐条件，酶在没有P蛋白时还是有活性 P
的）
P protein or high salt is thought to
screen the repulsive electrostatic
interactions between RNAse P RNA and
substrate pre-tRNA
(P 蛋白质或高盐被认为是核糖核酸酶P RNA P
与前体tRNAtRNA
tRNA表面之间静电排斥反应的屏障。

18. P（核糖核酸酶P）
RNAse P P

19. 3.3 tertiary structure（三级结构）
锤头状核酶 发卡状核酶 丁型肝炎病毒 内含子I型核酶
I

20. Hammerhead ribozyme
（锤头状核酶）

21. The hammerhead ribozyme (锤头状核酶)
)
- tertiary structure
Scott et al and Klug, Science 1996

22. The hairpin ribozyme ( )
(发夹状核酶)
From Lilley TIBS (2003)

23. The hepatitis delta ribozyme (丁型肝炎核酶)
)
From Lilley TIBS (2003)

24. Group I &II intron ribozyme (rRNA and mt RNA)
内含子I型和II
I II
II型核酶
Doudna and Cech
Nature, 2002

25. Group I intron ribozyme (rRNA and mt RNA)
内含子I型核酶(rRNA and mt RNA)
Golden et al, and cech Science (1998)

26. 4.
4.核酶的功能 （The Activity of Ribozym ）
The
1. 核苷酸转移作用。
2. 水解反应，即磷酸二酯酶作用。
3. 磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作
用。
4. 脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。
5. RNA RNA
RNA内切反应，即RNA
RNA限制性内切酶
作用。

27. 5.mechanism of catalysis
5.mechanism
催化反应机理

28. How to catalyse the reaction ?
催化反应如何进行？
From Lilley TIBS (2003)

29. Catalytic efficiency, condition
催化效率和条件
- ribozyme follows a Michaelis-Menten kinetics
kinetics（米氏动力学）
k1 k2
E（酶） + S
S（底物） ES
ES（过渡态） E + P
k-1
k-1+ k2
Km（米氏常数）= = 10-5-10-7 M kcat
cat（催化常数）= 0.5-2 min
-1
k1
kcat/ Km= 103-106 M-1.min-1 Good catalytic efficiency!!
良好的催化效率
- all ribozyme need cations for activity (Mg 2+ ,Mn2+)
所有活化的核酶的需要阳离子(Mg2+ ,Mn2+)

30. mechanism of catalysis
催化机理
Intact
Phosphodiester
完整的磷酸二酯 Mg2+Coordinated
Transition
Mg2 +
+协调的过渡态
Cleaved
Phosphodiester
结合后的磷酸二酯

31. Catalytic Mechanism（催化机理）
New crystal structure shows five Mg 2+ sites:
新发现的结晶结构是五个 Mg2+ Mg2+
2+的结合域

32. 核酶的剪接机制
�
鸟苷的3’-OH攻击
内含子的5’剪接
点，并与Intron的
5’-端磷酸基形成
共价键连接，同时5’
外显子脱落下来，
但3’外显子此时仍
与Intron相连。
5’-端外显子的
3’-OH进攻内含子
的3’剪接点并使
413nt的内含子脱
落，同时5’外显子
与3’外显子连接成
成熟rRNA

33. 3D structure of ribozyme: mechanism of catalysis
hairpin ribozyme
Hepatitis delta ribozyme
（发夹状核酶）
（丁型肝炎核酶）
Ruppert et al, Nature 2001, Science 2002 Ferre d’Amare, Nature 1998
d’

34. Structure of the hairpin ribozyme
(发夹状核酶的结构)
)
hairpin ribozyme
Ruppert et al, Nature 2001, Science 2002

35. hairpin ribozyme(发夹状核酶))
Ground state
state（基态） Transition state
state（过渡态）
Ruppert et al, Nature 2001 Ruppert et al, Science 2002

36. hairpin ribozyme
(发夹状核酶)
Transition state(过渡态)
state( )
Ruppert et al, Science 2002

37. 5.Ribozyme
5.Ribozyme
Ribozyme应用
Ribozyme
Ribozyme的发现使我们认识到酶不一定都是蛋白质，
这些Ri-bozyme
Ri-bozyme RNA
Ri-bozyme主要用在RNA
RNA分子的切割与降解上。
因为真核生物的突变体很难获得，假如用特制的
Ribozyme
Ribozyme破坏切割特定的RNARNA
RNA分子，使这种RNA RNA
RNA不
能表达出相应的蛋白质，我们再进一步观察其表型变
化，从而了解这个基因的功能。
另外在医学方面，可以用特别的RibozymeRibozyme
Ribozyme切割一些对
人体有害的RNA RNA
RNA，达到解除有害基因功能的目的，这
也是基因治疗的又一条路子。
在动植物育种方面，可以将具有破坏病毒RNA RNA
RNA的
Ribozyme
Ribozyme基因导入动植物细胞，提高动植物抗病毒能
力。

38. 举例：Engineered allosteric ribozymes as biosensors
Engineered
（具有生物传感器功能的变构核酶）
a. ATP-sensing aptamer + self-cleaving
ribozyme.
ribozyme.
ATP传感适体+自我切割核酶。
ATP +
b. This variant favors ADP binding 100-fold
overATP.
overATP.
这种变异使对ATP ATP
ATP的亲和力是ADP 100
ADP 100倍。
ADP的100
c. Can be used as an in vitro sensor for
enzyme activity (or for enzyme inhibition).
inhibition).
用作体外传感器的酶激动剂（或酶的抑制剂）。

39. 蓝箭头显示裂解位
点

40. Most common output is Green Fluorescent
Protein (GFP)
最常见的输出是绿色荧光蛋白（GFP GFP
GFP）