1. Raul Blas, 2010 Facultad de agronomia Dpto. Fitotecnia [email_address] Marcadores moleculares

2. Marker (Cambridge, 2002) a sign wich shows where something is. an action which is understood to represent or show a characteristic of a person or thing or feeling. Marcador Que marca (se ñ al que se pone a una persona o cosa para reconocerla), marca registrada …

3. Qué es un marcador? Un marcador es considerado como un carácter cuyo patrón de herencia puede definirse en un nivel morfológico (fenotípico), bioquímico o molecular. Se asocian marcadores con caracteres, para esclarecer la probabilidad de relación entre un locus genéticos y un carácter determinado

7. F2: AA 1/4 Aa 2/4 aa 1/4 (codominante) A- 3/4 aa 1/4 ( A dominante) No se puede distinguir AA o Aa Como se interpreta esto con marcadores moleculares: Aa aa AA Co-dominante Dominante Aa aa AA

9. Marcador morfológico

10. Visualización de los Fragmentos Amplificados Polimorfismo 1 2 M 1 2 M

13. Aislamiento de DNA ‘ CTAB’ Proteina/polisacaridos DNA Moler hojas Marcos Malosetti, 2007 Wageningen University + + cloroformo Transferir sobrenadante isopropanol Eliminar isopropanol, Disolver en H20, TE

14. Conceptos Enzimas de restricción (Endonucleasas): Son proteínas que reconocen secuencias cortas de nucleótidos específicas y cortan ADN en esas zonas. ADN Pst I

15. Iniciadores (“Primers”): Es una secuencia corta de ácido desoxirribonucleótido (ADN) que se ancla a una hebra del ADN molde. El cual se requiere para la síntesis de ADN in vitro (reacción de polimerización), ya que la ADN polimerasa solo no es capaz de iniciar la polimerización de ADN .

20. 2 x -2x, x= número ciclos

21. Preparación de gel para electroforesis

22. Electroforesis : Es el movimiento de una partícula cargada (ion) en un campo eléctrico. El movimiento se realiza en medio líquido que está sostenida por sustancia sólida inerte, como papel o gel semisólido.

23. Sistema de marcadores DNA DNA ******* probe Basados en hibridación RFLP, VNTR, oligonucleotide fingerprinting Basados en amplificación DNA RAPD, DAF, AFLP, SSR, MP-PCR, ISSR, IRAP, REMAP, STS, SCAR, CAPS Basados en secuenciamiento ATTAGTCTTACCTAGGAATCGATT TAATCAGAATGGATCCTTAGCTAA EST, SNP, DNA microarray Gupta et al., 1999

25. + Enzimas de restricción = digestión Electroforesis en geles de agarosa DNA genómico Southern Blot Esponja Gel Membrana Papel toalla Membrana con DNA transferido Hibridación con sonda Perfil de polimorfismo obtenido RFLP

26. Esta técnica se vale de la capacidad que tienen las enzimas de restricción para poder reconocer secuencias especificas a lo largo del genoma, de modo que una mutación puntual dentro del sitio de restricción resultará en la pérdida o ganancia de una secuencia de reconocimiento, dando origen a un fragmento de restricción de diferente longitud a la del original. Las mutaciones causadas por una inserción, deleción o inversiones en el DNA también llevan a variación en la longitud de los fragmentos de restricción. Los fragmentos del genoma generados por las enzimas de restricción son separados en un gel de agarosa para luego ser transferidos a un soporte sólido que puede ser una membrana de nylon o nitrocelulosa. La transferencia de los fragmentos de DNA desde la matriz de agarosa hasta la membrana se realiza por capilaridad. Una vez que se encuentran en el soporte sólido, el DNA digerido y separado, puede ser hibridizado con una sonda (DNA de una sola hebra) que debe estar marcada para su fácil detección. La sonda se hibridará en el lugar donde encuentre la zona complementaria a su secuencia. Para hacer visible el lugar donde se ha hibridado la sonda, ésta debe tener algún tipo de señal (marcaje) RFLP

27. Obtención de marcadores RFLP.

28. Random Amplified Polymorphic DNA RAPD Amplificación de ADN anónimo con cebadores de secuencia arbitraria

29. Temperatura de Hibridizacion: 36-42C RAPD: iniciaodores unicos , cortos y aleaoritos

31. RAPD: AMPLIFICA MULTIPLES REGIONES (MULTILOCI)

32. Correspondencia entre fragmentos amplificados y bandas en un gel _ +

33. Los RAPDs son marcadores dominantes 1 3 2 1 2 3 A A a A a a AA Aa aa

37. RAPD Reaccion PCR Electroforesis Tinción y visualización de los fragmentos de amplificación Polimorfismo con la técnica RAPD

40. Amplified Fragment Length Polymorphism AFLPs

41. ADN Genómico Digestión Ligación PCR1:Preamplificación Pcr2:Amplificación selectiva Electroforesis Autoradiografía Tinción Nitrato de plata Metodología de obtención de Marcadores AFLP Mse adapter Eco adapter Mse primer N N Eco primer Eco R I Mse I Mse primer NNN NNN Eco primer

42. GAATTC TTAA CTTAAG AATT Principios de la técnica AFLP 1. Digestión del ADN Genómico Eco RI Mse I AATTC T G AAT Liberación de fragmentos con terminales Eco RI y Mse I TTAA TA Adaptador Eco RI Adaptador Mse I 2. Ligación con adaptadores de secuencia conocida AATTC N N T TA TTAA G N N AAT

43. AATTC N N T TA TTAA G N N AAT 3. Amplificación preselectiva 5 T G 5 AATTC T NN NN C T TA TTAA G A NN NN G AAT AATTC T NN NN C T TA TTAA G A NN NN G AAT 5’ T TG AG G 5’ AATTC T TG TC C T TA TTAA G A AC AG G AAT 4. Amplificación selectiva Electroforesis en geles de poliacrylamida

44. Obtención de marcadores AFLP Polimorfismo en Arracacha, según la combianción de los iniciadres E-AAC/M-CTT.

46. Raul Blas

47. Simple Sequence Repeat SSR Sinónimos Microsatélites STR - Short Tandem Repeat STMS - Sequence Tagged Microsatelite Site SSLP - Simple Sequence Length Polymorphism

49. ADN genómico ...... CAGCCCGTAAATGTATCCATC ATTAGCTTTCGATAAAGACCA TCT C TCTCTCTC TCT CTC TCTCTC T CT C TGTGAAACCCAGTTGAATTAGAATTTTGAATTT ...... ...... GTCGGGCATTTACATAGGTAGTAATCGAAAGCTATTTCTGGT AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG ACACTTTG GGTCAACTTAATCTTAAAACTTAAA ...... Microsatélite (TC) 14

50. http://www.personal.psu.edu/faculty/j/e/jec16/Image02.htm OBTENCION DE MICROSATELITES

51. Tipos de SSR Perfectos: (CA) n Imperfectos: (CA) n – CCA – (CA) m Compuestas: (CA) n (TG) m Compuesta interrumpido: (CA)n –TG-(TG)m Compleja: (CA)n –TG-(TG)m (TA)r n, m y r = número de repeticiones del motivo GT n los mas extendidos en genoma de mamíferos At n la mas extendida en genoma de vegetales GA n mas abundante en cebada y arroz

52. Marcadores microsatélite Etapas de la técnica SSR incluyen: Huamani, 2008 1. Reacción PCR, con dos iniciadores especificos para un locus SSR 2. Electroforesis en geles Poliacrilamida o agarosa (casos muy limitados) I II III PCR en P 1 , 3 y 6 I II III PCR en P 2 , 2 y 5 IBT Gene Amp F1 F2 F3 1 4 7 5 6 8 0 ce 9 enter stop 2 3 F4 F5 I II III PCR en 1 y 4 100 pb 1000 pb M P 1 P 2 1 2 3 4 5 6

54. Los SSR son marcadores codominantes 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

58. Fases sucesivas en la creación de una nueva variedad 1. Gestion de recursos 2. Cambios en los genotipos 3. Selección (selección estabilizadora), 4. Multiplicación del genotipo mejorado

59. Poblaciones naturales, variedades nativas, … Idiotipo Contexto: Agronomico Industrial Alimenticio social Objetivos Biologia Tecnologia Tiempo Materiales Presupuesto Ganancia gen é tica M é todos de mejoramiento Mejoramiento genetico de plantas

60. Fases sucesivas en la creación de una nueva variedad 1. Gestion de recursos gen é ticos 2. Cambios en los genotipos 3. Selección (selección estabilizadora), 4. Multiplicación del genotipo mejorado

62. Capel et al. (2000)

69. AA BB x F 1 BC 1 F 1 F 2 RIL DH AB AB, BB AA, BB AA, AB? BB AA, AB, BB duplicacion F 1 xBB X X X X X X Retrocruza: BC1F1 Poblacion segregante filial 2: F2 Lineas endogamicas recombinantes: RILs Lineas de haploides duplicados: DH Tipos de poblaciones para mapeo

70. Determinación del orden Ejemplo: Par Frecuencia de Recombinación ---- ------------- A-B 0.1 B-C 0.1 A-C 0.2 A B C +----------+----------+ <- 0.1 -> <- 0.1 -> <- 0.2 -> No es posible otro orden!!!

72. Gebhart (2004)

73. Determinacion de sexo en plantas Phoenix dactylifera L

74. Ubicacion taxonomica: Family:Palmaceae Sub-family: Coryphyoideae Tribe:Phoeniceae Genus: Phoenix El genero Phoenix, presenta ~ 12 especies, incluida

78. CONVERTIR LOS MARCADORES AFLP A SCAR Secuenciar el fragmento y elaborar iniciadores especificos

80. Aplicabilidad de marcadores PVY-LB para mejoramiento

81. Objectivos: Identificación de clones con el gen Ry adg y Ry sto para inmunidad a PVY. Identificación de clones con genes R dem o R blb o QTLs (que gobiernen un alto porcentaje de la resistencia observada) para resistencia rancha (tizón).

84. Primers and its sequences used in genotipes screening

85. Resultados M= marcador de peso molecular (cada 100pb), la flecha indica el marcador con un peso molecular de 400bp M M M Tamizado para PVY Perfil de amplificación para 14 clones (primer M5)

86. ... Tamizado para PVY Perfil de amplificación para 18 clones (primer M17)

87. Identificacion de genes para resistencia a la rancha

88. S. phureja Clon 618 S. circaeifolium CIP-761030 (6b.25; 6b.39) F1 plantulas (~300) Analisis fenotipico Analisis molecular invernadero campo Analisis de datos, mapeo AFLP SSR selected clones Estrategia de trabajo para mapeo genetico x 92

90. Identificación de progenies hibridas

94. Dos cultivares de soya Identificación de variedades

95. Pureza genética

97. La selección asistida por marcadores y la selección fenotípica tradicional no son estrategias excluyentes y los programas de mejoramiento genético de mayor eficiencia se logran mediante una combinación de ambas estrategias. Consideración