Excelente libro para trabajos de Enfermería.

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Nutrigenética y epigenética:
técnicas de SNP y MSP
PRÁCTICA 46
P. Cordero Sánchez, F. I. Milagro Yoldi y J. Campión Zabalza
INTRODUCCIÓN
Entre el 40 y el70 % del peso corporal se ha
atribuido a la herencia genética, con más de 600
regiones cromosómicas potencialmente implica-
das. La nutrigenética estudia la relación entre las
diferencias interindividuales en la secuencia del
ADN y la distinta respuesta a la ingesta de los nu-
trientes. A otro nivel, la epigenética se centra en
el estudio de modificaciones covalentes sobre el
ADN que, sin variar su secuencia de nucleótidos,
puede regular su expresión.
Los polimorfismos son variaciones en un
punto determinado de la secuencia nucleotídica
del ADN presentes en más del 1% de la población
y que pueden estar asociados a patologías como
la obesidad y otras enfermedades metabólicas. Los
más estudiados son aquéllos en los que un nucle-
ótido es sustituido por otro. Su diagnóstico puede
llevarse a cabo mediante PCR (reacción en cadena
de la polimerasa) de discriminación alélica y ayu-
dar al establecimiento de un tratamiento nutricio-
nal basado en el genotipo individual.
El principal mecanismo de regulación epigené-
tica resulta de la adición de un grupo metilo en ci-
tosinas seguidas de guanina (sitios CpG). Estos dí-
meros abundan en regiones promotoras de muchos
genes y un aumento en su metilación está con fre-
cuencia asociado a una represión en la expresión del
gen. Este patrón de metilación es potencialmente he-
redable por la descendencia y modificable por los
hábitos dietéticos y estilos de vida (Fig. P46-1).
OBJETIVO
Los objetivos de esta sesión práctica son deter-
minar la presencia de un polimorfismo en la secuen-
cia de ADN (SNP, Single Nucleotide Polymorphism)
y analizar los niveles de metilación del ADN en una
zona concreta de la región promotora de un gen
(MSP, Methylation Specific PCR).
PROCEDIMIENTO
Fundamento
PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
Esta técnica de biología molecular tiene como
objetivo la amplificación de un fragmento defi-
Figura P46-1. Regulación
del patrón de metilación del
ADN.
Hábitos de vida
Enfermedades
Dieta
Cambios en patrón
de metilación
Citosina metilada
Citosina no metilada
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2. Parte II. Metodología y aplicaciones398
nido de ADN presente en una muestra. El proceso
se basa en la repetición de una serie de ciclos, nor-
malmente entre 25 y 40, con las siguientes fases:
1. Desnaturalización, en la que se produce la se-
paración de las hebras de ADN a alta tempe-
ratura.
2. Unión de los cebadores a su secuencia comple-
mentaria de ADN a partir de la cual se iniciará
la replicación. La temperatura de este proceso
varía entre 50 y 65 grados dependiendo del nú-
mero de nucleótidos de los cebadores y de su
proporción de bases púricas y pirimidínicas.
3. Elongación: la enzima ADN polimerasa sinte-
tiza una nueva hebra complementaria a la
molde en sentido 5´ → 3´, siendo la más em-
pleada la Taq polimerasa, de actividad óptima
a 72 ºC (Fig. P46-2).
El aparato empleado para llevar a cabo la re-
acción es un termociclador. Cuando se requiere
monitorizar a tiempo real la reacción de PCR
(rtPCR) se le acopla un medidor de fluorescencia
y los cebadores se diseñarán para que durante el
proceso de elongación desprendan moléculas emi-
soras de fluorescencia.
SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Su determinación está basada en una PCR a
tiempo real. Las sondas Taqman diseñadas son
complementarias a cada uno de los alelos de los
SNP y están marcadas con distintos fluorocromos
(normalmente VIC y FAM). Mediante la detec-
ción de la fluorescencia emitida por cada una de
las sondas durante la PCR se puede conocer el ge-
notipo del polimorfismo (Fig. P46-3).
MSP (Methylation Specific PCR)
La realización de esta técnica requiere un tra-
tamiento previo del ADN con bisulfito sódico
para transformar las citosinas no metiladas en
uracilos, mientras que las metiladas permanecerán
inalteradas (Fig. P46-4).
Se diseñan los cebadores para analizar la me-
tilación de una zona CpG específica, normalmente
la región promotora de un gen. Los cebadores am-
plifican una secuencia de 300 pares de bases de
tamaño máximo y son diseñados en parejas tanto
para el ADN metilado como para no metilado.
Figura P46-3. Detección de
un SNP mediante discrimi-
nación alélica de fluorescen-
cia.
Figura P46-2. Amplificación
del ADN durante la PCR.
1 2
ciclo 1
4
ciclo 2
8 2n
ciclo 3 ciclo n
ciclos ciclos
A/A
A/G
G/G
Fluorescencia
(fluorocromoA)
Fluoresencia
(fluorocromoA)
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3. Posteriormente a la reacción de PCR se realiza
una electroforesis en gel de agarosa cuantificando
mediante un transiluminador la intensidad de
cada una de las dos bandas amplificadas para
cada muestra; para el ADN metilado y para el no
metilado (Fig. P46-5).
Material y equipos
Extracción de ADN
• Kit para la extracción de DNA, disponible en
distintas casas comerciales.
• Microcentrífuga.
• Espectrofotómetro.
SNP
• Termociclador con medidor de fluorescencia.
• Sondas Taqman marcadas con distintos fluoro-
cromos (VIC y FAM).
• Reactivos para la PCR a tiempo real.
MSP
• Termociclador.
• Equipo de electroforesis.
• Transiluminador.
• Kit para tratamiento con bisulfito sódico.
• Reactivos para la PCR (ADN polimerasa, Buf-
fer 10 X, MgCl2
, nucleótidos y agua de biología
molecular).
• Cebadores para ADN metilado y no metilado.
• Agarosa.
• Tinción SYBR de ADN para geles.
• Tampón TBE.
Protocolo
Extracción de ADN
La obtención del ADN genómico de partida
para los posteriores análisis se realiza mediante el
protocolo de extracción del kit específico para ex-
tracción de DNA. La calidad y cantidad del ADN
final se analiza por espectrofotometría.
SNP
Para el análisis de la presencia de un polimor-
fismo en una población hay que tener en cuenta
Práctica 46. Nutrigenética y epigenética: técnicas de SNP y MSP 399
Figura P46-4. Tratamiento
con bisulfito de citosinas
metiladas y no metiladas,
donde se puede apreciar que
la citosina no metilada tras
la reacción de PCR pasa a ti-
mina y la metilada se man-
tiene.
Figura P46-5. Gel de agarosa para el análisis de la me-
tilación de dos muestras.
C G U G T G
C
met met met
G C G C G
bisulfito PCR
Marcador de
peso molecular
no met no met
met met
muestra 1 muestra 2
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4. Parte II. Metodología y aplicaciones400
tanto su prevalencia en la muestra como su posi-
ble repercusión en el ámbito de investigación que
se quiera realizar, en nuestro caso con la salud.
Para ello, existen distintas bases de datos como la
del proyecto HapMap (www.hapmap.org), un
proyecto de desarrollo de un mapa de haplotipos
del genoma humano.
Tras la elección del polimorfismo de interés se
seleccionan sus cebadores comerciales correspon-
dientes marcados con los fluorocromos VIC y
FAM según el haplotipo.
Para la PCR se añaden 5 µL de muestra de
ADN genómico a una concentración de 10 ng/µL,
4,5 µL de MASTER MIX comercial preparada y
0,25 µL de la sonda marcada con fluorocromo es-
pecífico en cada pocillo de la muestra. Se realizan
duplicados de cada muestra para cada una de las
dos sondas marcadas. La programación de la re-
acción de PCR en el termociclador con medidor
de fluorescencia integrado será de 40 ciclos de
copia con una temperatura durante la fase de
unión de los cebadores de 72 o
C.
Para el análisis de los resultados, comparar los
obtenidos con la figura P46-3.
MSP
Tratar 1 µg de ADN genómico con el kit de
bisulfito sódico siguiendo el protocolo.
El diseño de los cebadores se realiza me-
diante el programa informático METHPRIMER
(www.urogene.org/methprimer/index1.html). Pri-
mero se selecciona la zona a estudio: el promotor
(o, en ocasiones, inicio de la transcripción) de un
gen, de aproximadamente 1.000 pares de bases
previos al inicio de la transcripción, con alta den-
sidad de sitios CpG, denominada isla CpG. Los
cebadores resultantes deben ser optimizados para
conocer su temperatura óptima para la unión al
ADN (se recomienda realizar una PCR en un ter-
mociclador con gradiente de temperatura), así
como el número de ciclos de amplificación para
poder apreciar con nitidez las bandas de la PCR
en un gel de agarosa, pero sin llegar a una satura-
ción en su exposición.
Tras la optimización de los cebadores se rea-
liza una PCR a número de ciclos óptimo aña-
diendo 1 µL del ADN tratado con bisulfito, 2,5 µL
de Buffer 10X, 1,5 µL de MgCl2
, 0,2 µL de la en-
zima ADN polimerasa, 1 µL de un mix de los 4
nucleótidos a 20 mM, 1 µL del mix de cebadores
a 20 mM y c.s.p. 25 µL de agua de biología mo-
lecular.
Tras la reacción de amplificación se realiza un
gel con TBE 1X y 1,5% de agarosa con tinción
SYBR de ADN. A los productos de la amplifica-
ción se le añaden 5 µL de tampón de carga y se
cargan en el gel, dejándolo correr en la cubeta de
electroforesis con TBE 1X durante 1 hora a 100
voltios.
El gel resultante se analiza con un transilumi-
nador, con el que se cuantifica la intensidad de
cada una de las bandas, la referente al ADN me-
tilado y la de ADN no metilado.
intensidad banda metilada
% metilación = ––––––––––––––––––––––––––– × 100
intensidad banda metilada +
intensidad banda no metilada
BIBLIOGRAFÍA
Campión J, Milagro FI, Martínez JA (2009). Individua-
lity and epigenetics in obesity. Obes Rev 10: 83-392.
Cordero P, Milagro FI, Campión J, Martínez JA (2010).
Epigenética nutricional: una pieza clave en el rom-
pecabezas de la obesidad. Rev Esp Obes 8:10-20.
Livak KJ (1999). Allelic discrimination using fluorogenic
probes and the 5´ nuclease assay. Genet Anal
14:143-149.
Ordovas JM, Mooser V (2004). Nutrigenomics and nu-
trigenetics. Curr Opin Lipidol 15:101-108.
PRESENTACIÓN DE RESULTADOS
SNP
Tipo de polimorfismo.
MSP
Porcentaje de metilación.
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