Take Home

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Recinto de Mayagüez
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Facultad de Artes y Ciencia
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Departamento de Biología
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1. Describa los tipos de secreción, indicando proteínas involucradas, mecanismo general, función y microorganismo que posee
el mismo. (20 pts).

Función: Translocar y exportar proteínas no plegadas
A. Sistema Sec “General Secretory Pathway”

Proteínas Involucradas:
SecB: chaperona SecYEG: complejo de protenias de unión (SecY, E y G),
SecA ATPasa: citoplasmática y receptor SecG: estimula el transporte
SecD, SecF y yajC: proteínas regulatorias

Mecanismo General:
N terminal de proteína es reconocida por SecB y se trasloca por
SecA en la forma plegada usando hidrólisis de ATP y el
gradiente de electrones. La translocación ocurre en el complejo
SecYEG que forma un canal conductor de proteínas.

Microorganismos que lo posee: Bacterias Gram -, Gram +, E. coli;
Archaea – Euryarcheota y Crenarcheota; Eukaryotes – Levaduras
(Saccharomyces cereviciae)

B. Tat “Twin arginine translocation pathway” Función: Transportan proteínas totalmente plegadas

TatA: Proteína membrana (formación del poro) TatB y TatC: reconocedoras

Mecanismo General:

Reconoce un motif en una secuencia de aminoácidos básica en la región N
terminal del cofactor que contiene la proteína y transloca la proteína en el estado
plegado utilizando solamente un gradiente de protones como fuente de energía.

Microorganismo que lo posee: Bacterias, mitocondrias y cloroplastos; E. coli

C. SSTI “Sistema de Secreción Tipo I” Función: Secreción de toxinas y exoenzimas (proteasas y lipasas)

ABC: transportador en membrana interna PF: proteína de fusión a la membrana interna
PME: forma canal en la membrana externa

Mecanismo General:

Sec-independiente. La secreción de la proteína se da en un solo paso desde
el citosol hasta el exterior de la célula. El sustrato se reconoce a través de
una secuencia señal en el extremo C terminal. Al ser reconocido forma un
complejo con la proteína PF, posteriormente una conexión con el poro de
salida PME utilizando un gradiente de protones como fuente de energía,
formando un canal que atraviesa el periplasma. Para la secreción del
sustrato utiliza hidrólisis de ATP.

Microorganismos que lo posee: Gama amplia de bacterias; bacterias Gram -
como E. coli

Función: Responsable de la secreción de toxinas y enzimas
D. SSTII “Sistema de Secreción Tipo II”
hidrolíticas.

GspD: secretina GspS: lipoproteína (actúa como chaperona)
GspBCFGHIJKLMNO: asociadas o parte a la membrana interna

Mecanismo General:
El sustrato con péptido líder es secretado al periplasma mediante el
sistema Sec. Luego es excretada a través de la membrana externa por un
secretón que consiste de proteínas localizadas en la membrana interna
externa. La GspD se inserta en la membrana externa y forma un anillo
para transportar los polipéptidos. La GspE, L y M regulan la hidrólisis
de ATP. Las proteínas GspG, H, I, J y K forman una estructura en
forma de pilis que empuja la proteína a través del poro.

Microorganismos que lo poseen: Bacterias Gram -,Klebsiella oxytoca,
Vibrio cholerae

Función: Traslocar factores de virulencia a la célula huésped,
E. SSTIII “Sistema de Secreción Tipo III”
biogénesis flagelar y relaciones sibioticas.
Sobre 20 proteínas forman los anillos, Proteínas citosólicas o periféricas a la membrana, ATPasa, Secretina forman un canal
en la ME, Chaperonas para ensamblaje del injectosoma y para translocacion de proteínas efectoras.

Es una via Sec-independiente. Las proteínas exportadas son
Mecanismo General:
translocadas a la célula huesped mediante un poro que cruza el periplasma.
Este poro consiste de una serie de anillos en la ME y MI. Para la secreción
se requiere la energía de la hidrólisis de ATP. Las proteínas que
conforman el poro o translocón, forman parte de los efectores que son
exportados por la bacteria.

Microorganismos que lo poseen: Sodalis glossinidius, Photorhabdus
luminescens Pantoea agglomerans. Patogenos de humanos, animales y
plantas como Bordetella, Chlamydia, Erwinia, E. coli, Pseudomonas,
Ralstonia, Rhizobium, Salmonella, Shigella, Xanthomonas y Yersinia.

Función: Transporta ADN y proteínas, toxina pertusis
F. SSTIV “Sistema de Secreción Tipo IV”

ATPasas forman canales y proveen energía. VirB6 atraviesa la MI, VirB2, VirB1

Mecanismo General:
Sec-independiente, Se asocian los componentes generadores de energía
en la MI y la maquinaria de secreción. Las estructuras en la superficie
celular inician el contacto con la célula hospeder, la vía de translocación
del sustrato es aún desconocida. La proteína VirB1 se encarga de lisar la
capa de mureína facilitando así el ensamblaje del complejo. Las
proteínas pueden ser secretadas al medio o transferidas mediante un pili
a la célula hospedera.
Microorganismos que lo poseen: Agrobacterium tumefaciencs (plásmido Ti
y proteínas en el huésped), Helicobacter pylori (inyecta CagA en células
epiteliales gástricas), Bordetella pertusis (toxina persusis), Legionella
neumophila, Brucella suis

G. SSTV “Sistema de Secreción Tipo V” Función: Transporte de proteínas, factores de virulencia

OMP, Tat Enzimas hydroliticas o toxinas que son autotransportadores que forman el poro
Helper protein que facilita la traslocacion a través de la membrana
Proteínas trimericas T5cSS dobles y Proteínas T5bSS doble una carga el dominio beta

Mecanismo General:
El péptido señal dirige el transporte del la proteína al citoplasma por el
sistema Sec, una vez ahí, la proteína a secretar inserta su dominio C-terminal en
la membrana externa formando un poro mediante el cual el dominio pasajero de
la proteína alcanza el espacio extracelular. Generalmente estas proteínas se cortan
asi mismas liberando el dominio pasajero al medio.

Microorganismos que lo poseen: E. coli, Haemophilus influenzae,Yersinia
enteroliticola, Bordetella Pertusis, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrheae,
Neisseria meningitides, Shigela flesneri, Serratia marcescen, Serratia marcescens,
Dickeya dadantii, Proteus mirabilis, Edwardsiellla tarda

Función: Introducir proteínas efectoras directamente al
H. SSTVI “Sistema de Secreción Tipo VI”
citoplasma por medio de un injectosoma.
Proteínas involucradas:
Chaperona citoplasmática con actividad de ATPasa
Proteína formadora de poro Proteínas efectoras

Mecanismo general:
Las proteínas son introducidas en el citoplasma de la célula huésped mediante un injectosoma.

Microorganismos que lo posee: Vibrio cholerae, Edwardsiella tarda, Pseudomonas aeruginosa, Francisella tularensis,
Burkholderia mallei, Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Xanthomonas oryz,. Mesorhizobium loti,
Rhizobium leguminosarum, Myxococcus xanthus, Dechloromonas aromatica y Rhodopirellula baltica.

I. Función: Transporte de proteínas
SSTVII “Sistema de Secreción Tipo VII”

Rv3877 es una proteina integral de la membrana
Proteínas que forman canal en la membrana ATPasas parecida a chaperona

Mecanismo General:
La proteína integral de la membrana forma un canal interno de translocacion por donde pasa la proteína. Un segundo cana
formado por proteínas aun desconocidas se localiza en la mycomembrana para el paso de la proteína. La ATPasa enlasa el
terminal C de los efectores.

Microorganismos que lo posee: Gram + y microbacterias, Mycobacterium, Corynebacterium diphtheria, Nocardia, Bacillus,
Clostridium spp, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae y Listeria monocytogenes

Función: Exportar proteasas, toxinas, adhesinas e invasinas
J. Autotransportadores

Mecanismo General:
Sec dependiente; Atraviesa la membrana interna mediante Sec. El dominio β del intermediario periplásmico adquiere la
conformación de barril-β y se inserta en la membrana externa para formar el poro. Por último se transloca el dominio pasajero a
la superficie celular donde puede permanecer unido o bien procesarse.

Microorganismo que lo posee: Neisseria gonorrhoeae

Referencias

Flores Herrera O, Riveros Rosas H, Sosa Peinado A, Vázquez Contreras E (eds). Mensaje Bioquímico, Vol XXVII. Depto
Bioquímica, Fac Medicina, Universidad
Nacional Autónoma de México. Cd Universitaria, México, DF, MÉXICO. (2003).

FACTORS INFLUENCING THE MORPHOLOGY OF BLASTOMYCES
DERMATITIDIS SEYMOUR LEVINE AD Z. JOHN ORDALl
Department of Bacteriology and Public Health, University of Illinois, College of Medicine, Chicago 15, Illinois. Received
for publication August 16, 1946

INFLUENCE OF OSMOTIC PRESSURE ON THE MORPHOLOGY OF THE REITER TREPONEME PAUL H.
HARDY, JR. AND E. ELLEN NELL
International Treponematosis Laboratory Center, Department of Microbiology, Johns Hopkins University School of
Medicine and School of Hygiene and Public Health. Baltimore, Maryland. Received for publication July 13, 1961

2. Diseñe dos experimentos, uno para probar que una proteína es translocada usando el sistema

Sec y otro a través de ABC. (10 pts).

Sistema Sec

Se debe localizar el gen que codifique para la proteína que se sospecha es translocada por el

sistema Sec. Luego se hace una fusión traduccional con un reportero que este activo en periplasma,

por ejemplo fosfatasa alcalina (Pho A).

Para comprobar que la proteína en cuestión es translocada por sistema Sec se debe mutagenizar al

menos uno de los componentes del sistema de forma que no se pueda llevar a cabo la translocación

de la proteína.

En E. coli, por ejemplo, se puede mutar sec A, que es un componente periferial de la translocasa.

Sec A tiene función de ATPasa y es la que recibe la pre-proteína y sufre el cambio en conformación

que resulta en el enlace de ATP. Este enlace de ATP es responsable de la translocación de parte de

la pre-proteína. La chaperona que se encarga de transportar la pre-proteína hasta el lugar en la

membrana donde ocurrirá la translocación se conoce como sec B [1].

Por lo tanto, si se muta sec A, el complejo de la translocasa va a estar incompleto y sec B no va a

poder transferir la pre-proteína de manera que pueda translocarse.

Después se hace un fraccionamiento celular y se verifica la actividad del reportero en los distintos

compartimientos. Para el mutante de E. coli con el complejo de la translocasa deficiente no se va a

observar señal en el periplasma porque la proteína no puede pasar a través de la membrana

citoplasmática.

Luego se le puede insertar a este mutante un vector con el gen que codifica para la ATPasa (sec A)

del complejo de translocasa en E. coli. Después de crecer estas bacterias y llevar a cabo el

fraccionamiento celular se va a observar actividad en el periplasma. Esto comprobaría que la

proteína de interés se transloca utilizando el sistema sec y que un solo componente que este mutado

ya es suficiente para incapacitar la translocación de la proteína.

Referencia:

[1] White, D. (2007). The Physiology and biochemestry of prokaryotes 3rd edition. In Chapter 17:

quot;Protein Transportquot; (pp. 438-4). New York: Oxford University Press.

Sistema ABC

Un experimento para determinar el transporte de proteínas a través del sistema ABC, sería validando

la función del mismo sistema. Se debe crear una mutación de deleción (para formar una pérdida o

impedimento de función) en el segmento del gen que codifica para el motif C del transportador. El

motif C es altamente conservado en el sistema ABC y sus función es llevar a cabo hidrólisis de ATP

(Hung LW). La mutación en este segmento de la proteina, impediría el transporte de proteínas

específicas para el sistema ABC hacia las membranas externas e internas del organismo.

Se utilizaría la proteasa alcalina, que es una proteína distintiva de la bacteria Pseudomonas

aeruginosa, para ser marcada con “green fluorescent protein” (GFP) y poder observar la

acumulación de la proteína no-transportable en la célula. El control para el experimento sería crecer

las bacterias sin la mutación de deleción en el segmento del gen que codifica el motif C. El transporte

no se veria afectado quedando totalmente funcional y permitiendo el paso de la proteasa alcalina

hacia el exterior de la célula.

Para verificar los resultados, se podría cotejar la presencia y ausencia de la proteasa alcalina en los

diferentes compartimientos a través de fragmentación celular por la fluorescencia de GFP.

Referencia:

[1] Crystal structure of the ATP-binding subunit of an ABC transporter. Hung LW, Wang IX, Nikaido K,

Liu PQ, Ames GF, Kim SH; Nature 1998;396:703-707

3. Se cree que el concepto de sistemas regulación por dos componentes puede ser involucrado en
procesos de control estructural y función. Mencione y describa cuatro ejemplos donde uno de ellos
sea la formación de porinas por cambios en osmolaridad. (20 pts)
Distintos organismos han desarrollado sistemas que ayudan en la transducción de señales y a
detectar factores ambientales. Algunos de los factores ambientales que influyen en las respuestas
adaptativas que puede generar una bacteria para sobrevivir en el ambiente son: los cambios en
temperatura, en el pH, la intensidad de luz, la concentración de nutrientes, la presencia de repelentes
y atrayentes, resistencia a antibióticos y cambios en osmolaridad [6]. Por tal razón el sistema
regulador de dos componentes permite que bacterias puedan adaptarse a distintas condiciones
ambientales [3]. Este sistema de regulación consiste de dos proteínas asociadas: una proteína
sensora (HPK) y una proteína reguladora de respuesta [1-7]. La proteína sensora se encuentra
localizada en la membrana y actúa como el receptor del estímulo ambiental. La proteína reguladora
de respuesta se encuentra en el citoplasma siendo la encargada de regular los cambios en la
expresión de genes. La señal fluye desde la proteína sensora hasta la proteína reguladora mediante
el proceso de fosfoliración involucrando residuos de histidina y aspartato. La proteína sensora tiene
la capacidad de autofosforilar un residuo de histidina para luego transferir el grupo fosfato a un
residuo de aspartato que se encuentra asociado a la proteína reguladora [2].
Existen varios ejemplos en que el sistema de regulación de dos componentes está
involucrado en procesos de control estructural y función. Uno de estos ejemplos es la formación de
porinas por cambios en osmolaridad mediante el sistema EnvZ/OmpR, el cual regula la expresión de
genes para la síntesis de porinas [7]. La bacteria Escherichia coli contiene las porinas OmpC y
OmpF en su membrana. El poro de la OmpC es pequeño, mientras que en la OmpF el poro es
grande.
En medios de alta osmolaridad se favorece un aumento en la proporción de la OmpC, lo cual
supone que sólo entren moléculas pequeñas e impidiendo la entrada de moléculas mayores en
tamaño, moléculas hidrofóbicas y cargadas negativamente [1]. Las condiciones ambientales de alta
osmolaridad son características de los fluidos dentro del cuerpo, como los del tracto digestivo. Por
tal razón, la OmpC en las enterobacterias colabora en la protección y retraso de la entrada de
substancias toxicas como las sales biliares que existen en el ecosistema intestinal. Fuera del cuerpo
hay un ambiente externo de baja osmolaridad y bajas concentraciones de toxinas y nutrientes.

Aumentando la proporción de OmpF, siendo más ventajoso ya que contiene el poro más grande
facilitando la entrada de nutrientes. [4,7]
La proporción de ambas porinas está regulada por un mecanismo genético que depende de la
presión osmótica del ambiente. El aumento en la osmolaridad es detectado por la proteína sensora
llamada EnvZ, la cual fosforila a la proteína reguladora de respuesta OmpR. La OmpR controla las
proporciones relativas de las porinas OmpC y OmpF en la membrana externa y en altos niveles de
OmpR-P (fosfatado) estimula la formación de la porina de poro más pequeño, haciendo que
predomine la OmpC. [6]
Otro ejemplo de sistemas de regulación por dos componentes es el de BaesSR, el cual
controla la expresión de los genes transportadores que confieren resistencia a antibióticos en
Escherichia. coli. Mediante el análisis del genoma de dicha bacteria se han encontrado 29 proteínas
sensoras, 32 proteínas reguladoras de repuesta y un Hpt dominio de proteína. Cada proteína
sensora en la bacteria E.coli es específica para los distintos estímulos ambientales que puede
enfrentar. En estudios realizados se encontró que el sistema de dos componentes BaeSR controla
la resistencia a antibióticos de E. coli al regular la expresión de genes transportadores de
antibióticos. La proteína reguladora de respuesta BaeR controla la expresión de los genes mdtABC y
acrD, los cuales codifican para múltiples sistemas de transporte de medicamentos (antibióticos). La
sobreproducción de la proteína BaeR en un trasfondo de deficiencia de los múltiples sistemas
transportadores AcrB de E. coli, le confiere resistencia a la bacteria contra lactámicos, novobiocina,
“sodium dodecyl sulfate” y sales biliares. [3]
Un tercer ejemplo que se puede mencionar es el de la bacteria Bacillus subtilis, en la cual se
han encontrado 36 proteínas sensoras y 35 reguladores de respuesta, de los cuales alrededor de 30
pares de proteínas sensoras-reguladoras se encuentran en el operon del genoma. Alrededor de 10
sistemas de regulación por dos componentes se han caracterizado en esta bacteria. El sistema
DesK/DesR está involucrado en “thermosensing” y transducción de señales de bajas temperaturas.
Existe otro sistema como el YycG/YycF, que se ha encontrado que es esencial para el crecimiento
bacteriano de B. subtilis. [2]
Un cuarto ejemplo que se puede mencionar es el de la bacteria Streptococcus pneumoniae
existe 13 sistemas de regulación por dos componentes y una proteína reguladora de respuesta. Uno
de los sistemas de regulación en esta bacteria es el sistema CiaR/CiaH, el cual pertenece a la familia
de EnvZ/OmpR. El sistema de neumococos de transducción de señales de dos componentes más
estudiado ha sido el sitema ComDE, el cual está envuelto en competencia genética en respuesta a
“competence-stimulating peptide”. Otro sistema que ha sido parcialmente caracterizado es el sistema
BlpR/BlpS (TCS13). Dicho sistema es activado por el péptido BlpC autoinducible y controla la
producción de bacteriocina. Ocho de los sistemas de regulación han demostrado ser importantes

para el crecimiento e infección en el tracto respiratorio del ratón, asumiendo que son importantes
para la patogénesis de S. pneumoniae. [6]

Referencias:

[1] Eleanore T. Wurtzel, Mei-Yin Chou, and Masayori Inouye. (1982). Osmoregulation of Gene Expression I.
DNA sequence of the ompR gene of the ompB operon of Escherichia coli and characterization of its
gene product. The Journal of Biological Chemistry, (pp. 13685-1369). Vol. 257. No. 22

[2] Kazuo Kobayashi, Mitsuo Ogura, Hirotake Yamaguchi, Ken-Ichi Yoshida, Naotake Ogasawara, Teruo
Tanaka and Yasutaro Fujita. (2001). Comprehensive DNA Microarray Analysis of Bacillus subtilis Two-
Component Regulatory Systems. Journal of Bacteriology, (pp. 7365–7370). Vol. 183, No. 24

[3] Kunihiko Nishino, Takeshi Honda, and Akihito Yamaguchi. (2005). Genome-Wide Analyses of
Escherichia coli Gene Expression Responsive to the BaeSR Two-Component Regulatory System.
Journal of Bacteriology, (pp.1763–1772). Vol. 187, No. 5

[4] Linda J. Kenney, Mark D. Bauers, and Thomas J. Silhavy. (1995). Phosphorylation-dependent
conformational changes in OmpR, an osmoregulatory DNA-binding protein of Escherichia coli. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, (pp. 8866-8870). Vol. 92

[5] Sally M. Hoffer, Hans V. Westerhoff, Klaas J. Hellingwerf, Pieter W. Postma, and Jan Tommasen. (2001).
Autoamplification of a Two-Component Regulatory System Results in “Learning” Behavior. Journal of
Bacteriology, (pp.4914–4917). Vol.183, No. 16

[6] Stuart J. McKessar and Regine Hakenbeck. (2007). The Two-Component Regulatory System TCS08 Is
Involved in Cellobiose Metabolism of Streptococcus pneumoniae R6. Journal of Bacteriology, (pp. 1342–
1350) Vol. 189, No. 4

[7] White, D. (2007). The Physiology and biochemestry of prokaryotes 3rd edition. In Chapter 18:
quot;Microbial Development and Physiological adaptationsquot; (pp. 492-494). New York: Oxford University Press.

4. Utilizando un diagrama de flujo, y desde el punto de vista quimiotáctico, presente
lo qué ocurriría fisiológicamente con una bacteria: (20 pts)
(1) si hay un atrayente y un repelente presentes, pero hay mayor concentración de
repelente.
La quimiotáxis es el mecanismo que la bacteria utiliza para dirigirse en el ambiente de
acuerdo a la presencia de atrayente o repelente. El o los flagelos de la bacteria pueden moverse
“contra reloj” (CCW) o a “favor de reloj”(CW). Si utiliza el primero veremos que el movimiento que va
presentar el organismo es el denominado movimiento dirigido o lineal, mientras que el segundo
genera el movimiento denominado “tumble” en el cual la bacteria se queda en un solo lugar. Este
último lo utiliza para detectar en qué dirección está el atrayente y poder reorientarse en dirección a él
para hacer nuevamente movimiento lineal. El siguiente diagrama muestra ambos movimientos:

Movimiento lineal Movimiento “Tumble”
o

El comp
portamiento que exhib
o ben las bac
cterias va a depender de la pres
r sencia de atrayente o
repe
elente que haya en el ambiente. En un me
. edio con at
trayente se va a supr
e rimir el mov
vimiento de
e
“tum
mble” y por lo tanto la bacteria es
stará un tie
empo más prolongado en movim
o miento dirigi o lineal
ido l.
En e
este proces estará deteniéndos algunas veces par realizar “tumble” y reorientars Por otra
so d se s ra se. a
parte en prese
encia de un repelente se detendr más vec para re
n rá ces ealizar “tumble” y estará periodos
s
brev en mov
ves vimiento line
eal.

http://emon
h net.biology.y
yale.edu/ag
gentcell/car
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En e
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sentación ve
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ovimiento q exhibe la bacteria desde me
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entración de
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ta or ración del mismo. E el caso de que haya una
En o a
conc
centración mayor de repelente q de atra
r que ayente la ba
acteria opta por ale
ara ejarse aun c
cuando hay
y
atray
yente. Esto se debe a que con cada epis
o sodio de “tu
umble” que haga la b
e bacteria, al haber más
s
repe
elente pres
sente, dete
ectara al m
mismo más veces de las que detecte at
s e trayente po estar en
or n
cant
tidades menores. Esto por lo tant la llevara a alejarse cada vez más.
o to a e
(2 en prese
2) encia de un atrayente si los MCP están m
n P’s mutados de tal maner que siempre están
e ra n
meti
ilados.:
La metilación de las MCPs que es realizada p CheR c
por constantem
mente, caus la neutra
sa alización de
e
carg en esta proteína lo que a su v reduce los efectos de repulsión electros
gas a o vez e s stática lo qu fuerza la
ue a
sepa
aración de terminales carbonilos Esto perm que se restablezc el complejo recepto activo de
s. mite e ca or e
Che
eA-CheW. A ocurrir es la acció de autof
Al sto ón fosforilación de CheA comienza. CheA-P e
n A entonces se
e
enca
arga de fos
sforilar a CheB y Che Esta ú
C eY. última actúa sobre el motor flagelar lo que promueve
a e e
mov
vimiento “CW y por lo tanto “tum
W”, o mble”. Por o parte c
otra cuando hay presencia de atrayen éste se
y a nte, e
enla a los receptores lo que causa un cambio en confor
aza o a o rmación y p lo tanto disminuye la actividad
por d
de a
autofosforila
ación de CheA. Con n
niveles bajo de CheA también disminuye CheY-P l que lleva
os A-P n lo a

a movimiento lineal o “sm
mooth swim
mming”. En el caso d que hay una mut
n de ya tación de lo MCPs y
os
esto se mante
os engan metilados, ento
onces la acc
ción de CheB-P que e demetila los MCPs no tendrá
es ar s, á
efec
cto sobre ellos. Com consec
mo cuencia la acción autofosforila
adora de C
CheA se mantendrá
á,
aum
mentarán los niveles de CheA-P y por lo ta
s d anto tambié de CheY lo que mantendrá la bacteria
én Y-P a
haci
iendo “tumble”, aun cuando est en prese
c té encia de at
trayente. E siguiente es un dia
El e agrama que
e
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canismo de las proteín Che.
e nas

“Tummble” – se re
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cuando los CheY se
Y
qued fosforilad y
dan dos
activ FLIM
van

5. Di
iagramáticam
mente repre
esente el mo
odelo de interacción entr las proteín
re nas
Af
fectadas y la involucrad en las siguientes sit
as das tuaciones: (2
20pts)

a. prese
encia de per
róxido de hid
drógeno en e medio de cultivo.
el

El peróxi de hidro
ido ogeno (H2O2 es un ag
2) gente oxidan que pued originarse en el met
nte de tabolismo de
e

muchas bacteria aeróbicas y anaeróbicas. En el c
as s caso de las bacterias a
aeróbicas y a
aeróbicas fa
acultativas e
el

H2O es a su v transform intracelularmente po medio de la enzima c
O2 vez ma or catalasa. El H2O2 inhibe o destruye
e e

las b
bacterias por medio de la inactivació de enzimas. (4) Este se descomp
r a ón pone fácilme
ente produciendo agua y

oxige
eno, pero d
dentro de la células e
as esta descom
mposición se debe por acción de l enzima c
e la catalasa que
e

neut
traliza la acc
ción de este químico. P
e Pero si la bacteria no p
produce esta enzima su mecanism de acción
a u mo n

cons
siste en la o
oxidación de los grupo sulfhidrilo y los dob
os o bles enlaces de los enz
s zimas de la bacterias
as s,

prov
vocando una modificació conforma
a ón acional de la proteínas que forman dichos enz
as n zimas, con la pérdida de
a e

su fu
unción, y po lo tanto, la muerte celular. (fig. #1 Lo más q afecta a la bacteria son los rad
or a 1) que a dicales libres
s

que se producen de la descomposición de H2O2, afectando la célula.
n

Uno de los ejemplos donde
observamos que la proteína
OxyR es activada luego de
recibir un estimulo al
exponerse a un ambiente
oxidativo es cuando los
factores de transcripción
redox de los procariotas se
unen al DNA, ya que esta
acción solo se realiza
cuando están baja
condiciones de estrés
oxidativo. Es demostrado
por OxyR la firmeza de la
Figura # 1
union refleja el tipo de
modificacion oxidativa de
las cisteínas reactivas (S-
OH, S-SG, S-NO).
(3)(Figura # 1)

Una de las proteínas que regula su expresión en presencia de H2O2 es OxyR en especial en
organismos gram (-). (Fig. #1) OxyR es un activador clase I, este se une a secuencia blanco de DNA
interactuando con el terminal carboxilo α de RNA polimerasa. Esta proteína es activada a través de oxidación,
que resulta en la formación de enlaces disulfuro entre cisteínas. (1) Su función varía dependiendo de los
organismo que la posea en N. gonorrhoeae OxyR es un regulador negativo, esta es distinta en E. coli y S.
typhimurium en donde OxyR es un regulador positivo de la expresión de catalasa y incrementa la sensitividad
de H2O2 en cepas mutantes de OxyR. Esta regula la expresión de la mayoría de las respuestas de H2O2 en
E. coli, incluyendo katG. Los genes que regulan OxyR están directamente e indirectamente relacionados con
las funciones de defensa contra el estrés oxidativo. La actividad del peróxido de hidrogeno es reversible ala de
OxyR en el proceso de la oxidación de los residuos de las dos cisteínas y la formación del doble enlace
desulfuró intermolecular. (2) Algunas de las enzimas que la expresión es regulada por OxyR esta katG, gorA,
grxA, ahp C y ahpF. (1)

(1) Albert G. Moat, John W. Foster and Michael P. Spector (2002) Microbial Physiology 4th edition. In
chapter 18: Microbial Stress Responses (pp. 592-595) New York, Wiley-Liss
(2) Kate L. Seib, Hsing-Ju Wu, Yogitha N. Srikhanta, Jennifer L. Edwards,Megan L. Falsetta, Amanda, J.
Hamilton, Tina L. Maguire, Sean M. Grimmond, Michael A. Apicella, Alastair G. McEwan and Michael
P. Jennings. 2007. Characterization of the OxyR regulon of Neisseria gonorrhoeae. J. Molecular
Microbiology. 63(1), 54–68
(3) G Filomeni, G Rotilio and M R Ciriolo (2005) Disulfide relays and phosphorylative cascades: partners in
redox-mediated signaling pathways. J. Cell Death & Differentation. 12, 1555–1563.
(4) Universidad Nacional de Colombia. 2004. Peróxido de hidrogeno. 7 de abril de 2009.
http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/agronomia/2001819/lecciones/cap06/cap06_02.html

b. Cambiar la temperatura de un microorganismo que de 37oC a 42oC.

Cada microorganismo posee condiciones y temperaturas específicas a las cuales su crecimiento y
condiciones internas se encuentran en un estado óptimo y constante. Alterar los mismos o exponerlos a algún

tipo de estrés, puede conllevar a cambios, los cuales podrían ser letales si no poseen los mecanismos
necesarios para su estabilización. El aumentar la temperatura de una bacteria con temperatura óptima de 37
a 42 podría provocar en la misma tanto cambios morfológicos como fisiológicos. Un ejemplo de esto es el
caso de la bacteria E. coli. El aumentar la temperatura de ésta a 42 induce a la producción de unas proteínas
llamadas Proteínas de cheque térmico (Hsp). Las proteínas de choque térmico son uno de los más
importantes factores de protección contra el estrés en todos los organismos (2). Estas proteínas aunque se
encuentran en bajas concentraciones en la célula normalmente, es en estrés térmico cuando su producción y
estabilidad aumenta. Algunas de las HSP son chaperonas no forman parte de la estructura primaria de la
proteína funcional, son moleculares las cuales unen y estabilizan las proteínas a fases intermedias de dobles,
montaje y translocacion a través de las membranas y la degradación (3). Estas proteínas participan en el
plegamiento de proteínas recién sintetizadas y protegen a las ya existentes de los procesos de
desnaturalización producidos por el incremento de la energía cinética de las distintas moléculas ante un
incremento de temperatura. (5) Los cambios de conformación tridimensional de las proteínas pueden estar
afectados por un conjunto de varias chaperonas que trabajan coordinados, dependiendo de su propia
estructura y de la disponibilidad de las chaperonas. Existen unas HSP específicas las cuales tienen un papel
importante en la regulación de apoptosis de la célula. Esto es posible ya que estas HSP interactúan
directamente con los componentes principales de la ruta apostólica.(3) Otras proteínas de choque térmico,
como la HSP70 y la gp96, están en estudio en vacunas para tratar el cáncer. (4) A mayor temperatura M.
xanthus induce la síntesis de un mayor número de proteínas en respuesta al cambio brusco de To. Finalmente
se establece que M. xanthus es capaz de crecer y proliferar a temperaturas elevadas de forma similar a otros
microorganismos, probablemente estas proteínas le permiten a este microorganismo sobrevivir en su
ambiente natural en donde la temperatura del suelo cambia conforme pasa el tiempo.(5) Otra de las funciones
de las HSP son que permiten el paso de proteínas de un compartimiento de la célula a otra y transportan
viejas proteínas a depósitos de basura dentro de la célula. Proteínas de choque térmico también se cree que
desempeñan un papel en la presentación de fragmentos de proteínas (péptidos o) sobre la superficie de la
célula para ayudar al sistema inmunitario reconoce las células enfermas. (6) No importa si el organismo se
mantiene expuesto a estas temperatura, la expresión de HSP ira disminuyendo hasta llegar a su nivel normal,
ya que solo durante el periodo inicial de estrés la síntesis de HSP está en su máximo nivel. (3)

Figura # 2, En esta se observa la función de las HSP la cual es ayudar en el doblamiento de las
proteínas, para adquirir su estructura funcional. La grafica nos muestra como el aumento de
temperatura beneficia la viabilidad de las células.

Referencias:

(1) D Lanneau , M Brunet , E Frisan , E Solary , M Fontenay , and C Garrido (2008) Heat shock proteins:
essential proteins for apoptosis regulation. J. Cell Mol Med
(2) Dr. Cronje MJ (2009) Cellular stress and Heat Shock Protein. University of Johannesburg.
(3) Dr. Landry (September, 1998) Protein Interactions and Molecular Chaperones. Tulane University
(4) Instituo nacional del cáncer. 2009. Proteína de choque térmico. 6 de abril de 2009.
http://www.cancer.gov/Templates/db_alpha.aspx?CdrID=617664&lang=spanish
(5) Mosser, D.D., Caron, A. W., Bourget, L., Meriin, A.B., Sherman, M. Y., Morimoto, R.I., and Massie, B.
(2000). The Chaperone funtion of Hsp 70 is required for protection against stress - induced apoptosis.
Mol. Cell. Biol. 20, 7146-7159.
(6) Antigenics. 2008. Proteínas de choque térmico: fundamentos. 7 de abril de 2009.
http://translate.google.es/translate?hl=es&langpair=en|es&u=http://www.antigenics.com/products/tech/h
sp/&prev=/translate_s%3Fhl%3Des%26q%3Dproteinas%2BHsp%26tq%3Dprotein%2BHSP%26sl%3D
es%26tl%3Den
(7) Assay Design. 2009. Proteins. 8 de abril de 2009.
http://images.google.es/imgres?imgurl=http://www.assaydesigns.com/corp/images/hsp70-
pathway.jpg&imgrefurl=http://www.assaydesigns.com/cccrp1073-1015-proteins-
proteins.htm&usg=__k0HjdkmnqSg4HvJlwLXQdDRRUkk=&h=800&w=800&sz=122&hl=es&start=29&u
m=1&tbnid=2Y-
CG0vBfW1sOM:&tbnh=143&tbnw=143&prev=/images%3Fq%3DHSP%26ndsp%3D18%26hl%3Des%2
6rlz%3D1B3GGGL_esPR238PR238%26sa%3DN%26start%3D18%26um%3D1
(8) Albert G. Moat, John W. Foster and Michael P. Spector (2002) Microbial Physiology 4th edition. In
chapter 18: Microbial Stress Responses (pp. 596-601) New York, Wiley-Liss
(9) A Parcellier , S Gurbuxani , E Schmitt , E Solary , and C Garrido (2003)Heat shock proteins, cellular
chaperones that modulate mitochondrial cell death pathways .Biochem Biophys.304: 505-12.
(10) J. Starmer, A. Stomp, M. Vouk and D. Bitzer (2005) Predicting Fidelity of Protein Synthesis in E.
coli.

6. En la replicación microbiana las proteínas Fts y Mreb juegan un papel protagónico. Presente un

modelo secuencial de participación de estas proteínas en el proceso de replicación y las

consecuencias de haber mutaciones en las mismas que eviten su expresión y actividad. (10 pts).

En E. coli las proteínas del citoplasma MreB y FtsZ juegan un papel importante en asegurar

que la nueva subunidad de peptidoglucano se inserte en la pared celular en la ubicación correcta

durante la elongación y la división celular. En particular, para mantener un diámetro constante y una

figura definida, en adición para que se inserte nuevo material (peptidoglucano) dentro de la pared

uniformemente alrededor del perímetro de la célula. La función de la proteína Fts es intervenir en la

división de las bacterias, si este se muta las bacterias no se pueden dividir y todas las copias de las

células se quedan unidas a la célula madre formando una célula alargada. En cambio la proteína

Mreb interviene en la forma que asume la bacteria, si este está activo la bacteria es alargada

(bacilo), pero si esta mutada la bacteria es redonda (coco). Esto se ha comprobado

experimentalmente ya se ha inhibido la proteína MreB con antibióticos (A22) y esto no ha afectado la

inserción de una nueva pared, en cambio la célula pierde su forma alargada y se torna en una

redonda. Esto sustenta que la forma de la célula es determinada solo por la presencia o la ausencia

de MreB y no por la regulación de la distribución del nuevo material de la pared celular donde está

involucrado FtsZ. Una forma simple de visualizar como esto ocurre en células en forma de bacilo, es

cuando la pared es creada por dos procesos alternados. En el primer proceso, se inserta nuevas

moléculas de peptidoglucano al lado de la pared permitiendo que la célula se alargue y de esta forma

crear un espacio en donde el material citoplasmático es segregado. En la segunda etapa la síntesis

del peptidoglucano (PG) es completada, luego comienza a invaginarse la pared en el centro

formando unos anillos para dividir la célula en dos y a la misma vez completar el proceso de

segregación del citoplasma. En la bacteria E.coli el proceso de elongación de la célula es controlada

por la proteína MreB, se cree que su función es para localizar los componentes de la maquinaria de

la síntesis de peptidoglucano a lo largo de la pared celular, controlando la geometría del crecimiento

de la pared. La división celular es iniciada cuando el homologo de la proteína tubulina (FtsZ) es

condensado en el interior de la membrana en el centro de la célula y esto desencadena la

invaginación por la atracción de un par de proteínas que forman el septo del anillo. Así, MreB se

encarga de la inserción del PG en la pared y Ftsz se encarga del desarrollo del septo de la pared.

Las proteínas MreB y FtsZ están localizadas en al lado del citoplasma de la membrana interior,

mientras que la síntesis de PG está localizada en el periplasma. Estas proteínas nunca entran en

contacto con el periplasma, están interactúan con la síntesis de PG indirectamente a través de unas

proteínas transmembranales. (1)

En este dibujo se observa el efecto en la
morfología de las bacterias al inhibir
alguna de las proteínas que interactúan en
la división celular. (A) y (F) Inhibición de
MreB y FtsZ (B) y (E) inhibición de FtsZ
con SulA por pFAD38 (C) y (D) inhibición
de MreB con el antibiótico A22. (2)

(3)

(4)

Referencias

( Archana Varma and Kevin D. Young (abril, 2009) In Escherich coli, Mre and FtsZ direct the
a n eB Z
hia
(1)
synthesi of lateral cell wall via independ
is dent pathwa that req
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10.11288
( Archana Varma, Miguel A. de Pedro,† an Kevin D. Young. (2
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(2)
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( Martin T Thanbichler & Lucy Shapiro. (200 Getting organized — how bac
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(3)
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( Ramón Muñoz-Chá ápuli. (2001 ¿Existe u citosque
1) un eleto en pro
ocariotas?
(4)
uentros en la Biología 7 73:5-7
J. Encu l

7. Usando el pr
rograma Tm mpRed, sug giera la loca
alización y topología d la siguiente proteína.
de
Aseggúrese de i
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ráfica de hid
drofobicidad (10 pts)
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aa (i) a (t) # aa
aa score d dirección
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7 17 1176 o o-i
2 90 108
1 19 2473 i-o
3 157 174
1 18 1743 o o-i
4 214 233
2 20 2094 i-o
5 237 258
2 22 1557 o o-i
6 276 293
2 18 941 i-o
7 303 322
3 20 2413 o o-i
8 344 361
3 18 981 i-o
9 388 406
4 19 1213 o o-i
10 421 440
4 20 1743 i-o
11 493 511
5 19 2652 o o-i
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nferir según
n
los resultados obtenidos que la p
s proteína es una tr
ransmembra
anal multip
paso en β
β-lámina. A

continuación expondremos algunas de las características que tiene estas proteinas, las cuales
rectifican nuestros resultados.
La hoja plegada β o β-lámina es un tipo de estructura secundaria que pueden adoptar
distintas proteínas integrales de la membrana. Muchas de las proteínas con estructuras de β-lámina
pueden ser expresadas en forma de agregado o cuerpos de inclusión y re arregladas en su
conformación original. Estas proteínas transmembranales pueden atravesar la bicapa múltiples
veces utilizando un mínimo de 10 amino ácidos (aa). Algunos de los organismos que posee este tipo
de proteínas son los cloroplastos, mitocondrias y las bacterias. (3) Muchas de las proteínas β-
láminas, se presentan en la naturaleza como OMP’s. (1) La única localización conocida para las β-
láminas en bacterias es en la membrana externa de las Gram negativas. (2) Las proteínas β-láminas
muestran una variedad de funciones, incluyendo el transporte pasivo de iones y pequeñas moléculas
hidrofílicas, la exportación de “xenobiotics”, la importación de “siderophore-bound iron” y también
tiene un rol en la patogenicidad bacteriana. De estas funciones, dos son de partículas importancias al
momento de predecir la topología de la β-lámina: se establece que el N- y C- terminal se encuentran
localizados en el espacio periplásmico del final de la β-lámina, limitando el número de hebras a solo
valores pares. De igual forma se establece que las conexiones de la parte externa de la β-strand son
loops largos y las de la hebra del espacio periplasmico son cortas. (3)

Referencias
(1) Ioannis K. Valavanis Pantelis G. Bagos Ioannis Z. Emiris (2006) β-Barrel transmembrane
proteins: Geometric modelling, detection of transmembrane region, and structural properties
Source. J. Elsevier Science Publishers B. V. 30, 416-424
(2) Georg E Schulz (2000) β-Barrel membrane proteins. J. Science Direct. 10(4):443-7.
(3) Paul D Taylor,1 Christopher P Toseland,2 Teresa K Attwood,3 and Darren R Flower (2006)
Beta barrel trans-membrane proteins: Enhanced prediction using a Bayesian approach. J.
PubMed Central. 1(6): 231–233.
(4) Pantelis G. Bagos*, Theodore D. Liakopoulos, Ioannis C. Spyropoulos and Stavros J.
Hamodrakas (2004) PRED-TMBB: a web server for predicting the topology of b-barrel outer
membrane proteins. J. Nucleic Acids Research, Vol. 32.

Bono: Describa los factores involucrados en la morfología microbiana (10pts)

La temperatura es un factor que afecta el crecimiento microbiano.

Las formas de un microorganismo (micelio, levadura) poseen una temperatura máxima para la
cual el crecimiento más rápido.

Un organismo como Blastomyces dermatitidis crece en forma mycelial dede temperatura
ambiente hasta 33°C. De 35°C a 37°C crece en forma de levadura.
Treponemes expuestos a temperaturas sobre 40°C forman esferas.
Al bajar la temperatura algunas bacterias tienden a reducir su tamaño ya que a menor
tamaño, mayor velocidad y eficiencia en el intercambio de nutrientes.

El pH también afecta el crecimiento microbiano.

La formación de micelio aéreo en Blastomyces dermatitidis es restringida a pH de 4.5 o
menos.
La combinación de los factores de temperatura y pH tiene diferentes efectos en el crecimiento
microbiano.
A temperatura ambiente y una variación en pH Blastomyces dermatitidis restringe la formación
de micelio mientras mas alto sea el pH.
Al aumentar la temperatura a 33°C se restringe la formación de micelio a cualquier
concentración de pH.

Los nutrientes disponibles también afectan la morfología microbiana.

En un medio deficiente para el crecimiento de Blastomyces dermatitidis, la levadura y el
micelio serán diferentes.
Spiroplasma citri crece en forma redonda en ausencia de un surem PPLO, cambiando su
forma espiral, helicoidal y filamentosa.
Reiter treponemes mantiene su forma espiral al ser suspendido en solución de NaCl
fisiológico mientras que en agua destilada adquiere un forma esférica, este cambio en
morfología esta determinado por la presión osmótica.
Un cambio en la concentración de lípidos debido a la presencia o ausencia de lípidos en el
medio puede afectar la morfología microbiana. Mycoplasma mycoides produce filamentos
cortos en un medio sin colesterol mientras que en un medio con colesterol los filamentos
producidos por este microorganismo son largos.
Deficiencias de colesterol, Glicerol y ácidos grasos de cadenas largas produce formas muy
frágiles en M. mycoides.

La luz es un factor que afecta la producción de pigmento.

En Platypoecilus masculatus la coloración a la luz del sol, luz incandescente y ultravioleta
varía dependiendo del tiempo de exposición.

La temperatura afecta la pigmentación de los organismos.

En Platypoecilus masculatus no produce pigmentación a 4°C mientras que al transferir el
cultivo a 37°C se desarrolla el mismo nivel de pigmentación que el del organismo cultivado a
37°C.

La concentración de Oxigeno también afecta la formación de pigmento.

En Platypoecilus masculatus a condiciones anaerobias no hay formación de pigmento
mientras que a condiciones aerobias se produce la pigmentación usual.

La concentración de nutrientes también afecta la formación de pigmento.
El Pigmento en S. aureus es mayor en medios ricos de agar sangre que las que crecen en
medios de agar coagulado de Loeffler.

Referencias
(5) Albert G. Moat, John W. Foster and Michael P. Spector (2002) Microbial Physiology 4th edition.
New York, Wiley-Liss
(6) Effect of External Environmental Factors on the Morphologyof Spiroplasma citri R. PATEL,* K.
J. MAYBERRY-CARSON, AND P. F. SMITH Department ofMicrobiology, University of South
Dakota, Vernillion, South Dakota 5706. Received for publication 20 October 1977

.

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