1. LABORATORIO Nº 4
Pruebas Bioquímicas
Debido a la diversidad de especies bacterianas existentes en la naturaleza, la información
obtenida a través de tinciones, aunque importante, no es suficiente para identificar una especie
bacteriana. Por lo mismo, es necesario también detectar las propiedades fisiológicas y
bioquímicas de cada microorganismo. Dichas propiedades son características más puntuales por
cuanto demuestran la existencia de enzimas, las cuales son la expresión de un determinado gen
en el DNA bacteriano.
En microbiología para caracterizar bioquímicamente un microorganismo, se dispone de
numerosas técnicas agrupadas en su conjunto como Pruebas Bioquímicas.
1. Pruebas bioquímicas relacionadas con la respiración celular
El oxígeno es un excelente aceptor de electrones durante la respiración, pero también un
poderoso agente oxidante. Especies altamente tóxicas del oxígeno, se forman como
subproductos del proceso de respiración aerobia. Estas formas tóxicas incluyen: peróxido de
hidrógeno (H2O2), anión superóxido (O2-)y el radical hidroxilo (OH•):
O2 + e- → O2- supeóxido
O2- + e- + 2H+ → H2O2 peróxido de H
H2O2 + e- + H+
→ H2O + OH• radical hidroxilo
OH• + e- + H+
→ H2O agua
Reacción neta: O2 + 4 e- + 4H+ → H2O
Los microorganismos poseen mecanismos de defensa enzimáticos para protegerse de las
especies tóxicas del oxígeno. Estas enzimas son la peroxidasa, la catalasa y la superóxido
dismutasa.
La catalasa ataca el peróxido de hidrógeno según la reacción siguiente:
H2O2 + H2O2 → catalasa → 2H2O + O2
Prueba de la catalasa: esta prueba tiene por finalidad determinar la presencia de esta
enzima. Para realizar la prueba se usa un cultivo de 18 a 24 h de incubación en medio sólido. A
dicho cultivo se le agregan unas gotas de peróxido de hidrógeno. La inmediata observación de
burbujas, indicativo de la liberación de oxígeno, señala un resultado catalasa positivo (presencia
de la enzima). Por el contrario, un organismo catalasa negativo no produce burbujas.
2. Pruebas bioquímicas relacionadas con el uso de distintas fuentes de carbono
Prueba del agar hierro Kliger: este medio (Kliger) corresponde a un medio diferencial
que permite determinar si el microorganismo es capaz de utilizar glucosa y lactosa o sólo la
glucosa, además de producir ácido sulfídrico (H2S ) y gas.
El agar hierro Kliger contiene tiosulfato de sodio y sulfato férrico de amonio, los cuales
permiten determinar la producción de H2S, lo cual se detecta por la formación de un precipitado
negro en el tubo.
En relación al uso de azúcares, algunos microorganismos tienen la facultad de usar tanto la
lactosa como la glucosa, otros solamente la glucosa y un tercer grupo no usan ninguno de los
dos azúcares. En

2. caso de usar los azúcares esto puede producirse con o sin liberacióbn de gases, en forma
aerobia o anaerobia. El medio Kliger lleva lactosa1 al 1% y glucosa al 0,1%, además posee
como indicador de pH rojo fenol.
Resultados de la prueba
• K/A = superficie alcalina (color fucsia) sobre fondo ácido (amarillo): el
microorganismo es capaz de usar sólo la glucosa. En la superficie del tubo la glucosa es
degradada aeróbicamente (vía oxidativa). A las 24 h, tiempo requerido para la lectura de
esta prueba, la glucosa ha sido agotada y el microorganismo comienza a usar las peptonas,
con lo cual el medio se alcaliniza dando una superficie de color fucsia. En el fondo del tubo,
la glucosa es fermentada produciéndose ácidos estables, por lo tanto se observa un fondo
amarillo.
• A/A = superficie ácida (amarillo) sobre fondo ácido (amarillo): el microorganismo
es capaz de usar ambos azucares. Después de 24 h, cuando el microorganismo a usado
toda la glucosa comienza a usar la lactosa. Debido a que éste azúcar está 10 veces más
concentrado, aún no se ha consumido totalmente, por lo que el medio se mantiene ácido
(color amarillo).
• K/K = superficie alcalina (fucsia) sobre fondo alcalino (fucsia): el microorganismo
no usa ninguno de los dos azúcares, por lo que usa directamente las peptonas del
medio. Si el microorganismos puede usar este compuesto tanto aerobia como
anaeróbicamente, el resultado es K/K. Por el contrario, si sólo usa las peptonas
aeróbicamente el resultado es K/sin cambio (fucsia/rojo).
3. Pruebas bioquímicas relacionadas con compuestos nitrogenados
Prueba de la ureasa: esta prueba detecta la enzima ureasa, la cual cataliza la hidrólisis
de la úrea con producción de dos moléculas de amonio. El medio e cultivo usado en esta
prueba contiene una solución de úrea al 40% y rojo fenol como indicador de pH.
Si el microorganismo a probar posee la enzima ureasa, éste hidroliza la úrea con la
consecuente formación de amonio, lo cual alcaliniza el medio. Por lo tanto, una coloración
fucsia es indicativo de un resultado positivo.
1. Pruebas del IMViC
Corresponde a un conjunto de 4 pruebas bioquímicas: Indol, rojo de Metilo, Voges
Proskauer y Citrato. Estas pruebas se usan para diferenciar bacterias entéricas, las cuales
pueden ser usados como indicadores biológicos de contaminación fecal en agua y alimentos.
1.1. Prueba del Indol
Detecta la capacidad de un microorganismo para producir indol a partir del aminoácido
triptofano. Esta habilidad se debe a la presencia de la enzima triptofanasa. El
microorganismo a estudiar se siembra en un caldo peptonado. Después de 24 h, se
agrega el reactivo de Kovacs, el cual reacciona con el indol dando un color rosado
intenso. Así, la prueba positiva (indol +) corresponde a un anillo rosado en la superficie
del cultivo; y un resultado negativo a un anillo amarillo o sin color.
1.2. Prueba del Rojo metilo
Esta prueba detecta si el microorganismo es capaz de producir y mantener estables los
derivados ácidos de las fermentación ácido mixta de la glucosa. Las bacterias rojo
metilo (+) producen ácidos estables, es decir, que no continúan siendo degradados a
otros productos.
1
La lactosa es un dímero de glucosa y galactosa, por lo tanto, primero debe ser desdoblada a dichos azúcares por
medio de la enzima beta-galactosidasa.

3. En consecuencia el medio se mantiene ácido. Por el contrario, en las bacterias rojo
metilo (-), los
ácidos formados durante a fermentación ácido mixta de la glucosa continúan siendo
degradados a carbonatos y CO2, por ello la acidez del medio no se mantiene.
El medio usado en esta prueba es un caldo suplementado con glucosa. El
microorganismo se siembra y se incuba en condiciones apropiadas. Después de 24 a 48
h, se agregan unas gotas de rojo metilo. Si el indicador detecta ácidos, mantiene su
color rojo, lo cual indica un resultado positivo. Por el contrario si el indicador vira a
amarillo, significa un resultado rojo metilo (-).
1.3. Prueba del Voges Proskauer
Esta prueba detecta si el microorganismo es capaz de realizar la fermentación
butanodiólica de la glucosa. Las bacterias pueden usar varias vías fermentativas según
el sistema enzimático que cada una posea. Una de estas fermentaciones es la
bitanodiólica, llamada así porque esta genera como producto final bitanodiol. La
acetoína es un producto intermediario de esta vía, precursor del butanodiol. Cuando la
acetína reacciona con alfa naftol + KOH (40%), se produce una coloración rojiza
indicativo de un resultado positivo (ver recuadro).
Para esta prueba se usa el
mismo medio que para la Glucosa
prueba del Rojo metilo. La
bacteria se siembra y se Ácido pirúvico
incuba por 48 h. Para leer el
resultado se agregan 6 a 8
gotas de KOH y 1 ml de α Acetoína + α naftol + KOH coloración
naftol en solución rojiza
alcohólica (5%, actúa como
2,3 – butanodiol
catalizador). La mezcla se
deja unos 20 min en estufa
resultado (+)
tiempo después del cual se
lee el resultado. La
formación de un anillo rojizo
indica resultado (+), un
anillo incoloro resultado (-).
1.4. Prueba del Citrato
Esta prueba determina si el microorganismo es capaz de usar el citrato como única
fuente de carbono. Para esta prueba se usan los medios Koser citrato (líquido) o Simón
citrato (sólido). Este medio posee citrato como única fuente de carbono, sales de
amonio como única fuente de nitrógeno, sales minerales y azul de bromotimol como
indicador de pH. El medio originalmente es de color verde, pero a medida que la
bacteria usa el citrato, éste se va alcalinizando y virando a un color azul intenso, lo cual
es indicador de un resultado citrato (+). Si por el contrario, el medio permanece verde
después de un periodo de incubación, esto indica resultado citrato (-).
Tabla 4: Principales características de las pruebas del IMViC
Resultados
Prueba Objetivo Reactivos Positivo Negativo
Detectar capacidad para producir indol Kovacs Anillo fucsi Anillo amarillo
Indol
a partir de triptófano
Detectar producción de ácidos estables Rojo metilo Rojo Amarillo
Rojo Metilo

4. desde la fermentación ácido mixta.
Voges Detectar capacidad para realizar KOH + α naftol Anillo rojizo Anillo incoloro
Proskauer fermentación butanodióloca
Detectar capacidad para usar el citrato Medio azul Medio verde
Citrato
como única fuente de carbono
Tabla 5: Reacción a ciertas pruebas bioquímicas claves para la diferenciación de bacterias
entéricas
Producción Voges Producción de
Géneros Indol Rojo Citrato Ureasa
de H2S Proskauer gas desde
metilo
glucosa
Escherichia - + + - - + -
Enterobacter - - - + + + -
Shigella - +/- + - - - -
Salmonella + - + - +/- + -
Klebsiella - - - +/- + + +
Citrobacter +/- - + - + + -
Proteus +/- +/- + - +/- +/- +
Preguntas de revisión y aplicación
1. Señale la utilidad e importancia de las pruebas bioquímicas.
2. Explique como se generan dentro de la célula las formas tóxicas del oxígeno. Nombre
dos de ellas.
3. Investigue la función de las enzimas peroxidasa y superóxido dismutasa en la defensa
contra las especies tóxicas del oxígeno.
4. Indique el objetivo de las siguientes pruebas bioquímicas: agar hierro Kliger, ureasa,
citrato e indol.
5. ¿Qué se entiende por IMViC y cuál es su finalidad?