1. Jurnal Praktikum Fitofarmasi
Nama : Dewi Gayatri W.
NIM : 102210101057
Kelompok : S4
Hari/ tgl praktikum : Selasa, 26 Februari 2013
Dosen pembimbing : Endah Puspitasari, S. Farm., M.Sc., Apt.
Materi percobaan : Selektivitas, linieritas dan presisi
1. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah agar mahasiswa dapat mengetahui dan melakukan uji
validasi metode dan penetapan kadar kuersetin secara KLT densitometri.
2. Dasar Teori
Validasi metode analisis adalah suatau rangkaian percobaan yang bertujuan untuk
memastikan bahwa metode analisis yang digunakan telah memenuhi persyaratan yang telah
ditetapkan. Parameter metode validasi meliputi 10 parameter yaitu linieritas, batas deteksi
(LOD), batas kuantitas (LOQ), akurasi, presisi, selektivitas, atau spesifisitas, sensivitas,uji
ketangguhan (ruggedness), kekuatan (robustness), dan ketidak pastian (uncertainty).
(Sumardi,2002)
Suatu metode dikatakan spesifik apabila mampu mengukur analit tanpa diganggu oleh
komponen lain, sedangkan metode dikatakn selektif apabila mampu mengukur analit dalam
campuran berbagai komponen lain. Spesifitas dapat dilakukan dengan menentukan identitas
dan kemurnian dari analit yang ditentukan. Sedangkan selektivitas dilakukan dengan
menentukan nila resolusi (Rs).
Linearitas adalah metoda analisa yang digunakan untuk mensintesa formula persamaan
regresi hubungan antara absorbsi dan konsentrasi dari suatu matrik Standart Reference
Material (SRM) berdasarkan kurva linerity kalibrasi sehingga terdeteksi kemampuan metoda
memberikan kenaikan respon sesuai dengan kenaikan konsentrasi. (Tri Budi M,2005).
Sebagai parameter adanya hubungan linear atau tidak digunakan koefisen korelasi (r) dari
persamaan regresi linear y = bx + a. Sedangkan Batas Deteksi (Limit of Deteksi = LOD)
adalah konsentrasi terendah yang masih mampu terdeteksi oleh suatu metoda dan berbeda
nyata dengan pengukuran blanko .(Sumardi, 2002).

2. Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar
analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery)
analit yang ditambahkan. Persen rekoveri dapat ditentukan dengan menggunakan 4 macam
pendekatan yaitu :
 Analisis sampel dengan konsentrasi diketahui
 Perbandingan hasil dengan metode standar
 Standar adisi, spiking dalam blanko
Penentuan akurasi dilakukan dengan cara membuat sampel plasebo ( eksipien obat,
cairan biologis) kemudian ditambah standar dengan konsentrasi tertentu ( 80–120
% dari kadar analit yang diperkirakan ), kemudian dianalisis dengan metode yang
akan divalidasi.
 Standar adisi, spiking standar dalam sampel
Metode adisi dapat dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit (standar)
dengan konsentrasi tertentu pada sampel yang akan diperiksa, lalu dianalisis
dengan metode yang akan divalidasi.
Presisi adalah nilai yang menunjukkan bahwa dengan pengulangan beberapa kali
pengukuran akan menghasilkan nilai yang tidak berbeda bermakna. Parameter presisi adalah
simpangan baku relatif (RSD) dari pengukuran secara berulang. Presisi suatu metode dapat
ditentukan dengan melakukan analisis sampel yang sama secara berulang kali dan disarankan
sebanyak 10 kali dengan nilai RSD tidak boleh lebih dari 2 %. Sedangkan untuk cairan
biologis RSD 10 % masih cukup memadai.

3. 3. Alat dan bahan
a. Alat
 Labu alas bulat  Termometer
 Labu ukur 10 ml  Gelas ukur
 Labu ukur 25 ml  Erlenmeyer
 Lempeng KLT  Timbangan
 KLT densitometri  Mikropipet
b. Bahan
 Sampel/ekstrak
 Standar kuersetin
 Kloroform
 Asam formiat
 Metanol
 Aseton
 Air
 Toluen
 Etil Asetat
4. Cara Kerja
a. Uji Selektivitas
Tentukan resolusi dengan menotolkan 10 µl larutan sampel yang
telah dihidrolisis bersama dengan 2 µl larutan standar konsentrasi
tertentu pada lempeng KLT
Eluasi dengan kondisi :
1. Kloroform : Aseton : As. Formiat = 150: 33: 17
2. Kloroform : Etil Asetat : As. Formiat = 5 :4 : 1
3. Kloroform : : Metanol : Air = 85 : 15 : 1
4. Toluen : Aseton : Metanol : As. Formiat = 46 : 8: 5: 1

4. Hitung resolusi dengan rumus :
Rs = =
Dimana :
ΔZ : Jarak dua noda analit
( dR )A : Jarak yang ditempuh analit A
( dR )B : Jarak yang ditempuh analit B
WA : Lebar noda analit A
WB : Lebar noda analit B
b. Linieritas
1. Pembuatan Larutan Baku Induk
Ditimbang seksama 30 mg standar kuersetin
Masukkan dalam labu ukur 10 ml
Tambahkan etanol ad tanda, kocok pelan ad larut
2. Pembuatan Larutan Baku Kerja
Encerkan larutan baku induk dengan konsentrasi 300, 600, 900,
1200, dan 1800 ppm
3. Penentuan Linieritas

5. Tentukan linieritas dengan menotolkan larutan baku kerja
sebanyak 2 µl pada lempeng KLT
Eluasi dengan fase gerak
Kloroform : Aseton : As. Formiat = 150 : 33 : 17
Scan lempeng KLT dengan KLT Densitometer untuk
menentukan area masing-masing konsentrasi pada λmax
Buat garis regresi linier dari data yang diperoleh antara
konsentrasi dengan area noda
Hitung nilai koefisien regresi
c. Presisi
1. Preparasi Standar Kuersetin
Timbang standar kuersetin 30 mg
Masukkan dalam labu ukur 10 ml
Tambahkan etanol ad tanda, kocok pelan ad larut (
larutan baku induk )
Encerkan larutan baku induk untuk mendapatkan larutan
baku kerja dengan konsentrasi 300, 600, 900, 1200, dan
1800 ppm

6. 2. Preparasi sampel
Timbang sampel 250 mg ( replikasi 3 kali )
Tambahkan etanol 21 ml dan HCl 57 % 0,6 ml
Masukkan dalam labu alas bulat
Hidrolisis pada suhu 70ºC selama 30 menit
Masukkan hasil hidrolisis dalam labu ukur 25 ml
Tambahkan etanol ad tanda
3. Penentuan Presisi
Totolkan hasil preparasi masing – masing 10 µl pada lempeng KLT
bersama larutan standar kuersetin konsentrasi 300, 600, 900, 1200, dan
1800 masing – masing 2 µl
Eluasi dengan fase gerak :
Kloroform : Aseton : As. Formiat = 150 : 33 : 17
Scan lempeng KLT dengan KLT Densitometer

7. Buat kurva regresi antara konsentrasi standar kuersetin
` dengan area
Tentukan kadar kuersetin dengan menginterpolasikan area ke
dalam kurva regresi larutan standar kuersetin
Tentukan presisi dengan menghitung SD dan KV kadar
kuersetin

8. d. Akurasi
1. Preparasi Standar Kuersetin
Lakukan preparasi seperti pada penentuan presisi
2. Preparasi sampel
Timbang sampel 250 mg ( 3 x replikasi ), masing – masing
tambahkan kuersetin 1 mg
Masukkan dalam labu alas bulat
Tambahkan etanol 21 ml dan HCl 57% 0,6 ml
Hidrolisis pada suhu 70 ºC selama 30 menit
Masukkan hasil hidrolisis dalam labu ukur 25 ml dan
tambahkan etanol ad tanda
3. Penentuan akurasi
Totolkan hasil preparasi masing – masing 10 µl pada lempeng
KLT bersama – sama dengan larutan standar kuersetin
konsentrasi 300, 600, 900, 1200, dan 1800 ppm masing –
masing sebanyak 2 µl

9. Eluasi dengan fase gerak
Kloroform : Aseton : Asam Formiat = 150 : 33 : 17
Scan lempeng KLT dengan KLT Densitometer
Buat kurva regresi antara konsentrasi standar kuersetin
dengan area
Tentukan kadarkuersetin dalam sampel dengan
menginterpolasikan area ke dalam kurva regresi larutan
standar kuersetin
Tentukan akurasi dengan rumus :
% Recovery = =
Dimana :
Ct = Kadar kuersetin yang diperoleh
Cp = Kadar kuersetin dalam sampel
Cst = Kadar standar kuersetin yang ditambahkan

10. Daftar Pustaka
Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode Dan Cara Perhitungannya.
Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3, Desember 2004, 117 – 135. Jakarta :
Departemen Farmasi FMIPA-UI.
Infansyah, N. Metode Analisis KLT Densitometri.Unit Layanan Pengujian dan
Kerjasama Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.
Sumardi, 2002 . Validasi Metoda Pengujian . Jakarta : Pusat Standardisasi dan
Akreditasi Sekjen Deptan .
Tri Budi U . 2005 . Validasi Metode Uji . Bogor : Balai Penelitian Veteriner .