Praktikum ini mengisolasi piperin dari lada hitam melalui ekstraksi berkesinambungan dengan pelarut etanol menggunakan metode soxhletasi. Ekstrak kental yang dihasilkan direaksikan dengan larutan KOH-etanol untuk membentuk kristal piperin. Identifikasi menggunakan KLT menunjukkan adanya piperin dalam sampel.

1. Pembahasan
Praktikum kali ini yaitu Isolasi piperin dalam lada hitam. Kandungan piperin pada lada hitam
lebih banyak dibandingkan pada lada putih. Lada hitam diperoleh dari pengeringan buah lada yang
belum terlalu matang. Tanaman lada memproduksi secara besar-besaran pada waktu buah dibentuk.
Karena itu, buah lada yang belum matang memiliki kandungan piperin yang banyak daripada buah
lada yang tela masak. Piperin diproduksi lebih banyak ketika buah belum matang dengan tujuan
mencegah pembusukan buah oleh hama selagi buah masih muda. Struktur piperin adalah sebagai
berikut :
N
CO CH
HC CH
HC
O
O
CH2
Metode ekstraksi yang dilakukan adalah metode ekstraksi berkesinambungan. Tujuannya
adalah untuk memperoleh hasil ekstrak yang lebih murni lagi. Lada hitam yang digunakan
dibersihkan dan dihaluskan hingga terbentuk serbuk lada yang halus. Tujuan penghalusan lada hitam
adalah agar zat-zat yang terkandung di dalam lada hitam mudah melarut dalam pelarut yang
digunakan. Hal ini karena semakin halus serbuk, maka kelarutan akan meningkat karena semakin
banyak terjadi kontak dengan pelarut, sehingga semakin banyak zat yang dapat terbentuk dan
semakin efisien proses pemisahan atau ekstraksi yang terjadi.
Isolasi piperin dari lada hitam dilakukan dengan cara ektrasi padat-cair yaitu dengan teknik
soxhletasi. Metode ini dipilih karena pelarut yang digunakan lebih sedikit (efesiensi bahan) dan
larutan sari yang dialirkan melalui siphon tetap tinggal dalam labu, sehingga pelarut yang digunakan
untuk mengekstrak sampel selalu baru dan meningkatkan laju ekstraksi, waktu yang digunakanpun
lebih cepat. Pelarut yang digunakan adalah etanol. Etanol digunakan untuk melarutkan zat yang
diinginkan dari dalam lada hitam. Etanol dan piperin memiliki kepolaran yang sama yaitu bersifat
polar sehingga etanol mampu melarutkan piperin sesuai dengan prinsip like dissolved like. Piperin
dengan etanol mampu untuk membentuk ikatan hydrogen sebagai berikut:

2. N
CO CH
CH CH
CH3 O
CH2
O
HOCH2CH3
ikatan hidrogen
Proses yang terjadi selama soxhletasi adalah pelarut etanol dipanaskan dalam labu bundar sehingga
menguap dan didinginkan menggunakan kondensor, sehingga jatuh berupa cairan ke sample (lada
hitam) untuk melarutkan zat aktif di dalam sampel lada hitam dan jika cairan pelarut telah mencapai
permukaan sifon maka seluruh cairan pelarut etanol yang membawa solute telah mencapai
permukaan sifon akan keluar melalui pipa kecil menuju labu bundar datar dan proses ini terjadi
secara terus menerus atau continue sehingga terjadi proses soxhletasi. Dari proses ini mengalami 4
siklus yang continue menghasilkan larutan lada hitam atau ekstraktan yang berwarna hijau bening.
Ekstrak hijau bening yang terbentuk diletakkan dalam wadah didiamkan selama beberapa hari untuk
menguapkan pelarutnya sehingga didapatkan ekstrak kental. Saat praktikum, seharusnya sebelum
pelarut diuapkan, ekstrak cair di saring terlebih dahulu untuk emnghilangkan pengotor yang ada.
Namun saat praktikum tidak dilakukan. Alhasil, setelah beberapa hari muncul beberapa pengotor
tapi tidak mengganggu kestabilan ekstrak.
Ekstrak kental yang terbentuk disaring terlebih dahulu. Lalu ditempat berbeda dibuat KOH
etanolik 10% yaitu dengan mencampurkan 5 gram KOH dengan 50 ml etanol. Diaduk rata sampai
padatan KOH larut. Setelah larut, dicampurkan dengan ekstrak kental lada hitam yang telah disaring.
Penambahan larutan KOH etanolik bertujuan untuk memperoleh piperin dari ekstrak pekat tersebut,
dimana di dalam ekstrak tersebut terdapat komponen lain ketika ditambahkan KOH-etanol yang
menyebabkan piperin yang ada dalam ekstrak tersebut bereaksi menjadi garam asam piperat dan
dengan penambahan KOH-etanol dapat mengeliminasi senyawa lainnya, karena dalam ekstak
tersebut masih ada zat pengotor. Masih terdapatnya zat pengotor ini disebabkan senyawa piperin,
merupakan senyawa alkaloid golongan amida yang dapat mengalami reaksi hidrolisis baik dalam
suasana asam maupun basa.
Reaksi hidrolisis amida dalam suasana basa digambarkan sebagai berikut :
R C
O
NH2
+ -
OH R C
O-
NH2
OH R C
O
O-
NH3+

3. Reaksi hidrolisis dalam suasana asam digambarkan sebagai berikut :
R C
O
NH2
+ H+
R C
OH
NH2
R C
OH
NH2
HOH+ OH2 R C
O
OH
+ NH4
+
Hidrolisis piperin dapat dilakukan dengan menggunakan larutan 10% KOH-etanol menjadi
asam piperat digambarkan sebagai berikut :
N
CO CH
HC CH
HC
O
O
CH2
KOH
CH3OH N
H
Piperidin
+
CH
HC CH
HC
O
O
CH2
HO2C
Asam Piperat
Campuran KOH etanolik dan ekstrak dimasukkan ke dalam kulkas untuk mempercepat
proses kristalisasi dan agar terjadi pembentukan Kristal piperin yang sempurna. Beberapa jam
kemudian, ekstrak dikeluarkan dan dapat dilihat bahwa telah terbentuk Kristal didasar gelas beaker.
Kristal yang terbentuk diambil dengan cara mengambilnya menggunakan pipet tetes.
Identifikasi kristal piperin dengan metode KLT. KLT digunakan untuk uji kualitatif, yang
bertujuan mengetahui ada tidaknya piperin dalam ekstrak yang didapatkan. Pada dasarnya
piperin yang merupakan senyawa non polar akan lebih tertarik untuk ke fase gerak yang non polar,
dibandingkan dengan fase diam yang polar, sesuai dengan prinsip like dissolve like. Oleh sebab itu
dipilih pelarut berupa toluene yang nonpolar dan etil asetat yang semi polar. Pertama-tama, dibuat
fase gerak dengan mencampurkan toluene dan etil asetat dengan perbandingan 70:30 (7ml:3ml).
Fase gerak dimasukkan dalam chamber dan dijenuhkan. Penjenuhan dimaksudkan untuk membuat
tekanan di dalam dan di luar chamber sama, sehingga memudahkan ketika proses elusidasi.
Ditempat yang berbeda, kristal tersebut lalu dilarutkan dengan pelarut berupa etanol pada gelas
beaker pertama dan dilarutkan dengan etil asetat pada gelas beaker kedua. Setelah larut, ditotolkan
pada plat Silika yang sebelumnya telah ditandai batas atas dan bawahnya menggunakan pensil untuk
mengetahui panjang elusi. Penotolan dilakukan dengan bantuan pipa kapiler. Plat tersebut

4. dielusidasi di dalam chamber yang telah dijenuhkan tadi. Setelah proses elusidasi selesai dilakukan,
bercak atau spot yang terbentuk diamati di bawah sinar tampak, sinar UV 254 dan 366 nm.
Adapun mekanisme dan prinsip penampakan noda pada pegujian Kromatigrafi yaitu bila
pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel akan tampak berwarna gelap. Hal
ini karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada
lempeng. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh
komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang
lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi. Sedangkan pada UV
366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng akan berwarna gelap. Hal ini karena adanya daya
interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda
tersebut. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh
komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang
lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi. Sehingga noda yang
tampak pada lampu UV 366 terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak berfluororesensi
pada sinar UV 366 nm.
Kemudian plat yang sudah diamati tersebut, disemprot dengan pereaksi semprot dragendrof
yang berfungsi sebagai pengompleks warna, dan diamati warna yang terjadi. Dragendrof terbuat
dari 10 mL larutan KI 40% ditambahkan dengan 10 mL larutan 0,85 gram bismuth subnitrat dalam 10
mL asam asetat dan 50 mL air. Larutan tersebut diencerkan dalam 10 mL asam asetat dan 50 mL air.
Warna yang ditunjukkan dari bercak adalah orange. Bila reaksi warna tidak muncul maka perlu
dilakukan pemanasan. Identifikasi membuktikan bahwa dalam fructus piperis nigrii mengandung
senyawa piperin. Hasil yang didapat yaitu Rf Kristal dengan pelarut etil asetat yaitu 0,38 dan Rf
Kristal dengan pelarut etanol yaitu 0,56. KLT yang merupakan metode kualitatif sangat begruna
dalam menetukan jumlah kecil pengotor dan digunakan untuk mengevaluasi kandungan tanaman
obat. Rf Kristal hasilnya hampir sama dengan Rf standar yaitu RF dengan pelarut etil aseat 0,33 dan
Rf Kristal dengan pelarut etanol yaitu 0,55 (berdasarkan literature 0,3384 dan 0,5538).