Este documento describe la producción de metabolitos tóxicos por dinoflagelados y nuevos retos en su estudio. Presenta varias toxinas producidas por dinoflagelados como la brevetoxina, yessotoxina y maitotoxina, así como metabolitos con potencial farmacológico como anfidinolida A y goniodomina A. También describe líneas de investigación sobre la elucidación estructural de nuevas toxinas, estudios biosintéticos y de mecanismo de acción.

1. Metabolitos
de
excreción
de
dinoflagelados:
Nuevos
retos
José
Javier
Fernández
Ins$tuto
Universitario
de
Bio-­‐Orgánica
“Antonio
González”
(IUBO),
Universidad
de
La
Laguna
(ULL),
Astro@sico
Francisco
Sánchez
2,
38206
La
Laguna,
Tenerife

2. Producción de poliéteres
Dinoflagelados
TOXINAS
HERRAMIENTAS
FARMACOLÓGICAS
Almería
–
2012

3. Poliéteres
fusionados
Brevetoxina B
Organismo:
Karenia brevis
Gymnodinium breve
Actividad:
Interacciona con
canales de Na+
dependientes de
voltaje.
Intoxicación:
NSP
Yessotoxina
Organismo:
Protoceratium reticulatum
Lingulodinium polyedrum
Actividad:
Acción sobre fosfodiesterasa
Intoxicación:
DSP
Maitotoxina
Organismo:
Gambierdiscus toxicus
Actividad:
↑ [Ca2+] intracelular por
canales de cationes no
selectivos
Intoxicación:
CFP
Almería
–
2012

4. Macrociclos
ANFIDINOLIDA A
Organismo:
Amphidinium sp.
Actividad:
Anticancerígeno:
leucemia L1210
cáncer de colón
carcinoma epidermis KB
Intoxicación:
-----
GONIODOMIN A
Organismo:
Goniodoma sp.
G. pseudogoniaulax
Actividad:
Reorganiza citoesqueleto
Antifúngico
Intoxicación:
-----
ZOOXANTELATOXINA B
Organismo:
Symbiodinium sp.
Actividad:
Vasoconstrictora
Intoxicación:
-----
Almería
–
2012

5. Poliéteres
lineales
PALITOXINA
Organismo:
Ostreopsis siamensis
O. ovifrons
Actividad:
Interviene en las
bombas Na+ y K+
Intoxicación:
CFP
ANFIDINOL
Organismo:
Amphidinium klebsii
Actividad:
Disruptor de membrana
Hemolítico
Antifúngico
Intoxicación:
----
ÁCIDO OKADAICO
Organismo:
Prorocentrum: arenarium, belizeanum, concavum,
faustiae, hoffmanianum, lima, maculosum.
Dinophysis: acuminata, acuta, fortii, mitra,
norgevica, rotundata, sacculus, tripos
Actividad:
Inhibición PP1 y PP2A
Intoxicación:
DSP
Almería
–
2012

6. Poliéteres
lineales
ÁCIDO OKADAICO
Organismo:
Prorocentrum: arenarium, belizeanum, concavum,
faustiae, hoffmanianum, lima, maculosum.
Dinophysis: acuminata, acuta, fortii, mitra,
norgevica, rotundata, sacculus, tripos
Actividad:
Inhibición PP1 y PP2A
Intoxicación:
Diarrhetic Shellfish Poisoning (DSP)
O
O
OH
O
O
OO
O
HO
O
OH
OH
OH
1
44 7
9 11
42
14
17
20
24
26
41
40
39
31
35
38
43
O
O
OH
O
O
OO
O
HO
O
OH
OH
OH
3
8
19 25
347
11 18
20
24
26
33
35
38
Dinophysis sp. Prorocentrum sp.
Almería
–
2012

7. Almería
–
2012

8. Líneas
de
inves$gación
I. Estudio de elucidación estructural de nuevas toxinas
II. Estudios biosintéticos
III. Aproximación al modo de acción y estudios SAR
Almería
–
2012

9. O
O
OH
O
O
OO
O
HO
O
OH
OH
OH
1
44 7
9 11
42
14
17
20
24
26
41
40
39
31
35
38
43
O
O
OH
O
O
OO
O
HO
O
OH
OH
OH
3
8
19 25
347
11 18
20
24
26
33
35
38
Ácido
Okadaico
J.
Med.
Chem.
2004,
47,
10-­‐13;
Org.
Le..
2007,
9,
4191-­‐4194
Almería
–
2012

10. O
O
OH
O
O
OO
O
HO
O
OH
OH
OH
1
44 7
9 11
42
14
17
20
24
26
41
40
39
31
35
38
43
O
O
OH
O
O
OO
O
HO
O
OH
OH
OH
3
8
19 25
347
11 18
20
24
26
33
35
38
Toxinas
DSP:
análisis
y
control
Ensayo
ratón
Unidad
ratón
Deriva;zar
con
ADAM
Toxicon
2010,
56,
191-­‐217
Almería
–
2012

11. O
O
OH
O
O
OO
O
HO
O
OH
OH
OH
1
44 7
9 11
42
14
17
20
24
26
41
40
39
31
35
38
43
O
O
OH
O
O
OO
O
HO
O
OH
OH
OH
3
8
19 25
347
11 18
20
24
26
33
35
38
Toxinas
DSP:
análisis
y
control
Ensayos
de
inhibición
de
proteína
fosfatasa
Toxicon
2010,
56,
191-­‐217
Almería
–
2012

12. O
O
OH
O
O
OO
O
RO
O
OH
OH
OH
OH OH
OH
OH
OH
OH
OOH
OH
OH
OH
OH
OHOH H
OOH
Derivados
del
Ácido
Okadaico
Toxicon
2010,
56,
191-­‐217

13. DTX
5c
OA
diol
C-­‐10
Nuevas
toxinas
DSP
Toxicon
2006,
47,
920-­‐924;
Toxicon
2007,
50,
470-­‐478,
Toxicon
2010,
56,
191-­‐217
Almería
–
2012

14. Toxicon
2006,
47,
920-­‐924;
Toxicon
2007,
50,
470-­‐478,
Toxicon
2010,
56,
191-­‐217
Almería
–
2012
Toxinas
DSP:
análisis
y
control
Análisis
con
ratón
Análisis
HPLC/MS

15. Prorocentrum
belizeanum
Cepa
PBMA01
Isla
Reunión
(Océano
Índico)
Almería
–
2012

16. 20 días
INÓCULO INICIAL
3 ml (7000 células/ml)
TANQUES DE 60 L
42 LITROS DE CULTIVO
ERLENMEYERS 50 ml
20 ml DE CULTIVO
ERLENMEYERS 250 ml
100 ml DE CULTIVO
ERLENMEYERS 5 L
2 LITROS DE CULTIVO
TRATAMIENTO DEL CULTIVO
VOLUMEN TOTAL > 1000 L
50 días
20 días
20 días
CULTIVO PARALELO
ERLENMEYERS 50 ml
20 ml DE CULTIVO
20 días
Medio Guillard-K
Temperatura: 22 ºC
Irradiancia: 160 µE/m²s
Ciclo luz/oscuridad: 16/8
Cul$vos
a
gran
escala
de
Procentrum
belizeanum
Almería
–
2012

17. Almería
–
2012

18. RESIDUO
MEDIO DE
CULTIVO
(1) Decantación
(2) Centrifugación, 4 ºC
7000 rpm, 10 min
EXTRACTO EN
ACETONA
18,45 g
CULTIVO
Prorocentrum belizeanum
1000 L
BIOMASA
Diaion® HP-20
1,5 litros/hora
Extracción
con Acetona
Extracción
con Metanol
EXTRACTO EN
METANOL
14,95 g
MATERIAL
RETENIDO
1,52 g
RESTOS
CELULARES
Tratamiento
del
cul$vo
Almería
–
2012

19. Prorocentrum
belizeanum
Extracto
de
acetona
22.1
g
Okadaic
Acid
70
mg
Belizeanic
Acid
0.5
mg
FracTon
B2a
13
mg
FracTon
B2b
135
mg
FracTon
B2
209
mg
Sephadex
LH-­‐20
CH2Cl2:MeOH:n-­‐Hex
(1:1:2)
Lobar
Lichroprep
RP-­‐18
CH3CN:H2O
(1:1)
Lobar
Lichroprep
RP-­‐18
MeOH:H2O
(7:3)
Lobar
Lichroprep
RP-­‐18
MeOH:H2O
(17:3)
Lobar
Lichroprep
RP-­‐18
CH3CN:H2O
(1:1)
Corozalic
Acid
0.6
mg
Okadalactone
1.9
mg
FracTon
B3
5231
mg
FracTon
C
7.14
g
FracTon
A
4.65
g
FracTon
B4
138
mg
HPLC
XTerra
MeOH:CH3CN:H2O
(5:3:2)
HPLC
XTerra
CH3CN:H2O
(1:1)
19-­‐epi-­‐Okadaic
Acid
1.0
mg
FracTon
B
8.11
g
FracTon
B4d
14
mg
FracTon
B1
1742
mg
Esquema
cromatográfico
de
aislamiento
Almería
–
2012

20. Ácido
19-­‐epi-­‐Okadaico
Ácido
Okadaico
O
O
OH
O
O
OO
O
HO
O
OH
OH
OH
1
44 7
9 11
42
14
17
20
24
26
41
40
39
31
35
38
43
O OH
3
11 18
24
Ácido
19-­‐epi-­‐Okadaico
:
estudio
estructural
Almería
–
2012

21. Ácido
Okadaico
Ácido
19-­‐epi-­‐Okadaico
Ácido
19-­‐epi-­‐Okadaico
:
estudio
estructrual
Almería
–2012

22. Ácido
19-­‐epi-­‐Okadaico
:
estudio
conformacional
Ácido OkadaicoÁcido 19-epi-Okadaico
C1
C24
C1
C24
R*
Org.
Le..
2007,
9,
3045-­‐3048,
Mar.
Drugs
2008,
6,
489-­‐495
O
O O
OH
HO
O
O
OH
O
O
O
OH
OH
1
7
14
19 25
30
38
39
40
41
42
43
44
Almería
–
2012

23. O
O
OH
O
HO
O
O
HO
O
OH
OH
OH
1
44 7
9 11
42
14
24
26
41
40
39
31
35
38
43
OH
OH
16
19
Acido OkadaicoAcido Belizeánico
S*
S*
Ácido
Belizeánico
Chem.
Eur.
J.
2008,
14,
6948-­‐6956
Almería
–
2012

24. O
O
OH
O
O
O
OH
O
OH
HO
OH
OH
O
44
8
12
43
7 16
25
30
38
O
O
OH
O
O
O
OH
43
16
25
30
38
O
O
HO
HO
OH
OH OH
Ácido
Corozálico
Almería
–
2012
Chem.
Eur.
J.,
2010,
16,
11576-­‐11579

25. O
O
OH
O
O
O
OH
O
OH
HO
OH
OH
O
44
8
12
43
7 16
25
30
38
O
O
OH
O
O
O
OH
43
16
25
30
38
O
O
HO
HO
OH
OH OH
O
O
OH
O
HO
O
O
HO
O
OH
OH
OH
1
44 7
9 11
42
14
24
26
41
40
39
31
35
38
43
OH
OH
16
19
O
O
OH
O
O
OO
O
HO
O
OH
OH
OH
1
44 7
9 11
42
14
17
20
24
26
41
40
39
31
35
38
43
O
O
OH
O
O
OO
O
HO
O
OH
OH
OH
3
8
19 25
347
11 18
20
24
26
33
35
38
R*
Ácido Belizeanico
Ácido 19-epi-Okadaico
Ácido Corozalico
Nuevas
toxinas
de
$po
DSP
Almería
–
2012

26. Tratamiento del medio de cultivo
RESIDUO
MEDIO DE
CULTIVO
(1) Decantación
(2) Centrifugación, 4 ºC
7000 rpm, 10 min
EXTRACTO EN
ACETONA
18,45 g
CULTIVO
Prorocentrum belizeanum
1000 L
BIOMASA
Diaion® HP-20
1,5 litros/hora
Extracción
con Acetona
Extracción
con Metanol
EXTRACTO EN
METANOL
14,95 g
MATERIAL
RETENIDO
1,52 g
RESTOS
CELULARES
Almería
–
2012

27. Material Retenido
1,52 g
Fracción H1
0,47 g
Fracción H2
0,38 g
Fracción H3
0,55 g
Lobar® Lichroprep RP-8
CH3OH : H2O 50:50
Fracción H31
0,21 g
Fracción H32
0,19 g
Fracción H33
0,07 g
Fracción H34
0,04 g
Sephadex® LH-20
CH3OH : CHCl3 33:66
Fracción H32A
0,12 g
Fracción H32B
0,04 g
HPLC, XTerra® Prep MS C18
AcONH4 2 mM : CH3CN : CH3OH
56:6:38
Ácido belizeanólico
69,3 mg
Ácido okadaico
1,7 mg
HPLC, XTerra® Prep MS C18
CH3OH : AcONH4 2 mM 70:30
HPLC, Microsorb® 100-8 C18
CH3OH : AcONH4 2 mM 80:20
Belizeanolido
6,7 mg
Actividad citotóxica moderada
Cromatogra@a
de
las
aguas
de
cul$vo
Almería
–
2012

28. Estudio
estructural
del
Ácido
Belizeanólico
Almería
–
2012

29. ESI-
ANÁLISIS LC/MS
MODO TIC
-Total Ion Current-
Análisis
mediante
HPLC-­‐MS
Análisis
mediante
HPLC-­‐MS
Almería
–
2012

30. MALDI-TOF Ácido belizeanólico.MALDI-TOF Ácido belizeanólico.
ESI [M–H]–
m/z 1441,85
MALDI [M+Na]+
m/z 1465,89
MALDI [M+K]+
m/z 1481,87
C81 H134 O21
MLADI-­‐TOF
Almería
–
2012

31. Estudio
estructural
de
Ac.
Belizeanólico
Almería
–
2012

32. 10 Metilos
21 Metilenos alifáticos
27 Metinos alifáticos
7 Metinos olefínicos
6 Metilenos tipo exo
Heteronuclear Single-Quantum Correlation spectroscopy (HSQC)

33. Estudio
estructural
de
Ac.
Belizeanólico:
fragmentos
de
espin
Almería
–
2012
Correlation Spectroscopy (COSY)
Total Correlation Spectroscopy (TOCSY)

34. Estudio
estructural
de
Ac.
Belizeanólico:
fragmentos
de
espin
Almería
–
2012
Correlation Spectroscopy (COSY)
Total Correlation Spectroscopy (TOCSY)

35. Ac.
Belizeanólico:
esqueleto
de
carbono
Heteronuclear Multiple-Bond Correlation spectroscopy (HMBC)

36. DESPLAZAMIENTO INDUCIDO POR
EFECTO ISOTÓPICO SECUNDARIO
Efecto β en grupos hidroxilo
ΔδC 0,09 - 0,12 ppm
Ac.
Belizeanólico:
iden$ficando
sistemas
de
anillos
Almería
–
2012

37. ÁCIDO BELIZEANÓLICO
SINAQO
–
Córdoba
2011
Ac.
Belizeanólico:
iden$ficando
sistemas
de
anillos
Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 796.

38. Belizeanolido
Almería
–
2012

39. BELIZEANOLIDO
Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 796.
Belizeanolido
Almería
–
2012

40. Líneas
de
inves$gación
I. Estudio de elucidación estructural de nuevas toxinas
II. Estudios biosintéticos
III. Aproximación al modo de acción y estudios SAR
Almería
–
2012

41. Cul;vos
de
Prorocentrum
Medio
Guillard
K
2,5
Litros
x
7
Adición
de
an;bió;cos
Penicilina
G
(40
U/mL)
Sulfato
de
estreptomicina
(200
U/mL)
Adición
de
precursores
enriquecidos
con
isótopos
estables
(0.67
mM)
Recolección
Preparación
del
extracto
Metabolitos
enriquecidos
7
días
1
día
14
días
CHCl3:MeOH
1:1
Cromatograca
Experimento
biosinté$co
Almería
–
2012

42. Experimento
biosinté$co
Almería
–
2012
39
4240
35
43
37
32
6
21
44
31
28
11
20
5
29
17
333613
3
18
13
3 18
36
28
11
20 5
33
29
17
31 21
6
32
44
37 43
35
40
42 39
A)
B)

43. c
m
c
m
c
O
O
m
c
m
m
c
m
c
m
O
c
mc
m
c
m
c
O
O
m
m
m
c
m
c
m
O
m
c
m
c
c
O
m
c
m
HO
O
m
OH
m
m
OH
OH
m
m
HO m
m
m:
meTlo
de
acetato;
c:
carboxilo
de
acetato;
c-­‐m:
unidad
de
acetato
O
O O
O
O O
O
HO
O
OH OH
OH
HO
A
B C D
E
POLICÉTIDO
CLÁSICOCICLO
DE
KREBS
?
REAGRUP.
TIPO
FAVOSKI
?
Incorporación
de
13C
en
Ácido
Okadaico
Almería
–
2012

44. Experimento
biosinté$co
Almería
–
2012
!

45. Propuesta
biogené$ca
para
Ácido
Okadaico
Chem.
Rec.
2004,
4,
1-­‐9
Almería
–
2012

46. Propuesta
biogené$ca
para
Ácido
Okadaico
O
O
OH
O
HO
O
O
HO
O
OH
OH
OH
1
44 7
9 11
42
14
24
26
41
40
39
31
35
38
43
OH
OH
16
19
Chem.
Eur.
J.
2008,
14,
6948-­‐6956
Ac.
Belizeánico
Almería
–
2012

47. c
m
m
c
m
m
cc
m
c
m
m
c
m
m
O
OH
OHm OH
O
HO
*
*
*
*
*
* OH
*
c
c
m
m
m
m
c
O
O
c
m
c
m
m
c
m
HO
O
m OH
OH
m
**
*
m
c
*
c
m
m
c
m
m
cc
m
c
m
m
c
m
m
O
OH
OHm OH
O
HO
*
*
*
*
*
* OH
*
m
c
c
c
m
m
m
m
c
O
O
c
m
c
m
m
c
m
HO
O
m OH
OH
m
**
*
*
O
O
HO
HO
4
43
16
OH
O
*
*
*
12
8
Porpuesta biosintética para Ácido Okadaico
Almería
–
2012

48. Porpuesta biosintética para Ácido Okadaico

49. Propuesta
biogené$ca
para
Ácido
Okadaico
O
O
OH
O
O
O
OH
O
OH
HO
OH
OH
O
44
8
12
43
7 16
25
30
38
O
O
OH
O
O
O
43
16
25
30
38
O
HO
HO
OH
OH OH
Chem.
Eur.
J.,
2010,
16,
11576-­‐11579
Almería
–
2012

50. ÁCIDO COROZÁLICO
ÁCIDO OKADAICO
SN1
-H2O
+H+
Propuesta
biogené$ca
para
Ácido
Okadaico
Chem.
Eur.
J.,
2010,
16,
11576-­‐11579
Almería
–
2012

51. Propuesta
biogené$ca
para
Ácido
Okadaico
Chem.
Eur.
J.,
2010,
16,
11576-­‐11579
Almería
–
2012

52. Almería
–
2012
Nuevos retos
1.-­‐
Químicos
Aislamiento
y
caracterización
estructural
de
metabolitos
con
estructuras
y
esqueletos
químicos
singulares.
Estudio
de
nuevas
rutas
biosinté;cas
2.-­‐
Farmacológicos
Establecimiento
de
nuevos
modos
de
acción
e
iden;ficación
de
nuevas
dianas
moleculares
3.-­‐
Biotecnológicos
Desarrollo
de
procesos
biotecnológicos
que
permitan
la
explotación
industrial
de
las
nuevas
en;dades
químicas

53. Proyectos de Investigación en Curso
PROYECTO COORDINADO SAF2011-28883-CO3
BÚSQUEDA, CARACTERIZACIÓN Y DISEÑO DE
NUEVOS COMPUESTOS BIOACTIVOS DE
ORGANISMOS MARINOS
BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL DE MICROALGAS
MARINAS DINOFLAGELADAS Y SUSTACIAS
BIOACTIVAS DERIVADAS
EVALUACIÓN FISIOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE LOS
EFECTOS EN EL SNC DE FICOTOXINAS MEDIANTE
SISTEMAS EXPERIMENTALES IN VITRO BASADOS
ENCULTIVOS PRIMARIOS Y ORGANOTÍPICOS.
COMPUESTOS BIOACTIVOS DE ORGANISMOS MARINOS: ESTUDIOS
ESTRUCTURALES, FARMACOLÓGICOS Y BIOTECNOLÓGICOS

54. AGL,
PPQ,
SAF
Agradecimientos
José Franco
Santiago Fraga
Pilar Riobo
Emilio Molina Grima
Francisco García Camacho
Asterio Sánchez
Juan José Gallardo
Mª Carmen Ceron
María Teresa Fernández
Antonello Novelli
José Gavín

55. Agradecimientos
Grupo de
Productos
Marinos IUBO
Dr. Manuel Norte
Dr. Antonio H. Daranas
Dra. María L. Souto
Dra. Patricia Cruz
Dr. José Napolitano
Dr. Francisco Cen
Lcda. Tamara Vilches
Lcdo. Humberto Rodríguez
Lcdo. Alexio Ronchial

56. Isla del Hierro (Canarias)!
Volcán submarino!
Noviembre 2011!
Muchas gracias !