1. Tema VI
Fotometria d’emissió

2. Continguts
• Introducció a la fotometria d'emissió
• Descripció d'un fotòmetre de flama
• Interferències
• Exemple: determinació de la litèmia
• Fluorimetria i quimioluminescència. Espectre d'excitació
• Relació entre la intensitat fluorescent i la concentració
• Corba de calibratge
• Descripció d'un fluorímetre
• Immunoassaig per luminescència

3. Objectius específics
• Realitzar determinacions analítiques mitjançant
espectroscòpia d'emissió de flama i de fluorescència
• Identificar les diferències entre absorció i emissió
• Descriure les parts d'un fotòmetre de flama
• Distingir els factors que intervenen en la producció
d'interferències
• Descriure el funcionament i les diferències existents
entre fluorimetria i quimioluminescència i les seves
aplicacions en el camp de la bioquímica.

4. Introducció
http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/pertab/pertab.html#c1

5. Introducció
Font energètica
↓
Àtom ==== electrons “canvi d’orbital”

6. E=h·ν
h = constant de Planck
ν = freqüència radiació
emesa o λ

7. Fotometria d’emisió
# maneres d’excitar els àtoms
# mètodes de processar la radiació emesa
 Fotometria de flama: Na+
, K+
i Li+
 Fluorimetria: fluorescència
(quimio)..
LAB

8. Fotometria de flama
• Es basa en el fenomen de l’emissió de llum
• Quan un àtom en estat fonamental és sotmès a
l’energia calorífica d’una flama, els seus
electrons s’exciten, passant a nivells superiors
d’energia. En aquest estat excitat són
inestables, i al tornar al seu estat inicial
desprenen l’energia en forma de llum.
• Llum de diferents colors (# λ): Liti (vermell,
670nm), Sodi (groc, 589nm) i Potassi (violeta,
775nm)

9. • La intensitat lluminosa de la λ és
directament proporcional a la quantitat
d’àtoms que emeten energia i per tant a la
concentració de l’ió en la mostra (excepte
mostres molt diluïdes o molt concentrades)
• En una solució d’un ió, només es troben
excitats en la flama entre l’1 i el 5%
• La tècnica presenta molta sensibilitat per a la
determinació dels metalls alcalins (liti, sodi i
potassi)
• Altres metalls(calci, magnesi,..) no són excitats
tan fàcilment…

10. Instrumental (descripció)
Parts fonamentals:
1.Cremador
2.Atomitzador
3.Flama
4.Reguladors de pressió i flux dels gasos
5.Sistema òptic
6.Detector
7.Sistema de registre

11. Gasos:
1.En general s’utilitza gas natural, acetilè o
propà amb aire o oxigen.
2.L’elecció de la flama (gasos) depèn de la
temperatura que desitgem. Per a
determinacions de sodi i potassi és
suficient el propà-aire
3.És essencial que la temperatura de la
flama es mantingui constant, per a això hi
ha uns reguladors que mantenen el flux
del gas constant

12. Atomitzador:
• Té com a funció disgregar la solució
problema en petites gotes, per a que els
àtoms absorbeixin l’energia tèrmica de la
flama i s’excitin.
• La solució entra a gran velocitat i xoca
amb les parets d’una cambra, disgregant-
se en fines gotes.

13. Flama:
• La variable més important de la flama és la seva
temperatura (estandardització) ja que el canvis
tèrmics afecten a la resposta de l’instrument
• És pràctica comú l’existència d’un període
d’escalfament, i l’aspiració d’aigua i solucions
estàndard abans de les mesures, fins que
s’estableix l’equilibri tèrmic en la flama i en la
cambra d’atomització. A més a més,
s’introdueixen comprovacions amb estàndards
de valor conegut entre les determinacions.

14. Altres components fotomètrics:
• Les reixetes, monocromadors i detectors
tenen la mateixa funció que en
l’espectrofotometria d’absorció.
• Els monocromadors seran d’alta qualitat i
gran sensibilitat i evitaran la interferència
de totes les emissions produïdes en la
flama per elements no iònics
• Els detectors més utilitzats i amb millors
resultats són els fototubs

15. Tipus de fotòmetres de flama
Dos tipus:
- Directes: intensitat de llum= [ ]
- Amb estàndard intern: la intensitat de
l’emissió de l’element a determinar es
compara amb la d’un element agregat
com estàndard intern

16. Fotòmetres de flama amb
estàndard intern (FFEI)
• Tots els fotòmetres de flama utilitzats en
clínica són d’aquest tipus
• Utilitzem com estàndard intern liti o cesi
• El liti per a determinacions de sodi i
potassi
• El cesi per a determinar sodi, potassi i liti

17. FFEI
• Característiques de l’estàndard intern:
- que estigui absent dels líquids biològics
a mesurar
- que emeti a λ suficientment llunyanes dels
elements a mesurar, per a no interferir

18. Altres consideracions
• Les característiques de la flama són elements
reproduïbles en cada determinació
• La majoria del processos químics són reaccions
d’oxidació
• Les reaccions en la flama poden alterar el nivell
d’emissió dels elements que es troben en ella
• La velocitat fins arribar a l’equilibri de les
reaccions és molt important (difusió del gasos)

19. • Les característiques hidrodinàmiques dels
gasos(velocitat, pressió, flux ..) afecten a
la flama
• Un flux laminar(ordenat, estratificat, suau,
de manera que el fluid es mou en làmines
paral·leles sense entremesclar ) o un flux
turbulenten (forma caòtica, en què les
partícules es mouen desordenadament i
les trajectòries de les partícules es troben
formant petits remolins aperiòdics)
condueix a resultats diferents

20. • Un flux serà laminar o turbulent depenent
del nombre de Reynolds
R = V·D /ηk ηk = η / δ
R = nombre de Reynolds
V = velocitat mitjana de la flama
D = diàmetre del tub
ηk = viscositat cinemàtica del gas
η = viscositat (viscositat dinàmica)
δ = densitat
R = V·D /ηk ηk = η / δ
Si R < 2300 .......Flux Laminar
Si R > 2300....... Flux Turbulent

21. Interferències(I)
• Interferències de radiació: degudes a
elements productors de radiacions amb λ molt
similar a la de l’analit. Les evitarem amb
monocromadors de banda estreta.
• Interferències d’excitació: per transferència
d’energia d’altres àtoms excitats a l’àtom que
mesurem. És freqüent l’excitació del sodi transferida
al potassi. Les evitem afegint una concentració
elevada d’un metall que no es trobi en la mostra,
com el liti o el cesi, per a que absorbeixi la radiació

22. Interferències(II)
• Interferència de fons: presència d’altres
components iònics (proteïnes, lípids i
carbohidrats) --- la minimitzem fent altes
dilucions de la mostra.
• Interferències químiques: per compostos de
calci aïllats (fosfat càlcic) que impedeixen que
els àtoms de calci s’excitin ---- les minimitzem
afegint lantà que reaccionarà amb el fosfat i
deixarà lliures els àtoms de calci.

23. Litèmia(I)
• La fotometria de flama és la millor tècnica:
baix cost, alta especificitat i gran
reproductibilitat.
• Element psicoactiu, utilitzat en patologia
humana des de l’any 1970 en forma de
carbonat de liti per al tractament de la
PMD (nivell terapèutic entre 0,7 i 1,4
mmol/L)

24. Litèmia (II)
• Efectes indesitjables entre l’1.4 i 2
mmol/L: irritació gastrointestinal,
tremolors, debilitat muscular i poliúria.
• La seva toxicitat (nivells > 2 mmol/L)
ocasiona fracàs renal, convulsions, coma,
HTA, col·lapse cardiovascular i mort
• Monitorització dels malalts

25. Exercici
Determinar si el flux de la flama d’un
fotòmetre, amb les següents característiques, és
de tipus laminar o de tipus turbulent:
Velocitat mitjana de la flama 120 mm/s ; radi
del tub 1955 µm ; viscositat dinàmica del
combustible (gas natural) 7 mil·lipascals per
segon; densitat del gas natural 2566 grams per
dm3
.

26. η = viscositat dinàmica.............. pascals x
segons
ηk = viscositat cinemàtica
δ = densitat .................................. Kg/m3
v = velocitat .................................. m/s
D = diàmetre .................................. m
R = v . D / ηk
η / δ = ηk

27. Fluorimetria
Tècnica de laboratori que calcula la
intensitat i el tipus de radiació
fluorescent que emet una substància al
exposar-se a una radiació incident d’una
determinada λ
Determina la classe i la concentració de la
substància
És una tècnica qualitativa i quantitativa

28.  El fenomen de fluorescència es troba dins dels
fenòmens anomenats de luminescència, que
inclouen, a més a més d’aquest, la fosforescència i la
quimioluminescència
 Tots ells són resultants de la interacció de la llum
amb la matèria, que finalitza amb l’emissió d’energia
radiant
 La fluorescència es produeix quan una molècula
absorbeix llum d’una determinada λ (energia) i emet
llum d’una λ superior (menor energia)

29.  Quan una molècula és excitada per un feix de
llum d’una intensitat i energia determinada,
absorbeix energia i es produeix el pas dels seus
electrons d’un estat basal a un estat excitat,
alliberant aquesta energia en forma de llum,
resultant en una emissió fluorescent o
fluorescència
 La llum emesa en aquest fenomen té sempre
menor energia que el feix de llum d’excitació
(incident), per això la llum fluorescent emesa és
de λ major que la de la radiació absorbida o d’excita-
ció

30. El fenomen de la fluorescència és més
lent que el fenomen d’absorció
Entre l’absorció d’energia i l’alliberació en
forma de llum fluorescent es produeix un
retard comprès entre 10-8
i 10-4
segons
(l’absorció es produeix en 10-15
segons)
La llum fluorescent s’utilitza per a
quantificar la quantitat de compost
fluorescent que l’emet

31. La relació entre la concentració i la
intensitat d’emissió fluorescent es dedueix
a partir de la Llei de Beer:
It / I0 = e-ε·b·c
It = Intensitat transmesa
I0 = Intensitat incident (excitadora)
ε = Coeficient d’extinció molar
b = Camí òptic (pas de llum)
c = Concentració

32. S’anomena rendiment quàntic de la
fluorescència (φ, lletra fi grega) a la
relació entre els fotons emesos (It) i els
absorbits , i varia des de cero,
substàncies no fluorescents, fins quasi un
100% (fluorescència òptima)

33.  La fluorescència és una tècnica analítica quantitativa
 La intensitat de la radiació fluorescent, F, és
proporcional a la intensitat del feix d’excitació que és
absorbit per el sistema, i al rendiment quàntic
 Relacionant la Llei de Beer:
 Si treballem amb solucions diluïdes, de manera que
aconseguim que no s’absorbeixi més del 2% de la
radiació incident, l’expressió es converteix en:
 I la intensitat de la radiació fluorescent serà proporcional
a la concentració de substància en solució.
F = φ (I0 – It)
F = φ · I0 (1 – e-εbc
)
F = K · c

34. La fluorimetria combina la simplicitat de la
fotometria amb l’alta sensibilitat i
especificitat del fenomen fluorescent
Sempre es realitza una corba de
calibratge

35. Al augmentar la concentració, augmenta
la intensitat de la llum fluorescent fins
arribar a un valor per sobre del qual la
recta de la gràfica es transforma en una
corba asimptòtica (s'apropa infinitament a
una altra sense mai coincidir-hi)
La primera part de la gràfica (recta)
acompleix l’equació F = K · c , però la
segona part (corba) queda fora de la
calibració

36. Moltes vegades convé relacionar la
concentració de la substància, no amb la
intensitat de fluorescència en valor
absolut, sinó amb el seu valor relatiu a la
intensitat màxima de fluorescència
emessa (Fm = k1 · I0) obtinguent:
k1 és el coeficient d’eficiència, un factor
que agrupa les característiques de la
substància i de l’instrument

37. Instrumentació ( 7 parts)

Font de radiació: làmpades d'arc de Hg o
làmpades de Xenó (250-800nm)

Filtre primari: filtres d'interferència o
monocromadors d’excitació

Cubeta per a mostres: quars o sílica fosa (UV)

Filtres secundaris: són monocromadors
d’emissió davant dels tubs fotomultiplicadors per
a evitar les radiacions reflectides i dispersades.
Així només transmeten la radiació fluorescent
produïda

38. Instrumentació (II)

Tubs fotomultiplicadors (detectors) a
90º amb la direcció de la radiació
excitadora

Solució estàndard: en dilucions seriades
per a ajustar i calibrar l'instrument

Pantalla d'absorció: opaca i en la
mateixa direcció que la radiació
excitadora. Absorbeix tota la radiació
transmesa

39. Monocromador d’emissió
Tub fotomultiplicador

40. Fluorímetres de doble feix

Un feix travessa la mostra i l'altra
travessa la solució estàndard

La làmpada de Hg emet radiació
excitadora alternativament cap a la mostra
o cap el patró

El fotoreceptor captarà el feixos també de
manera alternativa, comparant-los

No els hi afecten el canvis de
temperatura ni les radiacions reflectides ni
difractades sobre les cares de la cubeta.

42. Quimioluminescència
Fenomen luminescent ocasionat per a
una energia d’excitació produïda en el
curs d’una reacció química
A vegades no és l’analit el que
experimenta el procés l’excitació-relaxació
sinó una espècie formada per la reacció
de l’analit i els reactius químics utilitzats
en la prova, freqüentment una espècie
oxidada

43.  Mètode d’elevada sensibilitat
 Utilitza luminògens (substàncies com l’acridina,
fenantridina, ABEI.. que absorbeixen la llum de
la reacció química i la transformen en llum
visible entre 400 i 650nm),
 Ex: l’èster d’acridina + H2O2 → N-metilacridina
(alta energia) → Producte final (baixa energia) +
llum (445nm)
 Flash de llum de màxima energia als pocs
segons i posteriorment disminueix de manera
exponencial

44. El senyal lluminós es detecta mitjançant
un tub fotomultiplicador i es transmet a un
amplificador molt sensible (registre
intensitats lluminoses molt petites)

45. Tipus d’assaigs luminescents:
• LIA (Assaig immunoluminescent ,
↑Pm)
• ILMA (Assaig immuno-lumino-mètric,
↓Pm)

46. LIA
Immunoassaig tipus sandvitx
S’utilitzen dos tipus diferents d’ anticossos
monoclonals
Un es fixa de manera irreversible a la
paret interna d’un tub de disseny especial
“cel·les”, i reacciona específicament amb
una regió de la molècula de l’element
problema (ex: TSH)

47. El segon està unit a una molècula
luminògena (actua com marcador o
market) i reacciona específicament amb
una regió diferent de la molècula de
l’element, formant el complex tipus
sandvitx
Després rentem els elements no fixats
I finalment es mesura l’emissió
quimioluminescent (tub fotomultiplicador)

49. ILMA
• Utilitza un traçador (tracer) format per la
unió de l’analit i el marcador

50. • Hi ha una competitivitat entre una
quantitat coneguda de traçador i una
quantitat desconeguda de l’element
problema, deguda al limitat nombre
d’anticossos específics fixats
irreversiblement a la paret interna del tub

52. Metodologia LIA
≠ Etapes (Seccions)
1. Pipetejar (màxim 300 tubs)
2. Incubació o de reacció amb
un agitador per a minimitzar
el temps de reacció.
Generalment a temperatura
ambient i en cambra fosca
3. Rentat amb aigua
destil·lada o NaCl 0,14M
4. Mesura de la intensitat
lluminosa emesa en el
luminòmetre (un segon per
mostra)
5. Registre amb un
microprocessador amb el
soft adequat

53. Aplicacions
Quimioluminescència
TSH
T4
T3
T4 lliure
Ferritina
β2 Microglobulina
Prolactina
LH
FSH
Teofil·lina
Digoxina
Marcadors Tumorals (CEA, PSA, PSA lliure, CA125, CA19.9….)
Fàrmacs (Antibiòtics, Antitumorals, Antiepilèptics…)
Drogues….