Este documento estudia la actividad de proteinasas y fosfolipasas como factores de virulencia en especies de Candida aisladas de sangre. Se analizaron 114 muestras de sangre de pacientes hospitalizados y se identificaron varias especies de Candida. Se utilizaron métodos como el de Staib para detectar proteinasas y el método de Samaranayake para detectar fosfolipasas. Los resultados mostraron que varias especies de Candida producen estas enzimas, las cuales juegan un papel importante en la virulencia de estas levad

1. ACTIVIDAD PROTEINASA Y FOSFOLIPASA COMO
FACTORES DE VIRUELENCIA EN ESPECIES DE
CANDIDA AISLADAS DE SANGRE
PROFESORA: Angelica Minaya
Galarreta
CICLO: VI
INTEGRANTES:
 Stephany Araujo Zacarías
 Arnold Cuya Silva
 Jonathan García Puccio
 Ilianova Huamán Zacarías
 Dante Huamani Zambrano
 Delia Morales Aguilar

2. INTRODUCCION:
 El numero de fungemias nosocomiales debidas
a las especies de Cándida se debe a la
infección de patógenos oportunistas que tiene
que evadir el sistema inmunológico, para
sobrevivir, dividirse en los tejidos y diseminarse
a otros órganos.
 El trabajo presentado nos informa que la
secreción de fosfolipasas y proteinasas son
factores de virulencia de especies de
Cándida, aisladas de hemocultivos de
pacientes en cuidados intensivos, unidades de

3.  Se trabajos con 114 muestras de sangre donde se aisló
Cándida y se identificaron las siguientes especies:
 Cándida albicans
 Cándida glabrata
 Cándida guilliermondii
 Cándida kefyr
 Cándida krusei
 Cándida parapsilosis
 Cándida tropicales
 Para detectar proteinasa se utilizo el método de Staib.
 Para detectar fosfolipasa se utilizo el método de
Samaranayake et al.

4. CONCEPTOS BASICOS:
 Fosfolipasa.-Son una
clase de enzimas que
hidrolizan los enlaces
éster presentes en los
fosfolípidos. Sólo la
PLB1 ha demostrado
ser necesaria para la
virulencia en modelo
animal de candidiasis.

5.  Proteasas.-Son enzimas que rompen
los enlaces peptídicos de las proteínas.
Familia de enzimas de secreción aspártico
proteinasas (SAP), que proporcionan al
hongo un sistema proteolítico La
presencia de los genes de la familia SAP
es única en las especies patógenas de
Candida.

6. CANDIDA:
 Es un hongo diploide asexual. Normalmente
se encuentra en la cavidad oral, en el tracto
gastrointestinal y en la vagina.
 La microfoflora comensal aprovecha la
‘oportunidad’ para provocar infección. 4a
causa más frecuente de IS.

7. GLOSARIO:
 Factor de virulencia.-
Son moléculas producidas por
un patógeno, que influencia específicamente
las funciones del hospedante, para permitir
al patógeno crecer.
 Fungemias nosocomiales.-Enfermedad en
la cual la sangre esta contaminada por
hongos, es frecuente en pacientes con
inmunosupresión o inmunodeficiencia.
 Método de Staib.-Es un método para
identificar microorganismos utilizando una
serie especial de tintes (colores).

8. GLOSARIO:
 Gonocócica.-Un tipo de enfermedad
clasificada entre las enfermedades
infecciosas y parasitarias.
 Candidiasis.-Es una infección
fúngica (micosis) de cualquiera de las
especies Candida (todas
las levaduras), de las cuales
la Candida albicans es la más común.

9. ESPECIES DE CANDIDA
Especie A: Candida krusei:
colonias rugosas de borde
irregular y de color rosa pálido.
Especie B: Candida albicans:
colonias brillantes de borde
regular y de color verde.
Especie C: Candida glabrata:
colonias brillantes de borde
regular y de color rosa-violeta.
Especie D: especie
indeterminada; no es posible su
identificación, ya que no
produce ningún pigmento.
Especie E: Candida tropicalis:
colonias brillantes de borde
regular y de color azul brillante

10. Las levaduras del
género Candida son hongos
dimorfos de distribución universal
que forman parte de la flora
residente de la boca, tracto
digestivo y genital femenino de
sujetos sanos. Bajo algunas
condiciones, son responsables de
patologías de alto riesgo y en
ocasiones fatales. Pueden
producir lesiones en
piel, uñas, cavidad
oral, bronquios, pulmones y
alcanzar todos los órganos y
sistemas mediante la
diseminación sanguínea de la
levadura.
Pesenta una forma ovalada y un
tama;o de 5-7 um.

11. FACTORES DE
VIRULENCIA
La incidencia cada vez mayor de
infecciones intrahospitalarias por MORFOLOGIA CELULAR
Candida y su asociación en
individuos susceptibles con ciertas
inmunodeficiencias hacen posible
que estos microorganismos SECRECION ENZIMATICA
comensales, se vuelvan
patógenos. Conocer los
factores de virulencia hace posible EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE
determinar, cómo se modifica la GENES EN REACCIÓN AL
relación que establece con su MEDIO AMBIENTE
huésped una vez que los
mecanismos de resistencia se han SINTESIS DE ADHESINAS Y SU
deteriorado. CAPACIDAD DE FORMAR
BIOPELICULAS

12. MORFOGENESIS
Se refiere a la transición entre las
levaduras y la forma de crecimiento
filamentosa que puede convertirse de
forma reversible a células de levadura, con
crecimiento de hifa o Pseudohifa, que es
uno de los atributos que capacitan a
Candida albicans para invadir los
tejidos, aunque la hifa puede ser idónea
para abrir la brecha entre las barreras
tisulares, gracias a que su punta es el sitio
de secreción de enzimas capaces de
degradar proteínas, lípidos y otros
componentes celulares, ésta facilita su
infiltración en sustratos sólidos y tejidos.

13. ENZIMAS
Las enzimas son
determinantes de PROTEASAS
virulencia en
Candida, ya que tienen
la capacidad
de romper polímeros
que proporcionan
nutrientes accesibles
para el crecimiento de FOSFOLIPASAS
los hongos, así como
de inactivar las
moléculas útiles en la
defensa del
organismo

14. PROTEASAS FOSFOLIPASAS
En Candida albicans se han Se han identificado cuatro
descrito varios miembros de una fosfolipasas (PLA, PLB,PLC y
gran familia de enzimas de PLD), de las cuales sólo la PLB1
secreción aspártico proteinasas ha demostrado
(SAP). ser necesaria para la virulencia en
Las proteínas SAP tienen funciones modelo animal de candidiasis.
especializadas durante el proceso Una cepa con la deleción de este
infeccioso e incluyen la digestión de gen (con
moléculas proteínicas para adquirir menor producción de esta enzima)
nutrientes,digerir o distorsionar las reduce su virulencia hasta en
membranas del huésped y facilitar 60%, comparada con la cepa
la adhesión, la invasión a tejidos y silvestre. La PLB1A es una
la digestión de moléculas del glucoproteína de 84 kDa,que tiene
sistema inmunitario del huésped actividad de hidrolasa
para evitar o resistir el ataque Se secreta y detecta en la punta
antimicrobiano de éste; de las hifas durante la invasión a
los tejidos.

15. EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE
GENES EN REACCIÓN AL MEDIO
AMBIENTE
Candida albicans es capaz de sobrevivir y proliferar
en
un amplio rango de tejidos, ya sea como comensal o
como patógeno. Durante los diferentes estados y
tipos
de infección las células del hongo necesitan amplia
flexibilidad, ya que cada sitio anatómico tiene sus
propias presiones ambientales. Esta al tener genes
que codifiquen para factores de virulencia puede
reflejar la adaptación a amplio rango de condiciones
ambientales.
La principal función del gen PHR1 se asocia con la
síntesis de la pared celular, cuya expresión es óptima
en pH cercanos a la neutralidad, como en el torrente
circulatorio o en los tejidos, mientras que en el canal
vaginal la función del PHR2, que es similar pero con
pH ácido. Éste es un ejemplo de cómo Candida
albicans se adapta a condiciones fisiológicas
extremas dentro del huésped.

16. ADHESINA

18. BIOPELICULA

19. DIAGNOSTICO
Los métodos de diagnóstico 1) Observación microscópica
microbiológico los podemos
clasificar de • Examen en fresco con KOH (10-30%).
la siguiente manera: • Blanco de calco-fluor.
• Tinciones biológicas.
2) Métodos basados en el cultivo
• Identificación mediante criterios morfológicos
• Identificación mediante criterios bioquímicos basados en sistemas enzimáticos
• Identificación rápida de levaduras mediante pruebas bioquímicas y enzimáticas
3) Métodos independientes del cultivo.
• Detección de antígenos o anticuerpos.
• Detección de metabolitos.
• Detección de componentes fúngicos.

20. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
Examen en fresco con KOH (10-30%):
Facilita la observación ya que el KOH presenta efector clarificador, disolviendo los
distintos elementos celulares y permaneciendo intacta la pared celular fúngica.
Blanco de calco-flúor:
Se une específicamente a la quitina de las células fúngicas y emite una fluorescencia
que delimita a los elementos fúngicos. Al microscopio de fluorescencia C. albicans y
demás especies muestran una fluorescencia verde brillante; C. glabrata emite una
fluorescencia más débil.
Tinción Biológica:
Aunque las levaduras se tiñen bien con la mayoría de los colorantes bacterianos
(tinción de Gram), también disponemos de tinciones histológicas específicas
como la de plata-metenamina y la del ácido periódico de Scheffer (PAS), que nos
permiten su visión bien diferenciada.

21. Hifas y blastosporas de
Cándida albicans en
frotis oral. (Tinción de
PAS x 400).
Blastosporas y tubos
germinales de Cándida
albicans teñido con blanco
de calco-flúor, x1.000.

23. MÉTODOS BASADOS EN EL CULTIVO
La mayoría de los organismos levaduriformes crecen fácilmente en un gran
número de medios de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de
Microbiología (agar harina de maíz, agar Wolin-Bevis, agar arroz o
agar patata-zanahoria) es característica y de utilidad para la identificación de
C. albicans y C. dubliniensis.. Sin embargo, el agar glucosado de Sabouraud
(SDA), con o sin antibióticos añadidos, es el medio de aislamiento por
excelencia para la identificación de levaduras

24. El tubo germinal es una
extensión filamentosa
de la levadura, sin
estrechamiento en su
origen, cuyo ancho suele ser
la mitad de la célula
progenitora y su longitud tres
o cuatro veces mayor que la
célula madre.
Sólo C. albicans es capaz de producir verdaderos tubos germinales; sin
embargo, otras especies como C. tropicalis pueden producir pseudohifas
precoces de aspecto similar a los tubos germinales pero con una zona de
constricción característica adyacente a la célula madre, por lo que esta prueba
es útil para diferenciar C. albicans del resto de las especies de
Cándida, aunque no está exenta de falsos negativos.

25. Materiales y Métodos

26.  Las muestras de sangre fueron
recolectadas en las unidades de cuidados
intensivos (UCI), unidades de diálisis, y
las unidades de oncología en los
hospitales y asilos de ancianos en los
alrededores de Bangalore. Un total de 114
cepas de Cándida fue recuperado de las
muestras de sangre. Los aislamientos
fueron identificados por tubo germinativo
de información.

27. Detección de Proteinasa
 La proteinasa Cándida fue detectada
por la ligera modificación del método
Sabouraud Glucosado Agar
 Albúmina de suero bovino medio (2%
de dextrosa, KH2PO4 0,1%, MgSO4
0,05%, agar al 2% mezclado después
de enfriar a 50 C con 1% bovino
solución de albúmina de suero)

28.  Candida albicans aislada de cavidad oral

29. Sabouraud Glucosado Agar
 Es un método diferencial para el cultivo de hongos
con un medio de bajo pH y elevada concentración de
azúcar.
 Recomendado para el aislamiento y desarrollo de
hongos, particularmente los asociados con
infecciones cutáneas (piel, pelo, etc.).
 40 g/L glucosa
 10 g/L pluripeptona
 15 g/L agar
 0,05 g/L [cloranfenicol]
 pH 5.6

30. Detección de Fosfatasa
 El método ligeramente
modificada de
Samaranayake et al. Medio
de yema de huevo utilizado
consistió en 13,0 g de agar
de dextrosa Sabouraud
(SDA), 11,7 g de NaCl, 0,111
g de CaCl2, y 10% de huevo
estéril. La yema se
centrifugó y 20 ml del
sobrenadante se añadió al
medio esterilizado.

31. RESULTADOS:
 De las 114 especies aisladas de Candida, en las
muestras de sangre se encontraron los
siguientes generos C. albicans (37), C. glabrata
(7), C. guilliermondii (5), C kefyr (3), C. krusei
(45), C . parapsilosis (5) y C. tropiccilis (12).
 Todos los aislamientos fueron probados para la
proteinasa y la producción de fosfolípasa.
 En la actividad de la proteinasa se detectó en
85 (74,56%) aislamientos y la actividad
fosfolipasa se detectó en 51 (44,73%)
aislamientos (Tablas 1 y 2). Los aislamientos
probados demostraron diversos grados de
actividad fosfolipasa (valor PZ: 0.23-1.0), con el
más importante actividad de la fosfolipasa.

32. RESULTADOS:
 El valor Pz para la actividad de proteinasa
oscilaron entre 0,17 y 1,0.
 El nivel más alto de la actividad enzimática
era para los valores de Pz cercanos a cero.
ANOVA se utilizó para comparar la
producción de proteinasa y fosfolipasa en
diferentes organismos.
 No hubo diferencia significativa entre los
organismos con respecto a la significancia de
produccion de proteinasa y fosfolipasa (p>
0,05).

33. Tabla 1. actividad de la proteinasa (mm) exhibida por candida. Aislación de
sangre
Candida spp. N Mean Std. Minimum Maximum
Desviation
C. albicans 37 0.55 0.36 0.20 1.00
C. glabrata 7 0.43 0.26 0.24 1.00
C. guilliermondii 5 0.56 0.40 0.19 1.00
C. kefyr 3 0.59 0.37 0.27 1.00
C. Krusei 45 0.42 0.25 0.20 1.00
C. parapsilosis 5 0.38 0.35 0.20 1.00
C. tropicalis 12 0.52 0.37 0.17 1.00

34. Tabla 2. actividad de la fosfolipasa (mm) exhibida por candida spp. Aislación
de sangre.
Candida spp. N Mean Std. Minimum Maximum
Desviation
C. albicans 37 0.66 0.34 0.23 1.00
C. glabrata 7 0.73 0.35 0.24 1.00
C. guilliermondii 5 0.86 0.31 0.30 1.00
C. kefyr 3 0.59 0.37 0.27 1.00
C. Krusei 45 0.73 0.33 0.24 1.00
C. parapsilosis 5 0.88 0.27 0.40 1.00
C. tropicalis 12 0.68 0.35 0.23 1.00

35. Discusiones
 El considerable aumento de
candidiasis se observa en pacientes
de las UCI, que reciben tratamiento
oncológico, los receptores de
trasplante de órganos, y otros
individuos inmunocomprometidos
sometidos a fuertes protocolos
terapéuticos.

36.  Se consideraron como importantes
factores de virulencia de C.albicans a las
fosfolipasas y proteinasas aspartilo.
 Dieciocho de C.albicans fueron
productores de fosfolipasa. Sin embargo
pocas cepas de C. tropicalis, C. krusey y
C. galabrata se comportaron de manera
similar.
 C. albicans, C. kefyr, C. parapsilosis y C.
tropicalis mostraron que tienen similar
actividad de la proteinasa.

37. Conclusiones
 A pesar de que todas las cepas
aisladas fueron patogenas, no todas
las cepas de candida producen
proteinasa y fosfolipasa como factores
de virulencia.
 La ausencia o presencia de estas
secreciones enzimáticas nos puede
indicar la naturaleza menos o mas
virulenta de las especies de
cándida, independientemente de la
especie que haya sido aislada.

38.  La virulencia de las especies de candida
no solo se atribuye a un solo factor, sino a
una combinación de varios factores.
 La C. albicans muestra una significativa
actividad de la fosfolipasa frente a las
cepas que no son C. albicans.
 Las cepas que no son C. albicans muestra
mayor actividad proteinasa frente a las
cepas que si son C. albicans.