DNA Lesions, mutations and repairs

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DNA Lesions, mutations and repairs

  1. 1. Mutagenèse et Mécanismes de réparation de l’ADN Michel De Méo Janvier 2014 UE S6-2 Initiation à la Recherche en Toxicologie Génétique IMBE - UMR CNRS 7263 / IRD 237, Faculté de Pharmacie, AixMarseille Université, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 05 France
  2. 2. Plan du cours 1 – Lésions et Mutations de l’ADN 2 – Systèmes de réparation de l’ADN 3 - Conséquences
  3. 3. 1. Lésions de l’ADN : caractéristiques Biochimiques De L’ADN Double-Brins ADN: 2 brins antiparallèles liés par des liaisons H (bases)
  4. 4. 1. Les lésions de l’ADN Les lésions de l’ADN sont causées principalement par trois types d’agents: 1.1. Instabilité chimique intrinsèque de l’ADN (lésions spontanées) 1.1.1. Hydrolyse spontanée des nucléotides  sites abasiques 1.1.2. Désamination de C, A, G et 5-méthyl C  formation de U, 1.1.3. Tautomérisation des bases 1.2. Les sous-produits du métabolisme cellulaire (lésions endogènes) Espèces radicalaires (ROS, O2•, OH•, H2O2) Lésions variées: bases oxydées et hydroxylées, cassures de brin 1.3. Les agents environnementaux (lésions exogènes) Soleil (UVA et UVB), Radiations ionisantes, Produits génotoxiques 1.3.1: alkylations des bases 1.3.2. insertion de bases erronées 1.3.3. Intercalations 1.3.4. Pontages (inter- et intra-brins) 1.3.5. Cassures de brins (simples et doubles) 1.3.6. Adduits (petits et volumineux)
  5. 5. 1.1. Les lésions spontanées de l’ADN 1.1.1. Hydrolyse spontanée des bases Hydrolyse de la liaison N-glycosylique - carbone C1 du sucre et azote N9 de purine (A, G) - carbone C1 du sucre et azote N1 de pyrimidine (T, C) -élimination Sites abasiques Cassures de brin 2000 – 10 000 adénines/cellule/jour
  6. 6. 1.1. Les lésions spontanées de l’ADN 1.1.1. Hydrolyse spontanée des bases O N O désoxypyrimidine C1 du sucre et N1 de pyrimidine (T et C) N N N N O O O O O N N N désoxypurine C1 du sucre et N9 de purine (A et G)
  7. 7. 1.1. Les lésions spontanées de l’ADN 1.1.2. Désamination des bases H2 O NH2 O H N N N O N O NH3 Cytosine Uracile
  8. 8. 1.1. Les lésions spontanées de l’ADN 1.1.2. Désamination des bases Désamination Adénine → Changement d'appariement Hypoxanthine A-T ↓ H-C Uracile C-G ↓ U-A Xanthine G-C ↓ X-C Cytosine → Guanine → 1 - U s’apparie à A 2 - Transition d’une paire G-C en une paire A-T
  9. 9. 1.1. Les lésions spontanées de l’ADN 1.1.3. Tautomérisation des bases 1 – Les bases peuvent se présenter sous deux formes tautomères - Cétone (la plus fréquente) - Imino (pour A et C) ou Enol (pour T et G, les plus rares) Déplacement d’un proton et d’une double liaison 2 – tautomérisation spontanée des bases : appariements illicites - Forme imino de C appariée avec A (à la place de G) - Forme énol de T appariée avec G (à la place de A) - Forme imino de A appariée avec C (à la place de T) - Forme énol de G appariée avec T (à la place de C)
  10. 10. 1.2. Les lésions endogènes de l’ADN METABOLISME ENDOGENE PRODUCTION DE ERO (espèces radicalaires de l’oxygène) Cancer Vieillissement Maladies neurodégénératives (Parkinson; Alzheimer)
  11. 11. 1.2. Les lésions endogènes de l’ADN ERO : hydroxyle OH•; oxyle RO•; péroxyle ROO•; superoxyde O2•-;péroxyde d’hydrogène H2O2; monoxyde d’azote NO• Lésions variées : bases oxydées ou hydroxylées (8-OH G; Foraminopyrimidines; Glycol de thymine) Cassures de brin d’ADN (simples et doubles)
  12. 12. 1.2. Les lésions endogènes de l’ADN O2 O O H N O Thymine N H O N N CH 3 OH OH CH 3 Glycol de thymine
  13. 13. 1.3. Les lésions induites de l’ADN Lésions qui résultent de l’exposition à des agents génotoxiques qui sont dans notre environnement : - Atmosphère (UVs, HAPs) - Alimentation (nitrosamines, amines aromatiques, mycotoxines) - Médicaments (agents anticancéreux) - Produits cosmétiques (nanoparticules, filtres photosensibles) - Etc… Xénobiotiques et agents physiques
  14. 14. 1.3. Les lésions induites de l’ADN 1.3.1 alkylation des bases Source: endogène ou exogène Mécanisme : L’alkylation peut être facilement réalisée sur les bases de l’ADN par addition de groupes méthyles (-CH3), éthyles (-C2H5) ou alkyles (-CnH2n+1) DMS; DES; MMS; EMS (exogènes) S-adénosylméthionine (endogène) Bases alkylées
  15. 15. 1.3. Les lésions induites de l’ADN 1.3.1 alkylation des bases Principaux sites de liaison des agents alkylants sur la guanine Pour les quatre bases : 17 sites d’attaque possibles
  16. 16. 1.3. Les lésions induites de l’ADN 1.3.2 Insertion de bases erronées Mécanisme : une molécule ayant une structure similaire à une base est incorporée durant la réplication Exp: 5-bromouracile incorporée à la place d’une T Mésappariements des bases durant la réplication exp : A-G
  17. 17. 1.3. Les lésions induites de l’ADN 1.3.3 Intercalations Mécanisme : incorporation non covalente de molécules planes entre les plateaux de paires de bases : perte ou addition de bases durant la réplication Exp : acridine orange et bromure d’éthidium BET
  18. 18. 1.3. Les lésions induites de l’ADN 1.3.4. Pontages Mécanisme : Fixation covalente d’un agent génotoxique comportant deux sites réactifs Pontages intrabrins : T-T (UVB); G-G (cis-platine) Pontages interbrins : G-G (mitomycine C; chlorambucil) MitC
  19. 19. 1.3. Les lésions induites de l’ADN 1.3.5. Cassures de brin (simple et double) Plusieurs origines : 1. Interaction directe avec un agent génotoxique exp : - ERO et CSB - Radiations ionisantes, radiomimétiques et CDB 2. Processus de réparation et réplication (bases, nucléotides, AF et topoisomérases) 3. Sites abasiques et CSB CSB AF : anémie de Fanconi
  20. 20. 1.3. Les lésions induites de l’ADN 1.3.6. Adduits Mécanisme : fixation covalente d’une entité chimique électrophile sur un site nucléophile (ADN) Les bases sont les cibles privilégiées (17 sites potentiels) Les agents alkylants : adduits peu volumineux Les amines aromatiques, mycotoxines, HAP : adduits volumineux
  21. 21. 1.4. Les conséquences et les effets des lésions Il existe deux types de conséquences : 2.1. Les lésions qui bloquent la transcription 2.2. Les lésions qui bloquent la fourche de réplication Il existe deux types d’effets des lésions : 2.3. Les effets immédiats : arrêt du cycle cellulaire mort cellulaire, apoptose 2.4. Les effets à long terme : mutations et cancers
  22. 22. 1.5. MUTATIONS Une mutation est une modification (lésion) stable et irréversible de l’ADN Une mutation est transmissible à la descendance Une mutation est une conséquence de l’incapacité des systèmes de réparation à restaurer l’ADN Mutation spontanée pendant la réplication de l’ADN et Mutation induite par un agent génotoxique Deux types de mutations : les mutations géniques et les mutations chromosomiques
  23. 23. 1.5. MUTATIONS 1.5.1. Les mutations géniques (ponctuelles) Substitutions de paires de bases (base pair) Remplacement d’une paire de bases par une autre - Transition (Pu par Pu ou Py par Py) - Transversion (Pu par Py) Décalage du cadre de lecture (frameshift) des ADN Pol Addition ou délétion d’un petit nombre de paires de bases ( 2) entraînant un glissement du cadre de lecture des ADN Polymérases Mutations non-sens : arrêt prématuré de la synthèse protéique Mutation mis-sens : changement dans la structure de la Pr Mutations silencieuses et mutations neutres
  24. 24. 1.5. MUTATIONS 1.5.2. Les mutations chromosomiques Elles concernent de grands fragments d’ADN qui sont visibles en microscopie optique Anomalies numériques (aneuploïdie et polyploïdie) Anomalies structurales brèches, échanges, délétions, aberrations (cassures, anneaux, échanges)
  25. 25. 1.5. MUTATIONS 1.5.3. Les conséquences 1. Cellules germinales - Avortements spontanés - Maladies héréditaires autosomales ou liées au sexe Xeroderma pigmentosum (enfants de la lune) Maladie de Huntington (Chorée) Syndrome de Down (mongolisme) 2. Cellules somatiques - Vieillissement accéléré - Neurodégénération - Cancers
  26. 26. Mutagenèse et Mécanismes de réparation de l’ADN Michel De Méo Janvier 2014 UE S6-2 Initiation à la Recherche en Toxicologie Génétique IMBE - UMR CNRS 7263 / IRD 237, Faculté de Pharmacie, AixMarseille Université, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 05 France
  27. 27. 2. Lésions de l’ADN, réparations et conséquences Il existe deux types de conséquences des lésions de l’ADN: 1. Les lésions qui bloquent la transcription sont éliminées par un système spécifique: La réparation couplée à la transcription (TCR) qui enlève l’ARN Pol bloquée et assure une réparation prioritaire 2. Les lésions qui bloquent la réplication peuvent être « shunter » par deux voies: 2.1. Permutation des polymérases 2.2. Permutation des brins (recombinaison homologue)
  28. 28. 2.1. Les mécanismes de shunt de la réplication Brin avancé Lésions bloquant la réplication ADN pol delta-epsilon ADN pol alpha Brin retardé Permutation des polymérases Synthèse effectuée par une polymérase spécifique (-) ADN pol dzéta-kappa Système Fautif (cellules somatiques) Permutation de la matrice Recombinaison homologue Système Fidèle (réplication)
  29. 29. 2.1. ADN POLYMERASES Famille Exemples 3’-exonu Taux d’erreurs (lyase) A Pol I, T7, Taq Oui B Fonction 10-5 à 10-6 Réplication Pol II, RB69, PolB Oui Pol α, δ, ε sauf α 10-5 à 10-6 Réplication C Pol III (ss unité α) Oui 10-5 à 10-6 Réplication D PolD 10-5 à 10-6 ? Réplication ? X Pol β, λ, μ, ζ, TdT Non 10-4 à 10-5 Réparation, Ig, TCR Y DinB, UmuCD’, Dpo4, Dbh, Pol ζ, η, ι, κ 10-2 à 10-4 Mutagénique, ,TLS ? Non procaryotes; archéobactéries; eucaryotes ; TdT : Terminal déoxynucleotidyl transférase Ig: immunoglobuline; TCR: réparation couplée à la transcription: TLS : synthèse trans-lésion
  30. 30. 2.1. Les mécanismes de shunt de la réplication : Permutation des polymérases (eucaryotes) 1: blocage de la fourche active par le dimère Rad6-Rad18 qui mono-ubiquitine PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen ou sliding clamp). 2: Ceci augmente l’affinité de PCNA pour Pol η (Pol êta). 3: Pol η est alors activée et opère la synthèse TLS pour shunter la lésion. 4: Après le shunt de la lésion, la réplication par Polδ peut reprendre
  31. 31. 3. Les systèmes de réparation de l’ADN 3.1. Systèmes spécifiques 3.1. 1. enzyme répare un seul type de lésion (alkyltransférases; photolyase) 3.2. Système non spécifiques 3.2.1. BER répare les petites lésions sur les bases; efficace pour éviter la mutagenèse; adapter pour les lésions endogènes - altèrent la structure de l’ADN - interférent avec l’appariement des bases - bloquent la réplication et la transcription 3.2.3. Réparation des CDB: - Recombinaison homologue (phases S et G2) - Raboutage (phase G1) 3.2.2. NER répare les lésions qui : (efficace pour les lésions exogènes) 3.2.4. Réparation des mésappariements 3.2.5. Réparation des pontages interbrins (AF/BCRA)
  32. 32. 3.1.1. Alkyltransférases O6-alkylguanine transférase (AGT) L’enzyme transfère le groupement alkyl de la guanine méthylée sur une cystéine localisée dans le centre actif de l’enzyme Inactivation de AGT et cible pour l’ubiquitination et dégradation par le protéasome 1-méthyladénine et 3-méthylcytosine et 1-éthyladénine ABH1, ABH2 et ABH3 Déméthylation oxydative
  33. 33. 3.1.2. Photolyases Chez les Bactéries et levures: Contiennent deux chromophores: Flavine (FADH) et Folate (MTHF) ou deazaflavine (8-HDH) Réparent les dimères de pyrimidines et les 6-4 photoproduits T T Visible light T T Chez l’homme: 6 cryptochromes utilisées comme photorécepteurs circadiens
  34. 34. 3.2.1. Réparation par excision des bases (BER) 1. C’est le système de réparation pour les lésions endogènes (bases modifiées, méthylation, désamination, hydroxylation) 2. C’est le système de réparation le plus important 3. Deux voies distinctes : BER short patch et BER long patch 4. Pas de maladie génétique connue * Souris « knock out » sur les glycosylases montrent des activité redondantes sur ces enzymes * Souris « knock out » sur les enzymes du tronc commun : MORT FETALE
  35. 35. 3.2.1. Réparation par excision des bases (BER) Mécanisme A. ERO, méthylation, désamination ERO, Méthylation, Désamination Radiations ionisantes, ERO (CSB) B. Sites abasiques C. CSB, ERO Hydrolyse spontanée (sites abasiques) I. Formation d’un site abasique II. Formation d’une CSB par APE1 (endoN) III. Implications de PARP et PNK (CSB) Short patch IV. Synthèse par pol ß V. Elimination du sucre VI. Synthèse et ligature (1 base) Long patch FRC VII. synthèse (2-10 bases) VIII. Suppression du segment d’origine IX. ligature BER short patch BER long patch VOIE PRINCIPALE VOIE MINEURE
  36. 36. Animations (Youtube) BER http://www.youtube.com/watch?NR=1&v=72oT6N90iWc Short patch http://www.youtube.com/watch?NR=1&v=g4khROaOO6c Long patch
  37. 37. Figure 2 Typical damaged DNA bases and DNA glycosylases acting upon them (Biochemical Journal (1997) 325, 1-16)
  38. 38. 3.2.2. Réparation par excision des nucléotides (NER) 1. La NER est le système de réparation qui reconnaît le plus grand nombre de lésions 2. La NER est adaptée à réparer les lésions d’origine exogène 3. Deux sous-voies principales : 3.1. La réparation globale du génome: le « gardien du génome » (lente) 3.2. La NER couplée à la transcription (rapide) 4. Maladies génétiques possibles : Xeroderma pigmentosum Syndrome de Cockayne Trichiodystrophie Xp CS TTD
  39. 39. 3.2.2. Réparation par excision des nucléotides (NER) Mécanisme I - Reconnaissance de la lésion (bases non appareillées) II - Formation de simple brin (30 paires de bases) par hélicases XPB et XPD de TFIIH III - Stabilisation de l’ADN simple brin par RPA IV - Élimination du segment lésé (24-32 bases) par endonucléases ERCC1/XPF (5’) et XPG (3’) V - Synthèse et ligature
  40. 40. Animations NER http://www.youtube.com/watch?v=bgUH9NfO2QM Global genome http://www.youtube.com/watch?v=XjNqqsvUXTw Transcription coupled repair
  41. 41. 3.2.3. Réparation des cassures double brin CDB dans réplication Mécanisme Recombinaison Homologue (S, G2) I. Présentation des extrémités 3’ par le complexe Radiations génotoxiques Raboutage Raboutage (G1) Reconnaissance des extrémités et ligature (étape V-VII) II. Assemblée de filaments III. Homologie, positionnement et synthèse d’ADN IV. Ligature Raboutage (avec perte ou gain de Nuc, parfois) Recombinaison (sans erreur)
  42. 42. Animations http://www.youtube.com/watch?v=xS6bJMcOrAk Raboutage http://www.youtube.com/watch?NR=1&v=jRGPxuo0H30 Recombinaison homologue
  43. 43. 3.2.4. Réparation des mésappariements 1. Ce système enlève les mésappariements provoqués par: - Les ADN polymérases durant la synthèse - Les boucle d’insertion/délétions (1-10 bases) résultant d’un glissement durant la réplication de séquences répétitives ou durant la recombinaison 2. Une seule maladie génétique connue : Syndrome de Lynch (syndrome de prédisposition héréditaire au cancer du côlon non polyposique) : HNPCC
  44. 44. 3.2.4. Réparation des mésappariements Mécanisme 1. Reconnaissance des mésappariements hMSH2/6 reconnaît mésappariements et boucles d’une seule paire de bases hMSH2/3 reconnaît les boucles insertion/délétion de plusieurs bases 2. Recrutement des facteurs spécifiques de la MMR 3. Recherche d’un signal qui identifie le brin fautif néosynthétisé suivie par sa dégradation après le mésappariement 4. Resynthèse du brin excisé
  45. 45. 3.2.5. Réparation des pontages interbrins (de Winter and Joenje, Mutat. Res., 668:11-19, 2009) Anémie de Fanconi (FA) Autosomal récessif. Clinique: nanisme harmonieux Anomalies cutanées : hyperpigmentation, taches café au lait ..: Malformations squelettiques dont hypoplasie de l'axe radial insuffisance médullaire progressive --> aplasie médullaire terminale Risque néoplasique: LAM et myélodysplasies: 10%, soit risque X 15000; autres cancers (5%). Cytogénétique: Cassures chromatiniennes spontanées. fréquence des cassures augmentée après traitement par agents de pontage interbrins de l'ADN. Autres: ralentissement du cycle cellulaire: retard du passage G2-->M. LAM : leucémies aiguës myéloïdes
  46. 46. Les 13 gènes identifiés dans AF Subtype Gene Location Protein (amino acids) Cloning method Features A FANCA 16q24.3 1455 Complementation cloning, positional cloning B FANCB Xp22.2 859 Protein association C FANCC 9q22.3 558 Complementation cloning D1 FANCD1/BRCA2 13q12.3 3418 Candidate-gene approach D2 FANCD2 3p26 1451 Positional cloning Partner of FANCG, contains nuclear localization signal Partner of FANCL, contains nuclear localization signal Partner of FANCE Supports RAD51 filament formation, contains BRC repeats and OB-fold Monoubiquitinated and phosphorylated following DNA damage E FANCE 6p21.3 536 Complementation cloning F FANCF 11p15 374 Complementation cloning G FANCG 9p13 622 Complementation cloning Adaptor protein stabilizing A/G and E/C interaction Partner of FANCA, contains TPR motifs I FANCI 15q26.1 1328 Positional cloning; candidate-gene approach Partner of FANCD2, monoubiquitinated and phosphorylated following DNA damage J FANCJ/BRIP1 17q22-24 1249 Positional cloning L FANCL 2p16.1 375 Protein association M FANCM 14q21.3 2048 Protein association Translocase, contains DEAH helicase and ERCC4/XPF like nuclease domain N FANCN/PALB2 16p12.1 1186 Protein association Partner of BRCA2, essential for stability and localization of BRCA2 Partner of FANCC and FANCD2, Chk1 target, contains nuclear localization signal 5′-to-3′ DEAH helicase, unwinds G-quadruplex DNA structures E3 ubiquitin ligase, contains RING-finger and WD40 domains
  47. 47. 3.2.5. Réparation des pontages interbrins Proteins participating in the FA/BRCA pathway. The FA core complex, which represent the upstream part of the pathway, consists of FANCA, -B, -C, -E, -F, -G, -L, -M, and two FA-associated proteins FAAP24 and FAAP100. This complex is essential for the monoubiquitination of the FA proteins FANCD2 and FANCI. In this reaction, FANCL is the E3 ubiquitin ligase and UBE2T is the E2-conjugating enzyme. Monoubiquitinated FANCD2 and FANCI co-localize in damage-induced nuclear foci with BRCA2, which, together with its binding partner PALB2 and BRIP1 belong to the downstream branch of the pathway. Ubiquitin is removed from FANCD2 and FANCI by the deubiquitinating enzyme USP1.
  48. 48. 3.2.5. Réparation des pontages interbrins Model for the FA/BRCA pathway. (A) The DNA interstrand cross-link prevents further DNA replication and this recruits FANCM and the FANCD2/FANCI complex independently. (B) The FA core complex associates with FANCM and together with UBE2T monoubiquitinates FANCD2/FANCI. (C) FANCM translocates along the DNA and processes the stalled replication fork. This creates ssDNA to which more monoubiquitinated FANCD2 is loaded and generates space for MUS81/EME1 and XPF/ERCC1 to unhook the cross-linked DNA. By cutting 3′ of the lesion MUS81/EME1 generates a one-ended double strand break. (D) Translesion synthesis (TLS) fills the gap formed by the unhooking step, while FANCD2 recruits BRCA2 and Rad51 to the one-ended double strand break. Homologous recombination repair (HR) is finally used to restore the DNA break, which may be stimulated by USP1 mediated deubiquitination of FANCD2. The cross-link adduct is removed by nucleotide excision repair or by other mechanisms.
  49. 49. 4. Déficit des systèmes de réparation Syndrome Réparation type de mutation Prédisposition au cancer Xeroderma pigmentosum NER (±TCR) mutations ponctuelles cancer de la peau induit par UV Syndrome de Cockayne TCR mutations ponctuelles non Trichthiodystrophie NER / TCR mutations ponctuelles non Ataxia telangiectasia réparation DSB Aberrations chromosomiques lymphomes AT-like réparation DSB Aberrations chromosomiques lymphomes Syndrome de Nijmegen réparation DSB Aberrations chromosomiques lymphomes BRCA1/BRCA2 HR Aberrations chromosomiques cancer du sein Syndrome de Werner HR? / TLS? Aberrations chromosomiques cancers variés Syndrome de Bloom HR? Aberrations chromosomiques (SCE) Leucémies, lymphomes, autres Syndrome de Rothmund-Thomson HR? Aberrations chromosomiques Ostéosarcomes Ligase IV Ligation Fidélité de recombinaison Leucémies (?) HNPCC MMR mutations ponctuelles Cancer colorectal XP variant DNA POL H mutations ponctuelles cancer de la peau induit par UV Anémie de Fanconi FA/BRCA Aberrations chromosomiques Leucémies, carcinomes
  50. 50. 5. La réponse SOS chez les bactéries Réparation fautive
  51. 51. 5. Lésions de l’ADN, réparations et conséquences Agent génotoxique Radiations ionisantes ROS Agents alkylants Lésions spontanées UV HAP Radiations ionisantes Anticancéreux (cis-Pt, MitC) Conséquences Erreurs de réplication Arrêt du cycle cellulaire (temporaire) Inhibition de: * transcription * réplication * ségrégation des chromosomes Uracile Site abasique Bases altérées CSB Excision des bases (BER) (6-4) PP Adduits Dimères Pontage CDB Excision des nucléotides (NER) Réparation Recombinaison homologue Raboutage, FA/BRCA Apoptose (suicide) Mésappariements (A-G; T-C) Insertion Délétion Réparation des Mésappariements Mutations Aberrations chromosomiques Cancer Vieillissement Maladies génétiques

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