Poster 3 biochimie

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Poster 3 biochimie

  1. 1. VALIDATION ANALYTIQUE DU DOSAGE DE L’HOMOCYSTEINE PAR SPECTROMETRIE DE MASSE EN TANDEM Mathilde Louis 1 , C. Tse 1 , N. Jacob 1 , C. Jardel 1 , A. Sprault 2 , F. Lamari 1 1 – Laboratoire de Biochimie, Hopital Pitié Salpétrière 2 – Laboratoire de Biochimie, Hopital Kremlin Bicêtre 2011 Biochimie Biochemistry Poster 3
  2. 2. <ul><li>Introduction </li></ul><ul><ul><li>L’Homocystéine plasmatique (Hcy) est un acide aminé soufré ayant un rôle majeur dans le cycle de la méthionine. Le dosage de l’Hcy totale sert au diagnostic et au suivi des hyperhomocystéinémies d’origine génétique, ou carentielles </li></ul></ul><ul><ul><li>L’hyperhomocystéinémie est associée à un risque accru de thromboses artérielles et veineuses. C’est aussi un facteur de risque athérogène de classe IIb </li></ul></ul><ul><li>Objectif </li></ul><ul><ul><li>Nous avons mis au point un dosage de l’Hcy par spectrométrie de masse, triple quadripolaire, couplée à une chromatographie liquide, avec dilution isotopique (LC-MS) </li></ul></ul><ul><ul><li>Les résultats sont comparés à ceux obtenus par chromatographie liquide haute performance avec détection fluorimétrique (CLHP-FD) </li></ul></ul>
  3. 3. <ul><li>Matériel : </li></ul><ul><li>- TQD : Source Electrospray + </li></ul><ul><li>UPLC :Colonne HSST3, 60 °C </li></ul><ul><li>Phase mobile : </li></ul><ul><ul><li>95% A1 : eau + 0,1 % acide formique </li></ul></ul><ul><ul><li>5% B1 : méthanol </li></ul></ul><ul><ul><li>Débit : 0,4 mL/min </li></ul></ul><ul><li>Méthode : Dilution isotopique </li></ul><ul><li>Standard interne : </li></ul><ul><li>D8-homocystine </li></ul><ul><li>Matériel : </li></ul><ul><li>- TQD : Source Electrospray + </li></ul><ul><li>UPLC :Colonne HSST3, 60 °C </li></ul><ul><li>Phase mobile : </li></ul><ul><ul><li>95% A1 : eau + 0,1 % acide formique </li></ul></ul><ul><ul><li>5% B1 : méthanol </li></ul></ul><ul><ul><li>Débit : 0,4 mL/min </li></ul></ul><ul><li>Méthode : Dilution isotopique </li></ul><ul><li>Standard interne : </li></ul><ul><li>D8-homocystine </li></ul>Validation des résultats selon le guide de validation technique d’une portée flexible B de la COFRAC
  4. 4. <ul><li>Méthode spécifique : </li></ul><ul><ul><li>1 transition de quantification </li></ul></ul><ul><ul><li>m/Z = 136 > 90 </li></ul></ul><ul><ul><li>1 transition de qualification </li></ul></ul><ul><ul><li>m/Z = 136 > 56 </li></ul></ul><ul><ul><li>1 temps de rétention </li></ul></ul><ul><li>Méthode sensible : </li></ul><ul><li>n = 19 blancs </li></ul><ul><ul><li>Limite de détection (LOD) </li></ul></ul><ul><ul><li>= 3 x σ (blanc) </li></ul></ul><ul><ul><li>= 0.1 µmol/L </li></ul></ul><ul><ul><li>Limite de quantification (LOQ) </li></ul></ul><ul><ul><li>= 10 x σ (blanc) </li></ul></ul><ul><ul><li>= 0.5 µmol/L </li></ul></ul>
  5. 5. Réalisée sur les contrôles de qualités externes européens ERENDIM Biais < 13% - 8 mesures pour chaque point de gamme - Linéarité jusqu’à 211 µmol/L <ul><li>Comparaison de gamme dans l’eau, l’albumine et le plasma </li></ul><ul><li>Effet matrice nigligeable </li></ul>Résultats justesse Concentration (µmol/L) Biais (%) E 111 117 12.4 E 112 48 2.8 E 109 13.1 -5.2
  6. 6. Réalisé sur les contrôles qualités internes BIORAD CV < 5 % => Conforme Recherche d’une contamination inter échantillon : - alternance de 3 mesures d’un plasma avec une homocystéinémie élevée (48 µmol/L) suivi de 3 mesures d’un plasma ayant une homocystéinémie basse (8.4 µmol/L) - Contamination inter-échantillons = 0,05 % 30, 2 dosages par jour 30, 2 dosages par jour 30, même série 30, même série Nombre 2,48 3,21 3,9 2,9 Coefficient de variation 0,70 0,34 1,1 0,30 Ecart-type 28 10,4 28 10,4 Moyenne (µmol/L) CQ2 CQ1 CQ2 CQ1 Reproductibilité Répétabilité
  7. 7. Transférabilité des résultats entre LCMS et CLHP <ul><li>74 échantillons analysés en double sur la LC-MS et CLHP </li></ul><ul><li>- Graphique des différences : < 20 % </li></ul><ul><li>- Graphiques des rapports : > 70 % </li></ul>
  8. 8. Conclusion <ul><li>La méthode mise au point est simple, rapide, sensible et spécifique. </li></ul><ul><li>La comparaison de méthode avec la CLHP-FD montre une parfaite transférabilité des résultats </li></ul>

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