LES COSMIDES
Dans le phage lambda, on peut introduire un fragment dADN eucaryotique de 15 à 20 kb. Cependant, certains gènes ont une ta...
1-DÉFINITIONCosmide: site cos du phage + plasmide→ Clonage de fragment de 45 kb maximum (capacité ×3)Sites cos→ Encapsidat...
2-STRUCTURE-un gène de résistance à un ou plusieursantibiotiques-une origine de réplication de plasmide-un ou plusieurs si...
FIGURE 1: STRUCTURE DE COSMIDE AVEC UNSEUL COS .
3-ETAPES     DU CLONAGE DANS UN COSMIDEIl existe deux stratégies de clonage associées à deux cosmides différents. Ces stra...
 Cosmide   à deux séquences cos : dans ce type de cosmide, les sites cos sont répliqués en tandem. Ils permettent un clon...
PRINCIPE    La construction d’une banque d’ADN génomique à partir de cosmides revient à cloner l’ensemble d’un génome par ...
1-FRAGMENTATION D’ADN :
2-FRAGMENTAION DE COSMIDE    Parallèlement à la digestion de l’ADN génomique, le vecteur est linéarisé par une enzyme de r...
3-LIGATION   Les vecteurs linéarités et les inserts d’ADN génomiques    sélectionnés sont ensuite mélangés pour la légati...
4-ENCAPCIDATION   Le vecteur recombinant est alors encapsidé in vitro comme    celui d’un phage à partir des extraits de ...
5- INFECTION ET MULTIPLICATION.   Les bactéries hôtes (E.coli souche DH5α)    sont ensuite infectées par le vecteur. Une...
6- SÉLECTION DES COSMIDES RECOMBINANTS  Les   bactéries contenant les cosmides sont     sélectionnées sur la base de leur...
FIGURE 2 : MODE DEMPLOI DUN COSMIDE   POUR LACONSTITUTION DUNE BANQUE.
   Les cosmides ont donc l’avantage sur les autres vecteurs de clonage    d’accepter de plus grands fragments d’ADN et so...
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Les cosmides

  1. 1. LES COSMIDES
  2. 2. Dans le phage lambda, on peut introduire un fragment dADN eucaryotique de 15 à 20 kb. Cependant, certains gènes ont une taille supérieure à 20 kb. Dautre part, il est parfois nécessaire disoler et danalyser une portion dADN chromosomique qui contient une famille de gènes. La famille des gènes de globine sétend sur 70 kb et des familles plus complexes peuvent occuper plusieurs centaines de kb.Cest pourquoi on a mis au point le clonage dans les cosmides .
  3. 3. 1-DÉFINITIONCosmide: site cos du phage + plasmide→ Clonage de fragment de 45 kb maximum (capacité ×3)Sites cos→ Encapsidation in vitro→ Particules virales capables dinfecter E. coli (efficacité > transformation)Origine de réplication plasmidique→ Multiplication dans la bactérie de la même façon quun plasmide
  4. 4. 2-STRUCTURE-un gène de résistance à un ou plusieursantibiotiques-une origine de réplication de plasmide-un ou plusieurs sites de restrictionunique(s) pour le clonage (polylinkers ouMCS)-une ou deux séquences cos-une petite taille : environ 6 kb
  5. 5. FIGURE 1: STRUCTURE DE COSMIDE AVEC UNSEUL COS .
  6. 6. 3-ETAPES DU CLONAGE DANS UN COSMIDEIl existe deux stratégies de clonage associées à deux cosmides différents. Ces stratégies ne diffèrent que dans la structure et l’arrangement des signaux cos dans les cosmides: Cosmide à une séquence cos : ce type de cosmide ne contient qu’une seule séquence cos. Il correspond à la première génération de cosmides. Il nécessite une sélection de la taille des inserts afin de limiter les phénomènes de co-ligation.
  7. 7.  Cosmide à deux séquences cos : dans ce type de cosmide, les sites cos sont répliqués en tandem. Ils permettent un clonage rapide et efficace des inserts, sans présélection sur leur taille.
  8. 8. PRINCIPE La construction d’une banque d’ADN génomique à partir de cosmides revient à cloner l’ensemble d’un génome par fragments dans des cosmides. Le principe général de cette technique a été établi à partir des premiers cosmides, contenant une seule séquence cos (cosmide simple cos). Les grandes étapes sont les suivantes :
  9. 9. 1-FRAGMENTATION D’ADN :
  10. 10. 2-FRAGMENTAION DE COSMIDE Parallèlement à la digestion de l’ADN génomique, le vecteur est linéarisé par une enzyme de restriction à site unique, qui coupe dans le multisite de clonage. L’enzyme BamHI est couramment utilisée.
  11. 11. 3-LIGATION Les vecteurs linéarités et les inserts d’ADN génomiques sélectionnés sont ensuite mélangés pour la légation. Celle-ci est effectuée grâce à la T4 DNA ligase. Cette étape doit être réalisée à haute concentration d’ADN pour favoriser les associations intermoléculaires par rapport aux associations intramoléculaires. Des concatémères se forment par l’association, par exemple d’un ADN g entouré de deux cosmides linéarisés. Cette ligation est possible par la complémentarité des bouts collants générés par MboI et BamHI.
  12. 12. 4-ENCAPCIDATION Le vecteur recombinant est alors encapsidé in vitro comme celui d’un phage à partir des extraits de capsides préparés préalablement in vitro ou d’extraits commerciaux . Décongelés et mélangés, les extraits complémentaires sont mis en présence des cosmides recombinants, ce qui active la machinerie pour l’assemblage de la tête de phage et l’insertion d’ADN. Cet empaquetage se fait dans une capside vide de bactériophage grâce à la reconnaissance des deux sites cos séparés d’environ 40 kb.
  13. 13. 5- INFECTION ET MULTIPLICATION. Les bactéries hôtes (E.coli souche DH5α) sont ensuite infectées par le vecteur. Une fois dans la bactérie, le cosmide se réplique comme un plasmide car il ne possède pas les gènes du phage nécessaires à la production de nouvelles particules phagiques.
  14. 14. 6- SÉLECTION DES COSMIDES RECOMBINANTS  Les bactéries contenant les cosmides sont sélectionnées sur la base de leur résistance à un antibiotique (gène de sélection présent sur le cosmide).  Seules les bactéries ayant intégrées un cosmide seront résistantes et pourront pousser sur ce milieu.
  15. 15. FIGURE 2 : MODE DEMPLOI DUN COSMIDE POUR LACONSTITUTION DUNE BANQUE.
  16. 16.  Les cosmides ont donc l’avantage sur les autres vecteurs de clonage d’accepter de plus grands fragments d’ADN et sont surtout utiliser pour caractériser des génomes. Dans le projet d’analyse génomique à grande échelle, les cosmides pourraient être utilisés pour la cartographie physique détaillée, pour convertir des contigs YAC en contigs cosmides, ainsi que pour les cartes de restriction ou l’isolement de gènes, l’analyse cytogénétique par hybridation in situ haute résolution et d’autres stratégies encore…

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