Este documento resume las principales técnicas empleadas en la validación de dianas terapéuticas. La validación consiste en demostrar que una diana molecular está implicada en una enfermedad concreta y es potencialmente susceptible de ser una diana terapéutica. Las técnicas más relevantes son la modulación de la expresión génica mediante antisentido y el uso de modelos vivos como ratones knock-out. Otras técnicas como microarrays de células, células madre y métodos de inactivación de proteínas también se

1. Biotecnología Aplicada
a la Identificación y Validación
de Dianas Terapéuticas
Informe de Vigilancia Tecnológica

3. Biotecnología Aplicada
a la Identificación
y Validación de Dianas
Terapéuticas
Informe de Vigilancia
Tecnológica

4. BIOTECNOLOGÍA APLICADA
A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN
DE DIANAS TERAPÉUTICAS
El presente informe de Vigilancia Tecnológica ha sido
realizado en el marco del convenio de colaboración
conjunta entre Genoma España y la Fundación General
de la Universidad Autónoma de Madrid (FGUAM), entidad
que gestiona el Círculo de Innovación en Biotecnología
(CIBT), perteneciente al Sistema de Promoción Regional
de la Innovación MADRID+D.
Genoma España y la Fundación General de la Universidad
Autónoma de Madrid (FGUAM) agradecen la colaboración
ofrecida a:
– Dr. Miguel Ángel Piris Pinilla
Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO)
– Dr. Arcadio García de Castro Andrews
PharmaMar
– Dr. Luis del Peso Ovalle
Hospital Universitario de la Princesa
– D.ª Rosario Ambite Domínguez
Círculo de Innovación en Biotecnología
La reproducción parcial de este informe está autorizada bajo
la premisa de incluir referencia al mismo, indicando:
Biotecnología aplicada a la identificación y validación de
dianas terapéuticas. GENOMA ESPAÑA/CIBT-FGUAM.
Genoma España no se hace responsable del uso que se
realice de la información contenida en esta publicación. Las
opiniones que aparecen en este informe corresponden a los
expertos consultados y a los autores del mismo.
© Copyright: Fundación Española para el Desarrollo
de la Investigación en Genómica y
Proteómica/Fundación General de la Universidad
Autónoma de Madrid.
Autores: Marta López (CIBT)
Paloma Mallorquín (CIBT)
Ion Arocena (CIBT)
José Antonio Mesa (Genoma España)
Miguel Vega (Genoma España)
Edición: Silvia Enríquez (Genoma España)
Referencia: GEN-ES05009
Fecha: Abril 2005
Depósito Legal: M-51618-2005
ISBN: 84-609-8741-8
Diseño y realización: Spainfo, S.A.
4

5. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN
DE DIANAS TERAPÉUTICAS
Índice de contenido
• RESUMEN EJECUTIVO 7
1. INTRODUCCIÓN A LA VALIDACIÓN DE DIANAS 8
2. TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE DIANAS 11
2.1. Análisis de la expresión génica 11
2.1.1. Análisis serial de la expresión génica (SAGE) 12
2.1.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) 13
2.1.3. Microarrays de ADN 13
2.2. Interacciones proteína-proteína 14
2.2.1. Microarrays de proteínas 15
2.2.2. Sistema doble híbrido 16
3. TÉCNICAS DE VALIDACIÓN DE DIANAS 17
3.1. Modulación de la expresión génica 17
3.1.1. Oligonucleótidos antisentido 17
3.1.2. ARN de interferencia 18
3.1.3. Ribozimas 20
3.1.4. Proteínas de dedos de zinc 21
3.2. Inactivación de proteínas 22
3.2.1. Química genética 22
3.2.2. Anticuerpos monoclonales 23
3.2.3. Aptómeros 24
3.2.4. Péptidos 24
3.2.5. Inactivación por láser mediante cromóforos y fluoróforos 25
3.3. Análisis de la expresión génica in situ 25
3.3.1. Microarrays de tejidos 26
3.3.2. Microarrays de células 26
3.4. Modelos vivos de la enfermedad 27
3.4.1. Ratones knock-out y knock-in 28
3.4.2. Ratones transgénicos 29
3.4.3. Mutagénesis de ratones al azar 30
3.4.4. Levaduras como modelo de enfermedad 30
3.4.5. Otros organismos modelo 31
3.4.6. Células madre embrionarias 32
3.5. Técnicas bioinformáticas 34
4. ESTRATEGIAS DE VALIDACIÓN DE DIANAS 37
5

6. 5. APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE VALIDACIÓN DE DIANAS 40
5.1. Enfermedades que requieren nuevas dianas 40
5.1.1. Enfermedades neurodegenerativas 40
5.1.2. Enfermedades cardiovasculares 42
5.1.3. Enfermedades psiquiátricas 43
5.1.4. Enfermedades metabólicas 45
5.1.5. Enfermedades autoinmunes 46
5.1.6. Cáncer 48
5.2. Naturaleza de las dianas terapéuticas para los fármacos actuales 49
6. ENTORNO ECONÓMICO EN LA VALIDACIÓN DE DIANAS 51
6.1. Validación de dianas en el desarrollo de fármacos 52
6.2. Estrategias de implantación de validación de dianas en la industria farmacéutica 54
6.3. Estrategias comerciales en la validación de dianas 55
7. EMPRESAS Y PROYECTOS EN VALIDACIÓN DE DIANAS 58
7.1. Empresas internacionales en validación de dianas 58
7.2. Empresas españolas en validación de dianas 59
7.3. Proyectos de I+D españoles en validación de dianas 60
8. CONCLUSIONES 61
ANEXOS 65
ANEXO I. Proyectos de I+D españoles en validación de dianas 65
ANEXO II. Empresas internacionales en validación de dianas 92
ANEXO III. Empresas españolas en validación de dianas 103
ANEXO IV. Principales dianas terapéuticas 111
REFERENCIAS 116
GLOSARIO 119
6

7. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN
DE DIANAS TERAPÉUTICAS
Resumen ejecutivo
Las dianas terapéuticas son moléculas localizadas correcta validación de dianas terapéuticas reduce
en cualquier parte de la célula, capaces de por tanto el tiempo y coste necesario para el
reconocer un fármaco y producir una respuesta desarrollo de un fármaco eficaz, ya que se evita
celular que modifique el curso de una continuar con los esfuerzos empleados en el
enfermedad. La evaluación de dianas terapéuticas desarrollo de fármacos cuyas dianas no han sido
constituye un proceso que incluye las etapas de validadas adecuadamente. De este modo, la
identificación, caracterización y validación de industria farmacéutica conseguiría optimizar sus
dianas, siendo este último el paso final en la esfuerzos de I+D orientándolos hacia los proyectos
determinación de la implicación de la diana en el basados en dianas validadas correctamente, con
proceso patológico. La secuenciación del genoma mayores posibilidades de salir adelante.
humano ha revelado la presencia de un gran
número de potenciales dianas terapéuticas, sin Las técnicas genómicas y proteómicas que se
embargo, la mayoría de estas dianas no han sido emplean en la identificación y validación de dianas
completamente caracterizadas ni se ha son de diversa naturaleza, y se emplean
establecido su asociación con una enfermedad generalmente en combinación con otras técnicas
concreta. Se ha estimado que el número de complementarias. La identificación de dianas se
dianas potenciales terapéuticas se encuentra en realiza principalmente mediante técnicas de
torno a 600 y 1.500, no obstante, los fármacos análisis de la expresión génica o bien mediante el
que actualmente se encuentran en el mercado análisis de interacciones proteína-proteína, como
actúan sobre alrededor de 500 dianas diferentes. los microarrays de ADN y microarrays de proteínas
El reto actual consiste en seleccionar a partir del respectivamente. En cuando a las tecnologías
conjunto de genes del genoma humano aquellos relacionadas con la validación de dianas, la
genes que dan lugar a proteínas que pueden modulación de la expresión génica mediante
llegar a ser dianas terapéuticas. tecnologías antisentido y el empleo de modelos
vivos de la enfermedad como los ratones knock-out
La tasa de fracaso a lo largo del proceso de son las técnicas más relevantes. No obstante, otras
investigación farmacéutica es elevada, más del tecnologías complementarias como los microarrays
80% de los proyectos se abandonan durante la de células y tejidos, células madre embrionarias, y
fase de descubrimiento anterior a los ensayos técnicas de inactivación de proteínas como
clínicos, de modo que sólo uno de cada cinco CALI/FALI, son alternativas cada vez más
proyectos consigue iniciar los ensayos clínicos. Una empleadas en las etapas de validación de dianas.
7

8. 1. Introducción a la validación de dianas
El presente informe tiene por objeto el estudio de las por el organismo. Las moléculas que reconocen
técnicas que se emplean en la actualidad en la estos fármacos se denominan dianas terapéuticas,
validación de dianas prestando especial atención a las y su modulación permite modificar el curso de un
aplicaciones de las técnicas genómicas y proteómicas. proceso patológico. Las dianas sobre las que
actúan los fármacos pueden ser de diferente
Los fármacos se componen de sustancias activas naturaleza, pudiendo ser azúcares, proteínas o
o compuestos responsables del efecto terapéutico, ácidos nucleicos (ADN o ARN), sin embargo, la
los cuales ejercen su acción sobre la enfermedad mayoría de los fármacos que se encuentran en el
cuando el compuesto es absorbido y distribuido mercado actúan sobre dianas proteicas1.
Diana terapéutica
Molécula localizada en cualquier parte de la célula, capaz de reconocer a un fármaco y producir una
respuesta celular que modifique el curso de una enfermedad.
El desarrollo de nuevos fármacos constituye un largo preclínicas y clínicas. Por tanto, una buena
proceso que se puede dividir en una serie de fases, caracterización de la actividad biológica de las
la primera de las cuales consiste en la identificación dianas moleculares que han sido identificadas en las
de nuevas dianas terapéuticas. La identificación de primeras fases, es fundamental para la obtención de
compuestos activos con actividad biológica un mayor número de fármacos. No obstante, debido
relacionada con las dianas previamente descritas a la complejidad de los procesos biológicos que dan
conforma la segunda etapa de este proceso. El lugar a distintas patologías, no siempre es posible
último paso consiste en el desarrollo y optimización identificar una diana que permita desarrollar un
del fármaco a lo largo de las distintas fases fármaco eficaz.
Validación de dianas
Proceso que tiene por objeto demostrar que una determinada diana molecular está implicada en la
aparición y progresión de una enfermedad. La validación de una diana permite establecer una
relación entre la alteración de la diana y su potencial terapéutico.
La validación de dianas consiste por tanto en alterar el curso de una enfermedad. Sin embargo,
determinar si una diana molecular está implicada la validación de dianas puede realizarse
en una enfermedad concreta, y por tanto es igualmente tanto a nivel molecular como genético
potencialmente susceptible de ser considerada mediante herramientas genómicas y proteómicas,
como diana terapéutica a la hora de diseñar que permiten relacionar una diana con un estado
nuevos fármacos. Para algunos autores la patológico determinado. El grado de validación de
validación de una diana se consigue únicamente una diana estará por tanto relacionado con la
cuando un fármaco se emplea con éxito para cantidad de datos preclínicos y clínicos que se
1
Smith, M. B. (2003). Hitting the target. Nature, vol. 422, 341-347.
8

9. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN
DE DIANAS TERAPÉUTICAS
reúnan respecto al mecanismo biológico de la activos3. Sin embargo, no se debe olvidar que en
diana y su relación con la eficacia del fármaco2. la realidad muy pocas dianas identificadas
El paso de una fase a otra del desarrollo de durante las primeras fases del proceso de I+D
fármacos depende en gran medida del grado de conducen al desarrollo de un fármaco eficaz, por
validación de la diana en cuestión y del avance en lo que el grado de incertidumbre del proceso de
el descubrimiento de potenciales compuestos desarrollo farmacológico es muy elevado.
Descubrimiento Descubrimiento Desarrollo
de dianas de fármacos de fármacos
Optimización
Identificación Validación Selección de Fase Fase
de
de dianas de dianas compuestos Preclínica Clínica
compuestos
Figura 1. Fases principales del desarrollo farmacológico.
Fuente: Whittaker, P. A. (2003). What is the relevance of bioinformatics to pharmacology? Trends In Pharmacological
Sciences, 24 (8):434-439.
La identificación y desarrollo de fármacos ha sido Los fármacos que actualmente se encuentran en
tradicionalmente un proceso lineal que consistía el mercado actúan sobre aproximadamente 500
en la búsqueda de compuestos químicos mediante dianas diferentes. Las estimaciones más recientes
ensayos sobre cultivos celulares, tejidos o calculan que existen entre 20.000 y 25.000 genes
animales4. Las dianas no se validaban con las en el genoma humano, de los cuales en torno a
tecnologías complejas que se emplean hoy en día, 5.000 podrían estar implicados en procesos
y se desconocían los mecanismos moleculares patológicos. De estos últimos, sólo ciertos genes y
responsables de las enfermedades. Los avances las proteínas que codifican serán de interés para
en genómica y proteómica han permitido a la el desarrollo de fármacos que modifiquen el
industria farmacéutica descubrir un gran número proceso patológico. De este modo, el número de
de fármacos por medio del estudio de las dianas terapéuticas potenciales se estima en
relaciones existentes entre los genes y las torno a 600 y 1.500 dianas6. La secuenciación del
enfermedades. Como consecuencia, la validación genoma humano en el año 20017 supuso el
de dianas al nivel del genoma ha surgido como descubrimiento de la secuencia de un gran
una necesidad que a su vez ofrece numerosas número de dianas terapéuticas potenciales. El
ventajas, ya que permite la posibilidad de conocer reto actual consiste en seleccionar a partir del
de antemano algunos de los efectos biológicos de conjunto de genes del genoma humano aquellos
las proteínas, que mediante las técnicas clásicas genes que dan lugar a proteínas y que pueden
de validación no era posible anticipar5. llegar a ser dianas terapéuticas.
2
Epstein, D. M., et al. (2002). Target Validation with Nucleic Acid Aptamers. Mimicking small molecule therapeutics by
attacking the protein, and not the gene. Pharmaceutical Discovery and Development. PharmaVentures Ltd.
3
Whittaker, P. A. (2003). What is the relevance of bioinfomatics to phamacology? Trends In Pharmacological Sciences, 24
(8), 434-439.
4
Douglas S. A., et al. (2004). Techniques: Cardiovascular pharmacology and drug discovery in the 21st century. Trends in
Pharmacological Sciences. Vol. 25 Nº 4: 225-233.
5
Liu, R., et al. (2004). New approaches in identifying drugs to inactivate oncogene products. Seminars in Cancer Biology
14: 13-21.
6
Hopkins. A. L. et Groom, C. R. (2004). The druggable genome. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 1 727-730.
7
Lander, E. S., et al. (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409(6822), 860-921.
Venter, J. C., et al. (2001). The sequence of the human genome. Science. 291(5507). 1304-51.
9

10. Genoma humano: 20.000-25.000 genes
5.000 fármacos que 5.000 Genes
actúan sobre el implicados en
genoma patologías
600-1.500
dianas terapéuticas
Figura 2. Estimación del número de dianas terapéuticas del genoma humano.
Fuente: Adaptado de Hopkins, A. L. et Groom, C. R. (2004). The druggable genome. Nature Reviews: Drug Discovery.
Vol. 1, 727-730.
Debido a que existen múltiples técnicas tempranas como técnicas de apoyo en la
moleculares que permiten relacionar genes y validación de dianas.
proteínas con un determinado efecto ligado a una
enfermedad, las técnicas con una aplicación El presente informe realiza una descripción de estas
potencial a la validación de dianas son muy últimas técnicas, para posteriormente describir con
diversas. Por esta razón, algunas técnicas más detalle las técnicas de validación de dianas
moleculares de identificación de nuevas dianas relacionadas con la genómica y proteómica,
terapéuticas pueden emplearse en etapas clasificadas en función de las estrategias empleadas.
Múltiples dianas
Identificación de dianas
candidatas
Interacciones Cribado virtual Análisis de la
proteína-proteína (“in silico”) expresión génica
Algunas dianas
Validación de dianas
potenciales
Modulación Inactivación Modelos “in vitro” Modelos “in vivo”
de la transcripción de proteínas
Múltiples
Cribado de compuestos
compuestos
candidatos
Desarrollo clínico
Fármaco
Seguridad Dosificación Efectividad
candidato
Fármaco final
Figura 3. Papel de la validación de dianas en el proceso de desarrollo de nuevos fármacos.
Fuente: elaboración propia.
10

11. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN
DE DIANAS TERAPÉUTICAS
2. Técnicas de identificación de dianas
Al buscar un gen asociado a una enfermedad Las técnicas genómicas y proteómicas más
genética, los investigadores se concentran destacadas que se emplean en la identificación de
generalmente en genes candidatos8. Se considera nuevas dianas terapéuticas se pueden clasificar
que un gen es candidato si la proteína que en tres grupos en función de la estrategia que
codifica representa una posibilidad lógica de que siguen. El análisis de la expresión génica, el
esté involucrado en la enfermedad, o bien si el estudio de las interacciones proteína-proteína, y
gen está localizado físicamente dentro de una el cribado virtual, son las tres estrategias
región del genoma asociada o ligada a la principales descritas en el presente informe.
enfermedad. La segunda situación se encuentra
frecuentemente en proyectos de clonaje
posicional, donde el gen buscado se identifica de
acuerdo a su posición dentro del genoma.
2.1. Análisis de la expresión
génica
En un proyecto de clonaje posicional típico, se
identifica primero una región pequeña del genoma El estudio del perfil de expresión de genes
que contiene el gen que estamos buscando. engloba un conjunto de técnicas que permiten
Entonces todos los genes ubicados en esa región identificar los genes implicados en el proceso
se convierten inmediatamente en posibles genes patológico mediante la observación de su
candidatos. Si se sabe o se puede deducir algo de fenotipo10 molecular. La expresión génica es el
la proteína codificada de un determinado gen proceso por medio del cual la información
candidato o si se puede demostrar que la proteína codificada en el ADN se transforma en las
está involucrada en la enfermedad, entonces ese proteínas necesarias para el desarrollo y
gen se puede considerar un candidato fuerte y se funcionamiento de la célula. Este proceso tiene
intensifican los esfuerzos para encontrar lugar por medio de una molécula intermediaria
mutaciones en él9. que transmite la información genética
denominada ARN mensajero (ARNm)11.
Transcripción Traducción
ARNm
ADN Proteína
Análisis de la expresión
génica al nivel de la
transcripción
Figura 4. Análisis de la expresión génica en la validación de dianas.
Fuente: elaboración propia.
8
Gen candidato: gen localizado en una región de un cromosoma sospechosa de estar involucrada en una enfermedad y
cuyos productos proteicos sugieren que podría ser el gen de la enfermedad en cuestión
(http://www.conocimientosweb.net/portal/term1494.html).
9
ConocimientosWeb.net (http://www.conocimientosweb.net/portal/term1494.html).
10
Fenotipo: rasgos o características visibles de un organismo, determinado por su constitución genética (genotipo) y por el
ambiente en el que crece y se desarrolla.
11
El ADN (ácido desoxirribonucleico) es una molécula de gran tamaño que se encuentra en todos los seres vivos y que es
portadora de la información genética. El ARN (ácido ribonucleico) es una molécula parecida al ADN en cuanto a sus
características químicas, que también está relacionada con la transmisión de la información genética, ya que actúa como
intermediario en el proceso de traducción o formación de proteínas.
11

12. Aunque todas las células contienen la misma expresan de modo diferencial en dos muestras
información genética, los genes se expresan en diferentes. Los resultados que se obtienen no
diferentes momentos dependiendo de la función proporcionan información acerca de la cantidad de
de la célula o tejido y de su estado fisiológico. El ARNm y no se pueden comparar resultados
análisis del perfil de expresión de genes consiste obtenidos en experimentos distintos13. Por este
en la identificación y cuantificación de los genes motivo, aunque son de gran utilidad en las
que se expresan en una célula o tejido concreto primeras etapas de identificación de dianas, no se
en un determinado momento. El estudio del perfil suelen emplear con el fin de validar dianas14.
de expresión de genes se puede realizar a partir
de la identificación y cuantificación del ARN o bien
de las proteínas expresadas directamente. 2.1.1. Análisis serial de la expresión
génica (SAGETM)
Las técnicas de análisis de la expresión génica
emplean el primer tipo de abordaje, de modo que
El análisis serial de la expresión génica (SAGETM)
la comparación de los genes expresados en se basa en la presunción por la cual un segmento
muestras distintas permite descubrir los genes corto procedente de ARNm posee una complejidad
que se encuentran activados e inactivados en suficiente como para identificar un gen completo.
diferentes estados metabólicos y patológicos. Por Esta técnica fue desarrollada por la empresa
tanto, comparando la expresión de genes de Genzyme como plataforma tecnológica de
tejidos sanos y enfermos, es posible descubrir los descubrimiento de nuevas dianas oncológicas15, y
genes implicados en el desarrollo y progresión de ha sido adoptada por el Instituto Nacional del
la enfermedad, así como establecer una Cáncer (NCI) como método de análisis de la
asociación entre el estado patológico y expresión génica dentro del Proyecto Anatomía
determinados genes que se encuentran alterados del Genoma del Cáncer16.
en esa enfermedad, y por tanto validar posibles
dianas terapéuticas.
Estos segmentos cortos se obtienen mediante la
acción de enzimas de restricción, que cortan en
Las principales técnicas de identificación de lugares específicos el ADN complementario
dianas basadas en el análisis de la expresión sintetizado a partir del ARN mensajero total de la
génica son los microarrays de ADN, el Análisis muestra. Midiendo la cantidad de copias de cada
serial de expresión génica (SAGE), y la fragmento específico se puede estudiar el nivel de
Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). expresión de un gen concreto, identificar
Otras técnicas alternativas de análisis de la simultáneamente miles de fragmentos de este
expresión génica son variantes de la PCR como tipo en una célula o tejido y cuantificar sus
RaSH, RDA, RSDD, DDRT-PCR12. La principal niveles de expresión. La comparación de dichos
limitación de estas últimas radica en que son perfiles en muestras sanas y enfermas permite
laboriosas y requieren la inversión de un tiempo asociar la presencia de genes con enfermedades
considerable para identificar los genes que se concretas17.
12
Pillutla, R. C. et al. (2002). Target Validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction
technologies. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 6 (4): 517-531.
13
Chanda, S. K. et Caldwell, J. S. (2003). Fulfulling the promise: drug discovery in the post-genomic era. Drug Discovery
today. Vol. 8, Nº 4. 168-174.
Allen, N. L. et al. (2003). Representational difference análisis: critical appraisal and metod development for the
identification of unique DNA sequences from prokaryotes. Journal of microbiological methods. 55: 73-81.
14
Coleman, R. A. and Clark, K. L. (2003). Target validation using human tissue. Targets Vol. 2, No. 2: 58-64.
15
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), Genzyme
(http://www.genzyme.com/research/gzmo/discovery/discoveryplatforms2_sage_gzmo.asp).
16
SAGE Genie, Cancer Genome Anatomy Project, CGAP. (http://cgap.nci.nih.gov/SAGE).
17
Serial Analysis of Gene Expression, Sagenet web page (http://www.sagenet.org).
12

13. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN
DE DIANAS TERAPÉUTICAS
2.1.2. Electroforesis en geles 2.1.3. Microarrays de ADN
de poliacrilamida (PAGE)
Las técnicas de análisis de la expresión génica
La electroforesis en gel de poliacrilamida mediante microarrays se basan en la capacidad
es una técnica que permite la separación de de los ácidos nucleicos para hibridar entre sí, es
proteínas de una muestra compleja en función de decir, para unirse a otros ácidos nucleicos de
su masa molecular mediante la aplicación de forma específica mediante un fenómeno
corrientes eléctricas. La distribución de las denominado complementariedad19.
proteínas en el gel y la intensidad de los puntos
permite obtener un perfil de la expresión de Los microarrays de ADN son herramientas
proteínas así como la identificación y moleculares que permiten analizar la expresión
cuantificación de las mismas. Este último paso se génica por medio de la cuantificación del ARN
suele realizar mediante espectrometría de masas, expresado en una muestra concreta20. Un
una técnica analítica que brinda información microarray de ADN consiste en un soporte sobre el
cualitativa y cuantitativa acerca de la composición cual se inmovilizan en posiciones concretas
atómica y molecular de materiales inorgánicos y pequeños fragmentos de ADN de secuencia conocida
orgánicos. denominados sondas. El ARN procedente de la
muestra que se desea analizar se transcribe a ADN
La comparación de los perfiles de expresión en un copia mediante transcripción inversa, ya que estas
tejido enfermo y uno sano permite analizar los moléculas son más estables que el ARN y es posible
cambios en la expresión de proteínas. De esta añadir marcadores que permitan su detección.
forma, aquellas proteínas implicadas en procesos Mediante la hibridación del ADNc procedente de
patológicos se expresarán en cantidades muestras diferentes con las sondas inmovilizadas en
diferentes en tejidos enfermos en comparación el soporte, es posible identificar el gen concreto que
con los tejidos normales, y por tanto podrían se expresa en cada muestra. La intensidad de los
constituir dianas potenciales. La principal puntos del microarray indicará la cantidad de ARN
limitación de esta técnica se debe a que el presente en ese punto. Las principales limitaciones
procedimiento resulta laborioso y consiste en una de los microarrays se refieren a su elevado coste por
técnica de bajo rendimiento18. unidad.
18
Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Vol. 3: 965-972.
19
El ADN está compuesto por dos cadenas enrolladas alrededor de sí mismas que forman una “doble hélice”, cada una de
ellas formada por millones de bloques químicos llamados “bases”, y denominadas por las letras A, T, G y C. Estas bases
poseen la capacidad de unirse entre sí de forma específica, de modo que las uniones entre las bases A-T y G-C son
complentarias entre sí.
20
López, M.; Mallorquín, P.; Vega, M. (2002). Microarrays y Biochips de ADN: Informe de Vigilancia Tecnológica. Genoma
España, Círculo de Innovación en Biotecnología y Fundación General de la Universidad Autónoma de Madrid.
13

14. Identificación de dianas mediante técnicas de análisis de la expresión génica
Técnicas basadas Técnicas basadas Técnicas basadas
en la PCR en la secuenciación en la hibridación
ARN
Transcripción inversa
ADN copia
Electroforesis en geles Análisis serial de expresión
Microarrays
de poliacrilamida (PAGE) génica (SAGE)
Proteína A Proteína B Hibridación sobre un soporte con
sondas de ADN complementarias
ARN
– S-S–
Desnaturalización Liberación de fragmentos
específicos de cada ARN
–SH
HS–
Detección por fluorescencia
Secuenciación
–
Cuantificación
+
Separación mediante
electroforesis
Fig. 5. Validación de dianas mediante técnicas de análisis de la expresión génica.
Fuente: Velculescu, V. E. et al. (2000). Analysing uncharted transcriptomes with SAGE. Trends Genet. Oct;16(10): 423-5;
University of Miami Department of Biology Homepage
(http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255hist/ecbxp4x—SDS.jpg).
2.2. Interacciones genes presentes en el ADN. Dado que la mayoría
de las dianas de fármacos son proteínas, su
proteína-proteína
estudio resulta esencial en el proceso de
validación de dianas.
Las técnicas genómicas anteriormente
mencionadas determinan la expresión de los La proteómica permite comprender el
genes en una célula o tejido, pero no permiten el funcionamiento de la célula a través del estudio
estudio de las interacciones entre proteínas21. Las del conjunto de proteínas que contiene una célula
proteínas son las moléculas responsables de o tejido o proteoma22. Por medio de técnicas
desempeñar las funciones controladas por los proteómicas es posible comparar perfiles de
21
Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Drug discovery. Vol. 3: 965-972.
22
Lindsay, M. A. (2003). Target discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 2: 831-838.
14

15. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN
DE DIANAS TERAPÉUTICAS
expresión de proteínas de tejidos y células sanas Los microarrays de proteínas consisten en un
con los perfiles de expresión en muestras soporte sólido sobre el que se inmovilizan proteínas
enfermas, lo que permite asociar dianas proteicas específicas en posiciones concretas. Los microarrays
a determinados procesos patológicos. Por otro de proteínas y anticuerpos permiten el análisis a
lado, existen técnicas que permiten estudiar las gran escala de los perfiles de expresión de proteínas
interacciones entre proteínas a gran escala y y el estudio de las interacciones entre las mismas26.
establecer redes de interacciones entre las Por medio del empleo de muestras procedentes de
proteínas de la célula. El conocimiento de estas tejidos sanos y enfermos, los microarrays de
redes permite conocer las rutas implicadas en proteínas permiten estudiar la expresión diferencial
procesos patológicos y el conjunto de las de proteínas en tejidos enfermos y relacionar las
proteínas implicadas en una determinada diferencias en el perfil de expresión proteica con el
enfermedad, es decir, potenciales dianas fenotipo de la enfermedad, lo que permite identificar
23 y validar dianas potenciales de una enfermedad.
terapéuticas .
Existen tres tipos de microarrays de proteínas en
función de las moléculas que interaccionan entre sí.
De esta forma, nos encontramos con microarrays de
2.2.1 Microarrays de proteínas interacciones proteína-proteína, ADN-proteína, y
enzima-sustrato27.
Los microarrays de proteínas se basan en la
tecnología desarrollada para la fabricación de los Las principales limitaciones técnicas de los
microarrays de ADN. En este caso, en vez de microarrays de proteínas se refieren a la dificultad
ácidos nucléicos, las moléculas que se inmovilizan para detectar e identificar proteínas de modo
sobre el soporte son de naturaleza proteica, como específico en comparación con los microarrays de
anticuerpos24, enzimas o proteínas de otro tipo25. ácidos nucléicos, que no poseen esta limitación28.
Interacción Interacción Interacción Interacción Interacción
prot-prot ADN-prot prot-molécula antic-prot enzima-sustrato
Figura 6. Interacciones de proteínas en validación de dianas.
Fuente: Smith, M. G. & Snyder, M. (2005). Global analysis of protein function using protein microarrays.
Mech. Ageing Dev. 126(1):171-5.
23
Brown, D. & Superti-Furga, G. (2003). Rediscovering the sweet spot in drug discovery. Drug Discovery today. 8 (23):
1067-1077.
Pillutla, R. C., et al. (2002). Target validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction
technologies. Expert Opin. Ther. Targets, 6(4): 517-531
24
Los anticuerpos son proteínas especializadas producidas por el sistema inmunológico que se unen a partículas extrañas
denominadas antígenos.
25
Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Vol. 3: 965-972.
26
Kumble, K. D. (2003). Protein microarrays: new tools for pharmaceutical development. Anal Bioanal Chem. 377: 812-819.
27
Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Curr. Op. in Chem. Biol. 8: 371-377.
28
Kramer, R. et Cohen, D. (2004). Functional genomics to new drug targets. Nature Reviews. Vol. 3: 965-972.
15

16. 2.2.2. Sistema doble híbrido La identificación de dianas terapéuticas mediante el
sistema doble híbrido analiza las interacciones
entre dos proteínas diferentes, que se unen a los
El sistema doble híbrido es una herramienta
dominios de unión de ADN y activación de un gen
molecular que permite el estudio a gran escala de
que se utiliza como indicador respectivamente. La
las interacciones proteína-proteína a través de las
unión de los dos dominios a través de las proteínas
proteínas que regulan la expresión génica,
fusionadas permite la activación de la expresión del
denominadas factores de transcripción29. Estas gen indicador, por lo que su presencia pondrá de
proteínas son las encargadas de regular la manifiesto la existencia de una interacción entre
expresión de los genes mediante su activación o las dos proteínas31. El sistema doble híbrido
represión. La mayoría de los factores de aprovecha la maquinaria celular de la levadura S.
transcripción presentan dos regiones o dominios, cerevisiae, que se utiliza como sistema de
un dominio de unión al ADN y un dominio expresión de ambas proteínas de fusión. Por otro
responsable de la activación del gen. Ambos lado, esta técnica permite estudiar la interacción
dominios son esenciales para que tenga lugar la entre proteínas y construir redes de interacciones
expresión génica, aunque no tienen porqué de todo el proteoma, proporcionando una visión
formar parte de una misma proteína30. global de la maquinaria molecular32.
Dom.
Activ.
Dom.
Activ.
Proteína
2
Proteína Proteína Proteína
1 2 3
Dom. Expresión del Dom. Sin expresión del
unión gen indicador unión gen indicador
ADN ADN
Promotor Gen indicador Promotor Gen indicador
Figura 7. Funcionamiento del sistema doble híbrido.
Fuente: Elaboración propia.
La principal limitación de esta técnica radica en que positivos provocados por la activación del gen
no permite analizar las interacciones entre indicador por parte de otras proteínas de la
proteínas localizadas en compartimentos diferentes levadura, además de falsos negativos debido a
de la célula, limitando por tanto su aplicación. Por problemas en la unión de las dos proteínas33.
otra parte, es habitual la presencia de falsos
29
Factor de transcripción: proteínas que regulan la expresión de determinados genes, mediante la activación o represión de
su expresión.
30
Coates, P. J. & Hall, P. A. (2003). The yeast two-hybrid system for identifying protein-protein interactions. Journal of
Pathology 199:4-9.
31
Pillutla, R. C. et al. (2002). Target validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction
technologies. Target Validation and Drug Discovery. 6 (4): 517-531.
32
Parsons, A. B. et al. (2003). Yeast genomics and proteomics in drug discovery and target validation. Progress in Cell
Cycle Research. Vol 5. 159-166.
33
Coates, P. J. & Hall, P. A. (2003). The yeast two-hybrid system for identifying protein-protein interactions. Journal of
Pathology 199:4-9.
16

17. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN
DE DIANAS TERAPÉUTICAS
3. Técnicas de validación de dianas
A pesar de que las técnicas anteriormente estrategia de validación permite comprobar la
mencionadas arrojan información relevante sobre existencia de modificaciones en el fenotipo de
la función de las dianas, su objetivo principal organismos o células en ausencia de expresión
radica en la identificación a gran escala de nuevas del gen. De este modo, se consigue reproducir el
dianas terapéuticas y no en la validación de las efecto que produciría la ausencia o inactivación de
mismas. A continuación se describen aquellas la proteína, lo que resulta de suma utilidad para
técnicas empleadas en etapas posteriores del validar dianas al permitir relacionar el fenotipo
proceso de I+D, en las cuales es necesaria la asociado a la enfermedad con un gen en
validación de la función de las dianas moleculares concreto. Otras técnicas de validación de dianas
ya identificadas. Las principales estrategias están basadas en la modulación de la expresión
encaminadas a la modulación de la expresión permiten activar la expresión de genes específicos
génica, la inactivación de la función de las dianas provocando la transcripción de ARN a partir del
proteicas, y el análisis de la expresión génica a ADN.
gran escala. Por último, se describen las técnicas
de desarrollo de modelos vivos de enfermedad.
3.1.1. Oligonucleótidos antisentido
3.1. Modulación Los oligonucleótidos antisentido son pequeños
de la expresión génica fragmentos de nucleótidos de unos 15 o 20 pares
de bases de ADN o ARN de cadena sencilla, que
La técnicas de modulación de la expresión génica son complementarios a un fragmento del ARN
persiguen bloquear o activar de forma específica la diana. Esta complementariedad permite su unión al
expresión de genes mediante diferentes estrategias ARN de forma específica, bloqueando su expresión
a nivel del ARN mensajero, a través del empleo de e impidiendo la producción de la proteína diana.
oligonucleótidos modificados34. Estas
modificaciones les permiten conseguir una serie de Los oligonucleótidos antisentido inhiben la
propiedades entre las que se encuentran la entrada expresión proteica mediante dos mecanismos
al interior de las células, la resistencia a la diferentes. En algunos casos el ARN emparejado
degradación y el aumento en la afinidad por la con el oligonucleótido es fragmentado por acción
molécula de ARN. Las tecnologías antisentido se de una enzima que reconoce el ARN emparejado
emplean en validación de dianas sobre cultivos de con ADN. Tras este corte, el ARN queda dañado y
tejidos o células, así como en modelos animales35. el oligonucleótido antisentido en cambio no sufre
alteración alguna de modo que puede seguir
Las técnicas de modulación de la expresión génica uniéndose al ARN. En otros casos no se produce
más habituales consisten en el bloqueo de la un corte en el ARN, pero el emparejamiento con
expresión génica a nivel del ARN impidiendo que el oligonucleótido puede impedir procesos
un gen concreto se exprese y por tanto esenciales para la producción de proteínas a partir
consiguiendo que la proteína no se sintetice. Esta del ARN36.
34
Los oligonucleótidos son moléculas de ácido nucléico de longitud reducida que se pueden emplear para bloquear el ARN
mensajero e impedir su función.
35
Ilag, LL, et al. (2002). Emerging high-throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7(18
Suppl):S136-42.
36
Stone, L. S. et Vulchanova, L. (2003). The pain of antisense: in vivo application of antisense oligonucleotides for
functional genomics in pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews 55, 1081-1112.
17

18. Ribosomas
Comienzo de la síntesis de proteínas
ARNm
Oligo antisentido
Unión de un oligonucleótido antisentido
Corte del ARNm por la enzima Ribonucleasa H
Inhibición de la expresión de la proteína
Figura 8. Tecnologías de oligonucleótidos antisentido en validación de dianas.
Fuente: Silencing code. Chemsoc, Royal Society of Chemistry (http://www.chemsoc.org/chembytes/ezine/1997/dna.htm).
En general, el empleo de oligonucléotidos duración. Este problema se ha solucionado
antisentido es una herramienta de validación de mediante el empleo de estructuras de ADN
dianas que proporciona una elevada especifidad. denominadas vectores de expresión, las cuales
Sin embargo, esta selectividad requiere como contienen la información necesaria para dirigir la
contrapartida el diseño detallado de oligonucleótidos síntesis de oligonucleótidos antisentido en el
ya que existen numerosas variables que afectan a interior de la célula. Estos vectores ofrecen la
la especificidad de los oligos37. Otra desventaja que ventaja de ser más estables que los
plantea el uso de los oligonucleótidos antisentido es oligonucleótidos antisentido desnudos, por lo que
que son muy inestables y se degradan rápidamente se consigue una inhibición de la expresión génica
en células y tejidos. Esta limitación puede ser más prolongada39.
atenuada mediante modificaciones químicas que
mejoren su estabilidad. Asímismo, la administración
y distribución de oligonucleótidos a los cultivos
celulares constituye un paso limitante y 3.1.2. ARN de interferencia
habitualmente es necesario combinarlos con
compuestos que facilitan la entrada de los El ARN de interferencia (ARNi) es una tecnología
oligonucleótidos a las células, como los liposomas38. que se basa en el empleo de moléculas de ARN
de doble cadena para bloquear la expresión de
La inhibición de la expresión génica mediante genes específicos. El mecanismo del ARNi está
oligonucleótidos antisentido es un proceso que presente en la naturaleza y es una respuesta
tiene lugar de manera transitoria, lo que supone celular innata que permite combatir las
una limitación en el silenciamiento de la expresión infecciones virales regulando la expresión
de proteínas con una vida media de larga del ARN.
37
Hall, J. (2004). Unravelling the general properties of siRNAs: strength in numbers and lessons form the past. Nature
Reviews. Genetics 5: 552-557.
38
Lee, L. K. et Roth, C. M. (2003). Antisense technology in molecular and cellular bioengineering. Current Opinion in
Biotechnology. 14: 505-511.
39
Dykxhoorn, D. M., et al. (2003). Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nature Rev. Mol. Cell
Biol. 4, 457–467.
18

19. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN
DE DIANAS TERAPÉUTICAS
En los ensayos de validación de dianas, el ARNi ARNsi son reconocidos por el complejo RISC
de doble cadena se introduce en el interior de las (“RNA-induced silencing complex”), el cual se une
células mediante distintos métodos. a moléculas de ARNm complementarias,
Posteriormente, este ARNi de doble cadena es facilitando la degradación de éstas. Asimismo, es
procesado enzimáticamente dando lugar a posible administrar directamente el ARNsi a la
moléculas de ARN más pequeñas denominadas célula, en cuyo caso no sería necesaria ninguna
pequeños ARNs de interferencia o ARNsi (“small de las etapas anteriores. De este modo, tanto el
interfering RNAs”). Estos ARNsi son de doble ARNi como el ARNsi son herramientas útiles para
cadena y están por tanto formados por dos la inactivación específica de la expresión de
hebras complementarias y emparejadas. Los genes40.
ARN de doble cadena
ARNi de
doble cadena
Activación del complejo
RISC por ARNi de
cadena sencilla
ARNm Reconocimiento
de la diana
Rotura del ARNm
Figura 9. Tecnologías de ARNi en validación de dianas.
Fuente: Dykxhoorn, D. M., et al. (2003). Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nature Reviews.
Molecular Cell Biology. Vol. 4,457-467.
Las principales ventajas de los ARNi radican en su El empleo de ARNi presenta básicamente los
bajo coste y alta especificidad, por lo que mismos problemas que las tecnologías antisentido
constituyen una herramienta molecular que está y se refieren principalmente a las dificultades de
sustituyendo a los oligonucleótidos antisentido administración y distribución en cultivos celulares
como método de modulación de la expresión y tejidos, viéndose agravada la situación en
génica41. Por otro lado, el ARNi puede emplearse estudios in vivo. Estos problemas se han
como herramienta para el estudio de la biología solucionado en parte mediante el empleo de
de organismos completos a escala genómica vehículos de administración como liposomas, o
mediante microarrays de células transfectadas vectores de expresión como plásmidos y virus43.
con ARNi. Esta estrategia ha sido empleada con Por otra parte, las técnicas de ARN interferente
éxito en líneas celulares procedentes de modelos pueden dar lugar a efectos inespecíficos debidos a
animales, siendo inminente su aplicación en la unión de alguna de las dos hebras del ARNsi a
células humanas42. moléculas de ARNm distintas del ARN diana44.
40
Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Current Opinion in Chemical Biology. 8: 371-377.
41
Lindsay, M. A. (2003). Target discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. 2: 831-838.
42
Gunsalus, K. C. & Piano, F. (2005). RNAi as a tool to study cell biology: building the genome-phenome bridge.
Curr. Op. in Cell Biology 17:3-8.
43
Cocks, B. G. & Theriault, T. P. (2004). Developments in effective applicaction of small inhibitory RNA (siRNA) technology
in mammalian cells. DDT: Targets. Vol. 3(4):165-171.
44
Lee, L. K. & Roth, C. M. (2003). Antisense technology in molecular and cellular bioengineering. Current Opinion in
Biotechnology. 14: 505-511.
19

20. Como solución a este tipo de problemas se han diseñado moléculas de ARN interferente modificadas
químicamente que evitan la aparición de efectos no específicos45. Por otra parte, mientras que la tecnología
de ARNi ha sido aplicada con éxito in vitro en numerosas ocasiones en la validación de dianas terapéuticas,
su empleo in vivo todavía no ha alcanzado el mismo grado de desarrollo.
Otro tipo de mejoras que se están desarrollando en tecnologías de ARN interferente incluyen la
administración directa de ARNsi de cadena sencilla en células, que ha demostrado ser efectivo en muchos
tipos celulares aunque de forma transitoria. Para solucionar este problema se ha recurrido a los ARNsh
(“short hairpin”), moléculas de ARN con secuencias repetidas invertidas que forman estructuras en forma
de horquilla, y que dan lugar a una inhibición mucho más estable de la expresión génica46.
Similitudes y diferencias entre Oligonucleótidos antisentido y ARNsi47
Similitudes Diferencias
• Fragmentos cortos de ácidos nucleicos • Dos hebras para el ARNsi, una hebra para
(aprox. 20 bases). oligos antisentido.
• Metodología común para la administración a • ARN de doble hebra es más estable que
cultivos celulares. ácidos nucleicos de una sola hebra.
• Inducen el silenciamiento de la expresión • Las modificaciones químicas no son tan
génica mediante su unión al ARNm. necesarias para su administración en cultivos
• Los ARNsi y ciertos oligos antisentido celulares en el caso de los ARNi.
provocan la ruptura del ARNm. • Mediación del complejo RISC en el ARNi.
• Sus propiedades pueden alterarse mediante • Activación de la enzima ARNasa en oligos
modificación de las bases. antisentido.
• Perfiles de biodistribución similares. • Aplicación más extendida de la técnica de ARNi.
3.1.3. Ribozimas
Las ribozimas son pequeñas moléculas de ARN que actúan como enzimas y que pueden cortar otras
moléculas de ARN en sitios específicos. La unión entre el ribozima y el ARN diana se produce por
complementariedad y apareamiento entre ambas moléculas. De este modo, se pueden diseñar ribozimas
que reconozcan cualquier ARN diana simplemente variando la región de reconocimiento del ribozima.
ARNm
Ribozima
Figura 10. Ribozimas en la validación de dianas.
Fuente: Chattterton, J. E. et al. (2004). Ribozymes in gene identification, target validation and drug discovery.
DDT: Targets, Vol. 3(1):10-17.
45
Samarsk, D. & Datta, M. (2003). Expediting target identification and validation through RNAi. Expert Rev. Mol. Diagn.
4(1):11-14.
46
Walgren, J. L. & Thompson, D. C. (2004). Application of proteomic technologies in the drug development process. Toxicol
Lett. 149:377-85.
47
Paroo, Z. & Corey, D. R. (2004). Challenges for RNAi in vivo. Trends in Biotechnology. Vol. 22, No. 8: 390-394.
20

21. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN
DE DIANAS TERAPÉUTICAS
Las principales limitaciones de los ribozimas se bloqueo o activación de la expresión génica en
deben a su inestabilidad y sensibilidad a la cultivos celulares. Los dedos de zinc son regiones
degradación, menor especificidad y restricciones presentes en proteínas tales como los factores de
en el diseño. Los ribozimas pueden ser transcripción que participan en la iniciación de la
modificados químicamente para incrementar su transcripción, es decir, el paso de ADN a ARN
estabilidad. Por otro lado, es posible introducir en previo a la síntesis de proteínas. Estos factores de
la célula vectores que dirigen la síntesis de transcripción poseen unas estructuras
ribozimas de tal modo que dicha síntesis ocurra características en forma de dedos unidos por un
directamente en el interior de las mismas. En este ión de zinc, los cuales reconocen secuencias
caso, el nivel de producción de ribozima en la específicas del ADN. Esta particularidad es de
célula será de suma importancia para que se gran utilidad en la validación de dianas ya que se
produzca una reducción significativa en el nivel de pueden diseñar proteínas con dedos de zinc que
ARN diana48. reconozcan específicamente la secuencia de ADN
que se desea bloquear o activar. La activación o
represión de la expresión génica se consigue
mediante la unión de dominios activadores o
3.1.4. Proteínas de dedos de zinc represores respectivamente a las proteínas de
dedos de zinc. La asociación entre la modulación
Una alternativa a las anteriores técnicas de de la expresión génica de la diana con el fenotipo
modulación de la expresión génica es el diseño de o estado patógico, será la que determine
proteínas de dedos de zinc como agentes de finalmente la validación de la diana49.
Activación de la expresión génica
ADN
Bloqueo de la expresión génica
Proteína de 3 dedos de Zinc
ADN
Figura 11. Modulación de la expresión génica mediante proteínas de dedos de Zinc.
Fuente: Jamieson, A.C. et al. (2003). Drug discovery with engineered zinc-finger proteins. Nature Reviews: Drug
Discovery. Vol. 2: 361-368.
48
Chatterton, J. E., et al. (2004). Ribozymes in gene identification and drug discovery. Drug Discovery Today: Targets,
vol. 3, No. 1, 10-17.
49
Jamieson, A. C., et al. (2004). Drug Discovery with Engineered Zinc-finger Proteins. Nature Reviews: Drug Discovery.
Vol. 2, 361-368.
Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Current Opinion in Chemical Biology. 8: 371-377.
21

22. La principal ventaja de esta técnica frente al resto a la función de la proteína completa. Por este
de técnicas de modulación de la expresión génica motivo, las técnicas basadas en la inactivación de
consiste en que es más estable que las proteínas son esenciales en la validación de
estrategias que emplean ácidos nucleicos. Por numerosas dianas terapéuticas54.
otro lado, el diseño de estas proteínas requiere la
identificación previa de las secuencias de ADN En el presente apartado se agrupan técnicas que
susceptibles de ser reconocidas por los dedos de permiten el bloqueo o inactivación de proteínas
zinc, que se corresponden con regiones del específicas de modo que éstas dejan de ejercer su
genoma de baja condensación. Este mapeado se función. El efecto observado tras la inactivación
realiza mediante enzimas ADNasas, que de la proteína diana permite relacionar dicha
reconocen regiones del ADN con baja proteína con su función concreta, y de esta forma
condensación y por tanto más accesibles a los resulta posible asociar un fenotipo determinado a
factores de transcripción50. Otra limitación a tener una proteína concreta.
en cuenta es la dificultad en la administración de
proteínas de dedos de zinc, que afecta por igual a
todas las tecnologías de modulación de la
3.2.1. Química genética
expresión génica mencionadas en el presente
informe. Este problema se puede solucionar por
medio del empleo de vehículos moleculares La estrategia clásica de validación de dianas o
llamados vectores que permitan introducir genes química genética consiste en el empleo de
en las células . 51 pequeñas moléculas que se unen a las dianas de
modo específico provocando su inactivación. De
esta forma, se consigue inactivar la función de
una proteína específica, lo que permite establecer
3.2. Inactivación de proteínas una relación entre la actividad de la misma y los
efectos que se manifiesten en los cultivos de
Debido a que la mayoría de los fármacos que células, tejidos o animales55. A diferencia de las
actualmente se encuentran en el mercado actúan estrategias genéticas, la química genética permite
sobre proteínas, parece lógico pensar que la la alteración del fenotipo de forma directa y
validación de dianas proteicas ha de ser una ocurre en tiempo real. Esta modificación en la
estrategia fundamental en el proceso de función proteica no es permanente, ya que su
desarrollo de un fármaco52. La validación de efecto es reversible si se eliminan los restos de
dianas mediante técnicas de modulación de la estas moléculas del medio. Este enfoque resulta
expresión génica no siempre está relacionada de muy útil a la hora de validar dianas mediante el
forma directa con la expresión de la proteína. En empleo de pequeñas moléculas, ya que permite
numerosas ocasiones, se ponen en marcha una asociar un fenotipo de interés con la acción de
serie de mecanismos moleculares que modifican una determinada molécula sobre una diana
la proteína hasta dar lugar a la molécula concreta56.
responsable del fenotipo final, y que por tanto
serían imposibles de identificar únicamente Además de permitir analizar la función celular y
mediante tecnologías de modulación de la validar dianas moleculares, estas pequeñas
expresión génica53. Así mismo, algunas proteínas moléculas pueden emplearse como base para
están formadas por varios dominios obtener potenciales fármacos. A partir del
multifuncionales, por lo que la inhibición de la conocimiento de la estructura química del
expresión de uno de los genes que codifica un compuesto activo, es posible diseñar nuevas
único dominio no proporciona datos extrapolables moléculas de cara a su potencial aplicación
50
Liu, P-G., et al. (2001). Regulation of an endogenous locus using a panel of designed zinc finger proteins targeted to
accessible chromatin regions. Activation of vascular endothelial growth factor. J. Biol. Chem., 276:11323-11334.
51
Peet, N. P. (2003). What constitutes target validation? Targets 2 (4): 125-127.
52
Smith, M. B. (2003). Hitting the target. Nature, vol. 422, 341-347.
53
Walgren, J. L. & Thompson, D. C. (2004). Application of proteomic technologies in the drug development process.
Toxicol Lett. 149:377-85.
54
Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high-throughput drug target validation technologies. DDT Vol. 7. Nº 18 (Suppl.) S136-142.
55
Peet, N. P. (2003). What constitutes target validation? Targets. Vol. 2, No. 4: 125-127.
56
Chanda, S. K., et al. (2003). Fulfilling the promise: drug discovery in the post-genomic era. Drug Discovery Today. Vol. 8,
No. 4: 168-174.
22

23. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN
DE DIANAS TERAPÉUTICAS
farmacéutica. Una de las principales limitaciones 3.2.2. Anticuerpos monoclonales
de esta estrategia consiste en que requiere la
disposición de pequeñas moléculas que sean Los anticuerpos son proteínas desarrolladas por el
capaces de interaccionar de modo selectivo con organismo con el fin de combatir infecciones
proteínas, lo que no es posible en todas las mediante el bloqueo de agentes infecciosos de forma
ocasiones57. específica. Esta selección y acción inhibitoria es de
gran utilidad en la validación de dianas proteicas, por
Las estrategias de química genética son de gran lo que se han desarrollado diferentes técnicas de
utilidad en aquellos casos en los cuales los genes fabricación de anticuerpos monoclonales58 a gran
de interés son esenciales para la supervivencia escala como el “phage-display” y el doble híbrido59.
del organismo, y su alteración es inviable para el En el caso de que las dianas se encuentren en el
funcionamiento de la célula. La principal limitación interior de la célula, es necesaria la administración de
de esta técnica consiste en que no siempre se anticuerpos mediante microinyección, o bien la
dispone de pequeñas moléculas que actúen de expresión de los mismos en el interior de la célula
modo específico sobre la proteína celular de mediante vectores de expresión, denominándose en
interés. este caso intracuerpos.
Anticuerpo intracelular
Proteína diana Interacción de la Proteína diana
y el anticuerpo monocional
Figura 12. Inactivación de proteínas mediante anticuerpos, aplicación en la validación de dianas.
Fuente: Iclectus Ltd. (http://www.iclectus.com/technology/intrabodies.htm#figure1).
Una de las limitaciones de los anticuerpos es su El principal problema que presentan los
inestabilidad en el interior de las células, por lo anticuerpos como agentes de validación de dianas
que las estrategias que se están desarrollando en es el bajo número de estas moléculas que dan
la actualidad van encaminadas al diseño de lugar a una inactivación efectiva de sus dianas
anticuerpos más estables y eficientes. proteicas60.
57
Williams, M. (2003). Target validation. Curr Opin Pharmacol. 3(5): 571-7.
58
Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos específicos que pueden ser producidos en grandes cantidades por células
que se originan a partir de una línea celular (hibridoma). Todos los anticuerpos monoclonales producidos por una célula
híbrida son idénticos.
59
Pillutla, R. C., et al. (2002). Target Validation and drug discovery using genomic and protein-protein interaction
technologies. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 6 (4): 517.531.
60
Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7 (18):
136-142.
23

24. 3.2.3. Aptómeros
Los aptómeros son nucleótidos artificiales capaces de reconocer y unirse a moléculas específicas debido a
su particular estructura terciaria. Es posible diseñar y construir aptómeros que unan e inhiban
prácticamente cualquier proteína diana.
Aptómero
Proteína diana Interacción de la Proteína
diana y aptómero
Figura 13. Inactivación de proteínas mediante Aptómeros, aplicación en la validación de dianas.
Fuente: Archemix Corp. (http://www.archemix.com/tech_aptapp.html).
Los aptómeros presentan problemas de aptómeros se consigue mediante la construcción
inestabilidad que se han solucionado mediante de aptozimas, aptómeros conjugados con
modificaciones químicas que incrementan su dominios de ribozimas, o bien pares de
estabilidad. Al igual que en el caso de los aptómeros que reconocen simultáneamente a la
anticuerpos, una solución al problema de proteína diana. En el primer caso, la unión de la
administración consiste en el empleo de vectores aptozima a la diana provoca un cambio
de expresión que permiten la síntesis de conformacional que altera la actividad de la
aptómeros en el interior de la célula61. Otra de ribozima. En el segundo caso, la unión de
sus principales limitaciones reside en la aptómeros adyacentes a la diana crea un puente
preferencia de unión de los aptómeros hacia de oligonucleótidos que provoca el ligamiento del
formas determinadas de la superficie de las nucleótido conector, que posteriormente es
proteínas, lo que implica una limitación a la hora amplificado y detectado por PCR. Esta última
de validar dianas proteicas. Por otro lado, la estrategia ofrece una sensibilidad potencialmente
naturaleza negativa de las moléculas de ácidos superior al ELISA hasta 1.000 veces63.
nucleicos que conforman los aptómeros supone
un impedimento a la hora de bloquear proteínas
con dominios cargados negativamente62.
3.2.4. Péptidos
Los aptómeros también pueden ser inmovilizados
sobre microarrays de manera similar a los Los péptidos son fragmentos de proteínas que
microarrays de ADN, con el objeto de ser pueden ser diseñados como agentes de unión a
empleados en la validación de dianas proteicas. dianas proteicas bloqueando su función o bien
Las ventajas de esta técnica radican en su alta inhibendo su interacción con proteínas
especificidad y sensibilidad. La detección de los intracelulares64.
61
Epstein, D. M., et al. (2002). Target Validation with Nucleic Acid Aptamers. Mimicking small molecule therapeutics by
attacking the protein, and not the gene. Pharmaceutical Discovery and Development. PharmaVentures Ltd.
62
Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7 (18):
136-142.
63
Walgren, J. L. & Thomson, D. C. (2004). Application of proteomic technologies in the drug development process.
Toxicology Letters 149: 377-385.
64
Ilag, L. L., et al. (2002). Emerging high throughput drug target validation technologies. Drug Discovery Today 7 (18):
136-142.
24

25. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN
DE DIANAS TERAPÉUTICAS
Los péptidos presentan ciertas ventajas Al exponer estas moléculas a luz láser, se inducen
como agentes de validación de dianas daños fotoquímicos en la proteína diana de modo
principalmente debido a su fácil producción. Por irreversible en las zonas de unión al anticuerpo,
otro lado, existen diversos sistemas que permiten péptido o aptómero, inactivando la proteína de
identificar los péptidos que inhiben dianas modo específico68. Esta técnica de validación de
concretas, entre las que cabe destacar la técnica dianas ha demostrado ser eficaz en el caso de su
del doble híbrido y el phage display . 65 empleo con anticuerpos, ya que se aprovecha de
La principal limitación de los péptidos consiste en la selectividad de los anticuerpos y mejora
que presentan problemas de afinidad y sensiblemente su poder de inhibición de la función
selectividad, por lo que no es una técnica que por de la proteína diana69.
sí sola permita la validación de una diana
terapéutica66. Una alternativa a esta técnica consiste en la
utilización de fluoróforos que reaccionan ante luz
difusa y que por tanto no requieren fuentes de luz
especiales. Esta técnica se denomina FALI70 o
3.2.5. Inactivación por láser
inactivación por láser mediante fluoróforos71. La
mediante cromóforos principal ventaja de esta ténica radica en que
y fluoróforos permite modificar un área más amplia de la
proteína, asegurando una inactivación más
La técnica CALI67 o inactivación por láser efectiva de la proteína diana. Tras la inactivación
mediante cromóforos, consiste en el empleo de de la diana es necesario purificar el complejo
cromóforos, moléculas que absorben la luz de una formado por el anticuerpo unido al cromóforo o
determinada longitud de onda, unidos a un fluorocromo junto con la proteína diana, y
anticuerpo, péptido o aptómero. posteriormente identificar esta última72.
Proteína Unión proteína-ligando Emisión Inactivación del dominio
diana (anticuerpo, péptido de luz láser funcional de la proteína
o aptómero) diana
Figura 14. Inactivación por láser mediante cromóforos y fluoróforos aplicado a la validación de dianas.
Fuente: Hanash, S. (2003) Disease proteomics. Nature 422, 226-232.
3.3. Análisis de la expresión génica in situ
Las técnicas de análisis de la expresión génica como los microarrays de ADN permiten la identificación de
genes implicados en procesos patológicos. Sin embargo, la mayoría de los patrones de expresión obtenidos
requieren de pasos posteriores de validación que posibiliten realizar una asociación entre la expresión de
un gen y su fenotipo. Las técnicas de análisis de la expresión génica mediante microarrays de tejidos y
células son dos técnicas empleadas en la validación clínica y funcional de dianas respectivamente.
65
Caponigro, G., et al. (2003). Functional analisis of expressed peptides that bind yeast STE proteins. Journal of
Biotechnology 103: 213-225.
66
Henning, S. W. & Beste, G. (2002). Loss-of-function strategies in drug target validation. Current Drug Discovery May. 17-21.
67
CALI: Chromophore assisted lasser inactivation.
68
Peet, N.P. (2003). What constitutes target validation? Targets. Vol. 2, No. 4: 125-127.
69
Henning, S. W. & Beste, G. (2002). Loss-of-function strategies in drug target validation. Current Drug Discovery May. 17-21.
70
FALI: Fluorophore assisted lasser inactivation.
71
Beck, S., et al. (2202). Fluorophore-assisted light inactivation: A high-throughput tool for direct target validation of
proteins. Proteomics 2: 247-255.
72
Ilag, LL. (2003). Direct methods for modulating protein function. Current Opinion in Drug Discovery & Development 6(2):
262-268.
25

26. 3.3.1. Microarrays de tejidos Las principales ventajas que ofrecen los
microarrays de tejidos frente a otras técnicas de
Los microarrays de tejidos (TMAs, Tisssue validación se basan en la naturaleza in vivo del
Microarrays) consisten en colecciones ensayo, que posibilita observar cambios
miniaturizadas de hasta 1.000 muestras de fenotípicos que no son obvios mediante técnicas
tejidos inmovilizadas sobre un soporte, que moleculares. En la actualidad, los principales
permiten el análisis in situ de dianas moleculares desarrollos encaminados a mejorar esta técnica
simultáneamente (ADN, ARN o proteínas). se centran en la mejora de la instrumentación
Prácticamente la mayoría de los artículos dedicada a la inmovilización de los tejidos en el
publicados sobre microarrays de tejidos están array, automatización de la obtención de
relacionados con el análisis de tumores, aunque imágenes digitalizadas, así como almacenamiento,
se ha demostrado su valor en otro tipo de análisis y estandarización de la información
patologías relacionadas en el sistema nervioso73. obtenida74.
Características de los Microarrays de Tejidos en la validación de dianas:
• Determinación de la distribución celular y subcelular de las dianas.
• Integración de la información procedente del análisis de las dianas a nivel del ADN, ARN y proteínas.
• Confirmación de los resultados obtenidos mediante técnicas de validación in vivo basadas en
modelos animales y microarrays de ADNc.
• Análisis de la prevalencia de dianas en diferentes etapas de progresión de la patología
(ej.: progresión tumoral).
• Correlación de los datos moleculares con los datos clínicos.
3.3.2. Microarrays de células introducen en las células, que posteriormente
expresan las proteínas codificadas por su secuencia.
Hasta la fecha, el análisis in vivo de la expresión Los cambios fenotípicos que se observen en las
génica se realizaba únicamente gen a gen, por células serán empleados para valorar la implicación
medio de la introducción de un gen en una célula, y de las dianas terapéuticas de interés76.
la posterior observación de su efecto fisiológico o
fenotipo. Los microarrays de células permiten el Una estrategia alternativa consiste en transfectar
análisis de la expresión génica in vivo a gran escala las células inmovilizadas en el array con ARN
en células humanas, y por tanto son una interferente, de modo que en vez de activarse la
herramienta valiosa a la hora de validar dianas expresión de un gen, se produzca el
75
terapéuticas . La estrategia empleada para su silenciamiento del mismo. Este bloqueo de la
diseño consiste en el cultivo de células sobre expresión génica define un conjunto de puntos en
fragmentos de ADN inmovilizados en un microarray. el array que se corresponderán con la expresión
Estos fragmentos de ADN se transfectan o del fenotipo esperado77.
73
Sauter, G., et al. (2003).Tissue microarrays in drug discovery. Nature Review: Drug discovery 2: 962-972.
74
Mousses, S., et al. (2001). Clinical and functional target validation using tissue and cell microarrays. Curr. Op. in Chem.
Biology, 6: 97-101.
75
Wang, S., et al. (2004). Tools for target identification and validation. Curr. Op. in Chem. Biol. 8: 371-377.
76
Mousses, S., et al. (2001). Clinical and functional target validation using tissue and cell microarrays. Curr. Op. in Chem.
Biology, 6: 97-101.
Ziauddin, J. & Sabatini, D. M. (2001). Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature 411:107-110.
77
Silva, J. M., et al. (2004). RNA interference microarrays: High-throughput loss-of-function genetics in mammalian cells.
PNAS 101, nº 17: 548-6552.
26

27. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA IDENTIFICACIÓN Y VALIDACIÓN
DE DIANAS TERAPÉUTICAS
Microarrays de Tejidos Microarrays de Células
b c
a a b
Inmovilización de Transfección de las
d células en un células con múltiples
Microarray de ADNc genes de interés
c
Inmovilización de secciones
de tejidos en un array
e
Visualización de la expresión de los
genes en las células in vivo
Figura 15. Esquema de funcionamiento de un microarray de tejidos aplicado a la validación de dianas.
Fuente: Sauter, G., et al. (2003). Tissue microarrays in drug discovery. Nature Reviews. Drug discovery 2: 962-972;
Ziauddin, J. & Sabatini, D. M. (2001). Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature 411: 107-110.
3.4. Modelos vivos de la enfermedad
El avance en el conocimiento del genoma de diferentes organismos que se ha producido a lo largo de los
últimos años ha puesto de manifiesto la existencia de un alto grado de conservación de la secuencia del
ADN y proteínas, así como una similitud en la función de los genes y rutas de señalización en diferentes
organismos. Este elevado grado de conservación permite el empleo de otros organismos diferentes del ser
humano como sistemas modelo en el proceso de desarrollo de fármacos. De hecho, se ha descubierto que
existe un elevado grado de similitud con las rutas moleculares implicadas en enfermedades humanas, lo
que hace que el valor de los organismos modelo en la validación de dianas sea mayor78.
Vertebrados
Ratón Pez cebra Mosca de la fruta
Invertebrados C. elegans
Unicelulares Levadura
Figura 16. Principales sistemas modelo en validación de dianas.
Fuente: Lindsay, M. A. (2003). Target discovery. Nature Reviews: Drug Discovery. 2: 831-838.
78
Doan, T. N. (2004). High-throughput target validation in model organisms. Drug Discovery Today: Targets. Vol. 3,
Nº 5: 191-197.
27

28. En lo concerniente a la validación de dianas, la proporciona un grado elevado de evidencia de que
obtención de un modelo animal que reproduzca la un gen en concreto está implicado en el proceso de
enfermedad humana constituye de por sí un interés. Por otro lado, el modelo animal obtenido
proceso de validación de la diana. Al tratarse de un es de gran valor para estudios posteriores
organismo completo, se puede así demostrar la necesarios para el desarrollo del fármaco, como
implicación de la diana en la enfermedad in vivo, y son los estudios farmacológicos y toxicológicos79.
Características de un modelo animal ideal80
• Facilidad de cría en cautividad.
• Tiempos de reproducción cortos.
• Descendencia numerosa.
• Disponibilidad de métodos de manipulación genética y experimental.
• Elevado número de genes conservados respecto al ser humano.
3.4.1. Ratones knock-out y knock-in tejido concreto. Los knock-out inducibles permiten
interrumpir la expresión de interés en el momento
Los ratones knock-out son ratones a los que se deseado administrando una sustancia
les ha inactivado uno o varios genes mediante determinada. En este caso, el gen se expresa con
81
técnicas de ingeniería genética , por lo que normalidad hasta que se administra el compuesto
carecen de una determinada función génica. Los concreto83.
ratones knock-out permiten estudiar la función
fisiológica de genes de mamíferos y son sistemas Los ratones knock-out suelen presentar problemas
modelo valiosos sobre los que estudiar la eficacia de letalidad de los embriones para determinados
de los fármacos. Se ha demostrado que el genes. En ocasiones se ponen en marcha
fenotipo de los ratones knock-out para una mecanismos de compensación en el embrión que
determinada diana se corresponde con los efectos hacen que la ausencia del gen no de lugar a los
de los fármacos que actúan sobre la diana y la efectos esperables ya que otros genes compensan
bloquean82. Los ratones knock-in, en cambio, son al gen inactivado. Los knock-out inducibles
ratones que sobreexpresan el gen de interés permiten inactivar el gen cuando el ratón ya se ha
mediante la introducción de varias copias del gen desarrollado y por tanto evitan que se den estos
durante el desarrollo embrionario del ratón. mecanismos de compensación y letalidad
embrionaria.
Una estrategia alternativa consiste en el
desarrollo de ratones knock-out y knock-in La principal limitación de los ratones knock-out y
específicos de tejido o inducibles. Los primeros knock-in se refiere al tiempo y coste que requiere la
consisten en ratones en los que la expresión de manipulación genética de estos organismos, lo que
un gen determinado se encuentra inhibida en un dificulta la manipulación de ratones a gran escala84.
79/80
Kramer, R. & Cohen, D. (2004). Functional Genomics to new Drug Targets. Nature Reviews: Drug Discovery. Vol. 3: 965-972.
Abuin, A., et al. (2002). Full-speed mammalian genetics: in vivo target validation in the drug discovery process. Trends in
Biotechnology. Vol. 20, Nº 1: 36-42.
81
La ingeniería genética es una tecnología que permite introducir cambios en el genotipo de un organismo.
82
Zambrowicz, B. P., et al. (2003). Predicting drug efficacy: knockouts model pipeline drugs of the pharmaceutical industry.
Current Opinion in Pharmacology. 3: 563-570.
83
Törnell, J. & Snaith, M. (2002). Transgenic systems in drug discovery: from target identification to humanized mice. Drug
Discovery Today. Vol. 7 No. 8: 461-470.
Hardy, L. W. & Peet, N. P. (2004). The multiple orthogonal tools approach to define molecular causation in the validation
of druggable targets. Drug Discovery Today. 9(3): 117-26.
84
Baumeister, R. (2002). The worm in us - Caenorhabditis elegans as a model of human disease. Trends in Biotechnology.
Vol. 20, Nº 4: 147-148.
28