پاکلی تاکسل و سمینار 2 کارشناسی ارشدم با موضوع : بيوتکنولوژی توليد آن در گياه و قارچ

1. بسم الله الرحمن الرحیم

2. سمينار 2 کارشناسی ارشد فيزيولوژی گياهی پاکلی تاکسل و بيوتکنولوژی توليد آن در گياه و قارچ استاد راهنما : آقای دکتر مهرداد لاهوتی ارائه : سيد جواد داورپناه شهری 1382

3. تاريخچه در سال 1856 ميلادي لوكاس تا كزين را از سرخدار معمولی جدا سازی کرد . حدود 100 سال بعد گراف اثبات كرد كه تاكزين مخلوط پيچيده اي از دست كم يازده آلكالوئيد است در سال 1964 در عصاره اي از پوست سرخدار اقيانوس آرام،كشف شد كه براي ياخته هاي كشت شده لوسمي مورين سمي است . جداسازي اين تركيب در سال بعد در آزمايشگاههاي مونروئه وال در بنياد پژوهشي تري انگل ( كاروليناي شمالي ) آغاز شد . شكل خالص اين تركيب به شكل خالص در سال 1969 بدست آمد و ساختار آن در 1971 پس از دشواريهاي فراوان به خاطر غلظت بسيار پايين آن در گياه و پيچيدگي ساختاري آن منتشر شد پاكلي تاكسل شانسي كشف شد . اما نتيجه بررسي بيش از 12000 تركيب براي فعاليت ضد سرطاني بود كه توسط چندين سيستم زيست سنجي ويژه پايش شد . اين تركيب نتيجه پروژه اي بسيار جاه طلبانه بود كه توسط ان . سي . آي براي كشف تركيبات ضد سرطان آغاز شد اهميت دارويي پاكلي تاكسل تا اواخر دهه 1970 ميلادي تا هنگامي كه براي اولين بار دريافتند چگونه عمل مي كند ، شناخته نشد . در 1979 دريافتند پاكلي تاكسل بازدارنده تكثيريافته اي است و ياخته ها را در مرحله M / G 2 چرخه ياخته اي با برانگيختن گردايش توبولين و سركوب فرايند واگردايش ميكروتوبول مهار مي كند .

4. در دهه 1970 ، ان . سي . آي آزمونهاي زيستي جديدي را براساس تومورهاي انساني كشت شده در موش ( گزنوگرافتها ) توسعه داد . اثبات شد پاكلي تاكسل روي انسان از تومورهاي مورين يا ياخته هاي نئوپلاستيك كشت شده در شيشه مؤثرتر است . نتايج به قدري اميدبخش بود كه آزمونهاي باليني در 1983 آغاز شد . در 1989 نتايج آزمون باليني با بيماراني كه از سرطان زهدان درمان ناپذير رنج مي بردند منتشر شد . اين تركيب همچنين روي سرطانهاي پستان و شش مؤثر بود ، دو سرطان بسيار رايج كه بين 45000 تا 100000 مرگ را در ايلات متحده به تنهايي سبب مي شوند . پاكلي تاكسل پس از گذراندن ازمونهاي باليني در دهه 80 ميلادي در سال 1992 توسط اداره غذا و داروي آمريكا براي درمان سرطان بدخيم زهدان و پستان و ياخته هاي غيركوچك شش و كاپوزير ساركوماي وابسته به ايدز مورد تأييد قرار گرفت . پاكلي تاكسل در 1999 توانست 5/1 ميليارد دلار فروش داشته باشد و در سال 2000 ميلادي فروش آن به 6/1 ميليارد دلار رسيد . استفاده از پاكلي تاكسل براي مواردي مانند كارسينوماي شش ، كلن ، پروستات ، سر و گردن ، گردن رحم و مغز در حال گذراندن آزمونهاي مرحله دوم مي باشد .

5. ساختار پاكلي تاكسل يك دي ترپن آميد با ساختار پيچيده و داراي استخلاف است كه متعلق به تاكسوئيدها با بيش از 350 ساختار متفاوت شناخته شده است . ساختار پايه بيشتر تاكسوئيدها از يك اسكلت پنتامتيل تري سيكلو پنتادكان تشكيل شده است كه اغلب اسكلت عادي تاكسان ناميده مي شود تفاوت با تمام تاكسوئيدها : 1- هسته ملكولي تاكسان چهار حلقه اي C 13 β - بنزوئيل - فنيل ايزوسرين استري شده در جايگا ه 2 - زنجير جانبي 3- حلقه غير عادي اكستان BAC III 10-DABIII تركيبات داراي الگوي مشابه استخلاف : در حقيقت پاكلي تاكسل داراي ساختماني است كه از دو بخش هسته تاكسان و زنجيره جانبي تشكيل شده است . اين ساختمان داراي اسكلت كربني دي ترپني غيرعادي است ، هشت گروه اكسو دارد و تركيبي از زنجيره هاي جانبي به آن ضميمه شده است و در كل 11 مركز فضايي دارد

6. عمل عمل مي كنند S – G1 بيشتر داروهاي ضد سرطان در مرحله چرخه ياخته اي و ميتوز را متوقف مي كند G2-M پاكلي تاكسل با مهار تكثير ياخته اي در مرحله . بر روي ديمرتوبولين دو جايگاه اتصال براي پاكلي تاكسل وجود دارد پاكلي تاكسل با اتصال با این جایگاه ها ميكروتوبول را پايدار مي سازد و از وابسپارش سريع ميكروتوبول به زيرواحدهاي توبولين جلوگيري مي كند و درجه بزرگي و ميزان تغييرات را در طول ميكروتوبول كه مجموعاً پويايي ميكروتوبول ناميده مي شودكاهش مي دهد در مورد نقش اجزاي پاكلي تاكسل به نظر مي رسد فعاليت ضد ميتوزي قوي محدود به تاكسانهايي مثل پاكلي تاكسل باشد كه داراي يك زنجيره جانبي بنزوئيل -3- فنيل ايزوسرين، عامل حلقه اكستان و يك گروه بنزوئيل باشد C2 در بخشي از فارماكوفور ساختماني پاكلي تاكسل مسئول اتصال به توبولین زنجیره جانبی بنزوییل فنیل ایزوسرین است همچنين گروه بنزوات کربن 2 براي فعاليت زيستي دارو لازم است و حذف اين گروه سبب كاهش قابل توجهي در فعاليت ضد توموري مي شو د به طور كلي تغييرات در زنجيره جانبي و استخلافهاي کربن . 2.4.13 منجر به كاهش فعاليت پاكلي تاكسل مي شود

7. منابع پاكلي تاكسل ، سرخدار، فندق 10/1 سرخدار ، Podocarpus gracilior Pilger گیاه : پدوکارپوس توزيع : اين تركيب در تمام بخشهاي گياه سرخدار وجود دارد و مقادير آن در بخشهاي مختلف در گونه هاي مختلف اندكي نوسان دارد . در سرخدار هيماليايي ريشه هاي سرخدار داراي دومين غلظت نزديك به پوست ساقه هستند . . در حالي كه در سرخدار معمولي مقادير آن در ريشه ها به طرز قابل توجهي بيشتر از كامبيوم است و ميزان آن تا % 05/0 وزن خشك مي رسد كه از مقادير جزيي آن در برگ ها و كامبيوم ساقه ها بيشتر است ساقه نهال سرخدار داراي نسبت بالايي از ياخته هاي پارانشيم فلوئم است كه تصور مي شود پاكلي تاكسل در آن توليدمی شود . پيشنهاد مي شود عمده بيوسنتز آن در پلاستيدها و بخش كوچكي از آن داراي خاستگاه سيتوپلاسمي است قارچهای آندوفیت و اپی فیت : Pestalotiopsis microspora , Colletotrichum Sp. ,Periconia Sp., Xylaria Sp. , Taxomyces andreanae , Stegolerium kukenani , Seimatoantlerium tepuiense , ,Tubercularia Sp. , Pestalotiopsis guepini , ) Monochaetia Sp . , Trichothecium Sp., ,Sporormia minima , ,Pithomyces Sp. ,Alternaria Sp., , Fusarium lateritum , Pestalotiota bicilia در فندق و سرو تالابي هم آندوفيتهايي يافت شده اند كه توليدكننده پاكلي تاكسل هستند البته توليد قارچ بسيار كمتر از گياهان و در حد زير ميكروگرم و ميكروگرم مي باشد

9. Tubercularia Sp. جداسازی شده از Taxus mairei  ---- Periconia Sp. جداسازی شده از Torreya grandifolia

10. Stegolepis guianensis آندوفیت در Stegolerium kukenani Cinnamomum zeylanicum آندوفیت در Muscodor albus

11. نخستین قارچ آندوفیت تولید کننده پاکلی تاکسل که از سرخدار جداسازی شد Taxomyces andreanae نیز به عنوان نخستین قارچ اپی فیت تولید کننده پاکلی تاکسل در Seimatoantlerium tepuiense گزارش شده است . Maguireothamnus speciosus

12. بيوسنتز پاکلی تاکسل مسير بيوسنتزي پاكلي تاكسل شامل حدود 20 مرحله آنزيمي از متابوليسم اوليه گياهي مي شو د كه مراحل – آغازين آن عمدتاً از مسير گليسر آلدئيد فسفات پيروات در پلاستيدها و در بخشي جزئي در سيتوسل / شبكه و پس از ايجاد ايزوپنتنيل دي فسفات آندوپلاسمي از طريق مسير موالونات شروع مي شود . ، منجر به تشكيل ژرانيل ژرانيل دي فسفات پيش ساز عمومي دي ترپنوئيدها شده ، طي يك دوجين واكنش آنزيمي شامل حلقوي شدن ، هيدروكسيلاسيونهاي متعدد ، استيلاسيونها ، بنزوئيلاسيون، اتصال زنجيره جانبي ، پاكلي تاكسل توليد مي شود خاستگاه نمی باشد Tc بر اساس مطالعات نشاندار شدن مشخص شد الگو های نشاندار شدن منطبق بر مسير موالونات در . استات به چهار گروه استيل تبديل شد اما وارد سيستم حلقه تاكسان نشد كه اين امر برخلاف خاستگاه موالونات سيستم تاكسوئيد است گلوكز به طور مؤثري هم وارد سيستم حلقه تاكسان و هم گروههاي استيل شد موالونات و استات خيلي ضعيف در فراواني بالاي مونو و دي ترپنوئيدها وارد مي شود ، خيلي ضعيف در گياهان جابجا شده ، ممكن است به جايگاههاي درون ياخته اي سنتز ترپنوئيد نرسند كه اين پيش سازها دچار وازگردي سريع مي شوند . اما همه اين موارد براي رد خاستگاه موالونات به طور قطع كافي نيست زيرا تشكيل سيستم حلقه تاكسان مي تواند در كده اي كه براي استات برون زا در دسترس نيست پيش رود در حالي كه گروههاي استيل در يك كده متفاوت كه براي استات برون زا در دسترس است افزوده مي شود

13. در شماري از باكتريها و تيلاكوئيد يك سيانوباكتر مسير بيوسنتزي موالونات وجود ندارد و . استالدئيد فعال حاصل از پيروات + يك تريوز فسفات توليد ايزوپنتنيل پيروفسفات مي كند در نتيجه اين فرض صحيح خواهد بود كه پيش ساز سيستم تاكسوئيد ا ز دي متيل آليل پيروفسفات وايزوپنتنيل پيروفسفات حاصل مي شود و الگوي همانند نشاندار شدن چهار جز ا ی زوپرنوئيدي آن نشان مي دهد كه اين دو توسط مسير بيوسنتزي يكسان حاصل شده ، با ايزو مريزاسيون به هم تبديل مي شوند دو مسير موالونات و غيرموالونات در ژينکو وجود دارد و پيشنهاد شده دو مسير توسط كده بندي از هم جدا مي شوند و از آنجا كه دريافته اند موالونات خيلي كم در بسياري از ترپنوئيدهاي تشكيل شده در پلاستيد وارد مي و ش ود ميزان فعاليت هيدروكسي متيل گلوتاريل ردوكتاز کوآنزيم آ خيلي ضعيف با تشكيل ترپنوئيدهاي پلاستيدي همبستگي دارد و موينولين بازدارنده مسير موالونات اثري جزئي روي توليد ترپنوئيدهاي پلاستيدي دارد و پاكلي تاكسل يك دي ترپنوئيد پلاستيدي است مي توان احتمال وجود هر دو مسير را تأييد كرد كه با شرط كده بندي در پلاستيد و سيتوسل وجود دارند

16. GGPP سنتز پيشساز عمومي دي و تتراترپنوئيدها سنتاز جفت شدن الكتروفيل فارنزيل دي فسفات و ايزوپنتنيل دی فسفات را كاتاليز مي كند GGPP در ياخته هاي سرخدار كانادايي داراي قالب خواندني باز با 1179 نوكلئوتيد است و پروتئين حاصل cDNA از 393 باقيمانده اسيد آمينه ( 6/42 کیلو دالتون ) را حاوی یک پپتيد احتمالی انتقالی در پایانه ان به رمز در می آورد که احتمالا این فراورده ژنی هسته ای را به پلاستيدها براي پردازش پروتئوليتيك به شكل بالغ هدايت مي كند . حضور توالي هدف گيرنده ويژه پلاستيد در این سنتاز بر اين كه دي ترپن ها ، مونوترپن ها و تتراترپن ها و همچنين پيش ساز مربوطه آنها پرنيل دي فسفات ها در پلاستيدها بيوسنتز مي شوندتاکيد می کند نشان داده شد كه مقادير حالت ايستاي RNA در آناليز لكه گذاري سنتاز درياخته های GGPP mRNA القا شده توسط متيل جاسمونات به طور قابل توجهي بيشتر از ياخته هاي شاهد بود كه پيشنهاد مي شود متيل جاسمونات دست كم در سطح نسخه برداري توليد اين سنتاز را تغيير مي دهد

17. ( تشكيل تاكسا دي ان ) GGPP نخستين مرحله اصلي بيوسنتز : حلقوي شدن تاكسا دي ان %30 در پاكلي تاكسل و تاكسوئيدهاي مربوطه وارد مي شود حلقوي شدن عمدتاً در پوست ساقه سرخدار و كامبيوم مجاور آن انجام مي شود تاكسادي ان سنتاز به صورت فعال و محلول عمدتاً در پوست و ياخته هاي كامبيوم چسبيده به آن وجود تاكسا دي ان سنتاز تقريباً انحصاراًدي ان تاكسا (5)4 ، (12) 11(%94) – دارد ـ ايزومرهاي تاكسان تاكسادي ان سنتازآنزيمي پلاستيدي است به صورت محلول،فعال و عملگر و مونومر با وزن ملكولي 79 نيازمند يون فلزي دو ظرفيتی به عنوان كو فاكتور منیزیم را به منگنز ترجیح می دهد در جايگزيني منیزیوم ب ا ساير يونها به صورت نمك كلريد فلزي فعاليت آن به اين ترتيب كم مي شود فعاليت تاكسا دي ان سنتاز انحصار را در پوست ساقه و كامبيوم متصل به آن وجود دارد و در گزيلم و هسته چوبي ساقه حدود %3 فعاليت در پوست ساقه ، در برگها %6 و در ريشه ها %3 است

18. 2586 نوكلئوتيدي ORF پروتئين كامل حاصل آن به همراه يك پپتيد هدف گيرنده پلاستيدي شامل 862 باقيمانده اسيدآمينه است Da 98 303 كه وزن ملكولي حساب شده آن است براي تجمع و پردازش در پلاستيدهاست N توالي هدف گيرنده طويل در پايانه موتيف شاخص ترپن سيكلاز در آن وجود دارد كه موتيف اتصال كمپلكس يون فلزي DDXXD دوظرفيتي مي باشد و غنی ار آسپارتات است – گهرمايه فعاليت با زخم زدن ساقه يا تيمار با اليسيتور چندان القاپذير نيست در حالي كه ميزان پروتئين و فعاليت ترپنوئيد سيكلازهاي كاج و نراد با زخم و اليسيتور القاپذير است . همچنين بالاترين مقادير فعاليت تاكسا دي ان سنتاز قابل استخراج در ساقه هاي نهال سرخدار ( ترجيحاً ساقه هاي با پوست سبز ) برداشت شده طي رشد فعال وجود دارد در حالي كه در كاج و نراد بيشينه مقدار ترپنوئيد سيكلازهاي دخيل در توليد الئوزين فقط پس از توقف رشد فعال مشاهده شد ، در نتيجه تاكسا دي ان سنتاز از ساير ترپنوئيد سيكلازها در موارد زير متفاوت است : 1- ميزان فعاليت بسيار پايين در بافت 2- مقدار پايين آنزيم در بافت 3- نبود پاسخ مشخص به آسيب زخم يا اليسيتورها اما اين مرحله اگرچه آهسته است اما براساس 1- مقادير و 2- زمان بندي حضور تاكسا دي ان سنتاز با توجه به انباشت پاكلي تاكسل در ياخته ها نمي تواند محدود كننده ميزان باشد

19. دومين مرحله اصلي در بيوسنتز : تشكيل تاكسا دي انول نخستين اكسيژناسيون دومين مرحله ويژه بيوسنتز را تشكيل مي دهد و منجر به تشكيل تاكسا – (20)4 ، (12)11 – دي ان - α 5 – ال مي شود آنزيم مسئول اين عمل يك مونو اكسيژناز وابسته به 450 Cyt P است كه نه تنها اكسيژناسيون  5 C هسته تاكسان را كاتاليز مي كند بلكه مهاجرت غيرعادي پيوند دوگانه (5)4 را به موقعيت (20)4 ( يك ويژگي شاخص ساختاري بسياري از تاكسوئيدهاي حد واسط را كاتاليز مي كند دي انول حاصل از اين فرايند انحصاراً ايزومر فضايي  5 مي باشد كه منطبق بر حضور شمار زيادي از تاكسوئيدهاي داراي اين پيكربندي است ا ين آنزيم وابسته به NADPH و 2 O است cDNA اين پروتئين هِم – تيولات تخصص يافته مكاني تاكنون جداسازي نشده است . تاكسا دي ان هيدوركسيلاز ويژگي هاي يك 450 Cyt P مونواكسيژناز را از خود نشان مي دهد يعني از عمل آن توسط مونواكسيدكربن در تاريكي ممانعت به عمل مي آيد و بخشي از اين ممانعت با نور آبي ( nm 450 ) برطرف مي شود ] 44 ، 15 [ . همچنين عمل آن به طور كامل توسط كلوتريمازول و ميكونازول و به طور جزئي توسط سيتوكروم C مهار مي شود كه مي توان نتيجه گرفت تاكسا دي ان هيدوركسيلاز مشابه به يك 450 Cyt P چندكاره شاخص مي باشد ] .

20. ميزان تاكسا – (20)4 ، (12)11 – دي ان -  5 – اُل به ميزان 1- Kg g μ 50 – 25 عصاره پوست سرخدار است كه در حدود گزارش شده براي پيش ماده آن تاكسا دي ان است در نتيجه اين مرحله اكسيژناسيون بايد در مقايسه با مراحل فرو دست آهسته باشد چون فراورده عمل ( تاكسا دي انول ) به ميزان قابل توجهي انباشته نمي شود و بنابراين براي جداسازي ژن مناسب است و اين امكان وجود دارد تا با جداسازي ژن تاكسا دي ان -  5 – هيدروكسيلاز و دستورزي آن بيوسنتز پاكلي تاكسل را تسريع كنيم ساير هيدروكسيلاسيون ها ترتيب ساير اكسيژناسيونهاي بعدي را مي توان براساس درنظر گرفتن فراواني گروههاي عاملي اكسيژن موجود در كربن هاي گوناگون حلقه تاكسان بيش از 350 تاكسوئيد طبيعي كه تاكنون شناخته شده اند را به صورت فرمول درآورد . براساس مطالعات تخصص يافتگي به گهرمايه 450 Cyt P هيدروكسيلازها اين احتمال وجود دارد كه بيشتر از يك مسير بيوسنتزي پاكلي تاكسل در سرخدار وجود دارد . كه احتمال دارد از اين مسيرهاي چندگانه كه به فراورده نهايي ختم مي شوند فقط يكي به لحاظ سينتيكي مناسب ترين باشد . اين موقعيت هاي هيدروكسيله دچار واكنش هاي استريفيكاسيون از قبيل اسيلاسيون مي شوند كه به نظر مي رسد در ابتداي و انتهاي مسير رخ مي دهد

21. انشعاب مسير با توجه به مقالات دو مسير عمده مي توان براساس اكسيژناسيون تعريف كرد :

22. الف . چهارمين مرحله بيوسنتز پاكلي تاكسل يا 10 – بتا – هيدروكسيلاسيون تاكسان – 10 – بتا هيدروكسيلاز يك 450 Cyt P مونو اكسيژناز است كه تبديل تاكسا دي ان -  5 - ايل استات را تنها به يك فراورده 10 بتا – هيدروكسي تاكسا دي ان - α 5 - ايل استات را تنها به يك فراورده 10 بتا – هيدروكسي تاكسا دي ان -  5 - ايل استات را كاتاليز مي كند . اين هيدوكسيلاز به شدت تخصص يافته مكاني و فضايي است . cDNA به رمز درآورنده تاكسان – 10 بتا - هيدروكسيلاز داراي ORF با 1494 جفت باز است كه پروتئين حاصل از آن 498 باقيمانده اسيد آمينه با وزن ملكولي محاسبه شده Da 56690 است و توالي آن همه موتيف هاي ساختاري مورد انتظار براي يك 450 Cyt P مونواكسيژناز را داراست احتمالاً اين مسير اكسيژناسيون 10 بتا پس از اسيلاسيون 5 آلفا قوت بيشتري نسبت به 13 آلفا هيدروكسيلاسيون به عنوان سومين مرحله بيوسنتز پاكلي تاكسل دارد . ب – سومين مرحله بيوسنتز پاكلي تاكسل يا 13 آلفا – هيدروكسيلاسيون اينكوباسيون پرپاراسيونهاي ميكروزومي كشت ياخته اي سرخدار كانادايي با تاكسا دي انول در حضور NADPH و 2 O تركيبي قطبي تراز ماده اوليه يعني تاكسا دي ان دي اُل توليد كرد كه اين عمل توسط 450 Cyt P هيدروكسيلاز كاتاليز مي شود ] همچنين در آزمايشي روي سرخدار ژاپني با كلن كردن آنزيمي در مخمر ، 13 آلفا – هيدروكسيلاز بيان شد كه داراي 485 اسيد آمينه و وزن ملكولي محاسبه شده Da 54652 است . اين پروتئين داراي لنگر غشايي در پايانه N است و يك حوزه اتصال به اكسيژن ، يك موتيف حفظ شده اتصال به هِم و و يك Cys مطلقاً حفاظت شده در جايگاه 431 دارد cDNA آن داراي ORF با 1458 جفت باز است . PH بهينه آن حدود 5/7 است

23. سومين مرحله اصلي در بيوسنتز : استيلاسيون تاكسا دي انول تبديل تاكسا دي انول به تاكسا – (5)4 و (12)11 – دي ان – 5 آلفا ايل استات توسط تاكسا دي ان – 5 آلفا - ال – O – استيل ترانسفراز مرحله سوم خاص بيوسنتز پاكلي تاكسل است تاكسا دي ان – 5 آلفا – اُل – o– استيل ترانسفراز پروتئين محلول و مونومر با وزن ملكولي KDa 50 ~ ( Da 79 490 ) با 7/4 ~ PI است كه تاكسا دي انول و استيل CoA را به فراورده هدف تبديل مي كند اما بنزو ئيل CoA را به عنوان كوسوبسترا قبول نمي كند و همچنين فاقد اطلاعات هدف گيرنده اندامكي در پايانه N مي باشد . cDNA آن داراي ORF با 1317 نوكلئوتيد است كه منطبق بر پروتئين حاصله با توالي اسيد آمينه حاصل از 439 باقيمانده است . آنزيم هاي اصلي و نو تركيب آن PH بهينه در 9 نشان می دهد هر دو شكل آنزيم در O - استيلاسيون پيش ساز پيشرفته پاكلي تاكسل ، III DAB – 10 كه داراي هيدروكسيل آزاد در 1 C ، 7 C ، 10 C و 13 C است ، ناتوان ظاهر شد كه پيشنهاد مي كند 5 - آلفا – استيل ترانسفراز به شدت براي جايگاه هيدروكسيل 5 C ويژگي يافته است

24. ساير مراحل الف ـ 10 ـ داستيل با كاتين III ـ 10 بتا ـ O ـ استيل ترانسفراز ( DABT - 10 ) ترانس استيلاسيون در هيدروكسيل 10 C III DAB – 10 رخ می دهد و III DAB – 10 را به همراه استيل CoA به با كاتين III تبديل مي كند cDNA جدا شده اين آنزيم به طور كامل داراي ORF با 1320 جفت باز است كه پروتئيني به طول 440 باقيمانده اسيد آمينه را با وزن ملكولي محاسبه شده K Da 49 ~ را به رمز درمي آورد . DABT – 10 مونومر و عملگر در حالت محلول است . شكل نو تركيب آن داراي P H بهينه 5/7 از آنجا كه DAB III – 10 به ميزان كافي (%1/0 ) در برگ و پوست وجود دارد در حالي كه غلظت ب ا كاتين III و پاكلي تاكسل خيلي پايين است (% 4 00/0 ) اين مرحله تبديل 10-DABIII به با كاتين III مرحله اي كليدي است ، خصوصاً كه غلظت DABT - 10 در ياخته ها بسيار پايين است و در كاربردهاي فني اشكال ايجاد مي كند در سنجش فعاليت اين آنزيم در عصاره هاي خام ساقه و ريشه سرخدار معمولي نشان داده شد فعاليت آن در كامبيوم ساقه ها 3 تا 5 برابر كمتر از ريشه است فعاليت این آنزیم توسط متیل جاسمونات القا پذیر است

25. ب - تاكسان – 2 آلفا – O - بنزوئيل ترانسفراز بيان اين آنزيم در E.coli توليد آنزيم نو تركيبي كرده است كه تبديل 2- د بنزوئيل – 7 ، 13 دي استيل با كاتين III ( يك گهرمايه نيمه سنتزي ، را به 13 و 7- دي استيل با كاتين III كاتاليز مي‌كند و به نظر مي رسد اين آنزيم در يك مرحله پاياني آسيلاسيون در مسير بيوسنتزي پاكلي تاكسل عمل مي كند . اين بنزوئيل ترانسفراز نو تركيب داراي PH بهينه 8 اس ت cDNA اين آنزيم به طور كامل داراي ORF با 1320 جفت باز است و پروتئيني را با 440 باقيمانده و وزن ملكولي محاسبه شده Da 50089 به رمز درمي آورد . اين سه استيل ترانسفراز پيش گفته داراي يك موتيف توالي HXXXDG به شدت حفاظت شده هستند كه در ساير ترانس آسيلازها يافت مي شود . مطالعات جهش زايي هدفمند روي مكان و تغييرات شيميايي نشان داده است كه باقيمانده His اين عنصر براي فعاليت كاتاليتيك اين آنزيم ها ضروري است و پيشنهاد شده است كه His ممكن است به عنوان يك باز عمومي در كاتاليز انتقال گروه آسيل از آسيل / آروئيل – CoA به گهرمايه الكلي عمل كند

26. پ - با كاتين III : 3- آمينو – 3- فنيل پروپانوئيل ترانسفراز ( BAPT ) BAPT 13- O استيلاسيون انتخابي با كاتين III را با فنيل آلانوئيل CoA به عنوان دهنده آسيل كاتاليز مي كند كه توليد N – دبنزوئيل – / 2– داكسي تاكسول را باعث مي شود PH بهينه آن 8/6 است . cDNA آن با طول كامل داراي ORF با 1335 باز است و يك پروتئين با 445 اسيد آمينه را به رمز درمي آورد كه وزن ملكولي محاسبه شده آن Da 50546 است در بين پنج آسيل ترانسفراز دخيل در بيوسنتز پاكلي تاكسل BAPT تنها آسيل ترانسفرازي است كه داراي موتيف 168XXXDA 163 G به جاي H XXXDG شاخص ترانسفرازها يا با فراواني كمتر عنصر HXXXDA است كه His و Asp زنجيره جانبي در كنار يك باقيمانده فرا دست 95 Cys حفاظت شده يك سه گانه كاتاليتيك دخيل در انتقال گروه آسيل را تشكيل مي دهند و جايگزيني 163 Gly به جاي 167 His در BAPT احتمالاً اين گروه سه گانه پيشنهادي را از هم مي‌گسلد . از طرفي آمين بتاي آزاد استر CoA به عنوان كوسوبسترا در اين مورد مي تواند از طريق اتصال به هيدروژن به عنوان يك اسيد / باز عمومي درون ملكولي به جاي H is عادي در اين جايگاه عمل كند .

27. براي اتصال زنجيره جانبي 13 C به هسته تاكسان دو ساز و كار پيشنهاد شده است : 1- استريفيكاسيون هيدروكسيل 13 C با فنيل ايزوسرين سپس N – بنزوئيلاسيون آن . كه فنيل ايزوسرين از واكنش آمينوموتاز فنيل آلانين به بتا – فنيل آلانين و سپس آلفا – هيدروكسيلاسيون ايجاد مي شود . 2- گروه هيدروكسيل 13 C ابتدا با بتا – فنيل آلانين استري شده ، سپس از طريق واكنش آلفا – هيدروكسيلاسيون به فنيل ايزوسرين تبديل مي شود . سپس زنجيره جانبي N - بنزوئيله مي شود . نشان داده شده است زنجيره جانبي كامل ( N - بنزوئيل فنيل ايزوسرين ) در حضور بتا – فنيل آلانين و تا حد كمتري آلفا – فنيل آلانين و فنيل ايزوسرين در ساختمان پاكلي تاكسل وارد نمي شود ، در نتيجه فنيـــل آلانين به صورت آمين آزاد به باكاتين III متصل می شود و اين زنجيره جانبي هيدروكسيله و N – بنزوئيله شده تا مسير به سمت پاكلي تاكسل كامل شود حساسيت دو برابر BAPT براي فنيل پروپانوئيل در برابر فنيل ايزوسرينوئيل پيشنهاد مي كند كه بيوژنز زنجيره جانبي با ايزومريزاسيون آلفا – فنيل آلانين توسط يك آمينوموتاز به بتا – فنيل آلانين آغاز مي‌شود كه توسط يك ليگاز به استر CoA واكنشگر تبديل مي شود و توسط BAPT به گروه هيــــدروكسيــــل 13 C باكاتين III متصل مي شود تا 13- O - بتا – فنيل آلانوئيل باكاتين III ( يك /3 - N – دبنزوئيل تاكسول ) را توليد كند .

28. ت - ´ 3 -N – دبنزوئيل - ´ 2 - داكسي تاكسول . N بنزوئيل ترانسفراز ( DBATNBT ) آ DBTNBT نوتركيب جفت شدن انتخابي فضايي سوبستراي جايگزين -N دبنزوئيل ( RS ´3 ) - ´ 2 - داكسي تاكسول را با بنزوئيل CoA كاتاليز مي كند كه عمدتاً يك ´3 - اپيمر از ´ 2 - داكسي تاكسول توليد مي كند . اين واكنش آخرين آسيلاسيون را در بيوسنتز پاكلي تاكسل تشكيل مي دهد و اين بنزاميداسيون N – دبنزوئيل تاكسول مرحله پاياني مسير پاكلي تاكسل است كه توسط دبنزوئيل تاكسول N – بنزوئيل ترانسفراز انجام مي شود . DBTNBT بنزوئيل CoA را به عنوان دهنده آسيل مورد استفاده قرار مي دهد و در حضور فنيل استيل CoA يا استيل CoA فراورده اي توليد نمي كند و در بين پنج آسيل / آروئيل ترانسفراز شناخته شده تنها آنزيمي است كه با استيل CoA فراورده اي توليد نمي كند . cDNA اين آنزيم ساخته شده از mRNA جدا شده از سرخدار ژاپني القا شده توسط متيل جاسمونات در E.coli بيان شد كه داراي ORF با 1323 نوكلئوتيد است و پروتئيني را با 441 باقيمانده با وزن ملكولي محاسبه شده Da 49000 به رمز درمي آورد . PH بهينه اين آنزيم نوتركيب در E.coli 8 است

29. راه هاي تهيه پاكلي تاكسل استخراج از پوست گياه پاكلي تاكسل به لحاظ فعاليت و عمل آن عليه سرطانهاي بدخيم مثل زهدان و پستان كه درمان آنها مشكل است و سالانه 60000 زن از اين دو سرطان مي ميرند و همچنين طرز عمل آن که داروهاي ضدسرطان قبلي به اين شيوه عمل نمي كنند مورد توجه قرار گرفت . آزمونهاي پيش باليني و مرحله يك باليني پاكلي تاكسل نيازمند 1500 – 500 پوند وزن خشك پوست است . يك درخت بالغ سرخدار اقيانوسي (100 ساله ) تقريباً 10 پوند وزن خشك توليد مي كند بنابراين هر جمع آوري نيازمند قطع 500 تا 1500 درخت است و هرچه تأثير دارو مشخص تر مي شود نياز براي آن افزايش مي يابد .. يك دوره درماني باليني به تنهايي mg 300 – 125 دارو نياز دارد و درمان تيپيك آن ممكن است 10 دوره يا بيشتر طول بكشد . درمان 12000 زن كه هرساله به تنهايي از سرطان زهدان مي ميرند kg 36 دارو را مصرف مي كند . با روش هاي حاضر kg 1 پاكلي تاكسل از 25000 پوند پوست خشك جدا مي شود ، به عبارتي 2500 درخت قطع مي شود . بنابراين تنها درمان سرطان زهدان در يك سال 90000 درخت بالغ سرخدار را نياز دارد . موافقت براي استفاده از پاكلي تاكسل براي سرطان پستان مشكل را سه برابر كرده است و وقتي مجوز براي استفاده از آن براي درمان سرطان هاي سخت مثل سر و گردن ، شش صادر شود عقلاني است كه فرض كنيم نياز به دارو بالغ بر k g 300 يا 750000 درخت در سال خواهد شد و تأمين اين نياز در آينده حتي با قطع تمام درختان غيرممكن خواهد بود . ديگر آنكه توليد بسيار كم و در حدود كمتر از % 02/0 وزن خشك پوست درخت است بنابراين با درنظر گرفتن مخرب بودن برداشت سرخدار و توليد كم بايد توليد بر روشهاي ديگري استوار شود .

30. سنتز كامل توليد سنتزي پاكلي تاكسل پيچيده ، گران و خيلي كم توليد است و به لحاظ اقتصادي مقرون به صرفه نيست روش نيمه سنتزي اين روش براساس جداسازي پيش ماده هاي فراوانتر پاكلي تاكسل از برگ و سرشاخه هاي سرخدار معمولي و سرخدار هيماليايي مثل DABIII – 10 ( %1/0 وزن خشك ) و اتصال زنجيره جانبي N - بنزوئيل – 3- فنيل ايزوسرين به گروه هيدروكسيل 13C و استيلاسيون هيدروكسيل موقعيت 10 بتا و همچنين با كاتين III استوار است روش نيمه سنتزي در مقايسه با برداشت سرخدار روشی سازگار با محيط زيست است و بر منبعي تجديد شونده تكيه دارد اما توليد آن نيز كم است و به دلايل اپي ژنتيكي و زيست محيطي توليد متغير است و همچنين در خالص سازي پيش سازها از بافت گياهي نيازمند تلاش فراوان براي جدا کردن حد واسط هاي موردنظر از فنل ها ، ليپيدها وسايرمواد همراه در گياهان دارد . اين روش چند مرحله اي شامل اين مراحل است : الف - حفاظت سيليل 1 و استيلاسيون III DAB – 10 است تا با كاتين III حفاظت شده در O -7 بدهد ب - اتصال زنجيره جانبي سنتزي N - بنزوئيل فنيل ايزوسرين در موقعيت OH 13C و پ - در پايان حذف حفاظت از O – 7 تا توليد پاكلي تاكسل كند . با وجودي كه بنا به دلايل بالا و همچنين رشد كندگونه هاي سرخدار توليد محدود و متغيري دارد تنها روش اقتصادي در حال حاضر است .

31. فن آوري زيستي : كشت پروتوپلاست ، ياخته ، بافت و مهندسي متابوليت در گياه و قارچ كشت ياخته هاي سرخدار زی توده نسبتاً سريع الرشدي دارد و جداسازي پاكلي تاكسل و تاكسوئيدهاي مربوطه از كشت ياخته اي نيازمند مراحل كمتري نسبت به بافت گياه كامل است چون مقادير مواد مزاحم كمتر است اما مقدار توليد تاكسوئيدها در كشت ياخته اي در حال حاضر بسيار پايين تر از آن است كه به لحاظ اقتصادي پايدار باشد . در قارچ هاي توليد كننده پاكلي تاكسل هم توليد پايين و ناپايدار است . مقادير توليد تاكسوئيد در كشت ياخته اي به حد زيادي بيشتر از سيستم هاي ميكروبي است اما به حد كافي زياد نيست تا قابل تكيه به عنوان يك منبع اقتصادي باشد با اين حال آينده دارترين سيستم توليد زيستي ، كشت ياخته سرخدار است كه با افزايش سنتزبه اليسيتاسيون متيل جاسمونات پاسخ مي‌دهد همچنين افزودن پيش ماده ها ، تغيير دمايي ، كشت دوفازه و دو مرحله اي و مهندسي متابوليت باعث افزايش توليد در شيشه مي شود

32. 2 اثر عوامل مختلف بر توليد در كشت بافت سرخدار عوامل مؤثر بر رشد ياخته اي و توليد متابوليت اجزاي محيط پايه ، منبع كربن ، فيتوهورمونها ، آنتي متابوليت ها ، 2 O ، PH ، اليسيتورها ، دما ، بسامد همزدن و شرايط نوري گزارش شده است تركيب گازي فشار اسمزي دما تنظيم كننده هاي رشد : A BA اسيد آبسيزيك تغذيه با پيش سازها يا قندها شرايط اينكوباسيون : زمان ، همزدن ، نور اليسيتورها اليسيتورها براساس خاستگاه به زيستي و غيرزيستي تقسيم بندي مي شوند . 1. زيستي : پلي ساكاريدها و اسيدهاي با وزن ملكولي پايين كه از ياخته هاي گياهي و ميكرو ارگانيسم ها منشأ مي گيرند . 2. غير زيستي : الف - تنش هاي فيزيكي : تابش فرابنفش ، فراصوت ، شوك گرمايي ب - نمكهاي فلزات سنگين و ساير مواد شيميايي از جمله عناصر خاكي كمياب ( REEs )

33. جاسمونا تها MJA باعث افزايش تقريباً همه تاكسوئيدها شد اما افزايش نسبي بيشتري را در تاكسوئيدهاي اكسيژنه در 13 C را نسبت به تاكسوئيدهاي اكسيژنه در 14 C را سبب شد ه و ممكن است اكسيژناسيون در 14 C ناسازگار با توليد پاكلي تاكسل باشد و بنابراين انتظار مي رود جاسموناتها توليد پاكلي تاكسل را افزايش دهند . اما پيكربندي جاسموناتها نيز مي تواند مؤثر بر توليد باشد . در – MJA T.× media - ( S 7 ، R3 ) قويترين بازدارندگي رشد ياخته اي را نشان داد و پس از آن MJA – ( R 7 ، R3 ) بازدارنده بود اما MJA - ( R 7 ، S3 ) ، MJA ( S 7 ؤ S3 ) اثر بازدارندگي بسيار كمي داشتند درنتيجه بازدارندگي رشد عمدتاً به پيكربندي R3 بستگي دارد . از طرفي پاكلي تاكسل و باكاتين III حتي در غلظتهاي بالاي MJA – ( R 7 ، S3 ) افزايش يافتند در حالي كه ساير ايزومرها اثرات مخالف داشتند در مجموع مي توان گفت پيكربنــدي بهينــه ( R 7 ، R3 ) است و پيكـــربندي R3 زيـــاد مهم نيست و پيكربندي R 7 براي تحريك توليد پاكلي تاكسل و باكاتين III مناسب است در مورد تركيب چهار ايزومر فضايي MJA كه شكل تجاري آن است غلظت μM100 بيشترين توليد پاكلي تاكسل را سبب مي شود و دو ايزومر R 7 ، S3 و R 7 ، R3 بالاترين توليد را دارند . محل اثر در سرخدار چيني همزمان با افزايش تاكسانها در اثر القا به μM 100 MJA فعاليت دو آنزيم كليدي GGPP سنتاز و تاكسا دي ان سنتاز افزايش يافت كه محل اثر جاسموناتها را روي اين دو آنزيم پيشنهاد مي كند . هرچند در سرخدار اقيانوس آرام مقدار و فعاليت GGPP سنتاز در اثر زخمي شدن يا اليسيتورها از جمله JA افزايش قابل توجهي نشان نداده است ]

35. ضريب سينرژيستی بين مخلوطی از اليسيتورهای گوناگون در بيوسنتز پاكلي تاكسل كه از دو بخش سنتز هسته و زنجيره جانبي 13 C تشكيل شده است مسيرهاي با سرعت كمتر محدود كننده ميزان هستند . اليسيتورها آنزيم محدود كننده ميزان را فعال مي سازد و منجر به انتقال مرحله محدود كننده ميزان بين دو بخش سنتزي پاكلي تاكسل مي شود كه شايد دليل عدم تطابق مراحل محدود كننده ميزان گزارش شده در مقالات باشد . اگر افزايش همزمان سرعت سنتز هسته و زنجيره جانبي امكان پذير باشد با استفاده از اليسيتورهاي گوناگون امكان بهبود توليد وجود دارد . 51/0 54/0 69/0 1/1 25/1 44//1 اسيد متيل جاسمونيک + سيترات آمونيوم نيترات نقره + سيترات آمونيوم اسيد ساليسيليک + اسيد آراشيدونيک نيترات نقره + آراشيدونيک اسيد اسيد ساليسيليک + سيترات آمونيوم اسيد آراشيدونيک + سيترات آمونيوم ضريب سينرژيستی گروه اليسيتور

36. 1.5 رده بندی اليسيتورها بر اساس مسير عمل آنها پيشنهاد مي شود تأثير اليسيتور بر بيوسنتز پاكلي تاكسل به خاطر فعال سازي آنزيم ها در مراحل عمل متفاوت است . مسير عمل يك اليسيتور به صورت مرحله واكنشي كه در آن اليسيتور در واكنش آنزيمي مشاركت مي كند تعريف مي شود . اگر اليسيتوري فعاليت آنزيمي كه توليد DAB III – 10 مي كند را افزايش دهد توليد DAB III -10 ، BAC III و در نتيجه پاكلي تاكسل افزايش مي يابد . و اگر اليسيتوري فعاليت آنزيمي كه در مسير بين DAB III-10 و BAC III عمل مي كند را افزايش دهد غلظت DAB III-10 كاهش و BAC III و پاكلي تاكسل افزايش مي يابد و اگر اين اليسيتور در مرحله بين BAC III و پاكلي تاكسل عمل كند با افزايش فعاليت آنزيم باعث كاهش غلظت D AB III –10 و BAC III و افزايش غلظت پاكلي تاكسل مي شود . در هر سه مورد اگرچه نتيجه افزايش پاكلي تاكسل است اما مسير عمل متفاوت است افزايش افزايش افزايش افزايش افزايش کاهش افزايش کاهش کاهش قبل از 10 -DAB III بين 10 -DABIII و BACIII بين BAC III و پاکلی تاکسل 1 2 3 اثر روی غلظت تاکسان 10 -DAB III BAC III پاکلی تاکسل مسير عمل نوع اليسيتور

37. اثر سينرژيستي اليسيتورها فقط وقتي حاصل مي شود كه دو اليسيتوري كه روي مسيرهاي متفاوت بيوسنتز پاكلي تاكسل عمل مي كنند به كار برده شوند و با توجه به اين امر مي توان فرايند توليد را بهينه سازي كرد .

38. مدل عمل اليسيتورها در فرايندهاي انتقال پيام و بيوسنتز پاكلي تاكسل نتايج بر اساس استفاده از بازدارنده ها پس از الیسیتاسیون منجر به مدل آبشاري غيرخطي مي شود كه مركب از سه شبكه آبشاري است كه با فسفريلاسيون G - پروتئين ، فعال سازي كانال يوني و PLC و فسفريلاسيون پروتئين كيناز C ( PKC ) نشان داده مي شود

39. الف - در مرحله اول اليگوساكاريد به گيرنده Tyr پروتئين كيناز در غشاهاي ياخته اي متصل مي شود كه به G - پروتئين ها جفت مي شود ( در 15 دقيقه پس از اليسيتاسيون ). G - پروتئين به G - پروتئين – GTP فسفريله مي شود كه شبكه اي از انتقال پيام باز مي كند كه حدود 30 دقيقه پس از اليستاسيون آغاز مي شود . ب - در شبكه دو PLC و كانالهاي يوني توسط G - پروتئين ها فعال مي شوند كه منجر به توليد تري فسفو اينوزيتول ( 3 IP ) و دي آسيل گليسرول DAG مي شود كه سيستم پيام مضاعف را شكل مي‌دهد ( حدود 60 دقيقه پس از اليسيتاسيون ). فعالسازي كانالهاي يوني درون شارش +2 Ca برون ياخته اي را تحريك مي كند و 3 IP رهاسازي +2 Ca ذخيره شده در اندامكها را تحريك مي كند كه منجر به افزايش غلظت +2 Ca مي شود ( حدود 45 دقيقه پس از اليسيتاسيون ) . پ - در شبكه سوم PKC توسط غلظتهاي بالاي +2 Ca و DAG فعال مي شود و فسفريلاسيون و دفسفريلاسيون پروتئين ها را كاتاليز مي كند . پيام ها به هسته ياخته منتقل و بيان ژنهاي دفاعي را تحريك كرده ، توليد پاكلي تاكسل را مساعد مي سازد . هركدام از اين سه باعث OB مي شود ( شكل .1.20 و 1.21) . OB حاصل سبب افزايش پتانسيل ردوكس در ياخته ها مي شود و برخي متابوليسم‌هاي اوليه و ثانويه را نظير پليمريزاسيون فنل ها ، القا شده توسط 2O2 H را افزايش مي دهد توانايي دفاعي ياخته ها را زياد مي كند و وقتي شدت پيام OB به درجه اي خاص مي رسد بيان ژنهاي مرتبط با متابوليسم ثانويه را در هسته تشديد مي كند . در شبكه سوم واكنش كليدي فعال سازي PKC است كه PKC پيش از فعال سازي در سيتوپلاسم وجود دارد و پس از فعال سازي تحت عمل سينرژيسيتي +2 Ca و DAG به غشا انتقال مي يابد . در مجموع اين مدل نشان مي دهد كه كل شدت پيام توسط شدتهاي پيام در سه شبكه موضعي مشاركت مي شود و هر شبكه موضعي از مجموعه اي واكنش هاي آنزيمي تشكيل شده كه انتقال پيام را به صورت آبشاري انجام مي دهد

41. استخراج در محل يا كشت دو فازه در كشت دوفازه از سيستم قسمت بندي كننده براي هدايت مجدد فراورده بيرون ياخته به يك فاز دوم عموماً غيرقطبي استفاده مي شود . مزاياي اين سيستم عبارتند از : الف - خالص سازي متابوليت ثانويه را با برداشت در محل آسان مي‌سازد . ب - با ممانعت از مهار پس خوردي در متابوليسم ياخته اي روي بيوسنتز ، فعاليت ژن آن يا جلوگيري از تجزيه فراورده باعث افزايش توليد مي شود . كشت دو فازه با فراهم كردن يك جايگاه انباشت اين امكان را به وجود مي آورد كه با برداشت متابوليت امكان توليد بيشتري را داشته باشيم و تعادل درون و برون ياخته را جابجا كنيم به ويژه اين كه پاكلي تاكسل خيلي كم در آب حل مي شود و شرايط را براي برداشت آن به علت هيدروفوب بودن در فاز دوم مساعد مي سازد 1. فاز جامد 2. فاز مایع تركيب عوامل بهينه ساز : اليسيتور زيستي + غير زيستي + استخراج در محل كشت پروتوپلاست پاكلي تاكسل را در كشت مي توان براساس كده اي كه در آن حضور دارد به پاكلي تاكسل وابسته به ياختــه و ترشحي تقسيم بندي كرد . نوع اول بيشتر مقدار آن را تشكيل مي دهد و خود در سه بخش :1. درون ياخته اي 2. بين غشا و ديواره و 3. در ديواره تقسيم بندي مي شود

42. قارچ ها و توليد پاكلي تاكسل قارچها به عنوان سيستم هاي ميكروبي براي توليد پاكلي تاكسل داراي مزاياي زيرند : 1- توليد صنعتي تركيب زيست فعال ] مانند پاكلي تاكسل نيازمند توليد مثمر و قابل تكرار است . اگر يك ميكروب ارگانيسم منبع باشد تا زماني كه موردنياز است در فرمانتورها قابل رشد خواهد بود و در حقيقت منبعي پايان ناپذير از پاكلي تاكسل فراهم خواهد كرد . 2- ميكرو ارگانيسم ها به طور معمول به فنون رايج كشت بافت به خوبي جواب مي دهند . كشت ماكرو ارگانيسم ها ( كشت بافت ) به طرز قابل توجهي چالش زاتراست نيازمند فنون تخصصي تر يا ماهها رشد قبل از برداشت است . 3- افزايش توليد نسبتاً در ميكروارگانيسم ها آسان است . در مورد پنيسيلين ، بهبود شرايط كشت و دستورزي ژنتيكي سويه هاي توليد كننده Penicillium توليد را از چند ميكروگرم در ميلي ليتر به هزاران ميكروگرم در ميلي ليتر افزايش داد . در مورد ماكرو ارگانيسم ها برداشت بيشتر معقول ترين راه براي بهبود توليد است . در مورد پاكلي تاكسل برداشت بيشتر منجر به از بين رفتن ارگانيسم منبع در چندين سال مي شود . 4- تركيبات زيست فعال متنوعي با تغيير شرايط كشت قابل توليد است . تغييرات هدايت شده و هدفمند در شرايط كشت را مي توان به صورت نامحدود به عنوان روشي براي بهينه سازي مسيرهاي گوناگون بيوسنتزي دنبال كرد كه مي تواند حتي به مشتقات موثرتر پاكلي تاكسل بيانجامد . در مجموع چنانچه يك قارچ يا باكتري قادر به توليد mg/L 50 پاكلي تاکسل باشد . منبعي بي پايان براي آن خواهد بود و از ديدگاه اقتصادي و بوم شناختي جايگزين سرخدار با هزينه كمتر براي بيماران و محيط زيست خواهد بود

43. شرايط توليد در قارچ هاي توليدكننده Taxomyces andreanae . اسيد استيك و استات سديم و فنيل آلانين نشاندار هرسه به صورت پيشساز پاكلي تاكسل و BAC III در كشت قارچ عمل كردند كه سنتز از نوآن را تأييد مي كند و Phe موثرتر از استات سديم عمل كرد . افزودن لوسين و بنزوات سديم هيچ پاكلي تاكسل يا BAC III توليد نكرد در حالي كه لوسين در سرخدار اقيانوس آرام يك پيشساز موثر بوده است به كار بردن mg/L 1 كلروكولين كلرايد ( CCC ) كاملاً توليد پاكلي تاكسل متوقف شد و بازدارندگي آن اثر وابسته به غلظت دارد . از طرفي N - ( دي متيل آمينو ) سوكسينيك اسيد ( آلار ) به عنوان يك PGR توليد پاكلي تاكسل را در برخي غلظت ها افزايش داد همزدن سريع ( rpm 200 > ) منجر به رشد و توليد ضعيف پاكلي شد در حالي كه تكان دادن ملايم rpm 100 منجر به 10 برابر افزايش زي توده و چند صدبرابر پاكلي تاكسل در عصاره ميسليوم شد ( L / ng ). عصاره هاي ميسليومي محيط كشت ثابت داراي توليد كم پاكلي تاكسل بود و ميسليوم ها رشد ضعيفي داشتند افزودن عصاره g5 برگ در يك ليتر آب جوش با غلظت %1 حجمي محيط كشت باعث 100 برابر افــــزايش توليــد پاكلي تاكسل شد ( ng/L 3000 – 2000 پس از 21 روز ) د رحالي كه توليد عادي ng/L 90 – 40 بود و در تركيب عصاره %1 هم ng/L 200 – 95 پاكلــــي تاكسل وجود داشت .

44. Pestalotiopsis كم كردن فسفات و افزودن بنزوات سديم در محيط توليد را افزايش داد . بازدارنده هاي بيوسنتز استرول نظير تبوكونازول و تريادي مفون به شدت توليد پاكلي تاكسل را افزايش دادند . در محيط M-1-D توليد پاكلي تاكسل با تغيير غلظت سديم فسفات مونوبازيك به mg/L1 توليد پاكلي تاكسل به طور مشخصي افزايش يافت و رشد مناسب ميسليوم حفظ شد اگرچه منبع كربن مي تواند بر توليد متابوليت ثانويه اثر كند افزايش غلظت آن تا g/L 100 اثر معني‌داري روي توليد نداشت . نمكهاي سولفات Zn , Mg , Mn اثربهينه اي بر توليد پاكلي تاكسل در غلظت هاي g/L 1/0 ، g/L 001/0 ، g/L 1 داشتند . واناديل سولفات در mg / L 1/0 باعث افزايش توليد پاكلي تاكسل شد در حالي كه لوريل سولفات ، بنتونيت و پلي وينيل سولفات داراي اثر جزئي ، بدون اثر يا اثر منفي روي توليد پاكلي تاكسل در غلظت هاي μg/ml 1/0 ، μg/ml 1 و μg/ml 1 به ترتيب داشتند همه اين تركيبات جز بازدارنـــده‌هاي ريبونوكلئاز هستند . چون پاكلي تاكسل جز بنزوات دارد بنزوات سديم در غلظت μg/ml 10 اثر بهينه اي روي توليد آن داشت كه مخالف نتيجه بدست آمده با T.andreanae است . چون ارگاسترول به ميزان ppm 100 – 50 در محيط مشاهده شد براي هدايت خزانه GGPP به سمت پاكلي تاكسل به جاي استرول استفاده از بازدارنده هاي سنتر استرول تريادي مفون μg/ml 100 و تبوكونازول μg/ml 10 بهترين توليد پاكلي تاكسل را داشت . مشخص شد در محيط M – 2 – D در غلظت mg/L 5/1 پس از 10 روز كشت ( 20 – 18 روز طول كشت ) تبوكونازول اثري بيشتر روی توليد داشت . اجازه رشد به قارچ دادن به اين صورت وسپس افزودن بازدارنده های سنتز استرول منجر به 50 برابر افزايش پاكلي تاكسل در محيط M – 2 – D به تنهايي شد .

45. Periconia Sp. در محيط M – 1 – D ng/L 400 – 300 پاكلي تاكسل توليد مي كند كه 8-6 بار بيشتر از T.andreanae و 100 بار كمتر از Pestalotiopsis microspora است . مشاهده شد با كشت متوالي آن توليد كاهش مي يابد و پس از پنج واكشت از ng/L 350 به ng/L 118 كاهش مي يابد . در سرده های Taxomyces,Pestalotiopsis,Monochaetia,Alternaria توليد پاکلی تاکسل نهادين و ثابت بوده است و اين تنها قارچی است که تاکنون توليد آن القا پذير می باشد . افزودن عصاره برگ Torreya taxifolia به ميزان mg/L100 در محيط M – 1 – D ( پس از پنج واكشت ) توليد پاكلي تاكسل را حدوداً به ng/L 350 رسانيد . هيچ بخش عصاره به اندازه عصاره خام اثر نداشت بنابراين يا عصاره داراي يك پيشساز بحراني براي توليد است يا برخي مواد فعالساز در آن حضور دارند . بنزوئيك اسيد بهترين فعالساز با غلظت mM 01/0 است كه موجب افزايش 8 برابري پاكلي تاكسل به ng/L 27 ± 831 شد . اما به عنوان پيشساز پاكلي تاكسل عمل نمي كند . پس از آن – p هيدروكسي بنزوئيك اسيد در mM 2/0 ، ng/L 82 ± 595 و مخلوطي از فعالسازها در غلظت بهينه آنها mM 02/0 ، ng/L 6 ± 521 توليد كردند . گلوكز و فنيل آلانين به عنوان پيشساز پاكلي تاكسل عمل كردند اما فنيل آلانين بهتر عمل كرد كه با نتايج در P.microspora ، T.andreanae هماهنگ است . بنزوات سديم ، پاكلي تاكسل نشاندار توليد نكرد بنابراين بنزوات يك فعالساز و تنظيم كننده متابوليكي در Periconia است . بنابراين مي توان گفت در Periconia Sp. ، Taxomyces andreanae بنزوات سديم با وجود داشتن جز بنزوات دست كم به اندازه گلوكز و فنيل آلانين به عنوان پيشساز عمل نكرده است . از آنجا كه تركيبات فنلي فعالساز از نوعي بودند كه در A.tumefaciens بيماريزايي را القا مي كنند مي توان گفت توليد پاكلي تاكسل در برخي قارچ ها توسط فراورده هاي گياهي تنظيم مي شود و ممكن است در اقتصادي سازي توليد پاكلي تاكسل از طريق فرمانتاسيون صنعتي به كار آيد

46. از حضور و حوصله شما تشکر می کنم