6. SECUENCIACION DEL DNA METODO ENZIMATICO 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
7. 5’ 3’ ||||||||||||||| A T C A T G T C A T C A A G T C T A G C A C A T G C TAGTACAGTAGTTCAGATCGTG fragmentos largos fragmentos cortos 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
13. SORPRESA No. 1 S ó lo 2% del genoma son genes. Gen 1 Gen 2 98% del genoma 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
14. Somos casi idénticos (2% de diferencia) a los chimpancés. SORPRESA No. 2 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
15. Hay sólo 0,1% de variación genética entre todos los seres humanos. SORPRESA No. 3 Pero 0,1% de 3.000.000.000 bases = 3.000.000 bases 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
16. La propiedad mas importante del DNA es su secuencia de nucleótidos. La secuenciación es la determinación del orden de los nucleótidos. 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
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38. Figure 3: Atomic force microscopy of DNA on a microarray. This is a micrograph of a portion of a hybridization probe from a yeast microarray, taken after the array was subjected to hybridization. The DNA is clearly deposited at a sufficient density to allow many kinds of strand–to–strand interactions. The width of the picture represents a scanned distance of 2 m. Image kindly provided by J. DeRisi (Stanford) and E. Carr (Hewlett–Packard). Confección de arrays 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
39. Robot sembrador Siembra 7 nL/spot generando spots de 400-800 m de diametro. Confección de arrays Macroarrays 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010 Colección de genes blanco: DNA’s o Productos de PCR Membrana de nylon
40. Hibridación en microarrays Cy5 Cy3 Cy5 = 633 nm Cy3 = 532 nm Expresión de 1 > 2 2 1 Expresión de 1 = 2 Expresión de 1 < 2 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
42. El nivel de expresión de cada gen es representado por la intensidad de la señal asociada a un color: Rojo (Cy5) = > expresión en la muestra experimental Verde (Cy3) = < expresión en la muestra experimental Por convención el RNA de referencia es marcado con Cy3 . 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
55. El efecto combinado de estos factores puede ser expresado en una ecuación para el calculo de la Tm Tm = 81,5 ºC + 16,6log[Na] + 41(%G+C) - 0,63(%formamida) - (500/L) Tm = 79,8 ºC + 18,5log[Na] + 58,4(%G+C) + 11,8(%G+C) 2 - 0,5(%formamida) - (820/L) Para DNA:DNA Para DNA:RNA Para oligonucleotidos en 1 M Na+ Tm ( o C) = 4 (G+C) + 2 (A+T) IMPORTANTE 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
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58. T m : punto medio del perfil de desnaturalización térmica de ADN-ADN o de ADN-ARN Aumento de absorbancia del ADN a 260nm por desnaturalizacion 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010 Longitud de onda (nm) ADN simple hebra ADN doble hebra Absorbancia 220 260 300 Abs. relativa 260 nm 80 90 100 temperatura (ºC) T m = 86ºC ADN doble hebra ADN simple hebra desnaturalización
59. Ensayo de reasociación de ADN-ADN para cepas a y b 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
69. Hebra molde Hebra líder Hebra retardada EL ADN es la molécula que permite perpetuar la vida: REPLICACIÓN DEL ADN 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
75. Síntesis del primer de ARN por una primasa 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
76. En eucariontes los fragmentos de Okasaki tienen 200 nucleótidos, los primers unos 10. Los iniciadores de ARN se eliminan mediante una ARNasa específica que reconoce dobles hélices híbridas ARN-ADN La laguna es llenada por una polimerasa y la unión finalmente es realizada por una ligasa 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
77. La ligasa acopla la hidrólisis de un ATP para hacer más favorable la reacción de unión entre el fosfato y el hidroxilo libre, liberando al final un AMP. 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
78. Efecto de las proteínas de enlace con la hebra sencilla del ADN 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
79. Estructura de las proteinas de enlace a la hebra sencilla Modelo de la proteína humana 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
86. 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ La replicación en un ojo de replicación primer ADN 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
87. A T C G A A C C G T T G C A C C G T T G C A C Síntesis continua de la cadena 5’ -3’ Síntesis continua de la cadena en dirección 5' 3'. La síntesis de esta cadena no plantea ningún problema. Así, una vez separadas ambas cadenas, se sintetiza el primer y la ADN pol. III (una de las enzimas que unen los nucleótidos) va a elongar la cadena en dirección 5' 3'. 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010 U A G C T T G G C A A C G T G
88. A T C G A A C C G T T G C A C C G T T G C Síntesis discontinua de la cadena 3’ -5’ Síntesis discontinua. La cadena complementaria no se va a replicar en sentido 3' 5' sino que se replica discontinuamente en dirección 5' 3'. Primero se sintetiza el primer ( ARN) y posteriormente este se elonga con ADN. El ARN es posteriormente eliminado y los diferentes fragmentos sintetizados, llamados fragmentos de Okazaki , son unidos entre sí. 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010 T A G C T U G G C A A C G T G A A C C C G G T
98. 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010 Esto explica porqué los humanos, los ratones, y otros mamíferos son particularmente vulnerables al cáncer causado por la luz UV de los rayos solares, pero los demás miembros del reino animal, incluyendo insectos, peces, aves, anfibios, marsupiales, e incluso bacterias, virus y levaduras, poseen una capacidad mucho mayor de enmendar el daño.
110. Autoinmunidad SIDA Cáncer Alzheimer Apoptosis fisiológica Defecto Exceso 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
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112. Diferencias entre apoptosis y necrosis. Apoptosis Necrosis (Oncosis) Programada genéticamente Accidental. Se mantiene Se rompe Disminuye aumenta Se preservan Se desintegran Fragmentación del DNA tardía fragmentos grandes . En cuerpos apoptóticos rodeados por membrana Son reconocidos y fagocitados Los contenidos de los orgánulos se liberan Inducen inflamación local. Membrana. Tamaño celular Orgánulos. Temprana fragmentos oligonucleosomales Fragmentación celular Restos celulares Mecanismo 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
113. Fases de l a apoptosis 1. Decisión 2. Ejecución 4. Degradación y presentación antígenos 3. Fagocitosis Desequilibrio entre factores inductores e inhibidores bcl-2 <bax Temprana: Activación de proteasas y endonucleasas In termedia: Fragmentación DNA Tardia: Emisión de cuerpos apoptóticos Activacion de receptores Detección de fosfatidil Serina (PS) Evita liberación de componentes intracelulares inflamación TGF 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
115. conjugación Lederberg y Tatum, 1946 (P. Nobel 1958) 10 8 células 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
116. tubo en U pasa el medio pasan moléculas no pasan células tubo en U no nutrición cruzada no transformación (1944) 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
117. pilus pelo F o pelo sexual conjugación proceso unidireccional (Hayes, 1953) donadora o macho receptora o hembra pelos o fimbrias 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
124. a mayor tiempo entran marcadores (genes) nuevos 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
125. transferencia secuencial y lineal de genes de Hfr a F- La conjugación es un proceso de transferencia de material genético unidireccional y orientada 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
127. ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLE Los elementos genéticos transponibles son segmentos de DNA que tienen la capacidad de moverse desde una localización hasta otra ( ej. genes saltarines). 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
128. Propiedades de los Elementos Genéticos Transponibles Movimiento al azar- Los elementos genéticos transponibles pueden moverse desde cualquier molécula de DNA a cualquier otra molécula de DNA o aún a otro lugar dentro de la misma molécula. El movimiento no es totalmente al azar; existen sitios preferentes en una molécula de DNA en la cual se insertará el elemento genético transponible. 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
129. Incapaz de auto-replicarse – Los elementos genéticos transponibles no existen de manera autónoma (a excepción – algunos genes transponibles en los fagos) y por tanto, para ser replicados deben ser parte de algún otro replicón 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
130. Transposición mediada por recombinación sitio-específica – La transposición requiere poca o ninguna homología entre la localización actual y el nuevo sitio. El evento de transposición está mediado por una transposasa codificada por el elemento genético transponible. 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
131. La recombinación que no requiere de homología entre las moléculas recombinantes se denomina de sitio-específico, ilegítima o bien recombinación no-homóloga 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
132. Transposición acompañada por duplicación – En muchas instancias la transposición del elemento genético transponible resulta en la remoción del elemento de su sitio original y su inserción en un nuevo sitio. Sin embargo, en algunos casos el evento de transposición se acompaña de una duplicación del elemento genético transponible. Una copia permanece en el sitio original y la otra se transpone en el nuevo sitio. 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
133. Secuencias de Inserción (IS) Las secuencias de inserción son elementos genéticos transponibles que llevan genes desconocidos, con excepción de aquellos que se requieren para la transposición. Nomenclatura – A las secuencias de inserción ( insertion sequences ) se les da la designación IS seguida por un número ( ej : IS1) Las secuencias de inserción son pequeños tramos de DNA que a sus extremos tienen secuencias repetidas que están involucradas en la transposición. 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
134. En medio de las secuencias terminales repetidas hay genes involucrados en la transposición y secuencias que pueden controlar la expresión de los genes, pero no presentan otros genes que no sean esenciales. 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
135. Importancia Mutación – La introducción de una secuencia de inserción en medio de un gene bacteriano resultará en la inactivación de tal gene. 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
136. Inserción de plásmidos en los cromosomas – Los sitios en los cuales los plásmidos se insertan en el cromosoma bacteriano se localizan ya sea en las propias secuencias de inserción o cerca de ellas 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
138. Variación de Fase – Los antígenos flagelares son de los principales antígenos ante los cuales se dirige la respuesta inmune, en nuestro intento de luchar contra la infección bacteriana. En Salmonella existen genes que codifican para dos genes flagelares antigenicamente diferentes. La expresión de estos genes está regulada por secuencias de inserción. En una orientación, uno de los genes está activo mientras que en la otra orientación el otro gene flagelar estará inactivo. Como resultado Salmonella puede cambiar sus flagelos en respuesta al ataque del sistema inmune. La variación de fase en los antígenos flagelares de Salmonella no es única. También se ha visto que ocurre con otros antígenos de superficie. Además el mecanismo de la variación de fase puede ser diferente en diversas especies de bacterias ( ej. transformación en Neisseria ). 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
139. APLICACIONES EN MEDICINA VETERINARIA 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
152. El genoma dinámico: los elementos transponibles son el principal componente de los genomas grandes de eucariotas 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
153. Elementos Efectos fenotípicos y genotípicos de la transposición Disgénesis híbrida en Drosophila 29/04/10 Dr. Giovanni Gonzalez DMV/BIOMOL/2010
Xeroderma pigmentosa:alteracion de la pigemtacion y piel apergaminada.. Desarrollo de cancer de piel con alta frecuencia. Hasta ahora identificados 8 genes implicados en la repacion de los dimeros de pirimidinas.
quiescencia o dormancia son procesos reversibles. Modo de muerte celular activo en el que la célula ejecuta un programa de defunción siguiendo unos pasos característicos . Es sinónimo de : muerte celular fisiológica y muerte celular por suicidio . Existen otros procesos de muerte programada atípica distintos de la apoptosis . Sentido biologico muerte celular higienica.
La apoptosis disminuida puede provocar patologías de acumulación celular, mientras que su exceso se implica en otras de carácter degenerativo o de disminución celular. Las primeras incluyen a las Neoplasias , las Enfermedades autoinmunes y aquellas enfermedades infecciosas provocadas por patógenos que inhiben la apoptosis de las células que infectan. Las segundas incluyen : El daño hepático provocado por la respuesta inmune a los virus de la hepatitis. La deplección linfocitaria inducida por agentes infecciosos como el virus de la inmunodeficiencia humana y el Tripanosoma cruzi. Las enfermedades neurodegenerativas como la de Alzheimer, Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa y la atrofia muscular espinal. También se han relacionado con aumento de la apoptosis diversas enfermedades hematológicas como el síndrome mielodisplásico y la anemia aplásica , ciertas inmunodeficiencias primarias , el daño tisular secundario a isquemia , además de otras procesos degenerativos del sistema músculo-esquelético como la osteoporosis y la artrosis .
Biologia celular la cadena Procesos biológicos asociados a la apoptosis Cambios en la morfología celular. Estructura y función de transporte de la membrana plasmática. Función de orgánulos celulares Degradación del DNA
tema 25
tema 25 http://nobelprize.org/medicine/laureates/1958/index.html ¿Hay recombinaci ón (sexo) en bacterias? Figure: 09-03. Genetic Recombination of Two Auxotrophs Genetic recombination of two auxotrophic strains producing prototrophs. Neither auxotroph grows on minimal medium, but prototrophs do, suggesting that genetic recombination has occurred.
tema 25 La conjugaci ón requiere contacto entre las bacterias Figure: 09-04. Davis Experiment When strain A and B auxotrophs are grown in a common medium but separated by a filter, as in this Davis U-tube apparatus, no genetic recombination occurs and no prototrophs are produced.
tema 25 No es un proceso sexual convencional: dos gametos (n) formen un cigoto (2n) Conjugaci ó n: transferencia unidireccional orientada Hayes: mata un tipo celular antes de la mezcla. Si el receptor esta vivo, hay recombinantes!
tema 25 Conjugaci ó n: transferencia unidireccional orientada
tema 25
tema 25 a) pareja espec í fica; b) pareja efectiva
tema 25
tema 25 Unos 100 genes Transferencia (unos 22 genes): formación de los pili, origen de transferencia, corte del DNA, regulación del proceso
tema 25
tema 25
tema 25 Cromosoma se establece como una estructura lineal y circular!