Analisi dell’interazione di peptidi antimicrobici su membrane cellulari
1. UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SALERNO
Facoltà di Farmacia
Corso di Laurea in Chimica e Tecnologie Farmaceutiche
Anno accademico 2009/2010
Relatore:
Prof. Stefano Piotto Piotto
Candidato:
Nappi Maria Luisa
Matr. 07302/00066
Analisi dell’interazione di peptidi antimicrobici su
membrane cellulari mediante dinamica molecolare
2. Sviluppo di un nuovo algoritmo per la costruzione di membrane, in
particolare è stata realizzata una membrana modello di globulo rosso
umano,
Chiarire il comportamento di tali modelli di membrane in presenza di
alcuni peptidi antimicrobici e valutare i meccanismi d’interazione di questi
sulle membrane mediante tecniche di docking e MD.
Obiettivi del progetto di tesi:
3. Condizioni di
simulazione:
PBC, condizioni
periodiche,
NPT, Numero di
moli , Pressione (1
atm) e Temperatura
(310 K ) costanti,
pH 7,
NaCl 0,9%,
Force field
AMBER03,
Controllo
combinato della
pressione (1atm) e
della densità
dell’acqua (0,997
gml),
Minimizzazione,
Dinamica
molecolare di 5 ns.
4. [41]: Kučerka, N., Tristram-Nagle, S., Nagle, J.F. "Structure of fully hydrated fluid phase lipid bilayers with monounsaturated. J.Membr.Biol 208:193-
202 (2005)
[42]: J.C. Mathai, S.Tristram-Nagle, J.F. Nagle and M.L. Zeidel "Structural Determinants of Water Permeability through the Lipid Membrane",
Volume 131 Number 1 January 2008 69–76.
[43]: Donald E. Elmore; "Molecular dynamics simulation of a phosphatidylglycerol membrane", FEBS Letters 580 (2006) .
[44]: M.Pasenkiewicz-Gierula, K.Murzyn, T.Róg and C. Czaplewski "Review Molecular dynamics simulation studies of lipid bilayer system, Acta
Biochimica Polonica Vol 47.
[45]: T. Róg, M. Pasenkiewicz-Gierula"Cholesterol effects on a mixed-chain phosphatidylcholine bilayer: A molecular dynamics simulation
study,Biochimie 88 (2006) 449-460.
[46]: Hamilton, James A., Biophys. J. 95, 6, 15 -2008, 2792-2805
Lipide
[Riferimento]
Macro Yasara
Area lipide
(Å2
)
Spessore
(Å)
POPC [41] 68,3
POPC [42] 68,30 27,1
POPC [43] 66,40 36,8
POPC [44] 64,50 35–41
POPC [45] 63,50 35,5
POPC mcr 66,06 36
POPC mcr 66,06 36.5
SM-CHOL [46] 49.5 36.6
SM-CHOL mcr 48.61 35.58
Valori
sperimentali
Valori
ricavati
dalla
letteratura
Porzione della membrana di POPC.
v
Validazione delle membrane:
5. Fosfolipidi
Composizione in percentuale (%)
Valori della
composizione media
presenti in
letteratura (1)
Composizione
dell’outer layer
PC 17% 25%
SPM 18% 37%
CHL 23% 37%
PS 7% 1%
Glicolipidi 3%
Altri 31%
(1)
D.E Vance and J. E. Vance, Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes Q 1996 Elsevier Science.
Composizione fosfolipidica della membrana del globulo rosso umano:
7. Numero Atomi 98150
Residui dipalmitoilfosfatidilcolina 72
Residui colesterolo 208
Residui sfingomielina 208
Residui dioleilfosfatidilserina 8
Residui H2O 14253
Area lipide 42.11 Å2
Spessore 50.2 Å
Asse X 90 Å
Asse Z 101,60 Å
Asse Y 104,46 Å
Caratterizzazione della
membrana del globulo rosso:
8. 2
Review Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies R.W. Hancock & H.G.Sahl, Nature
Biotechnology Vol. 24 n.12 DEC 2006
I Peptidi Antimicrobici
2
9. Nome Sequenza
PDB
ID
AA
Carica
netta
Fonte Struttura
Aureina 1.2
GLFDIIKKIAESF
1VM5 13 0
Southern
bell frog
α-elica
Aureina 1.2
RLFDKIRQVIRKF
2F3A 13 +4 Sintetico α-elica
Dermaseptina
_S4_K4
ALWKTLLKKVLKA 2DD6 13 +5 P.sauvagei α-elica
Ovispirina-1
KNLRRIIRKIIHIIKKYG 1HU5 18 + 8 Sintetico α-elica
Tritrpticina VRRFPWWWPFLRR 1D6X 13 + 4 Sintetico
Ricco in
aa
inusuali
Gli AMP presi in esame:
10. A differenza dei tradizionali studi di docking ligando–recettore proteico, l’analisi
nel mio progetto di tesi ha come recettore una membrana e come ligando un
peptide antimicrobico.
Visualizzazione dell’iniziale interazione dell’Aureina con la membrana di globulo rosso.
Docking molecolare:
11.
12. • Effettuare una scansione in superficie della
membrana nella sua eterogeneità mediante
cicli ripetuti di annealing riscaldamento,
• Risolvere i problemi relativi ai lunghi tempi di
calcolo altrimenti necessari per l’investigazione
di tali sistemi complessi,
• Originare file intermedi che corrispondono ai
complessi AMP- membrana con una buona
energia di binding.
Docking
Energie di
binding
(KJ/mol)
Dock0 -48,18
Dock1 -32,50
-30,82
-41,35
Dock2 -31,53
-46,58
Dock3 -50,34
-44,72
-49,06
Dock4 -42,10
-45,46
Dock5 -45,15
Dock6 -47,03
-55,28
Dock7 -39,89
Dock8 -45,80
-45,44
Lo script per effettuare il surface
docking consente di:
13. Sfingomielina= giallo ; colesterolo = ciano, dops = arancione e dppc= verde .
Dal docking alla dinamica molecolare:
Individuata la regione con la migliore interazione si passa alla dinamica molecolare
full atom. Si intende comprendere:
•Come interagisce il
peptide con la
membrana?
•Come risponde la
membrana alla
perturbazione?
15. Density profile della membrana di globulo rosso a t=0 ns.
In questo grafico sono evidenziati i tre componenti del sistema, rispettivamente in verde il peptide,
in rosso l’acqua ed in blu la membrana.
Analisi: Profilo di densità
19. Hessa T, Kim H, Bihlmaier K, Lundin C, Boekel J, Andersson H, Nilsson I, White SH, von Heijne G. Nature. 2005
20. • Sviluppo di un nuovo algoritmo che ci ha permesso di realizzare
membrane modello,
• Costruzione di un prototipo di una membrana modello di globulo rosso
tenendo in considerazione anche l’asimmetria della stessa,
• Definizione di tecniche di docking flessibile,
• Studio dei primi stadi dell’interazione dell’Aureina con una membrana
modello di globulo rosso,
• Validazione del meccanismo d’azione carpet model dell’Aureina.
Conclusioni:
21. In particolare desidero ringraziare:
• Il mio relatore, Stefano Piotto Piotto per l’opportunità datami di lavorare
nel suo team,
• La prof. Simona Concilio per la disponibilità e per l’ospitalità sempre
mostratami,
• La prima e l’attuale dottoranda, Erminia Bianchino e Federica
Campana,
• Il neodottore nonché ex-collega Marco Perone,
• Il lab13 e il lab I4B,
• L’ultimo ringraziamento ma non meno importante degli altri và alla mia
famiglia, alla quale dedico questo mio traguardo raggiunto.
GRAZIE a tutti voi
per l’attenzione.
22. • Staphylococcus aureus,
• Escherichia coli,
• Pseudomonas aeruginosa.
Gram positivi
Gram negativi
Membrane in preparazione per il futuro:
23. Fosfolipidi
Composizione in percentuale (%)
Valori in letteratura
PG (DOPG) 58
Cardiolipina 42
Dual Mechanism of Bacterial Lethality for a Cationic Sequence-Random Copolymer that Mimics Host-Defense
Antimicrobial Peptides, Raquel F. Epand et al, J. Mol. Biol. (2008) 379, 38–50
Composizione fosfolipidica della membrana di S.aureus:
Composizione fosfolipidica della membrana di E. coli:
Fosfolipidi
Composizione in percentuale (%)
Valori in letteratura
PG (DOPG) 6
PE (DOPE) 82
Cardiolipina 12
Fosfolipidi
Composizione in percentuale (%)
Valori in letteratura
PG 15.12
PC 4.05
PE 68.37
Cardiolipina 12.45
Composizione fosfolipidica della membrana di P. aeruginosa:
Modulation of quorum sensing in P. Aeruginosa through alteration of membrane properties, C. Baysse and others Microbiology
(2005), 151, 2529–254.
S.R. Dennison et al, Chemistry and Physics of Lipids 151 (2008) 92–102.
24. Pulling dell’Aureina all’interno della membrana modello di globulo
rosso per valutare l’effetto dell’inserzione di questa minimizzando i
tempi richiesti altrimenti dell’ordine dei microsecondi.
Altre analisi da effettuare in futuro:
Notes de l'éditeur
SPIEGARE QUELLO CHE SI VEDE NEL VIDEO!!!
I valori presi in considerazione di area per lipide e spessore della membrana non sono gli unici parametri che sono stati considerati ma quelli che più frequentemente sono valutati per la validazione di sistemi lipidici.
Le membrane cellulari sono generalmente asimmetriche in quanto caratterizzate da composizioni in fosfolipidi differenti tra i due monostrati.
Perché IL GLOBULO ROSSO???? Caratterizzata meglio dal punto di vista della composizione sperimentale.
La membrana del globulo rosso quindi è stata costruita considerando quelli che sono i fosfolipidi più abbondanti nella composizione media ritrovata in letteratura e rispettando anche l’asimmetria riscontrata in tale membrana.
RACCORDARE meglio la prima parte con la seconda. Dopo la costruzione di membrane si è passati ad investigare il meccanismo di interazione di questi con le membrane cellulari.
ANTIMICROBICI e non solo : Antibatterici (Gram positivi e Gram negativi), Antifungini (Candida, Cryptococcus, Aspergillus), Antiparassitari (Malaria, Leishmania), Antivirali (Herpesvirus, influenza virus, HIV), Anticancro.
I peptidi sono stati modellati mediante metodi semiempirici PM3 e si visualizzano in base alle caratteristiche dei diversi residui che li costituiscono (idrofobici,polari,carichi o meno). Sono stati selezionati AMP ad alfa elica considerando che devono essere AMP che interagiscono su membrane.
La membrana è molto eterogenea quindi non possiamo fare una MD con membrane semplici, quali di SM-CHOL, DPPC,DOPS poiché non sappiamo quali residui della membrana sono coinvolti nell’interazione . E’ per questo che è stato sviluppato un secondo algoritmo che ci ha permesso di investigare la membrana nella sua completa eterogeneità, di indagare quindi quali domini lipidici siano importanti ai fini dell’attracco dell’AMP e di ridurre i tempi di calcolo che altrimenti sarebbero stati dell’ordine dei microsecondi.
SPIEGARE QUELLO CHE SI VEDE NEL VIDEO!!!
Come interagisce il peptide con la membrana (cambi conformazionali, residui, raft)?
Come risponde la membrana alla perturbazione?
Tra i parametri indagati abbiamo: ne abbiamo riportati solo alcuni per questioni di tempo a disposizione.
Spessore che aumenta per l’interazione dell’Aureina con la membrana oltre al fatto che già di per sé questo è più elevato rispetto alle altre membrane cellulari dato le code di 24atomi di carbonio della sfingomielina.
La densità del solvente viene monitorata per valutare come procede la simulazione.
RIASSUMENDO…
3 punto: con “binding pocket” con area superiore ai 10000 Å2 o meglio una superficie di legame.
