tecnicas moleculares, o principio delas, muito bom para ter uma introdução ao conteudo

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
LABORATÓRIO DE VIROLOGIA
Equipe de Virologia
UFRGS & IPVDF
www.ufrgs.br/labvir
Diagnóstico de
infecções virais

2. • Duas formas
 Buscar o vírus
 Métodos diretos
 Buscar a resposta do organismo
 Métodos indiretos
Diagnóstico de infecções virais

3. • Métodos diretos: utilizados na detecção do
vírus, antígenos ou genomas virais:
 Microscopia eletrônica
 Isolamento viral
 Detecção imunológica (IPX ou IF)
 Hemaglutinação (HA)
 ELISA direto
 PCR, RT-PCR, Real-time PCR
Buscar o vírus

4. • Permite a visualização de partículas
víricas viáveis e também inviáveis
• Aplicável virtualmente a todos os vírus
• Identificação definitiva do agente
• Desvantagens:
 Caro
 Baixa sensibilidade
 Mão de obra especializada
Microscopia eletrônica
Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Megavirus
Megavirus chilensis

5. • Identificação pela produção do efeito
citopático (ECP) característico
• Exige vírus viável
• Boa sensibilidade
• Não aplicável a alguns vírus
• Disponibilidade de linhagens celulares
Isolamento em cultivo celular

6. • Os vírus são espécie-específicos, mas alguns
conseguem se multiplicar em células da
espécie homóloga
• BVDV: céls de bovinos, ovinos, suínos,
carnívoros e primatas
• PRRSV: céls MARC-145 (céls de primata)
• EHV: céls VERO (primata) e RK-13 (coelho)
• Influenza: MDCK (canina)
• BoHV: MDBK, CRIB, VERO, etc
Qual célula utilizar

7. • É o dano que o vírus causa à célula
 lise
 arredondamento
 vacuolização
 formação de sincícios
 inclusões
 picnose
 apoptose
Efeito citopático (ECP)

8. Adenovírus em células 293A
Fonte: Knak et al., in prep
Efeito citopático (ECP)

9. • Obtenção do vírus viável permite a sua
caracterização e estudos posteriores
 Detecção de antígenos ou ácidos nucleicos
 Neutralização com soro imune específico
• Desvantagens: caro, demorado, risco de
contaminações
Isolamento viral

10. • Inoculação em animais
 Ex.: em camundongos lactentes para
o diagnóstico conclusivo da raiva
• Inoculação em ovos embrionados
 Teremos uma aula específica sobre este
tema
Outras formas de detecção
direta do vírus

11. • Observação da capacidade do vírus de
aglutinar hemácias
• Vantagens: rápida, boa sensibilidade e
especificidade e de fácil execução
• Desvantagens: aplicável a um grupo
restrito de vírus
 Necessidade de espécies doadoras de
hemácias (cobaias, coelhos ou galinha)
Hemaglutinação (HA)

12. • Alguns vírus possuem estruturas capazes de se ligar a
receptores específicos de hemácias de determinadas espécies
e produzir o fenômeno da HEMAGLUTINAÇÃO
Essas estruturas são as
hemaglutininas (glicoproteínas
de superfície dos virions)
Hemaglutinação (HA)

13. • Alguns vírus com capacidade hemaglutinante
– Influenza
– Parainfluenza
– Adenovírus bovino, equino, canino
– Parvovírus
– Doença de Newcastle
– Bronquite infecciosa das galinhas
Hemaglutinação (HA)

14. • Mecanismo /
Princípio
Hemaglutinação (HA)

15. • Interpretação
– Reação positiva: presença de vírus
– Reação negativa: ausência de vírus
– Reação negativa: ausência de vírus
Hemaglutinação (HA)

16. 1º PBS
Hemaglutinação (HA)

17. 2º Vírus
Hemaglutinação (HA)

18. 3º Diluição do vírus
25μl
Hemaglutinação (HA)

19. 4º Hemácias a 1%
Hemaglutinação (HA)

20. • Utiliza anticorpos específicos
• Método mais utilizado para detecção e
identificação viral
• Diferentes amostras: secreções, tecidos
ou céls de cultivo inoculadas
• IPX, Imunofluorescência, ELISA
Detecção de antígenos virais

21. • Vantagens: alta sensibilidade e
especificidade
• Rapidez, baixo custo e facilidade de
execução
• Kits comerciais ampliaram e popularizaram
o uso
Detecção de antígenos virais

22. • É uma técnica de detecção de antígeno (Ag)
utilizada no diagnóstico de infecções víricas
• Baseia-se na reação de anticorpos (Ac)
específicos com o antígeno presente no
material suspeito
 Imunocitoquímica: monocamadas celulares
 Imunoistoquímica: diretamente em tecidos
Imunoperoxidase (IPX)

23. IPX

24. - IPX indireta é mais sensível Ampliação do sinal!
IPX

25. Resultado positivo
Resultado negativo
IPX

26. • Tb é uma técnica baseada na reação
antígeno-anticorpo
• Proteínas virais são detectadas por Ac
conjugados com marcador fluorescente
• Rápida, fácil, apresenta boa sensibilidade
e especificidade
• Detecta tb vírus inviável
Imunofluorescência

27. • Disponível em kits
• Desvantagens:
 Podem ocorrer reações inespecíficas
 Reagentes para alguns vírus podem
não ser disponíveis
• Aplicação: imunofluorescência direta para
o diagnóstico do vírus da raiva
Imunofluorescência

28. • Diagnóstico da raiva
• Amostras de cérebro suspeitas
• Impressão tecidual em lâminas (imprint)
• Anticorpo marcado com FITC sobre
material infectado
• Visualização em microscópio de
fluorescência
Imunofluorescência direta

29. Imunofluorescência direta
Fonte: http://www.utmb.edu/virusimages/
Cérebro de raposa positivo para o vírus da raiva (CDC, 1958)

30. • Baseia-se na identificação de anticorpos e/ou
antígenos, por anticorpos marcados com uma
enzima, de maneira que esta enzima age sobre
um substrato e a reação faz com que o
cromógeno mude de cor
 Tipos de ELISA:
indireto, direto, competitivo
ELISA

31. • Anticorpos imobilizados em placas de
poliestireno detectam o vírus presente na
amostra
• Rápida, sensível, específica,
automatizável, disponível em kits,
 Desvantagens: kits comerciais são caros
e podem apresentar falhas na detecção
(falsos-negativos)
ELISA direto

32. • Também denominado sanduiche ou de captura
• Utilizado para detecção de antígenos
• Anticorpo primário específico ao antígeno é
adsorvido no poço da microplaca
• Adiciona-se o antígeno
• O segundo anticorpo específico ao antígeno é
marcado com uma enzima é adicionado
ELISA direto

34. • PCR, Nested PCR, multiplex PCR
• RT-PCR
• Real-time PCR
• NGS
• Alia alta sensibilidade e especificidade
• Aplicável a todos os vírus
• Rápida e automatizável
Detecção de ácidos nucleicos

35. • Teremos aulas específicas sobre estes
temas
 21/05 Prática: PCR e Nested PCR
(Fabrício e Helton)
 04/06 Prática: Real time PCR (Tiane)
 18/06 Teórica: Next Generation
Sequencing (Fabricio e Helton)
Detecção de ácidos nucleicos

36. • Quando ocorre contato com o vírus
• Detecção de anticorpos
• Métodos indiretos:
 Soro-neutralização
 Inibição da hemaglutinação (HI)
 Imunofluorescência indireta
 ELISA indireto
Buscar a resposta do organismo

37. • Técnicas de detecção de anticorpos são tb
denominados testes sorológicos
• Importância na epidemiologia: prevalência
e distribuição de infecções virais
• Resultados dos exames sorológicos
devem ser interpretados de acordo com a
biologia e epidemiologia do agente e da
resposta imunológica do hospedeiro
Detecção de anticorpos antivirais

38. Inibição da Hemaglutinação
• Anticorpos antivirais impedem a atividade
hemaglutinante do vírus
• Rápida, sensível, especifica, custo baixo
• Somente aplicável a vírus
hemaglutinantes
• Requer animais doadores de hemácias
• Não automatizável

39. Detecção de anticorpos capazes
de inibir a atividade aglutinante
de alguns vírus
Inibição da Hemaglutinação

40. Resultado positivo
PRESENÇA DE ANTICORPOS
Resultado negativo
AUSÊNCIA DE ANTICORPOS
Inibição da Hemaglutinação

41. • Anticorpos presentes no soro previnem a
replicação viral e a produção de ECP nas células
• Vantagens: sensível, especifica, qualitativa e
quantitativa
Soroneutralização
Anticorpos anti-BoHV
Foto: Fabrício Campos
Foto: http://images.google.com.br

42. • Obj.: avaliar o título de anticorpos neutralizantes
• Determinar nível de imunidade de uma população
• Determinar poder imunogênico de vacinas
• Desvantagens: exige cultivo celular, toxicidade do
soro
 Detecta somente anticorpos neutralizantes
 Somente vírus que replicam em cultivo
Soroneutralização

43. • Vírus “desafio” previamente conhecido e quantificado
• Teste realizado em microplacas de 96 cavidades
• Incubação das diluições crescentes do soro-teste com
uma quantidade constante de vírus (100 DICC50)
• 1h a 24h de incubação (OIE: 24hs)
• Adição das células de cultivo
• Soro-vírus-célula (37°C; 5% de CO2 ; 48 a 96h).
Soroneutralização

44. 100 DICC50
7° dil.1° dil. 2° dil. 3° dil. 4° dil. 5° dil. 6°dil.
100
DICC50
Vírus Estoque:
Título = 106
105 104 103 102 101 100 10-1
DICC50 = Doses infectantes em 50% do cultivo celular
900 ul
100 ul
MEM
Vírus
900 ul
100 ul
900 ul
100 ul
900 ul
100 ul
900 ul
100 ul
900 ul
100 ul
900 ul
100 ul
10
DICC50
1
DICC50
0,1
DICC50
Calculo de dose infectante

45. + -
soro teste
vírus suspeito
células
24 horas
Soroneutralização

46. Leitura: 48-96h
VÍRUS CITOPÁTICO
+ -
Presença de Ac –
neutralização viral –
ausência de efeito
citopático
Ausência de Ac –
vírus livre –
presença de efeito
citopático
Soroneutralização

47. Leitura: 48-96h
VÍRUS NÃO CITOPÁTICO
+ -
Presença de Ac –
neutralização viral –
ausência de efeito
citopático
Ausência de Ac –
vírus livre –
presença de efeito
citopático
Soroneutralização

48. VÍRUS NÃO
CITOPÁTICO
IPX
Soroneutralização

49. Soroneutralização

50. • Anticorpos presentes no soro se ligam a
antígenos imobilizados e são detectados
por anticorpos marcados com FITC
• Vantagens: rápida e simples
• Desvantagens: risco de reações
inespecíficas
 Reagentes para alguns vírus podem não ser
disponíveis
Imunofluorescência indireta

51. Imunofluorescência indireta
Fonte: www.virologyj.com - Figure
Imunofluoresncencia indireta feita com soro de galinha
em células Vero infectadas com virus West Nile

52. • Utilizado para detecção de anticorpos
• Antígeno fica aderido aos poços da microplaca
• Adiciona-se o soro
• Em seguida um anticorpo marcado com uma
enzima que reage com o substrato fazendo
com que o cromógeno mude de cor
ELISA INDIRETO

54. • Detecta exposição, mas não quando ela
ocorreu
• Considerar a cinética de replicação dos
vírus para escolher o teste diagnóstico
• Sugestão de leitura: Capitulo 11:
Diagnóstico Laboratorial das Infecções
Víricas do livro Virologia Veterinária;
Flores, 2007.
Limitações da sorologia

55. Cinética da replicação viral
Fonte: Flores, 2007

56. Grato pela atenção!