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Presentación para la determinación bioquímica de proteínas

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    Proteinograma Proteinograma Presentation Transcript

    • PROTEINOGRAMA: METODOS DE FRACCIONAMIENTO PROTEICO
    • PROTEINAS PLASMATICAS
      • Suero : Fracción de proteínas solubles que aparecen tras la retracción del coágulo sanguíneo. Carece de fibrinógeno
      • Funciones :
        • Transporte de compuestos endógenos/exógenos poco solubles en agua (medicamentos, hormonas, calcio, …)
        • Regulación de la presión oncótica y el balance intra/extravasal de agua.
        • Respuesta inflamatoria y control de la infección (PCR, Fibrinógeno, Ferritina, ...)
    • PROTEINAS PLASMATICAS
      • Síntesis proteica
        • Síntesis: la mayor parte de las proteínas plasmáticas se sintetizan en el hígado
        • Los linfocitos B son los responsables de la síntesis de las inmunoglobulinas
        • Degradación/Pérdidas.
          • El catabolismo tiene lugar en muchas y distintas células (endoteliales, fagocitos mononucleares, fibroblastos cutáneos)
          • Pérdidas por filtración glomerular
          • Pérdidas a través de la pared intestinal
    • PROTEINAS PLASMATICAS
        • Estructura : Los aminoácidos -> Unidad estructural de las proteínas (secuencia de aa)
          • La disposición espacial de esta secuencia de aa condiciona su carácter intrínseco y las diferencia de otras
          • Los aa, debido su composición (grupos ácidos y básicos), al disociarse en agua confieren a la molécula cargas + y – => La molécula proteica presenta una carga neta suma de las cargas positiva y negativa
          • La carga eléctrica de la proteína depende del grado de disociación de sus grupos funcionales ácidos y básicos, lo cual depende del pH.
    • PROTEINAS PLASMATICAS
    • PROTEINOGRAMA
      • Metodología (electroforesis)
        • Las proteínas son capaces de moverse en función de su carga y tamaño cuando son sometidas a un campo eléctrico
        • La movilidad electroforética es proporcional al cociente: Carga/Masa
    • PROTEINOGRAMA
    • PROTEINOGRAMA
    • PROTEINOGRAMA
      • Fracciones proteicas
        • Albúmina sérica
          • Banda mayoritaria (53-66%) del total del proteinograma
          • Valores normales:
            • Recién nacidos: 2.9-5.5 g/100ml
            • Niños: 3.8-5.5
            • Adultos (V): 3.3-6.1; (H): 2.7-5.6
        • Pre-albúmina (retinol binding protein)
          • Mayor movilidad electroforética.
          • Rápido recambio (18-45 mg/100ml)
          • Indicador de estado nutricional
    • PROTEINOGRAMA
      • Fracciones proteicas
        • Fracción α1 globulinas
          • Aumenta durante los procesos inflamatorios agudos, neoplasias, infartos y necrosis (1.9-4.1% del total del proteinograma)
            • α1- glicoproteína ácida
            • α1- antitripsina
            • α1- antiquimiotripsina
            • α1- fetoproteína (<2 mg/100 ml)
    • PROTEINOGRAMA
      • Fracciones proteicas
        • Fracción α2 globulinas
          • Aumenta en el síndrome nefrótico, ictericia obstructiva, tuberculosis, inflamación crónica (7.7-12.3%)
            • α2 macroglobulina (150-420 mg/100ml; Síndrome nefrótico)
            • Ceruloplasmina (20-40 mg/100ml; transporte Cu2+; enf. Wilson)
            • Haptoglobina (60-270 mg/100ml), transporte Hb; aumenta en inflamación, neoplasias; disminuye hemólisis intravascular, anemia perniciosa
            • Proteína C reactiva (<0.5 mg/100 ml). Inflamaciones e infecciones
    • PROTEINOGRAMA
      • Fracciones proteicas
        • Fracción β globulinas
          • Aumento moderado en síndrome nefrótico, ictericia obstructiva, cirrosis, tuberculosis, inflamación crónica (7.6-13.0%)
            •  -Lipoproteina (colesterol)
            • Fibronectina (25-40 mg/100ml; aumenta en síndrome nefrótico, colestasis, neoplasias. Disminuye en politraumatismos, quemaduras extensas, sepsis)
            • Transferrina (200-400 mg/100ml; transporte Fe; aumenta en anemias)
            • Transcobalamina (900 pmol/L; transporte de B12).
            • Complemento (C3, C4) (85-190; 12-36 mg/100 ml). Aumentan en procesos inflamatorios agudos. Disminuyen en reacciones autoinmunes.
    • PROTEINOGRAMA
      • Fracciones proteicas
        • Fracción  globulinas
          • La fracción de las gammaglobulinas supone entre 10.3 y 20.8% del total de proteínas del suero. Se pueden detectar IgG, IgM, IgA, IgD e IgE
            • IgM aparece aumentada tras procesos agudos virales
            • IgA aumenta en enfermedades intestinales autoinmunes (Crohn)
            • IgG aumenta en enfermedades autoinmunes (lupus eritematoso, hepatitis crónica activa, infecciones bacterianas crónicas)
            • IgE está aumentada en enfermedades con un componente alérgico (eczema, asma, infección parasitaria)
    • PROTEINOGRAMA
      • Cuantificación de proteínas totales (Siempre deben acompañar al proteinograma)
        • Método colorimétrico (R-Biuret y Sulfato de cobre alcalino)-> 545 nm
          • Valores normales: 6-8 mg/dL
      • Cuantificación de Igs
        • Nefelometria (tb. Ferritina)
        • IDR (tb. Haptoglobina, ceruloplasmina)
    • PROTEINOGRAMA
      • Principales alteraciones
        • Hipoproteinemia : hipoalbuminemia
        • Deficiencias: α1 antitripsina, inmunoglobulinas, complemento
        • Paraproteinemia : presencia de proteínas anormales o en cantidad excesiva (reacción de fase aguda, mielomas, macroglobulinemia, linfomas B, etc.).
    • PROTEINOGRAMA
      • Principales alteraciones (Albúmina)
    • PROTEINOGRAMA
      • Principales alteraciones (Albúmina)
        • Hipoalbuminemia
          • Artefactual (por dilución):
            • Error en la toma (miembro infundido)
            • Excesiva administración parenteral de líquidos
          • Redistribución:
            • Posicional (de pie, vs. decúbito)
            • Aumento de la permeabilidad capilar (postoperatorio, shock)
            • Retención de líquido (edema)
          • Balance negativo:
            • Menor síntesis (enfermedad crónica hepática, malnutrición, síndromes de malaabsorción)
            • Mayor catabolismo (muchos procesos patológicos con balance negativo de N2)
            • Pérdidas (enfermedad renal, quemaduras extensas, epidermolisis, enteropatías)
    • PROTEINOGRAMA
      • Principales alteraciones (Albúmina)
      • Consecuencias de la hipoalbuminemia:
        • Edema:
          • Extravasación de líquido, edema
        • Transporte:
          • Muchos compuestos endógenos van unidos a albúmina (Ca2+, ácidos grasos)
          • Muchos fármacos se unen a albúmina. Puede aumentar la fracción libre de fármaco, y con ello un exceso de efecto farmacológico.
          • Desplazamiento de un fármaco por otro, y aumento de la concentración libre plasmática
    • PROTEINOGRAMA
      • Principales alteraciones (Deficiencias)
    • PROTEINOGRAMA
      • Principales alteraciones
    • PROTEINOGRAMA
      • Principales alteraciones (R. de fase aguda)
        • Cambios en la síntesis hepática de proteínas plasmáticas, como consecuencia de la regulación de genes inducida por citoquinas inflamatorias (IL-6, IL-1β, TNF-α)
        • Aumento muy importante (>5x): PCR
        • Aumento moderado (1-5x): α1 antitripsina, α1 glicoproteína ácida, ferritina, IgG, complemento C3/C4, ceruloplasmina, α1 antiquimiotripsina
        • Pocos cambios (1-2x): Fibrinógeno, Haptoglobina
        • Disminución: Albúmina, Transferrina
    • PROTEINOGRAMA
      • Principales alteraciones
    • PROTEINOGRAMA
      • Principales alteraciones (Fracción  -globulinas)
        • Las hipergamaglobulinemias policlonales se manifiestan en inflamaciones crónicas (hepatitis crónica, cirrosis) e infecciosas (brucelosis, lepra, endocarditis), y ciertas enfermedades autoinmunes (lupus).
        • Las hipogamaglobulinemias se presentan en el síndrome nefrótico, mieloma con proteinuria Bence-Jones, gran parte de las leucemias crónicas, síndrome de Cushing. Existen también agamaglobulinemias
        • Gamapatías de células B (Plasmacitomas, mieloma múltiple)
        • - Macroglobulinemia de Waldeström
    • PROTEINOGRAMA
      • Principales alteraciones (Fracción  - globulinas)
    • PROTEINOGRAMA
      • Inmunofijación
        • Permite el estudio de proteínas en sangre y orina, específicamente la identificación de componentes monoclonales u oligoclonales
        • Se investigan bandas anormales que aparecen en el perfil electroforético de proteínas de sueros u orinas, principalmente situadas en las fracciones  -globulinas y  -globulinas que son siempre sospechosas de ser proteínas monoclonales, y por lo tanto son un indicio de gammapatías monoclonales.
    • PROTEINOGRAMA
      • Inmunofijación
        • Es una electroforesis de proteínas seguida de una inmovilización de las mismas al enfrentarse a un antisuero específico (Anti-IgG, IgA, IgM, IgD, λ , κ ) formando un complejo insoluble que luego se revela por coloración.
        • Se realiza en cuatro etapas:
          • Separación de proteínas mediante electroforesis en gel de agarosa
          • Inmunofijación (inmunoprecipitación) de las proteínas separadas : los carriles de migración electroforética apropiados son recubiertos con los antisueros individuales, los cuales difunden dentro del gel y precipitan los antígenos correspondientes cuando están presentes. Las proteínas del carril de referencia son fijadas con una solución fijadora.
          • Las proteínas solubles no precipitadas se eliminan del gel mediante un blotting y un lavado. La precipitación del complejo antígeno-anticuerpo queda fijada en la matriz del gel
          • Los precipitados y las proteínas fijadas son visualizadas mediante tinción
    • PROTEINOGRAMA
      • Inmunofijación (Suero / Orina)
    • PROTEINOGRAMA
      • Inmunofijacion (Utilidades)
        • Identificación de proteínas monoclonales en enfermedades hematológicas (Mieloma Múltiple, Gammapatías Monoclonales de significado incierto, Macroglobulinemia de Waldenstrom, Amiloidosis primaria, Crioglobulinemia)
        • Polineuropatia crónica (identificación de proteínas oligoclonales o monoclonales)
        • Investigación y caracterización de la Proteina de Bence Jones (Cadenas ligeras en orina) <-> MM
    • PROTEINOGRAMA
      • Electroforesis de alta resolución (HRE)
        • La HRE usa como medio un gel de agarosa acoplada a alto voltaje y un soporte de enfriamiento.
        • Para obtener los patrones de HRE, las muestras son aplicadas en el gel, que a la vez es sometido a un campo eléctrico para permitir la migración de las proteínas, luego los geles son teñidos, secados y analizados.
    • PROTEINOGRAMA
      • Electroforesis de alta resolución (HRE)
    • PROTEINOGRAMA
      • Electroforesis de alta resolución (HRE)
        • Aplicaciones
          • La orina normal contiene muy poca cantidad de proteínas (sólo la albumina es visible) y requiere ser concentrada para su análisis
          • Las proteínas en orina se pueden aumentar en disfunción glomerular o tubular y en enfermedad de las cadenas ligeras, inflamación, etc.
    • PROTEINOGRAMA
      • Electroforesis de alta resolución (HRE)
        • Aplicaciones
          • La HRE en orina es frecuentemente usada para la búsqueda de bandas monoclonales o cadenas ligeras .
          • En la enfermedad de Cadenas ligeras las cantidades anormales de proteínas monoclonales son filtradas a través de los glomerulos. Estas proteínas son usualmente encontradas en la región Gama , pero también se pueden hallar en las zonas alfa o beta.
          • En la proteinuria glomerular selectiva el patrón urinario refleja la pérdida de selectividad encontrada en el glomérulo con excreción de albumina, alfa 1- antitripsina, alfa 1-glicoproteína ácida y transferrina.
          • En proteinuria tubular la capacidad de reabsorción de los túbulos de proteínas de bajo peso molecular esta comprometida. El patrón urinario generalmente muestra la presencia de pequeñas cantidades de albúmina, 2 bandas en la región alfa 2 (alfa 2- microglobulinas) y una banda en el medio de la región beta.
          • En proteinurias no selectivas el patrón urinario puede ser similar al sérico.
    • PROTEINOGRAMA
      • Electroforesis de alta resolución (HRE)
        • Aplicaciones
          • Enfermedad de las cadenas ligeras (Proteinuria BJ)
          • Proteinuria glomerular (Se filtran moléculas de alto Pm: alfa 2 macroglobulina y beta lipoproteina
    • PROTEINOGRAMA
      • Electroforesis capilar
        • La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las técnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnología distinta (sopote: capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire.
        •   La corriente electroendosmótica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del líquido que contrasta con el frente parabólico de la cromatografía líquida de alta resolución .
        • La ventaja de esta técnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de poliamina para darle mayor rigidez y resistencia, permite el paso de la luz UV de tal manera que la visualización es on-line.
        • Con esta técnica descripta es posible separar cationes, aniones, proteínas, macromoléculas y sustancias no cargadas en forma simultánea.
    • PROTEINOGRAMA
      • Electroforesis capilar
    • PROTEINOGRAMA
    • PROTEINOGRAMA
    • PROTEINOGRAMA
      • Inmunoglogulinas (LCR)
        • IgG < 40 mg/L
        • Otras Ig muy inferior
        • ↑ [Igs]:
          • Aumento Ig en suero
          • Alteración de la BHE
          • Aumento de síntesis local
        • Procendencia :
          • Razón de IgG y diversos índices
            • Permiten conocer si existe un ↑ss.Intratecal de las Ig.
            • IgG: presencia y actividad de LB locales (E. desmielinizantes).
            • IgM: aparición más precoz en la RI: diagnóstico y seguimiento de procesos infecciosos e inflamatorios del SNC.
            • IgA: ofrece poco valor clínico en enfermedades neurológicas.
    • PROTEINOGRAMA
      • LCR
        • La medición debe realizarse de manera inmediata después de la recepción de la muestra.
          • Si se emplea electroforesis convencional para el estudio cualitativo, el LCR debe concentrarse entre 50 y 100 veces (ultrafiltración) hasta C ≈25–40 g/L.
          • Conservación: hasta 3 días a 2 – 8 ºC
          • Obtención de muestras simultáneas de suero y LCR :
            • Investigar la presencia de bandas oligoclonales
            • Para calcular los distintos índices
    • PROTEINOGRAMA
      • LCR
        • Detección de bandas oligoclonales
          • Imprescindible para confirmar la síntesis intratecal de Ig que se producen en la EM (método separación proteica)
          • La EEF convencional del LCR concentrado: detección de b. oligoclonales.
          • Inmunofijación: confirmación de bandas oligoclonales e identificación de Ig.
        • Para confirmar la síntesis intratecal de Ig:
          • Estudio electroforético
          • Análisis cuantitativos de Ig :
            • específicos
            • calidad metrológica
    • PROTEINOGRAMA
      • LCR
        • Métodos de separación proteica
          • Finalidad: detección de bandas oligoclonales.
          • Procedimientos más utilizados para su fraccionamiento:
            • Electroforesis en acetato de celulosa o el gel de agarosa –seguida de inmunofijación en gel de poliacrilamida.
            • Isoelectroenfoque en gel de agarosa o en gel de poliacrilamida .
            • Electoctroforesis capilar
    • PROTEINOGRAMA
      • LCR (Electroforesis)
    • PROTEINOGRAMA
      • LCR (Inmunofijación)
        • Gammapatías monoclonales:
        • Un solo clon de células. de plasma produce elevados niveles de Ig de una sola clase o tipo:
          • Benignas
          • Malignas: mieloma múltiple, macroglobulinemia Waldeström
        • Gammapatías policlonales:
          • Debido a desórdenes clínicos (E. crónica del hígado, desórdenes de colágenos, artritis reumatoide e infecciones crónicas).
    • PROTEINOGRAMA
      • LCR (Utilidad)
        • Esclerosis múltiple :
          • El patrón de B. Oligoclonales en el LCR, es característico de cada paciente y permanece inalterable en el tiempo.
          • La concentración de Ig en el LCR, puede afectarse por efectos del tratamiento.
        • Pérdida de LCR en rinorreas u otorreas :
          • Demostrar presencia de transferrina-τ : m.separación proteica.
          • Procesamiento en paralelo del LCR y del suero del paciente.
        • Electroforesis bidimensional :
          • Péptidos (LCR) ≈ cuadros neuropsiquiátricos.
            • Etiología
            • Mejoran diagnóstico y seguimiento.
    • PROTEINOGRAMA
      • Limitaciones
        • Visualización “a ojo”
          • Bandas monoclonales débiles
          • Bandas monoclonales enmascaradas dentro de otra fracción distinta a la esperada (IgA)->  ,  2
          • Integración (densitometría): Revisar fracciones y picos de la curva
          • Inmunofijación: Determinar Igs -> Referencia para ajustar diluciones => ↑ Sensibilidad
    • PROTEINOGRAMA
      • Criterios de rechazo de muestras
        • Muestras hemolizada ( ↑zona-  por la Hb)
        • Muestras hiperlipémicas ( ↑zona-  por Lipoprot)