Este documento resume las técnicas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. Explica las etapas generales de estas técnicas, incluyendo la obtención de muestras, fijación, unión con anticuerpos y detección de la reacción. También describe los tipos de anticuerpos, métodos de detección e importancia del análisis de imágenes para extraer información cuantitativa de las muestras.

1. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 1 Técnicas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

2. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 2 Generalidades

4. Se puede demostrar la presencia de antígenos de ubicación subcelular

5. Doble marcado permite la detección simultánea de dos antígenos y por tanto hay una comparación relativa

7. Puede ser medida la concentración aproximada de un antígeno (Softwares analizadores de imágenes)

9. Fijación

10. Unión con anticuerpos

12. Centrifugado de células en suspensión colocadas en un portaobjetos

13. Frotis de tejido

15. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 8 Fijación Ideal: Inmovilizar al antígeno sin modificarlo Mantener la estructura celular Permitir el acceso de los anticuerpos Realidad: Muchos epítopes son enmascarados o alterados y los anticuerpos pueden no reconocerlos (Tratamientos con tripsina)

16. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 9 Fijadores más utilizados

18. Producen una fuerte señal

19. El exceso de anticuerpos eventualmente puede producir una inhibición alostérica

20. Requiere controles

23. Trabajan bien en células o tejidos bien fijados

24. La mayoría no funciona con paraformaldehído

25. Ocasionalmente existe reacción cruzada

28. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 15 Técnica Directa Anticuerpo primario Antígeno

29. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 16 Técnica Indirecta Anticuerpo Secundario Anticuerpo primario Antígeno

30. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 17 Pool de anticuerpos monoclonales Anticuerpos policlonales Anticuerpos Monoclonales Intensidad de la señal Excelente Regular a buena Excelente Excelente Especificidad Buena Excelente Cualidad Señal intensa Especificidad Especificidad Disponibilidad Desventaja Señal baja No reutilizable Background Titulación

31. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 18 Agente patógeno Antígenos

32. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 19 Portaobjeto Frotis o impronta

33. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 20

34. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 21 Congelación Frotis o impronta Fijación en formalina Corte por congelación Inclusión en parafina Fijación

35. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 22 Resumen de pasos para la obtención de una muestra

36. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 23 Técnica de inmunofluorescencia

37. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 24 FLUORESCENCIA Es la capacidad que tienen algunas moléculas de emitir luz mientras están siendo estimuladas de modo adecuado. No confundir con la fosforescencia que es la emisión de luz con posterioridad a la estimulación,cuando ésta última ha cesado.

39. La radiación de excitación se transmite a través de los objetivos hacia la superficie de la muestra

40. La radiación absorbida por el fluorocromo hace que sus electrones salten a un nivel superior de energía, al volver a su estado normal libera energía como luz

41. Pueden observarse dos fluorocromos en la misma muestra

43. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 27 Los fluorocromos(colorantes fluorescentes) al ser estimulados con fotones de una determinada longitud deonda, denominada de absorción o excitación, emiten otro fotón de mayor longitud de onda, es decircon menor energía. El fluorocromo prototipo es la fluoresceína que al ser estimulada con luz azul (abs.máx. a495 nm) emite luz verde (emisión máxima a 520 nm).Tanto la excitación como la emisión no son exactas a esa longitud deonda: aunque la excitación de la fluoresceína sea máxima a495 nm, también es posible estimular (menos eficazmente) con 470 o con 510 nm, puesto que en realidad lalongitud de onda de excitación es una campana de Gauss (espectro de absorción). Siempre que se hable deexcitación y emisión de un fluorocromo se entiende que se está hablando de los valores máximos.

44. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 28

45. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 29 FUENTE DE LUZ Los microscopios de fluorescencia convencionales y algunos citómetros de flujo antiguos tienen como fuente emisora de fotones a una lámpara de arco de mercurio. La longitud de onda de excitación se consigue con filtros ópticos que solo dejan salir el tipo de luz de excitación que deseemos. En la actualidad, prácticamente todos los modelos de citómetros y los microscopios confocales llevan una fuente emisora de luz coherente (láser).Cada tipo de láser emite los fotones en una o varias longitudes de onda determinadas conocidas como líneas del láser. La energía de emisión que define una determinada línea se produce al caer un electrón electrón de una órbita alta a otra baja y por tanto vendrá determinada por la estructura atómica del gas contenido en el cañón láser.

46. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 30 FUENTE DE LUZ Los emisores láser más empleados son los de helio-neón (atómicos), argón-kriptón (iónicos) y helio-cadmio (moleculares). Recientemente se han empezado a introducir los basados en semiconductores (láser diodo) y en tecnología multifotón que permite estimular con mayor energía que la propia de la longitud de onda al hacer incidir, simultáneamente sobre el objeto, varios fotones que suman sus energías.

47. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 31 FLUOROCROMOS Existen cientos de fluorocromos cada uno de ellos con diferentes rangos de excitación y emisión. Los que más se usan son los que se excitan con la longitud de onda de emisión de los laseres que disponemos en los equipos de citometría de flujo y microscopía confocal. Los fluorocromos pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad que tienen algunos de unirse a determinadas moléculas u organelos tales como los colorantes de ácidos nucleicos: ioduro de propidio, bisbencimidas, etc.Pero lo más habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a otras moléculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo específico a estructuras concretas de la célula.

48. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 32 Propiedades de los fluorocromos más utilizados Excitación Emisión Fluorocromo Color DAPI 365 Sobre 420 Azul Verde Fluoresceina 495 525 Rodamina 552 570 Rojo Rojo Texas red 620 596

49. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 33 Espectros de emisión (visibles) de los fluorocromos más usados

50. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 34 Piscirickettsia salmonis

51. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 35 P. salmonis mediante microscopía confocal

52. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 36 Modificación de la técnica de inmunofluorescencia para la detección deP. salmonis mediante microondas (Larenas y col., 1996)

53. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 37 Técnicas de inmunohistoquímica

54. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 38 DAB AEC Fast red HRP HRP Fosf. Alc. Precipitado café Precipitado rojo Precipitado rojo 3 Precipitado coloreado Sustancia cromógena Peroxidasa (HRP) o Fosfatasa alcalina Enzima 2 Estreptoavidina Biotina Anticuerpo secundario marcado con biotina 1 Anticuerpo primario (Ratón, conejo, cabra, rata, cuy, oveja) Detección mediante reacción estreptoavidina-biotina

55. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 39 Sistema de detección fosfatasa alcalina Precipitado rojo Fast red Fosfatasa alcalina Anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina 2 1 Anticuerpo primario (Conejo) Antígeno

56. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 40 Sistema de detección APAAP Precipitado rojo Alkaline phosphatase-anti alkaline phosphatase complex Fast red Fosfatasa alcalina Anticuerpo monoclonal marcado con fosfatasa alcalina 3 2 Anticuerpo secundario (Anti-inmumoglobulina de ratón) 1 Anticuerpo primario (Ratón) Antígeno

57. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 41 Sistema de detección APAAP Precipitado rojo Alkaline phosphatase-anti alkaline phosphatase complex Fast red Anticuerpo monoclonal marcado con fosfatasa alcalina Fosfatasa alcalina 4 Anticuerpo anti-ratón 3 Anticuerpo secundario (Anti-conejo) 2 1 Anticuerpo primario (Conejo) Antígeno

58. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 42 Leiomioma: Fibra de actina específica de músculo liso. Inmunoperoxidasa (DAB) Melanoma: reconocimiento de antígeno de membrana intracelular específico del tumor. Inmunoperoxidasa (DAB)

59. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 43 Mieloma: Detección de un antígeno específico de células B alteradas. Inmunoperoxidasa. DAB. Reconocimiento de macrófagos en un ganglio linfático. Inmunoperoxidasa. AEC.

60. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 44 TVT: Proliferación celular de linfocitos. Fosfatasa alcalina. Epitelio alveolar: Virus PI3 en pulmón de ovino. Epìtelio infectado. Inmunoperoxidasa. DAB.

61. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 45

62. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 46

63. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 47 Corte de ovario de trucha arco iris negativo a P. salmonis.Inmunoperoxidasa AEC. 100X. Tejido renal proveniente de una hembra trucha arco iris inoculada con P. salmonis. Inmunoperoxidasa AEC 400X.

64. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 48 Análisis de imágenes

65. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 49 ANALISIS DE IMAGEN en biología y medicina. Los sistemas de análisis de imagen están diseñados para extraer información y transformarla en valores numéricos lo que nos permite exprimir la información contenida en la imagen, esta información puede sernos entregada en forma de imágenes retocadas o en falsos colores

66. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 50 ANALISIS DE IMAGEN en biología y medicina. Podemos obtener información, entre otras, sobre la forma, área y densidad óptica de los objetos. Existen magníficos sistemas de análisis de imágenes tanto comerciales como shareware. Los primeros tienen un costo excesivo y solo están al alcance de empresas y departamentos universitarios. Pero los sistemas shareware o de libre dominio son casi tan buenos como los comerciales y nos permiten aprender y adquirir experiencia sin necesidad de costosas inversiones entre ellos los mejores son: Image Tools (sólo para WIndows), NIH image (Para Mac y Windows) y TN-image (para MS-DOS y UNIX), este último aunque parezca anticuado, está muy bien programado tiene una gran potencia funcionando bajo MS-DOS.

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69. PROCESADAS SEGÚN PROCEDIMIENTO ESTANDAR PARA INCLUSION DE CORTES HISTOLOGICOS EN RESINA LR WHITE Y EPON.Uso de inmunoperoxidasa en microscopía electrónica

71. 4 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min.

72. BLOQUEAR CON TBS/BSA 1% POR 30 min.

73. ESCURRIR LA GRILLA EN PAPEL FILTRO.

74. INCUBAR ANTICUERPO POLICLONAL ANTI P.salmonis (DESARROLLADO EN CONEJO) 1:50 POR 2 hrs.

75. 4 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min .

76. INCUBAR ANTICUERPO ANTI CONEJO (CON BIOTINA) POR 1 hr.

77. 4 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min .Uso de inmunoperoxidasa en microscopía electrónica

79. 4 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min.

80. INCUBAR CON CROMOGENO AEC 10 min.

81. 2 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min.

82. 2 LAVADOS CON AGUA BIDESTILADA POR 5 min.

83. TEÑIR CON ACETATO DE URANILO AL 4% EN AGUA DESTILADA 5 min. Y CITRATO DE Pb DE REYNOLDS POR 5 min.Uso de inmunoperoxidasa en microscopía electrónica

84. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 55 Microscopia electrónica de transmisión Técnica de inmuno-oro (P. salmonis) Anticuerpo marcado con oro Oro Anticuerpo primario Antígeno

85. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 56 DAB AEC Fast red HRP HRP Fosf. Alc. Precipitado café Precipitado rojo Precipitado rojo 3 Precipitado coloreado Sustancia cromógena Peroxidasa (HRP) o Fosfatasa alcalina Enzima 2 Estreptoavidina Biotina Anticuerpo secundario marcado con biotina 1 Anticuerpo primario (Ratón, conejo, cabra, rata, cuy, oveja) Detección mediante reacción estreptoavidina-biotina

86. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 57 Microscopia electrónica de transmisión 1m 1m Técnica de inmunoperoxidasa (P. salmonis) Control negativo. Células provenientes de cultivo de tejido CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC. 10200 X. Control positivo células CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC. 16500X.

87. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 58 1m 1m RESULTADOS Control positivo células CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC 10200X. Control positivo células CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC. 7200X

88. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 59 RESULTADOS 1m Se observan varias P. salmonis unidas al corion de la ova mediante prolongaciones denominadas CAP. 6700x Control positivo células CHSE-214, infectadas con P. Salmonis. Inmunoperoxidasa AEC. 16500X. Control positivo células CHSE-214, infectadas con P. salmonis. Inmunoperoxidasa AEC. 15000X.

89. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 60 RESULTADOS 1m 1m Muestra de ovario día 20 p.i. Inmunoperoxidasa AEC. 27750X. Muestra de ovario día 10 p.i células CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC. 4350X.

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91. Células CHSE-214 Efecto citopático Piscirickettsia salmonis Piscirickettsia salmonis marcado con oro

92. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 63 INMUNODOT

94. Instalación de membrana PVDF en Bio-Dot®

95. Conexión Bio-Dot® en bomba de vacío

97. Incubación con 2º anticuerpo

98. IgG de Ratón anti-P. salmonis

99. Durante 2 horas

100. Anti IgG de ratón

101. Dilución 1:5.000

102. Durante 1 hora

103. Dilución 1:10.000

105. Generación de quimioluminiscencia

106. Exposición de membrana a película fotosensible, de 2 a 8 min.

109. Cada muestra positiva genera Nº de Píxeles.

110. Estas se comparan porcentualmente entre ellas respecto a un 100% que sería número de píxeles generados por la muestra control positivo o suspensión bacteriana usada en el desafío de ovas.

111. En base estos datos se compararían las cinéticas de infección generadas en una misma especie de ova por las distintas cepas de P. salmonis.

113. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc. 70 Gráfico: Detección mediante Dot Blot quimioluniscente de muestras en concentraciones crecientes de P. salmonis y cultivo celular sin infectar.