2. Es un microscopio óptico, la luz que
incide sobre la muestra estudiada no la
atraviesa sino que el mismo lente
ilumina y recibe la luz emitida por la
muestra. Su funcionamiento se basa
en la propiedad de fluorescencia que
tienen ciertas moléculas denominadas
fluorocromos.
Los fluorocromos son sustancias que tienen
la propiedad de emitir un fotón de una
longitud de onda determinada cuando son
excitados por un fotón incidente de una
longitud de onda característica.
3. Fuente de emisión
Filtro de Excitación
Filtro de
barrera
Espejo dicroico
Muestra
1. La lámpara emite luz en
todo el espectro
2. El filtro de excitación
sólo deja pasar la parte del
espectro necesaria para
excitar la muestra
3. El espejo dicroico refleja
hacia la muestra la excitación
correspondiente.
4. La muestra se excita con la luz que le
llega y emite en un espectro superior al
de la excitación.
5. El espejo dicroico transmite
la emisión de la muestra
6. El filtro barrera hace una selección exacta
del espectro de emisión que nos interesa.
4. Filtro de excitación:
selecciona la luz de la
longitud de onda
incidente.
Espejo dicroico: refleja la
luz de ciertas longitudes
de onda mientras que
deja pasar la luz de
longitudes de onda
mayores.
Filtro de emisión o
barrera: selecciona la
longitud de onda
fluorescente emitida por
el fluorocromo
permitiendo que llegue
hasta los oculares.
Objetivos: Pata obtener
una intensidad de la
señal óptima se debe
emplear una apertura
numérica elevada y el
menor aumento posible.
6. CD4
Dapi
JAK3
Localización nuclear de
JAK3 en los linfocitos CD4.
Cada celda está representada con y sin núcleo
Dapi y, con y sin etiquetado CD4 para visualizar
mejor la presencia de JAK3 en el núcleo y
citoplasma.
7. CD4
Dapi
pY980-JAK3
Localización nuclear de JAK3
fosforilada en los linfocitos CD4.
Cada celda está representada con y sin núcleo
Dapi y, con y sin etiquetado CD4 para visualizar
mejor la presencia de JAK3 fosforilado en el
núcleo y citoplasma.
8. La microscopía de fluorescencia se aplica a la determinación cuantitativa de aminoácidos, proteínas, ácidos
nucleicos y muchos fluorocromos celulares.
Este tipo de técnica ha sido importante en el estudio de señalización de enfermedades como el SIDA.
Por primera vez, se muestra localización nuclear de JACK3.
El JAK3 se observa en su ubicación subcelular en cantidades comparables, en los núcleos de los linfocitos CD4 de
pacientes sanos e infectados porVIH.
El estudio demostró que la infección porVIH no afecta la localización nuclear de JAK3.
Se demostró que la JAK3 fosforilada es mas abundante en los núcleos de las células T CD4+ de los pacientes
virémicos, y puede estar implicado en la patogénesis de la infección.
Notes de l'éditeur
Muy buenas tardes en el día´ de hoy les expondré mi tema a cerca de la microscopia con epifluorescencia, ejemplificado con el articulo….
La parte de la molécula que emite la fluorescencia se denomina fluoróforo. Las moléculas de fluorocromo se utilizan para marcar ciertas estructuras celulares destacándolas del resto de los elementos que componen la célula. Esto permite identificar distintas moléculas o conjuntos de moléculas. El fluorocromo puede tener afinidad por distintos elementos celulares o puede ser acoplado químicamente a otras moléculas como anticuerpos que reconocen específicamente cierto componente celular.
La lámpara emite luz en todo el espectro
EL filtro de excitación solo deja pasar la parte del espectro necesaria para excitar la muestra.
El espejo dicroico refleja hacia la muestra la excitación correspondiente.
La muestra se excita con la luz que le llega y emite en un espectro superior al de la excitación.
El espejo dicroico transmite la emisión de la muestra.
El filtro barrera hace una selección exacta del espectro de emisión que nos interesa.
Filtro de excitación: selecciona la luz de la longitud de onda incidente
Espejo dicroico: refleja la luz de ciertas longitudes de onda mientras que deja pasar la luz de longitudes de onda mayores.
Filtro de emisión o barrera: selecciona la longitud de onda fluorescente emitida por el fluorocromo permitiendo que llegue hasta los oculares.
Objetivos: Pata obtener una intensidad de la señal óptima se debe emplear una apertura numérica elevada y el menor aumento posible.
Los autores han utilizado la técnica de la epifluorescencia, con diferentes fluorocromos y anticuerpos para identificar las estructuras de interés. Durante la infección por VIH, los linfocitos CD4 del paciente dejan de responder a la IL2 e IL7, estos defectos junto con muchos otros juegan un papel importante en la patogénesis del VIH que se caracteriza por una anergia parcial de linfocitos CD4 que precede a una caída en su cuenta. Se ha demostrado que la vía JAK/STAT participa en estos defectos, dado que el receptor de IL2 e IL7 esta unido al Jak3 siendo esencial para lo mecanismos de transducción de señales.
Como explicamos en la diapositiva anterior se utilizaron diferentes fluorocromos para teñir las diferentes estructuras que se deseaban estudiar en este caso la membrana de los CD4, su núcleo y por último la proteína JAK3. Y porque se tiñe la membrana de verde, el núcleo de azul y el JAK3 de rojo; porque cada uno tiene un anticuerpo que posee un fluorocromo que tiñe para esos colores y el microscopio los ve así. Podemos observar que la cantidad del JAK3 situados en el núcleo es aproximadamente la misma en donantes sanos y en pacientes con viremia.
En el JAK3 fosforilado observamos que las concentraciones en el sitio de activación Y980 fueron más altos en los núcleos de los pacientes viremicos en comparación con los pacientes sanos.