1. The multiple roles of CRP at the complex acs promoter depend on activation region 2 and IHF Bianca Sclavi et al. Molecular Microbiology , 65 , 425–440

2. 1: Was/Wofür ist das acs -Gen? acs steht für Acetyl-CoA-Synthetase. Acetyl-CoA-Synthetase kommt in allen Organismen vor. Hier wurde E. coli untersucht. Acetyl-CoA-Synthetase ist eine Ligase, die die Synthese von Acetyl-CoA aus Acetat und Coenzym A katalysiert. Acetat kann somit als Kohlenstoffquelle genutzt werden und im Citratzyklus oder in der Biosynthese verwendet werden. Wird benötigt, wenn Kohlenstoffmangel herrscht, da andere C-Quellen zur Neige gehen.

3. 3: acs auf der DNA P1, P2 & P2A sind Promotoren P2 ist der bedeutendste von ihnen IHF = Integration Host Factor acs hat 3 Bindestellen für IHF CRP = cAMP Receptor Protein acs hat 2 Bindestellen für CRP

4. 4: Was macht IHF & CRP? IHF ist ein Nucleoid-Protein. Das bedeutet, es verändert die Form der DNA, Bsp. bei der Kondensation zu Chromatin. CRP bindet an cAMP, wodurch dieser CRP-cAMP-Komplex an die DNA binden kann. Anschließend kann die RNA-Polymerase rekrutiert werden.

5. 3: acs auf der DNA P1, P2 & P2A sind Promotoren P2 ist der bedeutendste von ihnen IHF = Integration Host Factor acs hat 3 Bindestellen für IHF CRP = cAMP Receptor Protein acs hat 2 Bindestellen für CRP

6. 3a: Klassen von Promotoren Klasse 1 Promotor: - Transkriptionsfaktor (hier: CRP) bindet bei Position -60 oder höher - Kontakt zwischen Transkriptionsfaktor & α-CTD Klasse 2 Promotor: - Transkriptionsfaktor überlappt mit der -35 Region - Kontakt zwischenTranskriptions- faktor & α-NTD, σ-Untereinheit und manchmal α-CTD Klasse 3 Promotor: - Klasse 1/Klasse 1 oder Klasse 1/Klasse 2 Verknüpfung

7. 5: Bisherige Bewertung der verschiedenen Domänen von acs Ist sowohl die IHF III- und die CRP II-Stelle besetzt, stoppt die Transkription, da diese Kontakte die RNA-Polymerase fest binden. CRP I muss besetzt sein, damit der Promotor P2 genutzt werden kann. Um die höchste Transkriptionsrate zu erreichen, muss auch CRP II besetzt sein. IHF I und IHF II wirken dieser Überstabilisierung entgegen.

8. 5a: Verwendete DNA-Bruchstücke & Mutanten

9. 6: Beitrag von IHF bei der Transkription

10. 7: Beitrag von CRP bei der Transkription

11. 8: Aktive Regionen von CRP Varianten: 1+ 2+ 3° = WT 1+ 2- 3° 1+ 2+ 3+ 1+ 2- 3+ 1- 2+ 3° 1- 2- 3° 1- 2+ 3+ 1- 2- 3+ AR1 & AR2 sind natürlich AR3 ist künstlich

12. 9: Auswirkungen dieser Mutanten auf die Transkriptionsrate mutierte AR1-Region: keine Promotoraktivität, unabhängig von den weiteren Mutationen

13. Footprinting Assay 1. DNA-Ende markieren 2. Protein zugeben 3. Partialverdau der DNA 4. Protein entfernen 5. Gelelektrophorese - Footprints (Lücken): von Protein geschützte Bereiche - Hypersensitive Sites (Banden): von Protein freigelegte Bereiche

14. 10: Charakterisierung der Proteinbindung durch DNase I Footprinting Assay

15. 11: Vorstellung von Potassium (= Kaliumpermanganat) Footprinting Analysis - DNA & Proteine inkubieren - KMnO4 zugeben - Proteine & KMnO4 entfernen - Primer Extension - Gelelektrophorese Banden: Einzelsträngiger Bereich der DNA

16. 12: Charakterisierung der Proteinbindung mit Kaliumpermanganat-Footprinting Analysis

21. Zusammenfassende Gedanken zum acs-Promotor - Regulierung durch Protein-DNA Interaktionen & durch Protein-Protein Interaktionen ==>diverse Signale können miteinbezogen werden - CRP, IHF & FIS stellen die wichtigsten Regulatoren dar - TOC (transcription open complex) wird de-/über-/stabilisiert - Aktivierung wenn C-Quellen aufgebraucht, um acetate & coA zu Acetyl-CoA zu katalysieren und dieses im Citratzyklus verwerten zu können - DNA-Kondensation führt zur inhibition der TOCs und somit von - DNA-Kondensation führt zur inhibition der TOCs und somit von Acetyl-CoA synthetase