2.  MODULO I°: MetODOs De
estUDIOs
 teCNICAs HIstOLOGICAs:
 DEFINICION: Es el conjunto de
operaciones que se somete un material
organizado para hacer posible su estudio
por medio del microscopio, posibilitando
la observación de las estructuras no
visibles al ojo humano.

3. METODOS HISTOLOGICOS:
1-Examen inmediato o in vivo:
a) En fresco: animales unicelulares y células
libres.
b) Coloración vital: usando soluciones de
colorantes no tóxicos (colorantes vitales),
coloración intravital o in vivo, y la coloración
supravital, donde pueden colorearse células
libres o porciones de órganos.
2- Examen mediato o post-morten:
Requiere de la muerte celular y supone seguir
una serie de pasos, la Técnica histológica

4. PAsOs De LA teCNICA:
1- Obtención del material:
Pueden provenir de:
* biopsias quirúrgicas
* material obtenido de necropsias
* utilizando animales de laboratorio
* estudios experimentales en animales
* material de cultivos de tejidos
* frotis o extendidos

5. 2- FIjACIóN:
Es el proceso Físico (Histoquímico) que logra una situación estable de los
constituyentes tisulares, interrumpiendo las reacciones enzimáticas de autólisis.

6. Cualidades de un buen fijador:
1) Actuar con rapidez y detener
los procesos autolíticos.
3) Buen poder de penetración.
4) Conservar lo mas fielmente
la estructura del tejido.
4) No interferir y facilitar los
procesos posteriores.
5) Endurecer el tejido y darle
mayor consistencia.
6) Insolubilizar los
componentes de los tejidos.
7) No producir estructuras
artificiales.

7. CLAsIFICACIóN De LOs FIjADOres:
1- Fijadores químicos: son los más empleados y pueden ser:
a) Simples: constituido por una sola sustancia:
Formol al 10%: Es muy usado.
Aldehído glutárico o glutaraldehido
Acetona en frío.
b) Compuestos o mezclas fijadoras: constituidas por varias
sustancias.
Liquido de Flemming: (mezcla cromo-osmio-acética) para estudios
citológicos.
Liquido de Bouin: (mezcla picro-formol-acética). El mejor fijador para los
trabajos corrientes. Muy penetrante.
2- Fijadores físicos:
Desecación:
Calor seco:
Calor húmedo:
Frío:
Congelación y desecación: (Método de Altmann-Gersh)

8. Mecanismo de acción de los fijadores:
• Por coagulación de las proteínas, sin
combinarse con ellas: alcohol, formol, ácido
Pícrico, etc.
• Formando combinaciones químicas con las
sustancias orgánicas: ácido crómico,
bicromato de potasio, de amoniaco, etc.
c) Por reducción, al contacto con las sustancias
orgánicas formando un precipitado fino:
ácido ósmico, bicloruro de mercurio.
d) Por oxidación: bicromato de potasio.

9. 3- INCLUsIóN
Es impregnar la pieza con una sustancia que le confiere dureza y permite
obtener cortes uniformes y delgados.
En la técnica corriente, se utiliza la parafina; que es insoluble en agua,
está condicionada por la extracción de toda el agua del material a incluir. Los
pasos de la inclusión son los siguientes:

10. c) Impregnación en parafina:
Es la inclusión propiamente dicha.
d) Confección del taco: Es la inclusión
definitiva del trozo de tejido. Se utiliza un molde metálico
especial denominado barras de Leuckart, donde se vierte
parafina liquida (60°C).

11. 4- ObteNCIóN DeL COrte:
Para obtener cortes finos se utilizan aparatos
denominados micrótomos, hay varios tipos.

12. Tipo Minot: (Mas Usados) dispone de 4 posiciones de
ajuste, según el corte sea de 1-10 µm, 11-20 µm, 21-30
µm o 31-40 µm así como ajuste del ángulo de la
cuchilla graduado, inmovilización de la rueda y
mecanismo de avance de gran precisión

13. Montaje del corte:
Se colocan sobre una platina con agua caliente. Luego se levantan los
cortes con un portaobjeto, se extiende sobre una película de
Albúmina de Mayer, que es una mezcla de partes iguales de
albúmina de huevo, glicerina con un cristal de timol. Los
portaobjetos con los cortes adheridos se llevan a la estufa.

14. 5 COLOrACION:
Los colorantes se pueden clasificar de diferente manera:
1-Colorantes naturales:
a) animales: carmín.
b) vegetales: hematoxilina, orceina.
2-Colorantes artificiales o sintéticos: (colorantes de
anilina).
a) ácidos: Son colorantes citoplasmáticos.
b) básicos: Son colorantes nucleares.
c) neutros: Tiñen citoplasma y núcleo de diferente color
3-Colorantes indiferentes: no forman sales. Sudan III, rojo
escarlata, etc.
Sustancias basofilas se tiñen con los colorantes básicos
Sustancias acidofilas se tiñen con los colorantes ácidos
Sustancias neutrofilas se tiñen con los colorantes neutros.

15. Técnica de la hematoxilina y eosina:
Hematoxilina:
Es un colorante nuclear, esta cargado positivamente por lo tanto es
un colorante básico.
De origen vegetal (hematoxilom compechianum).
Es incoloro y tiene que ser trasformado por oxidación en hemateina,
que es el auténtico colorante.
Eosina:
Es un colorante artificial, débilmente ácido, que pertenece al grupo
de las fluoresceínas, soluble en agua.
Colorea el citoplasma, el tejido conjuntivo y las fibras colágenas de
un rosado intenso.

16. Los pasos de la coloración son:
a) Desparafinización:
b) Hidratación:
c) Coloración propiamente dicha:

17. 6) Montaje final
Las fases del montaje final son:
d) Deshidratación: mediante la acción de alcoholes de
gradación creciente: 70°, 80°, 90° y 100°,
sucesivamente.
b) Homogenización o aclaración: se emplea el benzol o
xilol a los que se le puede agregar ácido carbónico o
fénico para aumentar su eficacia, estos son muy
ávidos de agua.
c) Colocación del cubreobjeto: con el objeto de proteger
el preparado, se la recubre con una laminilla de
vidrio de 0,2 mm de espesor, o cubreobjeto. Para
adherir el cubreobjeto al portaobjeto, se emplea una
resina, el Bálsamo de Canadá.

18. TECNICAS HISTOQUIMICAS:
Son técnicas utilizadas para determinar la presencia y localización de elementos
químicos en el tejido mediante ciertos colorantes afines.
A-Ácidos nucleicos: Azul de Metileno o de Toluidina y la hematoxilina. La
reacción de Feulgen, que es especifica para ADN.
B-Hidratos de carbono: se utiliza la Reacción del PAS (ácido peryodico y reactivo
de Schiff) y para polisacáridos ácidos el método del Azul de Alcian (Alcian
Blue).
C-Lípidos: colorantes del tipo Sudan III, el Escarlata R o Sudan IV, el Sudan
negro B (Sudan black B).
También se pueden determinar ciertas sustancias utilizando las Técnicas
inmunohistoquimicas, usando anticuerpos específicos marcados para ciertos
elementos puntuales.

19. MICROSCOPIO
 Microscopio simple: o lupa, consta de una sola
lente y se utiliza en materiales vivos
 Microscopio compuesto: Llamado así por estar
formado por tres tipos de lente: Ocular,
Objetivos y el Condensador

20. Descripción del
microscopio
Consta de dos partes
fundamentales:
1- Parte óptica:
• Ocular.
• Objetivo.
• Sist. De inluminacion.
2- Parte mecánica:
1- Pie.
2- Columna.
3- Tubo.
4- Mecanismo de
movimiento.
5- Platina.

21. Ocular
Es cilindro hueco metálico, provisto de una lente o un
sistema de lentes convergentes, cuya finalidad es
aumentar la imagen real e invertida enviada por el
objetivo. Actúa como una lupa y forma una imagen
virtual, significa que se forma del lado del objeto.

22. Objetivo
Es la parte mas
importante de un
microscopio.
Consta de varios
lentes, que actúan
en conjunto como
si fuera uno solo,
tratando de
corregir las
llamadas
aberraciones de
esfericidad y
cromática.
El objetivo manda al ocular una imagen magnificada, real, e
invertida del objeto que observamos, el lado derecho de la
preparación, aparece a la izquierda de la imagen, el lado superior
del preparado, se ve en el lado inferior de la imagen.

23. Aparatos de
iluminación
Son:
1- el espejo.
2- el
condensador.
3- el diafragma-
iris.

24. Parte mecánica:
También
denominado
estativo o montura
del microscopio.
Se compone de
las siguientes
partes:
1- Pie.
2- Tubo..
3- Columna
4- Mecanismo de
movimiento.
5- Platina.

25. Mecanismo de movimiento:
Para facilitar el
desplazamiento del
tubo y lograr un
enfoque correcto,
estan provistos de
un dispositivo de
tornillos,
denominados,
sistema de
movimiento rápido
y sistema de
movimiento lento.

26. MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO
1) Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina
completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya
debería estar en esas condiciones.
2) Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3) Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de
10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
4) Para realizar el enfoque:
a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo
macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que
se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de
ellos o ambos.
b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de
la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el
micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
5) Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser
suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar
de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el
objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy
poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances:
Incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo
con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo
de inmersión.

27. TECNICA DE MICROSCOPIA ELECTRONICA:
1- Utilizar fragmentos de menos de 1mm.
2- Proceder más rápidamente a la fijación, con tetróxido de osmio,
aldehído glutárico o glutaraldehido agregando o no ácido tánico.
3- Deshidratación.
4- Inclusión en resinas epoxi quedan la dureza necesaria para
obtener los cortes finos que la observación exige (200 Å a 0,1
micrómetro).
5- Cortar con ultramicrotomo de avance muy lento y cuchillas de
vidrio o diamante.
6- Recepción de los cortes en agua, luego en rejilla de cobre y
recubierta por una delgada película plástica, la que será la que
sostenga el corte.
7- Pase por ácido osmico, acetato de uranilo, sales de plomo, etc.
8- Observación en pantalla fluorescente.
9- Toma de fotografías y ampliaciones a voluntad.

28. Diferentes tipos de Microscopios
1) Microscopio Electronico
 Es el instrumento que por su alto poder de resolución nos permite
ver y conocer la ultraestructura de la célula.
Las lentes son remplazadas por bobinas electromagnéticas.
La fuente de energía utilizada, es un haz de electrones. El que se
genera calentando un filamento de tungsteno y son acelerados con
alto voltaje.
Los electrones son invisibles y la imagen que forman se observa
mediante una pantalla fluorescente o se registra fotográficamente. Se
requiere el máximo de delgadez del espécimen para la mejor
absorción de los electrones y para que estos puedan atravesarlos.
Los cortes son de 1/40 u (250 A) de espesor, que se logra con el
ultramicrotomo

29. 11) Los instrumentos modernos permiten
aumentos de más de 160.000 veces,
que mediante amplificaciones
fotográficas pueden aumentarse más
de 1.000.000 de veces.
12) Este aparato es el denominado
Microscopio Electrónico de
Transmisión (MET). Existen
microscopios electrónicas de alto
voltaje que se usan en metalurgia y
también en biología.
13) También tenemos el Microscopio
Electrónico de Barrido (MEB) o de
Scanning, con el que se estudian
imágenes tridimensionales ya que la
observación se produce sobre la
superficie del espécimen.

30. Microscopio de fluorescencia
Con este microscopio la observación se realiza con
luz ultravioleta, y los componentes se reconocen
por la fluorescencia que emiten en el espectro
visible. En la práctica la luz ultravioleta se enfoca
sobre el espécimen, la luz es absorbida por ciertas
estructuras, qua luego la emite dentro de la banda
visible. La radiación emitida por el compuesto,
aparece brillante sobre fondo oscuro.
Microscopio de luz ultravioleta
Emplea luz ultrvioleta en lugar de luz visible. La
imagen se registra en películas fotográficas dado
que la luz ultravioleta es invisible. Posee una
resolución mayor que el microscopio óptico. Se lo
emplea para estudiar estructuras que posan ácidos
nucleicos.

31. OTROS TIPOS DE
MICROSCOPIOS
 Ultramicroscopio.
 Microscopio de contraste de fase.
 Microscopio de interferencia.
 Microscopio confocal.
 Microscopio de polarizacion.
 Microscopio de fuerza atomica.

32. Unidades de medida en microscopia
Denominación:
Antigua Actual Valor
micrón o micra micrómetro milésima de milímetro
µ µm
milimicra manómetro millonésima de milímetro
mµ nm
ángstrom décima de nanómetro diez millonésima de milímetro
Å