UFR SCIENCES ET TECHNIQUES CÔTE BASQUE
UNIVERSITÉ DE PAU ET DES PAYS DE L’ADOUR
Licence Biologie des Organismes
Etude des ...
REMERCIEMENTS
Je remercie M. Antoine Bonhomme, Directeur Général de NPP, de m’avoir laissé
l’opportunité de faire mes prem...
AVANT-PROPOS
Présentation de l’entreprise
Natural Plant Protection (NPP) est une entreprise de biotechnologies spécialisée...
Table des matières
INTRODUCTION……………………………………………………………………….……...6
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
LICENCE BIOLOGIE DES ORGANISMES......
3.1. PROBLÉMATIQUE...........................................................................................................
INTRODUCTION
Dans les agro écosystèmes, la culture d’une seule espèce végétale sur de vastes
superficies s’accompagne de l...
ETUDE
BIBLIOGRAPHIQUE
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1. Présentation du ravageur Plutella xylostella
1.1. Systématique de l’insecte
Plutella xylostella fait partie de l’embran...
Chou Chou-fleur Brocoli Chou de Bruxelles
Navet Chou chinois Colza
Figure 1 : Plantes hôtes dont se nourrissent les larves...
1.4. Cycle de vie
Le cycle de vie de la teigne des Crucifères comporte quatre stades bien
différenciés morphologiquement :...
Figure 3 : œufs de Plutella xylostella déposés sur une plante hôte
Larve stade 1 (néonate) Larve stade2
Larve stade 3
Larv...
1.4.2.2. Stade 2
La larve de stade 2 est étroite et rétrécie aux deux extrémités. Son abdomen est vert pâle
ou grisâtre, s...
Figure 5 : chrysalides de P. xylostella
Figure 6 : Adulte de Plutella xylostella
Figure 7 : dégâts occasionnés par Plutell...
sont attirés par les femelles grâce à des phéromones1
[11]. Les accouplements débutent le jour
même de leur émergence. Ils...
ainsi permis une augmentation significative des rendements agricoles, mais ils n’ont pas fait
disparaître l’ennemi pour au...
Plutella xylostella compte parmi ses ennemis des insectes qui s’attaquent à la larve
comme à l’adulte. Ces organismes util...
Trichogramma chilonis Trichogrammatoidea lutea
Figure 8 : parasitoïdes des œufs de Plutella xylostella
Diadegma insularis ...
rapidement par une paralysie du tube digestif, entraînant un arrêt immédiat de l’alimentation. La
mort de l’insecte interv...
Figure 11 : GV et NPV sur MEB
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d’utilisation, écologiques, ils répondent aux critères requis pour la nouvelle génération
d’insecticides. Cependant, l’exp...
1.7.2. Elevage des insectes à NPP
1.7.2.1. Origine de la souche d’insectes
Les insectes présents dans l’élevage à NPP et u...
Figure 12: Panneaux simulant la photopériode
Figure 13 : Cage utilisée pour l’élevage des adultes de P. xylostella
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Le milieu semi-synthétique pour l’élevage des larves actuellement utilisé à NPP a été mis au
point par HRI en partenariat ...
ETUDE
EXPERIMENTALE
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2. Effet de l’incorporation au milieu d’élevage d’un antifongique, le
Delvocid®
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2.4. Effet du Delvocid®
sur les larves élevées en plaques de micro-titration
2.4.1. Matériels et méthodes
2.4.1.1. Prépara...
Tableau II: Quantités de Delvocid®
à peser dans chaque modalité
Figure 15 : Dépôt de larves en plaque de micro-titration
M...
en verre maintenue par deux élastiques afin d’éviter la fuite des larves hors des puits. Enfin, les
plaques sont incubées ...
Tableau III : Pourcentages de mortalité dans les 6 plaques de J+3 à J+10
J+10 (cumul thermique : 172)
Témoin 12 25 50 100 ...
Tableau III (suite) : Pourcentages de mortalité dans les 6 plaques de J+13 à
J+17
J+13 (cumul thermique : 210)
Témoin 12 2...
Le pourcentage de mortalité connaît une nouvelle hausse dans toutes les plaques : dans les 3
premières modalités, il est p...
à l’origine de la surmortalité observée. Cette dernière ne serait donc pas liée à la concentration
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2.5.2. Résultats et Discussion
Les données obtenues ont permis de déterminer les pourcentages de survie larvaire et
d’émer...
Tableau IV : Nombre de larves restantes, de pupes formées et d’adultes
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3. Détermination du stade larvaire par mesure de la largeur de la capsule
céphalique
3.1. Problématique
Pour réaliser le s...
Tableau V : Paramètres de tendance centrale et de dispersion sur les
mesures de la capsule céphalique de J+1 à J+13.
J+1 J...
A partir de J+6 et J+7, les valeurs commencent à s’hétérogénéiser : les étendues sont de
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Tableau VI : Distribution de fréquences des mesures de la largeur de la
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Figure 17 : Nuage de points et sa droite de régression exponentielle
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Nuage de points avec sa droite de régression
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Le coefficient de corrélation linéaire est égal à :
r = 0,995
Cet ajustement est considéré comme valide si r est en valeur...
CONCLUSION
Des résultats très encourageants ont été obtenus sur les essais menés au cours de ce
stage.
Dans un premier tem...
BIBLIOGRAPHIE
Ouvrages et périodiques
Biever K.D., Boldt P.E. 1971. Continuous Laboratory Rearing of the Diamondback Moth ...
Sites Internet
[1] Teigne des Crucifères [En ligne]. [11/04/06]
Internet : <URL : http://www.inra.fr/Internet/Produits/HYP...
ANNEXES
44
ANNEXE 1
Présentation du thermobouton
Principe du thermobouton :
C’est le plus petit enregistreur de température au monde....
ANNEXE 2
Largeurs des capsules céphaliques mesurées sur 30 larves de J+1 à J+13
J+1 J+2 J+6 J+7 J+8 J+9 J+12 J+13
1 12,5 1...
Résumé
La teigne des Crucifères, Plutella xylostella, est un des ravageurs les plus importants des
Crucifères. Il sévit pa...
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  1. 1. UFR SCIENCES ET TECHNIQUES CÔTE BASQUE UNIVERSITÉ DE PAU ET DES PAYS DE L’ADOUR Licence Biologie des Organismes Etude des paramètres biotiques de Plutella xylostella PARRAVICINI Florencia Stage effectué du 13/03/06 au 19/05/06 Sous la direction scientifique de Mlle Samantha MILLET Natural Plant Protection (N.P.P.) « Le présent rapport constitue un exercice pédagogique qui ne peut en aucun cas engager la responsabilité de l’Entreprise ou du Laboratoire d’accueil »
  2. 2. REMERCIEMENTS Je remercie M. Antoine Bonhomme, Directeur Général de NPP, de m’avoir laissé l’opportunité de faire mes premiers pas dans la vie professionnelle au sein de son entreprise. Je tiens également à remercier Mlle Samantha Millet, Adjointe Responsable Développement et responsable de mon stage, sans qui ce travail n’aurait jamais pu aboutir. Je te remercie entre autres pour toute l’aide que tu m’as proposée, ta sympathie, ta patience, ton amabilité et ta disponibilité. Merci à M. Olivier Soubabère, Responsable Qualité, pour sa cordiale implication et l’intérêt accordé au projet. Un grand merci au groupe de techniciens de laboratoire : Ghislain, Caroline et Perrine, pour tout ce qu’ils m’ont apporté, tant sur le plan professionnel comme humain. Je tiens pareillement à adresser ma gratitude au personnel entier : Babeth, Fatira, Jean-Pierre, Marie-Laure, Pierre, Rémi, Sandra, Sandrine, Stéphane, Véronique et Vincent. 2
  3. 3. AVANT-PROPOS Présentation de l’entreprise Natural Plant Protection (NPP) est une entreprise de biotechnologies spécialisée dans la production de biopesticides. Créée en 1993 elle est la filiale du groupe Calliope à 95%, rebaptisé en 2005 Arysta LifeScience EMA. NPP est une des 3 entités biologiques rattachées à ce grand groupe international, qui est principalement spécialisé dans la production et la commercialisation de produits phytosanitaires chimiques. Spécialisée dans la fabrication de pesticides biologiques, Natural Plant Protection est un site de production. Elle est devenue spécialiste dans l’élevage de masse du carpocapse des pommes, Cydia pomonella. Ce savoir-faire est né d’une étroite collaboration entre Calliope et l’INRA depuis 1989. L’élevage intensif du carpocapse a pour but la production du virus de la granulose, spécifique des larves du ravageur des vergers. La fabrication de ce virus est basée sur une production in vivo, sur les larves de l’hôte naturel du CpGV, le carpocapse. Le virus ainsi multiplié est récupéré et extrait par broyage et centrifugation. Par la suite, il est titré au laboratoire, formulé et conditionné en bouteilles. Le produit final a été homologué sous le nom de Carpovirusine® et représente 80% du chiffre d’affaires de l’entreprise. Il est le seul entièrement fabriqué sur le site. NPP accorde une place essentielle à la qualité de ses produits. Pour la Carpovirusine® notamment, des tests d’efficacité biologique sont réalisés en cours et en aval du processus de production. Le but de ces contrôles est de pouvoir assurer une efficacité optimale du produit. D’autres produits sont aussi commercialisés par NPP, dont le Batik® , biopesticide à base de la bactérie Bacillus thuringiensis, des médiateurs chimiques, comme des phéromones (Cosmotrak® , Pebax® ), ainsi que des extraits végétaux (Pollinus® ). NPP cherche cependant à se diversifier. Pour cela, elle a mis en place divers partenariats avec des laboratoires publics (INRA, Helioparc, IFTS, HRI). Les buts de ces collaborations peuvent être multiples : identification de nouveaux principes actifs, développement de produits… 3
  4. 4. Table des matières INTRODUCTION……………………………………………………………………….……...6 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE LICENCE BIOLOGIE DES ORGANISMES..........................................................................................................1 1. PRÉSENTATION DU RAVAGEUR PLUTELLA XYLOSTELLA..................................................................8 1.1. SYSTÉMATIQUE DE L’INSECTE...................................................................................................................................8 1.2. DISTRIBUTION GÉOGRAPHIQUE..................................................................................................................................8 1.3. PLANTES HÔTES......................................................................................................................................................8 1.4. CYCLE DE VIE......................................................................................................................................................10 1.4.1. Œuf ..........................................................................................................................................................10 1.4.2. Stades larvaires........................................................................................................................................11 1.4.2.1. Stade 1..............................................................................................................................................................11 1.4.2.2. Stade 2..............................................................................................................................................................13 1.4.2.3. Stade 3..............................................................................................................................................................13 1.4.2.4. Stade 4..............................................................................................................................................................13 1.4.3. Pupe.........................................................................................................................................................13 1.4.4. Adulte.......................................................................................................................................................13 1.5. DÉGÂTS..............................................................................................................................................................15 1.6. STRATÉGIES DE LUTTE...........................................................................................................................................15 1.6.1. Contrôles chimiques................................................................................................................................15 1.6.2. Lutte biologique.......................................................................................................................................16 1.6.2.1. Phéromones sexuelles.......................................................................................................................................16 1.6.2.2. Ennemis naturels..............................................................................................................................................16 Prédateurs.....................................................................................................................................................................17 1.6.2.3. Insectes parasitoïdes.........................................................................................................................................17 1.6.2.4. Lutte microbiologique......................................................................................................................................17 Les auxiliaires utilisés dans cette lutte sont des microorganismes (baculovirus, bactéries, champignons) ou les toxines qu’ils produisent..............................................................................................................................17 Champignons...............................................................................................................................................................17 Bactéries ......................................................................................................................................................................17 Baculovirus .................................................................................................................................................................19 1.7. MÉTHODE D’ÉLEVAGE DE PLUTELLA XYLOSTELLA SUR MILIEU SEMI- SYNTHÉTIQUE .........................................................21 1.7.1. Mise au point d’un milieu d’élevage semi-synthétique............................................................................21 1.7.2. Elevage des insectes à NPP.....................................................................................................................22 1.7.2.1. Origine de la souche d’insectes........................................................................................................................22 1.7.2.2. Conditions d’élevage de l’insecte.....................................................................................................................22 1.7.2.3. Elevage des adultes et récolte des œufs pondus................................................................................................22 1.7.2.4. Elevage des larves............................................................................................................................................22 2. EFFET DE L’INCORPORATION AU MILIEU D’ÉLEVAGE D’UN ANTIFONGIQUE, LE DELVOCID®, SUR LE DÉVELOPPEMENT DE PLUTELLA XYLOSTELLA..............................................26 2.1. PROBLÉMATIQUE...................................................................................................................................................26 2.2. PROPRIÉTÉS DU DELVOCID®..................................................................................................................................26 2.3. BUT ET PRINCIPE DE L’ESSAI...................................................................................................................................26 2.4. EFFET DU DELVOCID® SUR LES LARVES ÉLEVÉES EN PLAQUES DE MICRO-TITRATION.......................................................27 2.4.1. Matériels et méthodes..............................................................................................................................27 2.4.1.1. Préparation du milieu d’élevage avec différentes concentrations de Delvocid®......................................27 2.4.1.2. Réalisation des plaques de micro-titration........................................................................................................27 2.4.1.3. Lecture du test..................................................................................................................................................30 2.4.2. Résultats...................................................................................................................................................30 2.4.3. Discussion et Conclusion.........................................................................................................................33 2.5. EFFET DU DELVOCID® SUR LES LARVES ÉLEVÉES DANS DES BÉCHERS DE PONTE.............................................................34 2.5.1. Matériels et méthodes .............................................................................................................................34 2.5.2. Résultats et Discussion............................................................................................................................35 3. DÉTERMINATION DU STADE LARVAIRE PAR MESURE DE LA LARGEUR DE LA CAPSULE CÉPHALIQUE...........................................................................................................................................................37 4
  5. 5. 3.1. PROBLÉMATIQUE...................................................................................................................................................37 3.2. MATÉRIELS ET MÉTHODES.....................................................................................................................................37 3.3. RÉSULTATS..........................................................................................................................................................37 3.3.1. Paramètres de tendance centrale et de dispersion..................................................................................37 3.3.2. Tracé du diagramme en rectangles ........................................................................................................39 3.3.3. Tracé de la droite de régression..............................................................................................................39 3.4. DISCUSSION ET CONCLUSION..................................................................................................................................42 3.4.1. Sur les données du tableau......................................................................................................................42 3.4.2. Sur le diagramme en rectangles..............................................................................................................42 3.4.3. Sur la droite de régression.......................................................................................................................42 PRINCIPE DU THERMOBOUTON :...................................................................................................................47 CARACTÉRISTIQUES : ..................................................................................................................................................47 MODE D’EMPLOI :......................................................................................................................................................47 CONCLUSION………………………………………………………….…………….….…….27 BIBLIOGRAPHIE………………………………………………………………………….….28 ANNEXES…………......……………………………………………………………………….31 Annexe 1 : Présentation du Thermobouton Annexe 2 : Données brutes de la largeur des capsules céphaliques 5
  6. 6. INTRODUCTION Dans les agro écosystèmes, la culture d’une seule espèce végétale sur de vastes superficies s’accompagne de la prolifération d’ennemis animaux ou végétaux qui tendent à soustraire à l’homme une partie importante de sa récolte, notamment en rendant les plantes non commercialisables (Cloarec et al, 1987). Les Crucifères sont une bonne illustration de végétaux représentant un marché économique très important à travers le monde. Mais ces dernières années, pourtant, leur production a été fortement affectée par une régulière augmentation des attaques d’insectes ravageurs, et plus spécialement de la teigne des Crucifères, Plutella xylostella. La larve de cet insecte se nourrit du feuillage dès le stade jeune plantule, ce qui rend le produit inapte à la vente et entraîne aussi inéluctablement une baisse du rendement. Cette épidémie sévit surtout en Asie du sud-est (Talekar & Griggs, 1986). Auparavant d’une grande efficacité, de par leur rapidité d’action et de leur facilité d’utilisation, les pesticides chimiques ont atteint aujourd’hui leur limite d’efficacité. Pour contrôler la multiplication de ce ravageur, les agriculteurs ont utilisé des quantités irraisonnées d’insecticides, souvent en mélange avec produits pesticides de synthèse. Cet emploi souvent inconsidéré a engendré de lourdes conséquences car rapidement, les insectes ont développé des systèmes de résistance, rendant alors les traitements inefficaces contre ce fléau. Conscients des dangers de la lutte chimique, les agronomes ont multiplié les recherches pour développer des moyens de lutte plus naturels. Une attention considérable a été alors consacrée à l’élaboration d’agents de lutte biologique (virus, les bactéries et champignons) aussi appelés biopesticides, plus respectueux de l’environnement et permettant de mieux gérer l’apparition de résistances lors des infestations de Plutella xylostella (Huber, 1986 ; Wood et Granados, 1991). Natural Plant Protection (NPP), entreprise produisant des biopesticides, est spécialisée dans la production de masse in vivo du virus de la granulose, spécifique des larves du carpocapse des pommes (Cydia pomonella). Afin de poursuivre son développement, NPP envisage de mettre en place prochainement une production à grande échelle du virus spécifique des larves de Plutella xylostella (le PxGV), représentant un fort marché potentiel. Dans cette optique, un élevage sur milieu semi-synthétique à l’échelle du laboratoire a été intégré au sein du site il y a plus d’un an dans le but de mesurer les paramètres biotiques de l’espèce et d’initier la production du virus. Les résultats obtenus se sont montrés encourageants mais quelques problèmes ont suscité l’attention afin d’améliorer à la fois les conditions d’élevage de l’insecte hôte et les conditions d’inoculation. En effet, il est apparu que le milieu d’élevage des larves était très vite envahi par des moisissures affectant le bon développement larvaire. Il s’est donc avéré nécessaire de travailler sur l’incorporation d’un anti-fongique à ce milieu nutritif afin de déterminer la concentration maximale pouvant être ajoutée sans affecter la survie des insectes. D’autre part, afin de déterminer avec précision le stade larvaire, une mesure de la largeur de la capsule céphalique a été initiée. Ces résultats sont attendus pour réaliser les inoculations du virus à un moment opportun. Ces deux études font l’objet de mon rapport. 6
  7. 7. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 7
  8. 8. 1. Présentation du ravageur Plutella xylostella 1.1. Systématique de l’insecte Plutella xylostella fait partie de l’embranchement des Arthropodes et appartient à la classe des Insectes. Il est inclus dans l’ordre des Lépidoptères et dans la famille des Yponomeutidae, sous-famille des Plutellinae. Les larves et les adultes de cette espèce ont une morphologie et un mode de vie très différents. Le passage du stade larvaire au stade adulte se produit grâce à une métamorphose complète : ces insectes sont dits holométaboles. La présence de la cuticule, squelette extérieur dur des insectes, fait que la croissance est discontinue et se réalise par mues successives. 1.2. Distribution géographique Cette espèce est quasiment cosmopolite. Durant ces dernières années, P. xylostella est devenu le ravageur de Crucifères le plus important à travers le monde (N.S Talekar & A.M Shelton, 1993). Il s’agit du Lépidoptère le plus universellement distribué (Meyrick, 1928). Probablement originaire du pourtour méditerranéen, P. xylostella est actuellement rencontré en Amérique du Nord, dans la partie sud de l’Amérique Latine, en Afrique du Sud, en Europe, en Asie, en Nouvelle Zélande, et dans certaines régions d’Australie (Hardy, 1938). C’est un ravageur important dans les plaines tropicales et subtropicales. Dans les zones tempérées, P. xylostella ne survit pas à l’hiver. Il colonise les régions productrices de Crucifères durant toute la saison des cultures (Rueda & Shelton, 1996). 1.3. Plantes hôtes La teigne des Crucifères se nourrit exclusivement des plantes appartenant à la famille des Brassicacées, anciennement appelées Crucifères. Les Crucifères poussent dans les régions tropicales et tempérées, et constituent l’un des aliments végétaux de base chez les Asiatiques. Les différentes espèces de plantes de cette famille sont cultivées pour leurs nombreuses parties comestibles, comme par exemple les racines des radis et des navets, les tiges du chou-rave, les feuilles de chou, les graines de moutarde…(Talekar & Shelton, 1993). P. xylostella s’attaque en particulier au chou (Brassica oleracea var. capitata), chou- fleur (B. oleracea var. botrytis), brocolis (B. oleracea var. italica), radis (Raphanus sativus), navet (B. rapa pekinesis), chou de Bruxelles (B. oleracea var. gemmifera), chou chinois (B. rapa cv. gr. pekinensis), chou-rave (B. oleracea var. gongylodes), moutarde (B. juncea), graines de colza (B. napus), chou d’ornement (B. oleracea var. acephala), pak choi (B. rapa cv. gr. pakchoi), saishin (B. rapa cv. gr. saishin), cresson (Nasturtium officinale) et au chou frisé (B. oleracea var. alboglabra) (Talekar & Shelton, 1993) (Figure 1). 8
  9. 9. Chou Chou-fleur Brocoli Chou de Bruxelles Navet Chou chinois Colza Figure 1 : Plantes hôtes dont se nourrissent les larves de Plutella xylostella Figure 2 : Cycle de vie de Plutella xylostella à 25°C Adulte 14 jours Œuf 2-3 jours Larve 10 jours Pupe 3-4 jours 9
  10. 10. 1.4. Cycle de vie Le cycle de vie de la teigne des Crucifères comporte quatre stades bien différenciés morphologiquement : œuf, larve, pupe et adulte (Figure 2). En conditions naturelles, Plutella xylostella met environ 32 jours pour passer de l’œuf à l’adulte. Cependant, la durée du cycle de vie peut varier entre 21 et 51 jours, en fonction des conditions climatiques ou de l’accès de la larve à la nourriture [6]. 1.4.1. Œuf Il est de forme ovale, assez allongé, très petit (0,25 à 0,5 mm) (Figure 3). Sa base est aplatie et il est de couleur jaune pâle. Il s’obscurcit lors de l’approche de l’éclosion : ce stade est communément appelé « stade tête noire ». Sa période d’incubation, dépendante de la température à laquelle il est exposé, varie de 4 à 8 jours [1]. La ponte des œufs s’effectue au crépuscule et la période d’ovoposition dure environ quatre jours, durant laquelle la femelle dépose en moyenne 160 œufs (D.G. Hartcourt, 1963). Le nombre d’œufs pondus dépend de la photopériode, de la température et du régime alimentaire de la larve (Harcourt, 1957). L’absence de lumière durant la nuit stimule l’ovoposition (B.E. Tabashnik, 1990). La majorité des œufs sont déposés avant minuit avec un pic d’ovoposition se situant environ deux heures après le crépuscule (K.A. Pivnick et al., 1990). Les œufs sont pondus préférentiellement dans les régions de dépression de la feuille (P.D. Gupta, 1960) et sont collés à sa surface supérieure et/ou inférieure, en général en bordure des veines foliaires. Ils sont déposés séparément ou en petits groupes de deux à huit (N.S. Talekar & A.M. Shelton, 1993). 1.4.2. Stades larvaires Quatre stades larvaires se succèdent avant la métamorphose de la larve (Figure 4). Le passage d'un stade à l'autre est assuré par une mue larvaire. La durée des quatre stades larvaires dépend de la température à laquelle les larves sont soumises et de leurs conditions nutritionnelles (O.P. Bhalla, J.K. Dubey, 1986). En moyenne, la période larvaire dure de 6 à 30 jours [3]. Les larves ont tendance à résider sous le feuillage des plantes hôtes, rendant leur détection difficile [11]. 1.4.2.1. Stade 1 Les larves néonates de P. xylostella sont très actives, minces, très petites (moins de 1 mm), grisâtres et recouvertes de poils microscopiques. Sa tête, de couleur noire, se distingue nettement de celle des deux stades ultimes, chez lesquels elle présente une couleur vert- marron [3]. Immédiatement après son émergence, la larve néonate commence à se nourrir du feuillage. Elle rampe et s’attaque au tissu végétal mésophylle spongieux de la face inférieure de la feuille. Pour cela, elle mine le tissu interne et forme des galeries peu profondes, habituellement pas plus longues que la longueur de son corps [3]. Elle s’alimente ainsi pendant environ une semaine, puis elle quitte sa galerie, s’attaque au tissu extérieur, tisse quelque fils de soie et mue [1]. 10
  11. 11. Figure 3 : œufs de Plutella xylostella déposés sur une plante hôte Larve stade 1 (néonate) Larve stade2 Larve stade 3 Larve stade 4 Figure 4 : différents stades larvaires de Plutella xylostella 11
  12. 12. 1.4.2.2. Stade 2 La larve de stade 2 est étroite et rétrécie aux deux extrémités. Son abdomen est vert pâle ou grisâtre, sa tête noire, son prothorax foncé et pointillé de noir. Cette chenille est agile, et au moindre contact, elle se tortille dans tous les sens et se laisse tomber sur le sol, suspendue à l’extrémité d’un fil de soie [1]. Quelques secondes plus tard, la larve remonte par ce même fil vers la feuille et continue à manger [6]. Elle ronge alors la surface inférieure de la feuille en respectant les nervures, puis s’attaque à la face supérieure [1]. 1.4.2.3. Stade 3 Les larves âgées se nourrissent de la partie inférieure des feuilles et consomment tout le tissu excepté la couche de cire de la surface foliaire et les nervures (Talekar & Shelton, 1993). Elles peuvent également s’alimenter des pousses de jeunes feuilles en croissance, empêchant alors le correct développement de la plante [11]. 1.4.2.4. Stade 4 Ce dernier stade larvaire, pouvant mesurer jusqu’à 15 mm, est le plus vorace et cause le plus de dommages aux cultures [5]. Après 3 ou 4 jours, la larve cesse de s’alimenter et tisse un cocon de soie à la surface de la feuille, accolé aux nervures où elle reste pendant deux jours dans un état de quiescence, marquant le début du stade prépupe. La prépupe perd sa peau larvaire, qui néanmoins reste attachée à l’insecte par sa partie caudale, pour former la chrysalide, aussi appelée improprement pupe [1]. 1.4.3. Pupe Il s’agit d’un large fourreau soyeux, très délicat (Figure 5). Les pupes sont retrouvées fixées aux feuilles et aux tiges des plantes hôtes. Initialement, la pupe est de couleur vert pâle mais au fil de sa maturation, elle devient marron et le futur adulte peut être perçu à travers le cocon. Le stade pupe dure de cinq à quinze jours, suivant les conditions environnementales (température, humidité) [6]. 1.4.4. Adulte Les adultes sont petits (8-9 mm) et de couleur grise (Figure 6). Les mâles et les femelles sont de même taille [3]. Au repos, leurs ailes sont repliées en toit et leurs antennes projetées en avant. Les ailes antérieures, d’une envergure de 15 mm, sont de couleur jaune-brun, ponctuées de foncé. Les ailes postérieures, quant à elles, sont beaucoup plus courtes, pointues, longuement frangées et de couleur gris foncé [5]. Les deux sexes présentent des motifs en forme de diamants beiges sur le dos lorsque les ailes sont repliées. Ces motifs sont plus brillants chez la femelle que chez le mâle, ce qui permet de les différencier. Ils sont retrouvés sous la plante ou dans les feuilles mêmes afin de se protéger [11]. Les adultes émergent entre 13 heures et 16 heures, avec un pic d’émergence à 14 heures. Ils se nourrissent sur les gouttelettes de rosée et sont inactifs pendant la journée. Ils sont visibles en fin de soirée, en volant autour des plantes à la recherche d’un partenaire sexuel. Les mâles 12
  13. 13. Figure 5 : chrysalides de P. xylostella Figure 6 : Adulte de Plutella xylostella Figure 7 : dégâts occasionnés par Plutella xylostella sur feuilles de chou 13
  14. 14. sont attirés par les femelles grâce à des phéromones1 [11]. Les accouplements débutent le jour même de leur émergence. Ils durent environ une heure. Les papillons ont une courte durée de vie : les femelles vivent environ 16 jours, alors que les mâles ne dépassent pas les 12 jours en moyenne [3]. 1.5. Dégâts Les dégâts sur la récolte sont causés exclusivement par le stade larvaire [6] (Figure 7). Les principaux dommages sont dus aux larves de troisième et quatrième génération, à la période de floraison des plantes. Les larves se nourrissent de tissus internes sur le revers des feuilles [7]. Au fur et à mesure que la plante croît, les petits orifices s’agrandissent, occasionnant la formation de trous partout dans le feuillage [11]. De plus, elles souillent les feuilles de leurs excréments. Dans les régions tropicales, P. xylostella devient plus problématique pendant la saison sèche. Durant la saison des pluies, les larves se détachent du feuillage suite aux fortes intempéries. C’est pour cela qu’il est recommandé de semer les Crucifères au cours de la saison humide [11]. Bien plus que la qualité du légume en elle-même, d’autres facteurs d’appréciation entrent en compte dans la valorisation du produit, comme son aspect, son esthétique, qui jouent un rôle fondamental pour sa commercialisation. Dans ce sens, les Crucifères cultivées exigent une protection phytosanitaire aussi complète que possible contre les insectes ravageurs (A. Delobel, 1978). En effet, la part la plus importante des facteurs de dépréciation des récoltes est due aux Insectes phyllophages et plus particulièrement aux larves d’un certain nombre de Lépidoptères, dont fait partie Plutella xylostella, qui représentent la gêne la plus considérable pour la culture des légumes et leur commercialisation (A. Delobel, 1978). Afin de combattre ce ravageur, plusieurs méthodes de protection des cultures ont été mises au point de manière à limiter ou, au mieux, à diminuer les dégâts occasionnés par ce dernier. 1.6. Stratégies de lutte L’homme intervient dans le fonctionnement de la plupart des écosystèmes de la planète. Permanente dans les agroécosystèmes, cette intervention a pour but majeur d’obtenir un rendement optimal des cultures, en éliminant leurs ennemis. Pendant longtemps, Plutella xylostella a été considéré comme un insecte peu nuisible jusqu'à ce que dans les années 50, son nombre commence à s’amplifier de façon considérable pour devenir, dans les années 70, un des principaux ravageurs des cultures de Crucifères, suite à l’apparition de résistances aux traitements. L’agriculteur dispose donc de plusieurs techniques pour protéger ses cultures de ce ravageur. 1.6.1. Contrôles chimiques Ces trente dernières années ont vu l’accroissement spectaculaire de l’utilisation de produits phytosanitaires chimiques. Ce choix n’a pas été arbitraire, il existe plusieurs raisons à cette alternative : tout d’abord, il s’agit de la technique la moins coûteuse de protection des cultures. En outre, ils sont efficaces, faciles à l’emploi et agissent rapidement. Les pesticides ont 1 Phéromone : Substance émise par un individu (animal) et qui provoque un comportement particulier chez un autre individu de la même espèce : rapprochement sexuel, agrégation, alarme, suivi d'une piste… 14
  15. 15. ainsi permis une augmentation significative des rendements agricoles, mais ils n’ont pas fait disparaître l’ennemi pour autant. En effet, il est très difficile de contrôler la prolifération de P. xylostella avec des insecticides chimiques car il a su développer des résistances génétiques importantes à la plupart des pesticides de synthèse utilisés (Cloarec et al, 1987). P. xylostella a été le premier ravageur à développer une résistance au DDT (Dichloro-Diphényle- Trichloroéthane), insecticide chimique utilisé abusivement dans les années 50. Pour pallier cette résistance, les agriculteurs ont augmenté les doses, en mélangeant différents produits chimiques (Talekar & Shelton, 1993). D’autre part, les pesticides chimiques ne sont pas sans danger pour l’homme et pour l’environnement. Les systèmes de défense mis en place par P. xylostella n’ont pas facilité la tâche des cultivateurs. La capacité d’adaptation de ce ravageur les a incités à se pencher vers l’étude d’autres stratégies de lutte qui soient plus efficaces, plus adéquates et plus respectueuses de l’environnement. 1.6.2. Lutte biologique 1.6.2.1. Phéromones sexuelles En plus des pratiques culturales qui permettent de rompre le cycle de reproduction des ravageurs (rotation des cultures, hachage de pailles…), l’agriculteur dispose d’un moyen de lutte biologique fondé sur l’utilisation de phéromones émises par les femelles, ce qui entraîne une perturbation de la reproduction des ravageurs (Cloarec et al, 1987). Le principe est simple : dans des conditions normales, le mâle se dirige vers une femelle, guidé par le flux d’air chargé de phéromones. En plaçant dans une culture ou dans un verger de multiples diffuseurs de phéromone synthétique, la piste conduisant à la femelle est brouillée. Le mâle est ainsi incapable de la localiser. Ceci limite les chances d’accouplement et provoque une baisse des effectifs de la population (Cloarec et al, 1987). Deux composés sont utilisés chez Plutella xylostella : le (Z)-11 hexadecenal et le (Z)-11 hexadecenyl acétate (Talekar & Shelton, 1993). Ce sont des composants de la phéromone sexuelle femelle de P. xylostella. En outre, cette méthode permet de réaliser un dépistage des populations adultes des teignes des Crucifères et d’être ainsi alerté en cas d’infestation (monitoring). Des pièges diffusant des phéromones ont été conçus ; ils permettent de surveiller la population de Plutella xylostella. Des sachets contenant des phéromones de synthèse sont placés dans des cages au fond englué. Les phéromones sexuelles attirent les mâles vers le piège. En se posant, ces derniers restent emprisonnés dans la boîte. Par ce procédé, la surveillance de la population s’avère efficace. Le résultat obtenu (dépassement du seuil de nuisibilité ou non) permettra alors de prendre une décision quant à la nature de l’intervention, au produit à utiliser, sa quantité et le moment le plus opportun pour son application. 1.6.2.2. Ennemis naturels Compte tenu de l’énorme prolificité de P. xylostella, le préjudice causé à l’agriculture pourrait être beaucoup plus lourd. En fait, dans la nature, de multiples facteurs enrayent son potentiel de multiplication. En particulier, de nombreuses espèces sont des ennemis naturels de ce ravageur des cultures car ils le consomment ou le parasitent. 15
  16. 16. Plutella xylostella compte parmi ses ennemis des insectes qui s’attaquent à la larve comme à l’adulte. Ces organismes utiles sont aussi appelés auxiliaires des cultures. L’agriculteur peut favoriser leur multiplication naturelle ou les produire par élevage intensif avant de les lâcher en masse dans les cultures (Cloarec et al, 1987). Ces différents insectes peuvent être classés dans deux grandes catégories : • Prédateurs Ils consomment directement les ravageurs, qu’ils soient au stade larve ou adulte. Dans ce groupe, sont retrouvés des oiseaux et des araignées. 1.6.2.3. Insectes parasitoïdes Environ 90 espèces de parasitoïdes s’attaquent à P. xylostella (Goodwin, 1979), parmi lesquelles 6 s’attaquent aux œufs, 38 aux larves et 13 aux pupes (Lim, 1986). Les parasitoïdes des œufs appartiennent aux genres Trichogramma et Trichogrammatoidea (Figure 8). Ce sont de minuscules guêpes qui pondent à l’intérieur des œufs de l’insecte. Les larves du parasite se développent dans l’œuf de P. xylostella et provoquent sa mort en le consommant de l’intérieur (Cloarec et al, 1987). Les espèces parasitoïdes des larves sont les plus prédominantes et surtout les plus efficaces. La plupart de ces espèces font partie des genres Diadegma et Cotesia (Figure 9). Par exemple, au Honduras, la guêpe Diadegma insularis (Hymenoptera : Chalcididae) peut éliminer jusqu'à 40% de la population larvaire [11]. Quelques insectes du genre Diadromus spp. s’attaquent aux pupes (Figure 10). 1.6.2.4. Lutte microbiologique Les auxiliaires utilisés dans cette lutte sont des microorganismes (baculovirus, bactéries, champignons) ou les toxines qu’ils produisent. • Champignons Contrairement aux bactéries et aux virus, les champignons n'ont pas besoin d'être ingérés pour être actifs ; un simple contact suffit pour déclencher l'infection. Le champignon perfore le tégument de l'insecte, puis se développe à l'intérieur. Il synthétise diverses enzymes et toxines qui provoquent la mort du ravageur. Ces derniers meurent dans un délai de 3 à 10 jours [8]. L’humidité ambiante causée par de fortes pluies peut favoriser le développement des champignons et provoquer la diffusion de la contamination [11]. Les larves et quelquefois les pupes de P. xylostella ont été attaquées par plusieurs espèces dont notamment Erynia blunckii et Zoophtora radican. Des cas ont été recensés en Afrique du Sud et en Nouvelle-Zélande (Wilding, 1986). Néanmoins, les champignons restent peu efficaces sur Plutella xylostella. • Bactéries Bacillus thuringiensis (appelée aussi Bt) est une bactérie ayant la particularité de synthétiser des cristaux protéiques au moment où, en conditions défavorables, elle produit des spores. L’activité entomopathogène de ce germe est liée à la présence de delta-endotoxines dans les cristaux que la bactérie synthétise. Une fois ingérées par l’insecte, les delta-endotoxines se fixent sur des récepteurs situés sur les cellules intestinales. L’intoxication se manifeste très 16
  17. 17. Trichogramma chilonis Trichogrammatoidea lutea Figure 8 : parasitoïdes des œufs de Plutella xylostella Diadegma insularis Cotesia plutellae Figure 9 : parasitoïdes des larves de P. xylostella Diadromus collaris Figure 10 : parasitoïde des pupes de P. xylostella 17
  18. 18. rapidement par une paralysie du tube digestif, entraînant un arrêt immédiat de l’alimentation. La mort de l’insecte intervient 24 à 48 heures après l’ingestion des cristaux (Lopez-Ferber M. et al, 2001). Cependant, des résistances sont très vite apparues chez P. xylostella, qui reste la seule espèce d’insecte ayant développé une telle résistance envers les toxines du Bt (Sayyed et al, 2000). • Baculovirus Ce sont des virus pathogènes exclusivement d’invertébrés, principalement les Lépidoptères. Le spectre d’hôtes d’un baculovirus est très étroit. Ces agents sont très spécifiques d’une ou de quelques espèces et n’infectent pas les autres invertébrés (insectes utiles) ou les vertébrés que ce soit directement ou par la chaîne alimentaire. La maladie ne touche que les larves et résulte de l’ingestion, en mélange avec leur nourriture, de « corps d’inclusion », structures protéiques de protection du virion, dont il existe deux types : les uns, de grande taille, contenant plusieurs virions, appelés « polyèdres » ; les seconds, plus petits, en forme de capsule, ne contiennent qu’un seul virion, et sont appelés « granules ». La production de corps d’inclusion est associée à certaines différences dans le mode d’infection, ce qui permet la classification des baculovirus en deux grands genres taxonomiques : les nucléopolyèdrovirus (NPV) ou virus des polyèdroses nucléaires, et les granulovirus, ou virus des granuloses (GV) (Figure 11). Le virus est capable de persister dans l’environnement en attendant que la larve l’ingère avec sa nourriture grâce à ses corps d’inclusion. Après dissolution des capsules protéiques et pénétration des virions dans les cellules intestinales, les gènes viraux entraînent d’abord la production de virions par bourgeonnement à travers la membrane de la cellule infectée. Ces virions propagent l’infection à l’intérieur de l’hôte. Puis, au cours d’une étape plus tardive, la cellule accumule des virions inclus, protégés par le corps d’inclusion. Ces corps d’inclusion ne seront libérés qu’après la mort de la cellule et la dégradation de ses structures membranaires. Les organes de la larve se liquéfient, et sa cuticule se rompt, libérant une solution blanchâtre contenant des milliards de corps d’inclusion. Plutella xylostella peut être infectée par les GV et par les NPV. Les symptômes de l’infection se manifestent par un gonflement de chaque segment du corps de la larve et un changement de couleur du vert au blanc (Asayama & Osaki, 1970). La sensibilité des larves diminue au cours de leur développement : en général, la dose (nombre de virus) requise pour en tuer 50 % (LD 50) augmente d’un facteur 10 pour chaque stade larvaire. Pour tuer des larves tout juste écloses (néonates), elle est inférieure à dix corps d’inclusion. En pratique, cela signifie que le traitement sera d’autant plus efficace que la larve sera jeune. Mais, même dans ces cas, deux à quatre jours sont nécessaires pour que le virus tue la larve (Lopez-Ferber M. et al, 2001). Asayama et Osaki (1970) ont été les premiers à observer une infection de la teigne des Crucifères par ce virus de la granulose et son potentiel comme agent de contrôle envers P. xylostella a été rapporté par Nakahara et al. en 1986. Kadir et al. (1999) ont démontré que le virus de la granulose a un haut potentiel d’infection contre les larves de P. xylostella et ont suggéré que ce virus pourrait être développé comme biopesticide. En comparaison avec les autres moyens de lutte précédemment cités, les baculovirus sont ceux qui semblent les plus efficaces. En effet, très spécifiques de l’insecte hôte, simples 18
  19. 19. Figure 11 : GV et NPV sur MEB 19
  20. 20. d’utilisation, écologiques, ils répondent aux critères requis pour la nouvelle génération d’insecticides. Cependant, l’exploitation industrielle du baculovirus nécessite une production en masse de ce virus. La méthode la plus simple consiste à les répliquer in vivo sur les larves de l’insecte hôte. Pour cela, il faut tout d’abord mettre en place un élevage de masse du ravageur qui fournira les larves nécessaires à la multiplication du virus. A cet égard, il est nécessaire de mettre au point un milieu semi-synthétique d’élevage qui permettra l’alimentation des larves au cours de leur développement. 1.7. Méthode d’élevage de Plutella xylostella sur milieu semi- synthétique 1.7.1. Mise au point d’un milieu d’élevage semi-synthétique Pour son bon développement, la larve de P. xylostella nécessite une alimentation optimale, d’une bonne qualité nutritionnelle. Toutefois, il s’avère impossible de nourrir les larves avec des Crucifères dans un élevage de masse suite à plusieurs exigences. La plante est indisponible à certaines périodes de l’année (en hiver, surtout dans les régions tempérées). En outre, les qualités nutritives de la plante hôte sont très variables en fonction des saisons, ce qui ne permet pas d’avoir un milieu standardisé. D’autre part, cela requiert un nombre important de cages et donc de l’espace supplémentaire, de grandes quantités de matériel frais très vite périssable, entraînant une augmentation des risques de contaminations (Carpenter & Bloem, 2002). Toutes ces contraintes engendreraient des coûts de production trop élevés. Très vite, la mise au point d’un milieu semi-synthétique est apparue comme la solution qui permettrait de pallier à ces problèmes. Cependant, le milieu nutritif doit subvenir aux besoins nutritionnels de la larve et doit contenir les mêmes composantes que chez les Crucifères, c'est-à-dire : des protéines, des lipides, des glucides, des minéraux et des vitamines. En effet, la concentration en nutriments du milieu artificiel a un effet sur le taux de croissance des insectes (Carpenter & Bloem, 2002). De plus, il ne doit nullement affecter la survie de l’insecte : il ne doit pas raccourcir sa durée de vie, ne doit pas engendrer de diminution de la fécondité, ne pas entraîner des retards de développement ni des propagations de maladies. Un milieu d’élevage réussi est celui qui satisfait à la fois les meilleures conditions chimiques, physiques et nutritionnelles que possible pour le bon développement de l’insecte (Friend, 1955). Le premier milieu artificiel pour P. xylostella a été formulé par Biever et Boldt en 1971. Toutefois, le résultat obtenu n’a pas été celui escompté : le pourcentage d’adultes émergés a été faible (24.6%), et parmi ces derniers, 1/3 présentaient des déformations alaires. Ce faible pourcentage de survie s’explique par le fait que le milieu élaboré par Biever et Boldt ne contenait pas assez de substances phagostimulantes (Hsiao & Hou, 1976), ou bien encore pas de cholestérol, un des éléments impliqué dans la mue et dans la formation des ailes (Chapman, 1971). Hsiao et Hou, en 1978, ont ensuite repris les travaux initiés par Biever et Boldt. Ils ont modifié le régime alimentaire des larves en ajoutant dans leur milieu d’élevage d’autres composants : de l’huile de lin, de l’inositol et du cholestérol. L’émergence des adultes est alors passée à 83%, sans qu’aucun adulte anormal n’ait été recensé. Néanmoins, Hsiao et Hou rapportent qu’un des plus grands problèmes rencontrés fut la contamination du milieu par des champignons. 20
  21. 21. 1.7.2. Elevage des insectes à NPP 1.7.2.1. Origine de la souche d’insectes Les insectes présents dans l’élevage à NPP et utilisés dans toutes les manipulations proviennent d’une souche élevée depuis de nombreuses générations chez HRI (Horticulture Research International), basé à Warwick en Grande-Bretagne. 1.7.2.2. Conditions d’élevage de l’insecte L’élevage de Plutella xylostella est maintenu dans une pièce à 25°C sous 70% d’humidité, avec une photopériode de 16 : 8 simulée par 6 panneaux de lumière artificielle (Figure 12). Il s’agit d’une pièce, appelée plus communément « pondoir », qui est en surpression par rapport à l’extérieur pour éviter au maximum l’entrée de contaminants. 1.7.2.3. Elevage des adultes et récolte des œufs pondus Les papillons sont élevés dans quatre cages en plexiglas transparentes (Figure 13). Ils sont quotidiennement ravitaillés en eau (les adultes ne se nourrissant pas), celle-ci leur étant fournie via du coton imbibé afin d’éviter qu’ils ne s’y noient. Les œufs pondus par les femelles sont récoltés quotidiennement. Pour cela, deux béchers en plastique servant de réceptacles pour les pontes sont placés dans la cage. Ces derniers contiennent un morceau de feuille de chou qui stimule l’ovoposition. En conséquence, tous les œufs sont déposés par les femelles à proximité de ce fragment de plante. Pour les récolter, il suffit donc de sortir le bécher de la cage, de le recouvrir d’une serviette en papier (Kimberley Clark, Wypall X70) fixée par un élastique. Ainsi chaque jour, les béchers sont récoltés et remplacés par de nouveaux. Afin de limiter une prolifération bactérienne et fongique qui pourrait affecter la viabilité des œufs, un protocole de désinfection est réalisé immédiatement après cette récolte. Il consiste à pulvériser successivement dans le bécher de l’éthanol à 70%, suivi de formaldéhyde 0,3%, puis d’éthanol absolu. Afin d’avoir un bon suivi chronologique de l’élevage, sur chaque serviette en papier est marqué, au stylo indélébile, le nom de l’espèce en abrégé (ici Px), le numéro de la cage (A ou B) suivi du numéro de la génération ayant pondu les œufs (notée F1, F2…), et enfin la date de ponte. Les œufs mettent environ deux jours avant d’éclore. 1.7.2.4. Elevage des larves Les larves se développent du stade 1 jusqu’à la formation de la chrysalide dans les béchers de ponte (Figure 14). Les larves doivent être ravitaillées : deux barrettes de milieu nutritif semi-synthétique sont ajoutées tous les 2 jours dans tous les béchers depuis l’éclosion des œufs jusqu’à la formation de la pupe. Les larves, dans ces conditions, mettent environ 10 jours à former la chrysalide. Elles cherchent alors un endroit sec pour tisser leur cocon. Pour cela, elles migrent sur la serviette en papier ou sur le rebord supérieur du bécher. Deux jours avant l’émergence des adultes, les béchers sont ouverts et les serviettes (contenant les chrysalides) sont introduites à l’intérieur de la cage d’élevage. Les adultes émergés se reproduiront à leur tour et seront à l’origine d’une nouvelle génération d’individus. 21
  22. 22. Figure 12: Panneaux simulant la photopériode Figure 13 : Cage utilisée pour l’élevage des adultes de P. xylostella Figure 14 : béchers de ponte 22
  23. 23. Le milieu semi-synthétique pour l’élevage des larves actuellement utilisé à NPP a été mis au point par HRI en partenariat avec NPP. Les ingrédients utilisés et leurs quantités sont listés dans le Tableau I ci-contre. Tableau I : composition du milieu élaboré par HRI en partenariat avec NPP pour l’élevage de P. xylostella Ingrédients Quantités Solides Caséine 75,6 g Sucre 75,6 g Germe de blé 64,8 g Sels de Wesson 21,6 g Tourteau de Colza 32,4 g Cellulose 10,8 g Acide ascorbique 9,0 g Liquides Eau 580 ml Hydroxyde de Potassium 4M 10,8 ml Choline Chloride à 10% 21,6 ml Methyl-4-hydroxybenzoate à 15% 21,6 ml Vitamines 3,6 ml Huile de lin 6,0 ml Formaldéhyde 10% 9,0 ml Agent Gélifiant Eau 1200 ml Agar en poudre 54 g Antibiotiques Auréomycine 0,331 g Streptomycine 0,6 g Eau 40 ml 23
  24. 24. ETUDE EXPERIMENTALE 24
  25. 25. 2. Effet de l’incorporation au milieu d’élevage d’un antifongique, le Delvocid® , sur le développement de Plutella xylostella 2.1. Problématique Du fait de la forte humidité dans les pondoirs, le milieu d’élevage utilisé pour Plutella xylostella est très vite envahi par des moisissures qui peuvent par la suite, affecter le bon développement de l’insecte. En effet, une mortalité larvaire est observée, ainsi que des adultes non viables présentant une déformation de leurs ailes. Il a été démontré, lors d’un précédent essai, que le germe de blé incorporé au milieu d’élevage était le principal vecteur de contaminants fongiques. Pour limiter ce phénomène, il est nécessaire d’envisager l’incorporation d’un fongicide dans le milieu semi-synthétique d’élevage, qui permettra alors de limiter le développement des champignons et assurera une meilleure tenue du milieu dans le temps. Le choix s’est porté sur le Delvocid® car il est déjà incorporé dans le milieu d’élevage du Carpocapse, et donne de bons résultats. Toutefois, il est indispensable de tester l’innocuité de ce fongicide sur Plutella xylostella car la natamycine, matière active du Delvocid® , est complexée à un support lactose présentant un effet toxique chez les abeilles. 2.2. Propriétés du Delvocid® Delvocid® est un fongicide dont le composé actif est la natamycine (pimaricine). Il a été isolé à partir d’une souche de bactéries Streptomyces natalensis. Il est utilisé comme additif dans les aliments afin de contrôler la croissance des moisissures à la surface des fromages ou autres produits non stériles. Même à des doses infimes, il combat très efficacement les moisissures et levures susceptibles de se développer et de détériorer les produits alimentaires. Il détruit aussi les hyphes et les spores des champignons (Moll, 1966, Shahani et al, 1985). L’activité antifongique de la natamycine est basée sur son affinité avec les stérols et plus spécialement avec l’ergostérol, principal stérol des membranes cytoplasmiques des cellules fongiques. L’interaction entre la membrane fongique et le principe actif du Delvocid® rend les cellules perméables, en formant un pore polaire par lequel les ions K+ et H+ peuvent diffuser librement, interrompant le contrôle ionique cellulaire [10]. La natamycine a une plus grande affinité pour l’ergostérol que pour le cholestérol (les stérols de la membrane des mammifères). Les bactéries sont insensibles à la natamycine car leur membrane est exempte d’ergostérol. La résistance fongique à la natamycine est rare dans la nature (Pedersen, 1992). Le Delvocid® se présente sous forme d’une poudre blanche cristalline contenant 50% de natamycine. Il est très stable pour un pH compris entre 4,5 et 7 [9]. 2.3. But et principe de l’essai Cet essai a pour but de déterminer la concentration maximale de Delvocid® pouvant être incorporée au milieu semi-synthétique sans affecter la viabilité des larves. Le milieu contenant le fongicide est fourni aux larves néonates (stade 1). Cinq concentrations de Delvocid® sont testées : 24, 50, 100, 200 et 400 mg/kg de milieu, ce qui correspond respectivement à des doses de 12, 25, 50, 100 et 200 mg de matière active. La comparaison est réalisée par rapport à un témoin sans fongicide. 25
  26. 26. 2.4. Effet du Delvocid® sur les larves élevées en plaques de micro-titration 2.4.1. Matériels et méthodes 2.4.1.1. Préparation du milieu d’élevage avec différentes concentrations de Delvocid® Les ingrédients utilisés pour la préparation du milieu restent les mêmes que ceux utilisés pour le milieu d’élevage, à l’exception près qu’ici sera rajouté le Delvocid® à différentes concentrations. L’agar est préalablement pesé dans deux béchers contenant chacun 700 ml d’eau, puis tranvasé dans deux bouteilles en verre et autoclavé. Les poudres et les liquides sont mélangés dans le bol d’un mixer ménager (cf recette milieu Plutella xylostella dans la partie 1.7.2.4. Elevage des larves) et répartis dans 6 béchers, chaque bécher correspondant à une modalité, à raison de 157,06 g/bécher. Le Delvocid® est pesé sur la balance de précision avec la solution d’antibiotiques préalablement préparée et répartie dans 6 tubes plastique de 20 ml à raison de 8,33 ml par tube ; chaque tube correspondant à une modalité. Les quantités de Delvocid® pesées dans chaque tube sont consignées dans le Tableau II ci-contre. La masse de Delvocid® à ajouter dans chaque modalité est déterminée de la façon suivante : si nous prenons l’exemple de la modalité 25, il faut ajouter 50 mg de Delvocid® /kg de milieu préparé. Or, 363,73 g de milieu (correspondant à la somme de 157,06 g d’ingrédients solides et liquides, de 200 ml d’agar et de 6,67 ml d’antibiotiques) ont été préparés pour chaque modalité. Doivent donc être pesés dans 6,67 ml d’antibiotiques : (50*363,73)/1000 = 18,19 mg de Delvocid® . Toutefois, la solution d’antibiotiques a été préparée dans un volume supérieur de 8,33 ml pour pallier les pertes lors des pipetages successifs. Il est donc nécessaire de peser : (18,19*8,33)/6,67 = 22,72 mg de Delvocid® Enfin, il ne reste plus qu’à ajouter 200 ml d’agar aux 157,06 g du mélange solides- liquides, puis 6,67 ml du mélange d’antibiotiques et de Delvocid® . La préparation obtenue est par la suite mélangée quelques secondes à l’aide du turrax (broyeur-homogénéisateur de laboratoire) et coulée dans des bacs en plastique. Des plaques de milieu sont découpées, emballées dans du papier aluminium puis conservées au congélateur à -20 °C. 2.4.1.2. Réalisation des plaques de micro-titration Afin de réaliser cette expérience, il a été nécessaire de sortir de l’élevage de Plutella xylostella un bécher de ponte contenant des œufs prêts à éclore le jour du dépôt, soit le 29/03. A cet égard, le bécher Px AF13 daté du 27/03 a été sorti deux jours avant l’essai et mis à incuber dans l’étuve du laboratoire. Ainsi, nous avons disposé de larves au stade I pour le dépôt. Sous la hotte à flux laminaire préalablement désinfectée à l’éthanol, nous débutons par le découpage au scalpel des cubes de milieu. Ils sont déposés dans 8 rangées de 8 puits de la plaque de micro-titration. Six plaques au total sont réalisées : à chaque plaque correspond une modalité. Immédiatement après, sont déposées au pinceau les larves néonates (Figure 15), en laissant les puits du pourtour de la plaque sans larves car ceux-ci sont soumis de façon plus importante à la dessiccation. Puis, chaque plaque est recouverte de film étirable et d’une plaque 26
  27. 27. Tableau II: Quantités de Delvocid® à peser dans chaque modalité Figure 15 : Dépôt de larves en plaque de micro-titration Modalité Concentration en Delvocid® (en mg/kg) Concentration en matière active (en mg/kg) Masse de Delvocid® à ajouter (en mg) aux 8,33 ml d'antibiotiques T 0 0 0 12 24 12 10,89 25 50 25 22,72 50 100 50 45,42 100 200 100 90,86 200 400 200 181,70 27
  28. 28. en verre maintenue par deux élastiques afin d’éviter la fuite des larves hors des puits. Enfin, les plaques sont incubées à 25°C sous une photopériode 16 : 8 dans l’étuve du laboratoire. 2.4.1.3. Lecture du test L’évaluation de l’influence du Delvocid® sur le développement et la viabilité des larves s’est faite sur la seule observation morphologique des larves (changement de stades larvaires). Leur développement a été comparé à celui des larves élevées sur milieu témoin sans Delvocid® . La lecture du test s’effectue à la loupe binoculaire à J+3, J+6, J+8, J+10, J+13 et J+17 (J+n = nombre de jours après l’éclosion des oeufs) au grossissement 20. D’autre part, le développement larvaire est très dépendant de la température. En effet, la larve a besoin d’accumuler un certain nombre de degrés Celsius pour pouvoir passer au stade suivant. Afin de suivre les variations de température auxquelles ont été soumises les larves, un thermobouton a été placé dans l’étuve (Annexe 1). Son rôle est d’enregistrer, toutes les 30 minutes, la température régnant dans l’endroit où il est placé. Ce thermobouton aura suivi les larves pendant toute la durée de l’essai, du stade œuf jusqu’à l’adulte. Les données du thermobouton ont été relevées lors des lectures de manière à calculer le cumul thermique, correspondant à la somme des températures utiles. Les températures utiles se calculent à l’aide de la formule suivante : T° utiles = (T° t+1- T° zéro développement)*(t+1-t) où t = temps Les T° utiles sont exprimées en valeur décimale. La T° zéro développement est la température sous laquelle le développement complet de l’insecte est impossible : il est incapable de réaliser un cycle de vie en entier. La T° zéro développement chez Plutella xylostella est de 10°C. 2.4.2. Résultats Les résultats bruts sont consignés dans le Tableau III ci-contre. Sont rapportés le nombre de larves vues mortes ou vivantes dans chaque modalité. Toutefois, certaines larves ont tendance à se dissimuler sous les cubes de milieu, rendant leur observation à la loupe binoculaire impossible. A J+3, le pourcentage de mortalité dans les puits varie de 56 % à 71 %. Les plus forts taux de mortalité sont retrouvés dans les plaques des modalités 25, 100 et 200. A ce niveau de l’expérience, des larves de stade II apparaissent. Ces stades se retrouvent dans toutes les plaques, toutefois en plus grandes quantités dans le Témoin ainsi que dans les modalités 12 et 25. Un très fort taux de mortalité est déjà observé dans le Témoin (63 %). A J+6, apparaissent des larves de stade III, surtout dans les plaques Témoin et de la modalité 25. Aucune larve de stade III n’a été aperçue dans les plaques 100 et 200. La mortalité se maintient aux alentours de 60 % dans le Témoin et dans la modalité 12, mais elle avoisine les 100 % dans les modalités 50, 100 et 200. Le pourcentage de survie larvaire a quant à lui diminué considérablement : il est à peine de 50 % pour le Témoin, mais tombe aux environs de 30 % dans les modalités 12 et 25, pour chuter à 0 % dans la modalité 100. A J+10, des larves de stade IV sont apparues, qui sont surtout visibles dans le Témoin et la modalité 12. Aucune larve stade IV n’est retrouvée dans les modalités 50, 100 et 200. 28
  29. 29. Tableau III : Pourcentages de mortalité dans les 6 plaques de J+3 à J+10 J+10 (cumul thermique : 172) Témoin 12 25 50 100 200 Mortes 18 17 16 30 26 25 Vivantes stade 3 1 1 0 1 0 1 Vivantes stade 4 6 6 1 0 0 0 Nombre total de larves vivantes 7 7 1 1 0 1 Nombre d'individus vus 25 24 17 31 26 27 Larves déposées 36 38 38 36 36 36 Taux de mortalité corrigée (%) 72 71 94 97 100 96 J+3 (cumul thermique : 83) Témoin 12 25 50 100 200 Mortes 10 9 9 16 15 11 Vivantes stade 1 0 0 1 6 5 1 Vivantes stade 2 6 7 3 5 1 4 Total d'individus vivants 6 7 4 11 6 5 Nombre d'individus vus 16 16 13 27 21 16 Larves déposées 36 37 37 36 36 38 Taux de mortalité corrigée (%) 63 56 69 59 71 69 J+6 (cumul thermique : 122) Témoin 12 25 50 100 200 Mortes 14 11 11 26 19 16 Vivantes stade 2 7 2 2 0 0 1 Vivantes stade 3 4 4 1 1 0 0 Nombre total de larves vivantes 11 6 3 1 0 1 Nombre d'individus vus 25 17 14 27 19 16 Larves déposées 36 37 37 36 36 38 Taux de mortalité corrigée (%) 56 65 79 96 100 94 29
  30. 30. Tableau III (suite) : Pourcentages de mortalité dans les 6 plaques de J+13 à J+17 J+13 (cumul thermique : 210) Témoin 12 25 50 100 200 Mortes 22 19 16 30 26 25 Vivantes stade 2 0 0 0 0 0 1 Vivantes stade 4 6 3 0 1 0 1 Pupe 0 3 1 0 0 0 Nombre total de larves vivantes 6 6 1 1 0 2 Nombre d'individus vus 28 25 17 31 26 27 Larves déposées 36 38 38 36 36 36 Taux de mortalité corrigée (%) 79 76 94 97 100 93 J+17 (cumul thermique : 263) Témoin 12 25 50 100 200 Mortes 21 19 16 30 27 26 Vivantes stade 3 1 0 0 0 0 0 Vivantes stade 4 5 3 0 1 0 0 Pupe 1 1 0 0 0 0 Adulte 0 1 1 0 0 0 Nombre total d'individus vivants 7 5 1 1 0 0 Nombre d'individus vus 28 24 17 31 27 26 Larves déposées 36 38 38 36 36 36 Taux de mortalité corrigée (%) 75 76 94 97 100 100 30
  31. 31. Le pourcentage de mortalité connaît une nouvelle hausse dans toutes les plaques : dans les 3 premières modalités, il est passé en moyenne de 66 % à J+6 à 79 % à J+10. Il atteint 100 % dans les modalités 50 et 100. A J+13, 3 pupes se sont formées dans la modalité 12 et 1 dans la modalité 25. Le pourcentage de mortalité commence à se stabiliser dans toutes les plaques : il tend légèrement à progresser dans le Témoin et la modalité 12, mais reste identique aux taux de mortalité observés à J+10 pour les plaques suivantes. Enfin, à J+17, émergent 2 adultes dans les modalités 12 et 25. Le taux de mortalité s’est véritablement équilibré ; il n’a pas progressé depuis J+13. Globalement, il n’y a quasiment plus aucune larve vivante dans les modalités 25, 50, 100 et 200. 2.4.3. Discussion et Conclusion Les résultats trouvés ici ne sont pas vraiment ceux escomptés. Très vite, nous nous sommes rendus compte des limites de l’expérience. Le dépôt au pinceau ne serait pas adapté à la préhension de larves néonates de Plutella xylostella, ces dernières sont si petites et délicates que le transport jusqu’aux puits pourrait leur être fatal. Le fait également de se placer sous une hotte à flux laminaire nous a posé des difficultés pour le dépôt de ces dernières dans les puits. De plus, les cubes de milieu présents dans chaque puits ne facilitent pas la lecture des plaques, d’où un pourcentage de larves non vues élevé dans toutes les modalités. A J+3, la mortalité observée dans le Témoin serait principalement due à la noyade des larves. Des gouttelettes d’eau se sont formées sur le film étirable suite à la condensation de la vapeur d’eau. Les larves, en essayant de ramper sur le rebord du puits, ont fini par s’y noyer. A J+6, nous assistons à un pic de mortalité larvaire dans les 3 dernières modalités (jusqu'à 100%). Il n’y a presque plus aucune larve vivante dans les modalités 50, 100 et 200. Le passage du stade larvaire II au III serait très coûteux en énergie et engendrerait une hausse de la mortalité, surtout rencontrée dans les modalités 50, 100 et 200. Entre J+10 et J+13, les larves de stade III retrouvées dans le Témoin et dans la modalité 12 sont toutes passées au stade IV. Néanmoins, un accroissement de la mortalité dans les plaques Témoin et 12 a été observé. Ce phénomène pourrait être expliqué par le non ajout de nourriture fraîche dans les puits, préférée par les larves. De plus, elles souillent vite le cube de milieu par leurs déjections, le rendant impropre à la consommation. D’ailleurs, beaucoup de larves observées au stade IV semblent affaiblies : elles sont petites, minces, d’une couleur vert foncé. Elles contrastent beaucoup avec des larves de stade IV « vigoureuses » qui sont grandes et grosses, et de couleur vert pâle. A J+17, nous assistons à une stagnation du taux de mortalité larvaire dans toutes les plaques : il s’explique par le fait que la presque totalité des larves sont mortes. D’autre part, le nombre d’adultes émergés est très faible : seulement deux sur les 6 plaques. Par ailleurs, ces 2 adultes présentent des déformations alaires, sûrement dues à leur émergence dans les puits. En effet, le puits est trop étroit pour que l’adulte déplie correctement ses ailes afin de les faire sécher. Devant une telle mortalité dans le Témoin (75 % à la fin de l’essai), nous ne sommes pas en mesure de nous prononcer quant à l’efficacité du Delvocid® incorporé dans le milieu d’élevage de Plutella xylostella. Les conditions de manipulation et d’élevage des larves seraient 31
  32. 32. à l’origine de la surmortalité observée. Cette dernière ne serait donc pas liée à la concentration en natamycine dans chaque modalité. Il a été jugé nécessaire de reconduire l’expérience, mais cette fois-ci, dans un support différent permettant de manipuler les larves le moins possible. 2.5. Effet du Delvocid® sur les larves élevées dans des béchers de ponte Suite au très faible pourcentage de survie des larves néonates observé au sein des plaques de microtitration, et ce pour toutes les modalités testées lors du premier essai, un deuxième essai a été lancé directement dans les béchers de ponte. Le choix de ce support est simple : les larves néonates y sont plus facilement déposées et de la nourriture fraîche peut leur être ajoutée en cours d’essai. 2.5.1. Matériels et méthodes Les modalités testées restent les mêmes que lors du premier essai. Le surplus de milieu fabriqué et conservé au congélateur a été utilisé pour ce deuxième essai. Cet essai a débuté le mercredi 12/04 et s’est achevé le 5/05. Les œufs du lundi 10/04 ont été récoltés le jour de leur ponte et incubés à 25°C dans l’étuve du laboratoire avec un thermobouton. Par conséquent, le 12/04, des larves néonates issues de ces œufs étaient disponibles. Les larves néonates issues du bécher du 10/04 sont déposées dans 6 béchers, soit 1 bécher par modalité, à raison de 50 larves par bécher. Puis, trois barrettes de milieu, correspondant à chaque modalité, sont ajoutées dans les béchers. Enfin, chaque bécher est recouvert d’une demi-serviette pliée en deux, identifiée par le numéro de la modalité testée, et est incubé dans l’étuve à 25°C avec un thermobouton. Tous les 2 ou 3 jours, des barrettes de milieu correspondant à la modalité testée sont ajoutées dans chacun des béchers. Le jeudi 27/04 (J+15 après l’éclosion des œufs), date théorique correspondant à la formation des chrysalides pour un cycle de vie réalisé à 25°C, le nombre de chrysalides formées sur la serviette de chacun des 6 béchers est compté, puis le nombre d’adultes émergés ainsi que le nombre de larves restant dans les béchers. Les larves restantes ont ensuite été placées dans des boîtes de Pétri avec du milieu d’élevage correspondant à la modalité testée, à raison d’une boîte de Pétri par modalité. Le dénombrement de pupes formées et d’adultes émergés dans les boîtes de Pétri ont été déterminés le 05/05. Comme pour le précédent essai, l’effet du Delvocid® n’est étudié que sur la viabilité des larves. Le suivi de leur développement se fait par comptage du nombre de pupes formées sur chaque et nombre d’adultes émergés. L’analyse des résultats obtenus permettra de déterminer 2 paramètres qui aideront à comparer les 5 concentrations en Delvocid® au Témoin. Il s’agit du pourcentage de survie larvaire et du pourcentage d’émergence : % de survie larvaire = (nombre total de pupes formées / nombre de larves stade I placées dans le bécher)*100 % d’émergence = (nombre total d’adultes émergés/ nombre total de pupes formées)*100 Avec nombre total de pupes formées = nombre de pupes formées dans le bécher au 27/04 + nombre de pupes formées dans la boîte de Pétri au 05/05 ; et nombre total d’adultes émergés = nombre d’adultes émergés dans le bécher au 27/04 + nombre d’adultes émergés dans la boîte de Pétri au 05/05. 32
  33. 33. 2.5.2. Résultats et Discussion Les données obtenues ont permis de déterminer les pourcentages de survie larvaire et d’émergence. Les résultats sont consignés dans le Tableau IV ci-contre. Les résultats montrent que plus la concentration en Delvocid® est élevée, moins il y a de pupes formées. Cette affirmation s’applique surtout aux modalités 50, 100 et 200, et est très marquée pour cette dernière. En fait, l’observation des pourcentages de survie larvaire laisse clairement distinguer 3 groupes : le premier groupe inclut le Témoin et les modalités 12 et 25, le deuxième groupe englobe les modalités 50 et 100, enfin le troisième groupe contient seulement la modalité 200. Le premier groupe comprend le bécher Témoin ainsi que les modalités 12 et 25, qui n’affectent ni la survie, ni le développement larvaire. Effectivement, dans le bécher Témoin, 39 pupes se sont formées sur les 50 larves isolées. Dans les modalités 12 et 25, quasiment le même nombre de pupes s’est également formé. De plus, au maximum 2 larves de stade IV ont été retrouvées dans le bécher de la modalité 12 à J+15. En outre, le pourcentage de survie larvaire dans ces 3 modalités varie entre 78% et 84%. Les résultats sont très proches du pourcentage de survie larvaire déjà déterminé en conditions expérimentales à NPP, et qui est de 82%. Nous pouvons alors affirmer qu’à priori, jusqu’à une concentration de matière active de 25 mg/kg de milieu, le développement de l’insecte se fait normalement. En outre, jusqu’à cette dose, le Delvocid® n’affecte pas la survie larvaire, qui reste constante dans ces 3 béchers aux environs de 80%. Les effets néfastes commencent à apparaître lorsque la dose atteint 50 mg de natamycine/kg de milieu, correspondant aux modalités incluses dans le deuxième et le troisième groupe. En effet, dans les modalités 50, 100 et 200, la durée du développement larvaire s’est prolongée car sont trouvées, en moyenne, 10 larves aux stades III et/ou IV lors de la lecture. Le nombre de pupes formées descend à 34 pour la modalité 50, soit une survie larvaire de 68%. Il se maintient approximativement à ce taux pour la modalité 100. Ce sont des taux de survie larvaire inférieurs a ceux du Témoin mais compris dans un seuil acceptable, c’est à dire ne semblant pas être directement influencés par l’ajout de l’antifongique dans le milieu. En fait, l’incorporation dans le milieu d’élevage de Delvocid® à une concentration en matière active comprise entre 50 et 100 mg/kg de milieu induit surtout un retard de développement larvaire. Enfin, dans le cas de la modalité 200, le pourcentage de survie larvaire chute à 4%. Devant un tel pourcentage, il peut être affirmé que la concentration de matière active supérieure ou égale à 200 mg/kg de milieu entraîne principalement une diminution de la survie larvaire. Le pourcentage d’émergence est compris approximativement entre 75% et 90% pour les 3 premières modalités et autour 60-70% pour les 3 dernières. Ces taux d’émergence sont convenables dans les 3 groupes, même s’ils sont légèrement plus faibles dans le deuxième et troisième groupe. Néanmoins il n’est pas possible de se prononcer sur le fait qu’il y ait un lien entre le Delvocid® et ces dernières données. De ces résultats, il peut être affirmé que la trop forte teneur en matière active dans le milieu entraînerait non seulement une diminution de la survie larvaire, mais aussi un retard dans le développement larvaire. Dans cet essai, les béchers correspondant aux modalités 12 et 25 présentent une survie larvaire proche voire même identique à celle observée sur milieu Témoin. Il serait donc possible d’incorporer du Delvocid® au milieu d’elevage de Plutella xylostella mais à une concentration inférieure à 50 mg/kg de milieu. Un troisième essai devra être mis en place pour confirmer cette hypothèse, ainsi qu’en parallèle un suivi du poids des larves, qui constituera un deuxième marqueur fiable de la bonne qualité nutritive du milieu. 33
  34. 34. Tableau IV : Nombre de larves restantes, de pupes formées et d’adultes émergés dans les béchers et dans les boîtes de Pétri au 27/04 et au 05/05. Résultats au 27/04 T 12 25 50 100 200 Nombre de pupes formées 39 40 40 25 21 0 Nombre de larves dans bécher 0 2 1 9 11 8 Résultats au 05/05 Nombre de pupes formées au 05/05 0 2 1 9 11 2 Nombre total de pupes formées 39 42 41 34 32 2 Nombre total d'adultes émergés 34 34 31 21 23 2 % de survie larvaire 78 84 82 68 64 4 % d'émergence 87 81 75 61 72 100 34
  35. 35. 3. Détermination du stade larvaire par mesure de la largeur de la capsule céphalique 3.1. Problématique Pour réaliser le suivi du cycle de développement de Plutella xylostella et les inoculations du PxGV, il est important de pouvoir déterminer précisément le stade dans lequel se trouve une larve. Or, les différents stades sont caractérisés par les dimensions de la capsule céphalique. Contrairement au corps, la tête, sclérifiée, a une taille fixe entre chaque stade larvaire. Sa taille augmente uniquement lors des mues larvaires. La mesure de la largeur de la capsule céphalique se révèle alors être une des caractéristiques les plus fiables pour déterminer le stade larvaire [12]. 3.2. Matériels et Méthodes La largeur de la capsule céphalique est mesurée à l’aide d’un micromètre oculaire monté sur une loupe binoculaire au grossissement de 20. Il remplace l’oculaire droit et présente une réglette à l’intérieur de 14 mm de longueur graduée tous les 0,1 mm. Le relevé de la largeur de la capsule céphalique est réalisé quotidiennement jusqu’à la formation de la chrysalide, et ce depuis le stade larvaire I. Deux béchers issus de l’élevage de Plutella datés du 11/04 sont incubés dans l’étuve du laboratoire. La température est suivie par un thermobouton. L’essai a débuté le 13/04 pour s’achever le 25/04. Tous les jours ouvrés, jusqu’à la formation de la chrysalide, 30 larves sont prélevées au hasard dans le bécher au pinceau et chacune est déposée dans de petites boîtes de Pétri. Chaque boîte est ensuite placée sous l’objectif de la loupe binoculaire afin de mesurer la largeur de la capsule céphalique de chacune de ces 30 larves. Toutes les larves sont remises, après mesure, dans le bécher à l’aide du pinceau. La relève du thermobouton est réalisée à la fin et le cumul thermique est calculé pour chaque jour de mesure. Il s’agit ensuite de déterminer la largeur réelle de la capsule céphalique. Pour cela, la valeur obtenue lors de la mesure à la loupe binoculaire doit être divisée par le grossissement de l’objectif (ici 20). Le résultat est exprimé en microns : Largeur réelle de la capsule céphalique (exprimée en µm) = [largeur capsule céphalique mesurée à la loupe binoculaire (en mm) / grossissement de l’objectif]*1000 Les résultats obtenus seront ensuite représentés sous forme graphique. 3.3. Résultats 3.3.1. Paramètres de tendance centrale et de dispersion Les largeurs de la capsule céphalique mesurées durant cet essai sont regroupées dans le Tableau V ci-contre. Les tableaux des mesures brutes sont consignés en Annexe 2. A J+1 et J+2, les étendues des deux séries sont faibles : seulement 5 µm. De plus, l’écart-type associé à la moyenne est faible (+/- 1,83 µm et 1,30 µm). 35
  36. 36. Tableau V : Paramètres de tendance centrale et de dispersion sur les mesures de la capsule céphalique de J+1 à J+13. J+1 J+2 J+6 J+7 J+8 J+9 J+12 J+13 Cumul thermique: 55 69 124 138 150 166 208 221 Paramètres de tendance centrale Mode: 15 15 25 25 25 35 50 55 Moyenne: 13,7 14,3 23,3 25,8 30,8 36,3 46,3 50,7 Médiane: 15 15 25 25 32,5 35 50 55 Paramètres de dispersion Minimum: 10 10 15 20 20 25 30 35 Maximum: 15 15 30 35 40 55 55 55 Variance: 3,33 1,70 9,12 12,64 39,80 63,68 74,02 44,37 Ecart- type: 1,8 1,3 3,0 3,6 6,3 8,0 8,6 6,7 36
  37. 37. A partir de J+6 et J+7, les valeurs commencent à s’hétérogénéiser : les étendues sont de 15 µm pour chaque série. D’ailleurs, l’écart-type a doublé par rapport aux 2 jours précédents : il est maintenant aux environs de 3,25 µm. A J+8 et J+9, une nette augmentation des valeurs est observée : en effet, à J+9, l’étendue maximale est de 30 µm, entraînant une hausse de l’écart-type (compris entre 6,3 µm et 8 µm). La plus grande valeur observée (55 µm) est atteinte à J+9 et n’augmentera plus dans les jours suivants. Entre J+12 et J+13, les étendues des 2 séries tendent à diminuer (25 µm à J+12 et 20 µm à J+13). Les valeurs de la série à J+13 se sont maintenant homogénéisées car son étendue a diminué et son écart-type aussi (+/- 6,6 µm). 3.3.2. Tracé du diagramme en rectangles Un diagramme des effectifs est ensuite tracé (Figure 16). Il représente les effectifs en fonction des largeurs des capsules (en µm). Bien que la largeur de la capsule céphalique soit une variable quantitative continue, la représentation en diagramme en rectangles s’avère être la plus adaptée à notre étude. En effet, le but est de trouver des valeurs précises de la largeur qui seraient ensuite associées à chacun des stades 4 larvaires. Les données brutes ont été organisées dans le Tableau de données VI ci-contre. Les résultats sont rangés dans un ordre de grandeur croissante. A chaque grandeur est associé son effectif. Le pas choisi est de 2,5 µm. Ce diagramme présente 4 fréquences maximales, soit 4 modes ; le mode étant la valeur numérique de la largeur de la capsule céphalique la plus fréquemment retrouvée dans notre série de données. C’est ce qu’on appelle une distribution multimodale. Ces 4 fréquences maximales sont associées à 4 valeurs : 15 µm, 25 µm, 35 µm et 50-55 µm. 3.3.3. Tracé de la droite de régression Afin de savoir s’il existe une corrélation entre la variable « largeur de la capsule céphalique » et la variable « stade larvaire », les 4 largeurs de capsules céphaliques correspondant aux 4 fréquences maximales ont été reprises afin de tracer la droite de régression (Figure 17). Pour chaque largeur, un numéro de stade est associé. Respectivement, pour les largeurs 15 µm, 25 µm, 35 µm et 50-55 µm, ont été associés les stades 1, 2, 3 et 4. La courbe suivante est tracée : Largeur de la capsule ayant la fréquence maximale = f (numéro de stade larvaire) L’allure du nuage de points suggère, par le groupement des points, une exponentielle. Il semble qu’il existe une forte corrélation entre les 2 variables. Le modèle exponentiel peut être appliqué. L’équation de la droite de régression ainsi obtenue a pu être déterminée en procédant à un changement de variable. L’équation de la droite de régression suivant une loi exponentielle est de la forme : Y =a*b ex = 10,401* e0.4066x = 2,34 + 0,4066 x 37
  38. 38. Tableau VI : Distribution de fréquences des mesures de la largeur de la capsule céphalique largeur des capsules céphaliques (en µm) effectifs (ou fréquences absolues) ni 10 5 12,5 14 15 42 17,5 0 20 12 22,5 2 25 56 27,5 1 30 9 32,5 0 35 41 37,5 0 40 6 42,5 0 45 0 47,5 0 50 26 52,5 0 55 26 Total n=240 Figure 16 : Diagramme en rectangles représentant la distribution des effectifs en fonction des largeurs des capsules cephaliques de P. xylostella 38 Distribution des effectifs en fonction des largeurs des capsules céphaliques de P. xylostella 0 10 20 30 40 50 60 10 12,5 15 17,5 20 22,5 25 27,5 30 32,5 35 37,5 40 42,5 45 47,5 50 52,5 55 largeur capsule céphalique (en µm) effectif
  39. 39. Figure 17 : Nuage de points et sa droite de régression exponentielle 39 Nuage de points avec sa droite de régression y = 10,401e 0,4066x R 2 = 0,9908 0 10 20 30 40 50 60 0 1 2 3 4 5 numéro des stades largeurcapsulecéphalique(enµm)
  40. 40. Le coefficient de corrélation linéaire est égal à : r = 0,995 Cet ajustement est considéré comme valide si r est en valeur absolue supérieur à √3/2 (0,866). Le rapport de détermination R² est égal à : R² =0,991 Ici, R est très proche de 1. Il existe donc un lien entre les 2 variables. Le modèle exponentiel rend compte de 99,1% de la variabilité de Y. 3.4. Discussion et Conclusion 3.4.1. Sur les données du tableau Les valeurs tendent à s’hétérogénéiser au cours de l’essai. En effet, l’étude comparée des écarts-type de ces 6 séries statistiques montre que la dispersion des valeurs autour de la moyenne est plus marquée de J+8 à J+13 que de J+1 à J+7. Cette variabilité est le reflet d’une fluctuation statistique de l’échantillonnage. En effet, cette hétérogénéité est la conséquence d’une désynchronisation du développement des larves au cours du cycle larvaire : certaines larves se développeraient plus vite que d’autres. Cette désynchronisation des valeurs serait une caractéristique propre à l’espèce, ou pourrait être expliquée par une inégalité des individus face à l’accès à la nourriture, ou encore serait due à la position des individus dans le bécher. Cependant, la plupart des largeurs des capsules céphaliques mesurées sont comprises dans des intervalles restreints, qui ont été mis en évidence plus nettement dans le diagramme. 3.4.2. Sur le diagramme en rectangles Ce type de diagramme suggère l’existence au sein de l’échantillon étudié de 4 « populations » distinctes. Il est le reflet d’une population composée de plusieurs sous- populations. Il est alors possible de déduire que les larves, durant tout leur développement, passent par 4 stades mis en évidence ici-même par l’augmentation en largeur de leur capsule céphalique. Cette augmentation de la largeur de la capsule céphalique se fait donc par « paliers » successifs, et non pas de manière continue. Chaque palier correspond à un des 4 stades et chaque stade est caractérisé par les largeurs de capsules céphaliques suivantes, respectivement : 15 µm, 25 µm, 35 µm et 50-55 µm. 3.4.3. Sur la droite de régression Le coefficient de corrélation r étant très proche de 1, nous pouvons affirmer qu’il existe une corrélation entre les 2 variables. Nous pouvons en déduire que l’accroissement de la largeur de la capsule céphalique est une fonction exponentielle du stade larvaire. A partir de l’équation obtenue, il est possible de déterminer le stade dans lequel se trouve la larve en mesurant simplement la largeur de sa capsule céphalique. 40
  41. 41. CONCLUSION Des résultats très encourageants ont été obtenus sur les essais menés au cours de ce stage. Dans un premier temps, la concentration maximale en Delvocid® pouvant être incorporée au milieu d’élevage a été déterminée. Nous avons pu montrer que jusqu’à 50 mg/kg d’antifongique ajouté au milieu, le pourcentage de survie larvaire se maintient à des niveaux proches de ceux du témoin sans Delvocid® . Au-delà, un retard de développement des larves et une surmortalité sont constatés. Néanmoins, pour mener à bien cet essai, il a fallu s’adapter aux contraintes et trouver des alternatives permettant de contourner les problèmes rencontrés. Il a également fallu que les solutions envisagées soient les plus simples possibles à mettre en œuvre. C’est avec cette démarche que nous avons raisonné pour pallier au problème de la forte mortalité larvaire dans le premier essai mené sur l’incorporation du Delvocid® au milieu d’élevage. Cet essai prometteur a fait naître de nouvelles perspectives d’étude. Il s’agit de tester dans les mois à venir la natamycine (matière active du Delvocid® ) sur support xanthane, moins toxique sur les abeilles, ainsi que le Delvocid® sous forme liquide, beaucoup plus soluble. Ces études devront être menées avant toute incorporation à plus grande échelle à l’ensemble de l’élevage. D’autre part, un modèle a été établi pour aider à la détermination du stade larvaire à partir de la seule mesure de la largeur de al capsule céphalique. A partir de ce modèle, nous sommes maintenant capables d’associer à n’importe quelle largeur de capsule céphalique un numéro de stade larvaire. Il s’agit d’un paramètre essentiel dans la détermination du stade pour lequel l’inoculation de la larve par son baculovirus aura le meilleur rendement en particules virales. D’ailleurs, 7 essais en plein champ du virus de P. xylostella sont prévus pour l’été. Les résultats permettront de se prononcer encore un peu plus sur la viabilité de ce projet. 41
  42. 42. BIBLIOGRAPHIE Ouvrages et périodiques Biever K.D., Boldt P.E. 1971. Continuous Laboratory Rearing of the Diamondback Moth and Related Biological Data. Entomology Research Division, Agr. Res. Serv., USDA, Columbia, Missouri. 64 (3) : 651- 655. Carpenter J.E., Bloem S. 2002. Interaction between insect strain and artificial diet in diamondback moth development and reproduction. Entomologia Experimentalis et Applicata. 102 (3) : 283-294. Cloarec J.N., Faurie C., Gaudin B., Lamarque J., Lamarque P., Lizeaux C., Tavernier R., Videaud A. 1987. Biologie seconde. Collection Tavernier. Bordas. 187-202. Delobel, A. 1978. La protection des cultures de crucifères contre la teigne du chou en Nouvelle- Calédonie (Plutella xylostella (L) : Lep. Hyponomeutidae). Cah. O.R.S.T.O.M, sér. Biol., 13 (1) : 35-40. Fernandez S. A., Alvarez C. 1988. Biologia de Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera : Yponomeutidae) Polilla de repollo (Brassica oleraceae L.) en condiciones de laboratorio. FONAIAP. Estacion Experimental Lara. Apdo. 592. Barquisimeto, Venezuela. Agronomia Tropical. 38 (4-6) : 17-28. Hsiao J.H., Hou R.F. 1978. Artificial rearing of the diamondback moth, Plutella xylostella (L.), on a semi-synthetic diet. Department of Entomology, National Chung Hsing University. Taichung, Taiwan, Republic of China. Bull. Inst. Zool., Academia Sinica 17 (2) : 97-102. Lopez-Ferber M., Croizier G., Devauchelle G. 2001. Des virus tueurs d’insectes. Biofutur. 207 : 34-37. Pedersen J.C. 1992. Natamycin as a Fungicide in Agar Media. Department of Marine Ecology and Microbiology, National Environmental Research Institute, Denmark. 58 (3) : 1064-1066. Sayyed A.H., Mohsin R.R., Alvi A.H. 2002. Management of Diamondback Moth, Plutella xylostella (Lepidoptera : Plutellidae) : a Lesson from South East Asia for Sustainable Integrated Pest Management. Pakistan Journal of Biological Sciences. 5 (2) : 234-245. Talekar, N.S., Griggs T.D. 1986. Diamondback Moth Management : Proceedings of the First International Workshop. Shanhua, Taiwan : The Asian Vegetable Research and Development Center. Foreward. x. Talekar, N.S. 1992. Management of Diamondback Mot hand Other Crucifer Pests : Proceedings of the Second International Workshop. Shanhua, Taiwan : Asian Vegetable Research and Development Center. 603 pp. Talekar, N.S., Shelton, A.M. 1993. Biology, Ecology and management of the Diamondback Moth. Annu. Rev. Entomol. 38 : 275-301. Silvy C., Riba G. 2001. Les enjeux écologiques des biopesticides. Biofutur. 207 : 22-27. 42
  43. 43. Sites Internet [1] Teigne des Crucifères [En ligne]. [11/04/06] Internet : <URL : http://www.inra.fr/Internet/Produits/HYPPZ/RAVAGEUR/3pluxyl.htm> [3] MAU, F.L., MARTIN KESSING, J.L. Plutella xylostella (Linnaeus) [En ligne] [11/04/06] Internet : <URL : http://www.extento.hawaii.edu/kbase/crop/Type/plutella.htm> [2] diamondback moth – Plutella xylostella (Linnaeus) [En ligne] [11/04/06] Internet : <URL : http://creatures.ifas.ufl.edu/veg/leaf/diamondback_moth.htm> [4] Les Arthropodes – Généralités [En ligne] [12/04/06] Internet : <URL : http://perso.wanadoo.fr/brunopicart/Textes/arthropo.htm> [5] Teigne des Brassicacées Plutella xylostella (L.) [En ligne] [12/04/06] Internet : <URL : http://www.terresdelyonne.com/ressources/ravageurs/liste_ravageurs2.php? info=5> [6] Diamondback moth [En ligne] [12/04/06] Internet : <URL : http://www.agr.gov.sk.ca/DOCS/crops/integrated_pest_management/insects/Diamond.asp? firstPick=Crops&secondpick=Integrated%20Pest%20Management&thirdpick=Insects> [7] Canola de printemps et canola d'automne : Fausses-teignes des crucifères [En ligne] [13/04/06] Internet : <URL : http://www.gov.on.ca/OMAFRA/french/crops/pub811/8moth.htm> [8] Bio-insecticides [En ligne] [13/04/06] Internet : <URL : http://www.inra.fr/dpenv/scienceauquotidien/ficheshtml/04CC.htm> [9] Delvocid en bebdas alcoholizadas [En ligne] [23/03/06] Internet : <URL : http://www.interenzimas.com/Interenzimas/productos_detalle.php? id_catalogo_producto=23&id_catalogo_categoria=59> [10] Safety Evaluation of certain food additives and contaminants [En ligne] [23/03/06] Internet : <URL : http://www.inchem.org/documents/jecfa/jecmono/v48je06.htm> [11] Palomilla Dorso de Diamante (DDM) [En ligne] [07/04/06] Internet : <URL : http://www.nysaes.cornell.edu/ent/hortcrops/spanish/dbm.html> 43
  44. 44. ANNEXES 44
  45. 45. ANNEXE 1 Présentation du thermobouton Principe du thermobouton : C’est le plus petit enregistreur de température au monde. D’un diamètre de 16 mm, pour une épaisseur de 6 mm, le thermoubouton peut se placer où l'on veut par sertissage, ou simplement posé. Sa capsule est faite en acier inoxydable, le rendant étanche et très résistant contre les chocs ou les grandes variations de température. Caractéristiques : Il relève la température à intervalles réguliers entre 1 seconde et 273 heures, tout en enregistrant la date et l'heure de tous les relevés de température. Les données sont archivées et horodatées sur sa mémoire inviolable. Sa précision est de 0.5 °C. L'amplitude de température étant impressionnante (de -30 à +85°C). Mode d’emploi : Avant toute utilisation, il faut tout d’abord paramétrer le bouton. Pour cela, nous disposons d’un logiciel (Thermo Track PC) qui planifie plusieurs paramètres nécessaires au bon déroulement de l’expérience. Par exemple, il détermine des seuils de température (minimum et maximum), et si ces derniers venaient à être dépassés, ils sont signalés par une couleur voyante lors de la relève. Pour notre essai, nous avons choisi de programmer en alarme basse : 23°C ; en alarme haute : 27°C. Il faut également choisir la fréquence des relevés et la date de démarrage de l’enregistrement. Nous avons opté pour une relève de température toutes les 30 minutes. Le suivi de la température est ensuite décrypté sur le logiciel qui rend les mesures sous forme de tableau, courbes, en pointant sur les alarmes fixées. Ce logiciel permet de lire les données archivées par le bouton, consulter les alarmes, afficher les courbes, imprimer… mais surtout, il permet de calculer le cumul thermique. 45
  46. 46. ANNEXE 2 Largeurs des capsules céphaliques mesurées sur 30 larves de J+1 à J+13 J+1 J+2 J+6 J+7 J+8 J+9 J+12 J+13 1 12,5 15 25 25 25 35 55 55 2 15 15 20 25 35 35 35 55 3 10 12,5 20 25 35 35 35 55 4 15 15 25 25 35 30 50 50 5 15 15 20 25 35 35 50 55 6 10 15 20 25 40 35 50 50 7 12,5 12,5 15 20 35 35 50 55 8 12,5 15 25 27,5 35 35 55 55 9 15 15 25 25 30 55 50 55 10 15 15 25 25 35 35 35 50 11 10 12,5 20 25 40 35 55 50 12 10 15 20 25 40 25 35 35 13 12,5 15 20 22,5 25 55 50 55 14 15 15 25 30 40 35 55 55 15 12,5 15 20 35 25 35 50 55 16 15 10 20 25 25 30 50 50 17 15 15 30 25 35 50 50 55 18 12,5 12,5 25 25 35 35 50 35 19 15 12,5 22,5 25 25 35 55 55 20 15 15 25 25 25 30 35 55 21 15 15 25 25 40 50 35 55 22 12,5 15 25 25 25 35 30 50 23 15 15 25 25 35 30 55 55 24 12,5 15 25 25 25 35 50 35 25 15 15 25 25 20 40 50 55 26 15 15 25 35 25 35 50 50 27 15 12,5 25 35 25 50 55 50 28 15 15 25 20 25 25 35 50 29 15 15 25 25 25 35 30 35 30 15 15 25 25 25 25 50 50 46
  47. 47. Résumé La teigne des Crucifères, Plutella xylostella, est un des ravageurs les plus importants des Crucifères. Il sévit partout dans le monde, engendrant d’énormes pertes financières. Insecte devenu résistant à l’heure actuelle à la plupart des pesticides chimiques, les populations de Plutella xylostella sont quasiment impossibles à maîtriser. Néanmoins, il existe un virus spécifique aux larves de cette espèce, le PxGV, capable de diminuer considérablement leur impact, tout en étant respectueux de l’environnement. NPP a décidé de mettre en place un élevage de cet insecte sur milieu semi-synthétique afin d’étudier les paramètres biotiques de l’espèce dans le but de produire ce virus à l’échelle industrielle. Les essais expérimentaux effectués pour l’incorporation dans le milieu d’élevage d’un antifongique, le Delvocid, ont donné des résultats encourageants. Jusqu’à une concentration de 50 mg/kg de milieu, le produit n’a pas d’influence sur la survie et le développement larvaire. En parallèle, un autre essai a permis de trouver un lien entre la largeur de la capsule céphalique de la larve et le numéro de son stade. Maintenant il est possible d’associer à chaque stade une largeur caractéristique et vice-versa. Tous ces résultats ont augmenté l’espoir quant à la mise en place du projet final consistant à l’amplification en masse du virus sur les larves. Mots-clés : Plutella xylostella, biopesticides, élevage sur milieu semi-synthétique, Delvocid, capsule céphalique. 47

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