1
UNIVERSITE DE NANTES
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DE NANTES
DEVELOPPEMENT D’UNE METHODE DE
CONFIRMATION PAR GC-C-I...
2
LISTE DES PRINCIPAUX SIGLES ET ABREVIATIONS
AA Anhydride Acétique
ADD Androst-1,4-diène-3,17-dione
AE Acétate d’éthyle
A...
3
INTRODUCTION…………………………………………………………………….....1
PRESENTATION DU LABORATOIRE………………………………………………2
CHAPITRE I : Etude bibliogra...
4
II.2.3. EXTRACTION LIQUIDE/LIQUIDE (LLE)……………………………..17
II.2.4. EXTRACTION SUR PHASE SOLIDE : SPE SIOH…………………….17
II.2.5...
5
CONCLUSION…………………………………………………………………………40
BIBLIOGRAPHIE……………………………………………………………………...41
6
LISTE DES FIGURES
CHAPITRE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Figure I-1 : Structure du noyau stérane……………………………………………………3
Figure...
7
Figure III-11 : Taux de récupération des analytes en fonction des différents mélanges
Hex/AE après une étape sur SPE SiO...
8
CHAPITRE III: RESULTATS ET DISCUSSION
Tableau III-1 : Déviations isotopiques mesurées pour les molécules endogènes (ERC)...
9
INTRODUCTION
10
Depuis la fin des années 80, l’utilisation des promoteurs de croissance en élevage est
strictement interdite dans l’uni...
11
ONIRIS est le grand établissement, créé le 1 janvier 2010, issu du rapprochement
de deux écoles de l’Enseignement Supér...
12
CHAPITRE I
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
13
I.1. LES HORMONES STEROIDES NATURELLES
I.1.1. STRUCTURE CHIMIQUE
Les hormones stéroïdes, dérivées du cholestérol, prése...
14
Le schéma de la biosynthèse des hormones stéroïdes naturelles est présenté en annexe 1
Figure I-2 : Structure chimique ...
15
sans ambiguïté la plupart des composés strictement xénobiotiques. Cependant malgré la
connaissance des grandes familles...
16
Figure I-4 : Structure chimique de la boldénone undécylénate (A) et de la boldione (B)
(Androsta-1,4-diène-3,17-dione)
...
17
cryptorchides et de verrats non traités. Cette présence a été aussi décelée dans le foie, les
reins et les testicules d...
18
dans l’urine des animaux après que ces derniers ont reçu du lait enrichi en phytostérols,
mais aucune trace de boldénon...
19
autres métabolites isomères du 5ξ-androst-1-en-3ξ-ol-17-one et 5ξ-androst-1-en-3-one-
17ξ-ol ont été observés par cette...
20
sont typiquement analysées après abattage. Les poils, l’urine et les fèces peuvent quant à
eux être facilement collecté...
21
Une approche non quantitative a été développée et validée au sein du LABERCA
sur la base des travaux de Southan et al.,...
22
(appauvrissement ou enrichissement) en favorisant l’un ou l’autre des isotopes
(constantes de vitesse légèrement différ...
23
CHAPITRE II
MATERIEL ET METHODES
24
II.1. MATERIEL UTILISE
II.1.1. MATERIEL ANIMAL
La plupart des essais présentés dans ce rapport ont été réalisés en supp...
25
II.1.2.2. Produits chimiques et réactifs
Tous les produits chimiques et réactifs utilisés sont de qualité analytique.
A...
26
- Azote liquide (Air Liquide),
- Dioxyde de carbone provient de Messer (Saint-Herblain, France),
II.1.2.3. Matériel de ...
27
- D’un chromatographe en phase gazeuse équipé d’une colonne capillaire : colonne
capillaire de phase stationnaire à fai...
28
Figure II-1: Schéma du principe d’un spectromètre de masse de rapport isotopique couplé à un
chromatographe en phase ga...
29
Figure II-2 : Stratégie analytique pour la purification des composés.
II.2.1. PREPARATION ENZYMATIQUE
Une enzyme est ca...
30
Dans un premier temps, les androgènes libres sont isolés de l’estradiol et du 6β-
OH-boldénone. Afin, de n’extraire dan...
31
Tableau II-1 : Programme de gradient de solvants pour les stéroïdes
Temps (min) % Solvant A % Solvant B
0 96 4
15 96 4
...
32
moins 15h) à température ambiante. Ainsi, les pics sont plus fins, ce qui permet de gagner
en intensité, facteur très i...
33
II.2.8. PRECAUTIONS ANALYTIQUES
II.2.8.1. Séparation et identification des composés par GC-MS
Avant toute injection en ...
34
- Colonne : 60°C (1,5 min), 40°C.min-1
jusqu’à 220°C (0 min), 1°C.min-1
jusqu’à 240°C
(1 min), 20°C.min-1
jusqu’à 300°C...
35
CHAPITRE III
RESULTATS ET DISCUSSION
III.1. MISE AU POINT D’UNE METHODE D’ANALYSE DES METABOLITES
DE BOLDENONE DANS L’U...
36
obtenus, les temps de rétention, les facteurs d’asymétrie et les largeurs à mi hauteur ont
été relevés.
III.1.1.2. Résu...
37
En conclusion, entre les deux alternatives (natif ou acétylé) seul la dérivation par
acétylation a été retenue pour l’i...
38
Figure III-2 : Protocole « SPE C18 » pour la détermination le taux de récupération des
analytes dans les fractions F1, ...
39
Figure III-3 : Bilan des taux de récupération (%) des analytes de mix-irms et de mix
boldénone après une première éluti...
40
Déroulement du test
1ère
partie du test à pH 14 :
Figure III-4 : Schéma du test LLE en trois fois avec deux solvants à ...
41
Figure III-6 : Répartition des molécules dans les différentes fractions extraites à pH 14
(pourcentage de stéroïdes dan...
42
extraction par l’éther à pH14, l’estradiol et le 6β-OH-boldénone sont récupérés avec un
rendement correct d’environ 60%...
43
Figure III-9 : Protocole « SiOH fraction élution » ou « Se » en vue d’optimiser l’étape
d’élution des analytes sur SPE ...
44
boldénone est plus polaire et donc plus retenu sur SiOH que la boldénone. Au regard de
ces résultats, il paraît importa...
45
le mélange de 10 mL d’Hex/AE (90:10) pour un rinçage optimum sans perte des analytes
(précaution par rapport à M1).
III...
46
Figure III-12 : Chromatogramme d’un standard de mix-boldénone après injection sur la
colonne HPLC diméthyleaminopropyle...
47
Le fait est qu’avec cette première étape de séparation/purification par HPLC N(CH3)2, on
ne réussisse pas à bien sépare...
48
Figure III-14 : Taux de récupération des analytes obtenu avec un mélange MeOH/AE
différent pour chaque préparation d’éc...
49
III.1.4.3. Résultats
Tout d’abord, l’évaluation de la répartition des stéroïdes dans les différentes fractions
extraite...
50
obtenus pour la SPE C18. Par conséquent, des modifications des conditions de
purification/extraction ont été apportées ...
51
Figure III-16 : Chromatogramme d’ions de l’échantillon d’urine extrait à J3 après
administration de boldénone undécylén...
52
III.2.2.2. Conséquence de l'administration de boldénone
1- Identification des stéroïdes en GC-MS (veau 0056)
Les fracti...
53
Sur ces deux figures, aucun métabolite de la boldénone n’a pu être observé.
Néanmoins, après une analyse poussée du pro...
Development of confirmation method by GC-C-IRMS to determine the origin of metabolites in cattle urine: case of Boldenone
Development of confirmation method by GC-C-IRMS to determine the origin of metabolites in cattle urine: case of Boldenone
Development of confirmation method by GC-C-IRMS to determine the origin of metabolites in cattle urine: case of Boldenone
Development of confirmation method by GC-C-IRMS to determine the origin of metabolites in cattle urine: case of Boldenone
Development of confirmation method by GC-C-IRMS to determine the origin of metabolites in cattle urine: case of Boldenone
Development of confirmation method by GC-C-IRMS to determine the origin of metabolites in cattle urine: case of Boldenone
Development of confirmation method by GC-C-IRMS to determine the origin of metabolites in cattle urine: case of Boldenone
Development of confirmation method by GC-C-IRMS to determine the origin of metabolites in cattle urine: case of Boldenone
Development of confirmation method by GC-C-IRMS to determine the origin of metabolites in cattle urine: case of Boldenone
Development of confirmation method by GC-C-IRMS to determine the origin of metabolites in cattle urine: case of Boldenone
Development of confirmation method by GC-C-IRMS to determine the origin of metabolites in cattle urine: case of Boldenone
Development of confirmation method by GC-C-IRMS to determine the origin of metabolites in cattle urine: case of Boldenone
Prochain SlideShare
Chargement dans…5
×

Development of confirmation method by GC-C-IRMS to determine the origin of metabolites in cattle urine: case of Boldenone

1 438 vues

Publié le

0 commentaire
0 j’aime
Statistiques
Remarques
  • Soyez le premier à commenter

  • Soyez le premier à aimer ceci

Aucun téléchargement
Vues
Nombre de vues
1 438
Sur SlideShare
0
Issues des intégrations
0
Intégrations
2
Actions
Partages
0
Téléchargements
4
Commentaires
0
J’aime
0
Intégrations 0
Aucune incorporation

Aucune remarque pour cette diapositive

Development of confirmation method by GC-C-IRMS to determine the origin of metabolites in cattle urine: case of Boldenone

  1. 1. 1 UNIVERSITE DE NANTES FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DE NANTES DEVELOPPEMENT D’UNE METHODE DE CONFIRMATION PAR GC-C-IRMS EN VUE DE DETERMINER L’ORIGINE DES METABOLITES DE LA BOLDENONE DANS L’URINE DE BOVIN RAPPORT DE STAGE MASTER 2 PROFESSIONNELLE : ANALYSE ET CONTROLE DES BIOMOLECULES AUX PRODUITS INDUSTRIELS ANNEE 2009 – 2010 LABORATOIRE D’ETUDE DES RESIDUS ET CONTAMINANTS DANS LES ALIMENTS MOHAMED TALBI ENCADRANTS : EMMANUELLE BICHON RESPONSABLE PEDAGOGIQUE : PASCAL JANVIER
  2. 2. 2 LISTE DES PRINCIPAUX SIGLES ET ABREVIATIONS AA Anhydride Acétique ADD Androst-1,4-diène-3,17-dione AE Acétate d’éthyle AED Androst-4-èn-3,17-dione EI Impact Electronique GC Chromatographie Gazeuse Hex Hexane HPLC Chromatographie Liquide Haute Performance IRMS Spectrométrie de masse de rapport isotopique LLE Extraction Liquide Liquide MeOH Méthanol N(CH3)2 Diméthyleaminopropyle Pyr Pyridine SPE Extraction sur Phase Solide
  3. 3. 3 INTRODUCTION…………………………………………………………………….....1 PRESENTATION DU LABORATOIRE………………………………………………2 CHAPITRE I : Etude bibliographique I.1. LES HORMONES STEROIDES NATURELLES………………………………...3 I.1.1. STRUCTURE CHIMIQUE…………………………………………………3 I.1.2. BIOSYNTHESE DES HORMONES GONADIQUES……………………..3 I.1.3. UTILISATION DES STEROIDES EN ELEVAGE………………………..4 I.1.4. DOUBLE STATUT (XENOBIOTIQUE ET ORIGINE NATURELLE) DE LA BOLDENONE………………………………………………………………...4 I.1.4.1. Structure chimique de la boldénone et de la boldione …………...5 I.1.4.2.Excrétion naturelle de boldénone …………………………………6 I.1.5. METABOLISME DE LA BOLDENONE………………………………….7 I.2. METHODES DE CONFIRMATION DE L’UTILISATION FRAUDULEUSE DE BOLDENONE……………………………………………………………………….9 I.2.1. RECHERCHE DE METABOLITES SPECIFIQUES DE PHASE I ET II MARQUEURS D’UNE ADMINISTRATION DE BOLDENONE………………9 I.2.2. L’APPROCHE ISOTOPIQUE……………………………………………...9 I.2.2.1. Mesure par GC-C-IRMS…………………………………………10 I.2.2.2. Origine de la discrimination isotopique végétale………………...10 I.2.2.3. Application au contrôle de l’usage frauduleux des hormones stéroïdes…………………………………………………………………..11 CHAPITRE II : Matériel et méthodes II.1. MATERIEL UTILISE……………………………………………………………12 II.1.1. MATERIEL ANIMAL……………………………………………………12 II.1.2. MATERIEL ET APPAREILLAGE………………………………………12 II.1.2.1. Standards………………………………………………………..12 II.1.2.2. Produits chimiques et réactifs…………………………………..12 II.1.2.3. Matériel de laboratoire………………………………………….13 II.1.2.4. Appareillage…………………………………………………….14 II.1.2.4.1. HPLC semi-préparative……………………………….14 II.1.2.4.2. GC-MS………………………………………………..14 II.1.2.4.3. GC-C-IRMS…………………………………………..14 II.2. METHODE D’ANALYSE………………………………………………………..16 II.2.1. PREPARATION ENZYMATIQUE……………………………………...16 II.2.2. EXTRACTION SUR PHASE SOLIDE : SPE C18………………………16
  4. 4. 4 II.2.3. EXTRACTION LIQUIDE/LIQUIDE (LLE)……………………………..17 II.2.4. EXTRACTION SUR PHASE SOLIDE : SPE SIOH…………………….17 II.2.5. HPLC SEMI-PREPARATIVE : PHASE NORMALE DIMETHYLE- AMINOPROPYLE………………………………………………………………17 II.2.6. DERIVATION……………………………………………………………18 II.2.7. HPLC SEMI-PREPARATIVE : PHASE INVERSE C18………………..18 II.2.8. PRECAUTIONS ANALYTIQUES………………………………………19 II.2.8.1. Séparation et identification des composés par GC-MS…………19 II.2.8.2. Mesure des déviations isotopiques 13 C/12 C des composés par GC- C-IRMS…………………………………………………………………..20 CHAPITRE III : Résultats et discussion III.1. MISE AU POINT D’UNE METHODE D’ANALYSE DES METABOLITES DE BOLDENONE DANS L’URINE DE BOVIN PAR GC-C-IRMS………………21 III.1.1. MISE AU POINT DE LA METHODE DE DETECTION PAR GC-MS DES DIFFERENTS METABOLITES URINAIRES……………………………21 III.1.1.1. Optimisation de la séparation chromatographique…………….21 III.1.1.2. Résultats………………………………………………………..21 III.1.2. MISE AU POINT DE LA METHODE DE PREPARATION D’ECHANTILLONS À PARTIR D’EAU ULTRAPURE SUPPLEMENTEE…22 III.1.2.1. Estimation du taux de récupération après une extraction sur colonne SPE C18………………………………………………………...23 III.1.2.2. Optimisation de l’étape d’extraction liquide/liquide…………..24 III.1.2.2.1. Résultats……………………………………………...26 III.1.2.3. Extraction sur SPE SiOH en phase normale…………………...27 III.1.3. OPTIMISATION DE LA PURIFICATION PAR HPLC SEMI- PREPARATIVE…………………………………………………………………30 III.1.3.1. Identification et séparation des standards de mix-boldénone sur colonne HPLC diméthyleaminopropyle et sur colonne HPLC C18……30 III.1.4. MISE AU POINT DE LA METHODE DE PREPARATION D’ECHANTILLON DES DIFFERENTS METABOLITES URINAIRES D’INTERET SUR MATRICE (URINES BLANCHES SUPPLEMENTEES)….32 III.1.4.1. Optimisation de l’extraction sur phase solide C18…………….32 III.1.4.2. Optimisation de l’étape d’extraction liquide/liquide…………..33 III.1.4.3. Résultats………………………………………………………..34 III.2. APPLICATION DE LA METHODE SUR DES ECHANTILLONS URINAIRES PROVENANT D’ANIMAUX TRAITES……………………………...35 III.2.1. PROTOCOLE SUIVI……………………………………………………35 III.2.2. SYNTHESE DES RESULTATS OBTENUS…………………………...35 III.2.2.1. Intérêt de l'HPLC C18 (veau 1785)……………………………35 III.2.2.2. Conséquence de l'administration de boldénone………………..37
  5. 5. 5 CONCLUSION…………………………………………………………………………40 BIBLIOGRAPHIE……………………………………………………………………...41
  6. 6. 6 LISTE DES FIGURES CHAPITRE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE Figure I-1 : Structure du noyau stérane……………………………………………………3 Figure I-2 : Structure chimique du cholestérol……………………………………………4 Figure I-3 : Structures chimiques de la 17β-boldénone et de la testostérone……………..5 Figure I-4 : Structure chimique de la boldénone undécylénate (A) et de la boldione (B) (Androsta 1,4-diène-3,17-dione)…………………………………………………………..5 Figure I-5 : Structure chimique du β-sitostérol (3β-stigma-5-en-3-ol)……………………6 CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES Figure II-1: Schéma du principe d’un spectromètre de masse de rapport isotopique couplé à un chromatographe en phase gazeuse via un four à combustion………………………15 Figure II-2 : Stratégie analytique pour la purification des composés……………………16 CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION Figure III-1 : Chromatogrammes (GC) de certains composés non dérivés (à l’état natif) et dérivés après injection en GC-MS (TIC, acquisition full scan)........................................22 Figure III-2 : Protocole « SPE C18 » pour la détermination le taux de récupération des analytes dans les fractions F1, F2 et F3………………………………………………….23 Figure III-3 : Bilan des taux de récupération (%) des analytes de mix-irms et de mix boldénone après une première élution sur SPE C18……………………………………..24 Figure III-4 : Schéma du test LLE en trois fois avec deux solvants à pH 14……………25 Figure III-5 : Schéma du test LLE en trois fois avec deux solvants à pH 5, 2…………..25 Figure III-6 : Répartition des molécules dans les différentes fractions extraites à pH 14(pourcentage de stéroïdes dans chaque fraction calculé à partir des intensités des ions)………………………………………………………………………………………26 Figure III-7 : Répartition des molécules dans les différentes fractions extraites à pH 5 (pourcentage de stéroïdes dans chaque fraction calculé à partir des intensités des ions)..26 Figure III-8 : Protocole « Sr » pour la réalisation du profil d’élution des analytes contenus dans les fractions F1à F6 après l’étape de rinçage…………………………….27 Figure III-9 : Protocole « Se » pour la réalisation du profil d’élution des analytes contenus dans les fractions F1à F6 après l’étape d’élution………………………………28 Figure III-10 : Profil d’élution des mix-irms et mix boldénone étudiés en fonction de l’étape d’élution lors d’une purification SiOH…………………………………………..28
  7. 7. 7 Figure III-11 : Taux de récupération des analytes en fonction des différents mélanges Hex/AE après une étape sur SPE SiOH…………………………………………………29 Figure III-12 : Chromatogrammes d’un échantillon de mix-boldénone après injection sur la colonne HPLC diméthyleaminopropyle……………………………………………….31 Figure III-13 : Chromatogrammes d’un échantillon de mix-boldénone après injection sur la colonne HPLC C18……………………………………………………………………31 Figure III-14 : Taux de récupération des analytes obtenu avec un mélange MeOH/AE différent pour chaque préparation d’échantillon…………………………………………33 Figure III-15 : Taux de récupération des stéroïdes cibles dans les différentes fractions extraites lors des tests près extraction liquide/liquide……………………………………34 Figure III-16 : Chromatogramme d’ions de l’échantillon d’urine extrait à J3 après administration de boldénone undécylénate avant et après HPLC semi –préparative C18 ……………………………………………………………………………………………36 Figure III-17 : Chromatogramme d’ions obtenus après une SiOH pour l’échantillon d’urine extraite à J1 après administration de boldione…………………………………..37 Figure III-18 : Chromatogramme d’ions obtenu après SiOH pour l’échantillon d’urine extraite à J2 après administration de boldione…………………………………………...37 Figure III-19 : TIC de la fraction AF’4 après injection en GC-MS……………………… LISTE DES TABLEAUX CHAPITRE I: ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE Tableau I-1 : Métabolites identifiés dans l’urine de bovin par Frédérique Courant. 2007 après administration de la boldénone undécanoate et de la boldione……………………..8 CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES Tableau II-1 : Programme de gradient de solvants pour les stéroïdes…………………...18 Tableau II-2 : Détermination de l’intervalle des fractions récoltées en HPLC N(CH3)2...18 Tableau II-3 : Programmation du gradient de solvants pour les stéroïdes acétylés……...19 Tableau II-4 : Détermination de l’intervalle des fractions récoltées en HPLC C18……..19
  8. 8. 8 CHAPITRE III: RESULTATS ET DISCUSSION Tableau III-1 : Déviations isotopiques mesurées pour les molécules endogènes (ERC) et les métabolites de boldénone (M). Les moyennes des ERC et M sont mesurées. Les écarts entre ces moyennes sont mesurés pour les ERC et M à J3………………………………39
  9. 9. 9 INTRODUCTION
  10. 10. 10 Depuis la fin des années 80, l’utilisation des promoteurs de croissance en élevage est strictement interdite dans l’union européenne. Par la publication de directives européennes (96/22/EC et 96/23/EC), modifiées et complétées en fonction de l’évolution des pratiques frauduleuses et du développement du trafic de ces substances, l’usage des stéroïdes tend à s’essouffler au fil du temps en Europe. Cette interdiction s’applique aussi bien aux molécules artificielles qu’aux stéroïdes gonadiques naturels. Les contrôles ont ainsi été organisés par la répression des fraudes et les services vétérinaires en élevage, en abattoir et aux frontières. Des laboratoires communautaires de référence et des laboratoires nationaux de référence ont alors en charge de développer des méthodes d’analyse pour assurer le contrôle du respect de ces directives. Ces méthodes permettent de détecter sans ambiguïté l’usage frauduleux de substances d’origine exogène (xénobiotiques). Malgré la connaissance des grandes familles de composés prohibés en Europe et la maîtrise de leurs analyses, la question est la suivante : Est-ce que certains composés considérés jusqu’alors comme xénobiotiques, comme la boldénone, sont systématiquement la conséquence d’un traitement exogène? En effet, les publications de travaux hollandais démontrent la présence naturelle d’un métabolite de la boldénone (17α-boldénone ou épiboldénone), métabolite majoritaire dans l’urine d’animaux non traités par ce stéroïde anabolisant ou l’un de ses précurseurs (Arts et al., 1996). Cette molécule est alors considérée, comme probablement produite naturellement. La problématique a été également soulevée pour la nandrolone chez les animaux de rente ou les sportifs, ou encore pour la norandrostènedione chez l’espèce porcine. Dans ce cadre, le LABERCA, chargé laboratoire national de référence pour le contrôle des promoteurs de croissance en élevage, développe de nouvelles méthodes de détermination du caractère exogène des hormones stéroïdes naturelles. L’approche actuellement élaborée au sein du LABERCA permettant de déterminer l’origine de certains métabolites et précurseurs de la boldénone utilise la spectrométrie de masse de rapport isotopique 13 C/12 C par GC-C-IRMS. Cette méthode de mesure est très prometteuse mais reste à être finalisée en vue d’une application officielle par la suite. Dans un premier temps, nous avons donc cherché à optimiser la méthode initialement mise en place au laboratoire. Ce travail, réalisé à partir d’eau supplémentée de composés de référence purs, devrait nous permettre d’inclure les métabolites de la boldénone dans la stratégie globale de la mesure IRMS. Ensuite, cette nouvelle stratégie a été éprouvée sur urines animales supplémentées des mêmes composés de référence afin de valider les différentes étapes mises en place. Enfin, la méthode finale a été appliquée à des échantillons d’urines provenant d’animaux traités à la boldénone ou à l’un de ses précurseurs dans le but de valider le caractère discriminant de la méthode développée.
  11. 11. 11 ONIRIS est le grand établissement, créé le 1 janvier 2010, issu du rapprochement de deux écoles de l’Enseignement Supérieur Agricole : l’ENITIAA, sur le site de la Géraudière et l’ENVN, sur le site de la Chantrerie. Le LABERCA (LABoratoire d’Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments) est un laboratoire public dont l’origine remonte à la création, en 1979, de l’Ecole Nationale Vétérinaire de Nantes (ENVN) dont il fait partie. Il dépend du Ministère de l’Agriculture de l’Alimentation de la Pêche et des Affaires Rurales (MAAPAR) et est placé sous la double tutelle de la direction Générale de l’Enseignement et de la Recherche (DGER) et de la Direction Générale de l’Alimentation (DGAL). Il est de plus contractualisé avec le département Nutrition, Alimentation et Sécurité Alimentaire (NASA) de l’Institut National de la Recherche Agronomique (INRA). Les premières activités de recherche et développement du laboratoire ont eu pour thème l’endocrinologie appliquée aux animaux d’élevage. Les compétences acquises dans les techniques d’analyse des composés hormonaux l’ont conduit par la suite à s’impliquer plus spécifiquement dans le domaine des promoteurs de croissance, ce qui l’a amené à devenir Laboratoire National de Référence sur cette thématique en 1996. En 1999, le laboratoire s’est vu confier la responsabilité au niveau national du contrôle de contaminants de l’environnement dans les aliments, avec en particulier les polychlorobiphényles (PCBs). Au cours des dernières années, un important travail d’appui technique a été accompli auprès du Ministère de l’Agriculture et de la Commission Européenne. Les principales missions du LABERCA dans ce cadre sont un travail de développement méthodologique, essentiellement basé sur l’utilisation de la spectrométrie de masse sous toutes ses formes, pour l’analyse de substances hormonales naturelles et xénobiotiques à l’état de traces dans les matrices biologiques et alimentaires, le transfert technologique des méthodes, développées et validées conformément aux critères européens en vigueur, vers un réseau de laboratoires d’application, et enfin le développement de relations internationales auprès de la Commission Européenne et du réseau des Laboratoires Nationaux de Référence Européens. Parallèlement à ces missions, les activités de recherche ont pris une place grandissante au LABERCA. L’ensemble des activités du laboratoire est conduit sous un système de management de la qualité conforme aux référentiels ISO 17025 et ISO 9001.
  12. 12. 12 CHAPITRE I ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
  13. 13. 13 I.1. LES HORMONES STEROIDES NATURELLES I.1.1. STRUCTURE CHIMIQUE Les hormones stéroïdes, dérivées du cholestérol, présentent un noyau stérane, aussi appelé cyclopentanoperhydrophénanthrène (figure I-1). Les représentants de ce groupe d’hormones dérivent du stérane par ajout de chaînes latérales carbonées plus ou moins complexes, par la création éventuelle de doubles liaisons, et par la fixation de radicaux oxygénés qui peuvent être selon le cas, un alcool (OH) ou une cétone (C=O). Figure I-1 : Structure du noyau stérane Ce noyau est composé de 17 atomes de carbone. La stéréochimie de ces composés dépend de la position du substituant porté par le carbone 10 par rapport aux autres positions. Ce substituant peut être un groupement méthyle ou un hydrogène suivant les molécules. En effet, lorsque les substituants des carbones du noyau stérane sont du même côté que le groupement positionné sur le carbone 10, ils sont en position cis ou β. A l’inverse, les substituants seront en position trans ou α. Ces familles d’hormones stéroïdes ont la particularité de posséder en commun des groupes oxygénés, cétone ou alcool, en position 3, 11, 17 ou 20. I.1.2. BIOSYNTHESE DES HORMONES GONADIQUES Les différentes hormones recensées dérivent toutes d’un même précurseur commun : le cholestérol (figure I-2). Il provient en partie de l’alimentation mais il est aussi synthétisé par des cellules spécifiques. Le clivage de la chaîne latéral du cholestérol est la première étape de la biosynthèse stéroïdienne. La ∆5-prégnénolone ainsi formée se convertie en testostérone suivant deux voies possibles : - la voie de la progestérone dite voie ∆4, - la voie de la DHEA dite voie ∆5. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 A B C D
  14. 14. 14 Le schéma de la biosynthèse des hormones stéroïdes naturelles est présenté en annexe 1 Figure I-2 : Structure chimique du cholestérol I.1.3. UTILISATION DES STEROIDES EN ELEVAGE Pour répondre aux exigences du marché, l’amélioration de la rentabilité des élevages est devenue une nécessité au cours des dernières décennies. Les deux principaux aspects physiologiques sur lesquels l’administration d’hormones stéroïdes a un effet sont la reproduction et la croissance. En effet, afin d’optimiser la production de viande et de lait tout au long de l’année, la reproduction doit être maîtrisée. Ces hormones sont capables de programmer et synchroniser la période de mise-bas, de diminuer les périodes improductives ou encore d’optimiser la taille de la portée. En élevage bovin, les traitements hormonaux permettent d’augmenter la taille adulte des animaux dans le but de les abattre à un stade plus précoce et ainsi d’augmenter la productivité et la rentabilité (Paris et al., 2006). Outre les effets des hormones gonadiques sur les cycles hormonaux (reproduction), l’administration de celle-ci peut avoir divers effets sur des animaux : augmentation de la vitesse de croissance, modifications de la composition corporelle (muscle-os-gras et protéines-lipides-eau) et amélioration de la rétention azotée. On peut observer une nette augmentation au niveau du poids du muscle et donc du diamètre des fibres musculaires (Michel et Beaulieu, 1983). Des auteurs ont étudié l’effet anabolisant des hormones stéroïdes chez plusieurs espèces. En effet, selon Roche (1983) l’administration de stéroïdes anabolisants conduit à une augmentation de la vitesse de croissance et d’après Schmidely (1993), cette augmentation est de 18% en moyenne. D’après ce dernier, les effets des anabolisants peuvent varier en fonction du sexe, de l’âge et de la physiologie. I.1.4. DOUBLE STATUT (XENOBIOTIQUE ET ORIGINE NATURELLE) DE LA BOLDENONE L’utilisation d’hormones stéroïdes en tant que promoteurs de croissance chez les animaux de production est strictement interdite dans l’Union Européenne depuis la fin des années 80. Depuis, des méthodes d’analyse performantes ont été développées pour la surveillance de l’application de la réglementation. Ces méthodes permettent de détecter
  15. 15. 15 sans ambiguïté la plupart des composés strictement xénobiotiques. Cependant malgré la connaissance des grandes familles de composés potentiellement utilisées, et la maîtrise de leur analyse, certaines questions concernant l’existence naturelle de composés considérés jusqu’alors comme xénobiotiques stricts restent cependant en suspend. Le cas de la 17β-boldénone illustre parfaitement cette problématique. I.1.4.1. Structure chimique de la boldénone et de la boldione La 17β-boldénone (Androsta-1,4-diène-17β-ol-3-one) est un agent anabolisant de type stéroïdien à action androgénique. C’est un androgène qui favorise le développement musculaire ainsi que le développement des caractéristiques sexuelles masculines. La boldénone ou la 1-déhydrotestostérone améliore également la croissance et la bioconversion des aliments chez les animaux de rente et améliore la production de viande. Figure I-3 : Structures chimiques de la 17β-boldénone (A) et (B) de la testostérone La boldénone ne diffère de la testostérone (androstan-4-en-17β-ol-3-one) que par la présence d’une insaturation en ∆1 (figure I-3). La boldénone a été synthétisée pour la première fois en 1956 à partir de la déshydrogénation de la testostérone par le dioxyde de sélénium (Meystre, 1956). D’où également le nom de 1-déhydrotestostérone. O CH3 CH3 OH H H H A CH3 CH3 H H H noyau androstane O OH CH3 CH3 H H H testostérone B
  16. 16. 16 Figure I-4 : Structure chimique de la boldénone undécylénate (A) et de la boldione (B) (Androsta-1,4-diène-3,17-dione) La boldénone est fabriquée par le laboratoire Merck sous le nom de 1,4- androstadien-17β-ol-3-one ou 1-déhydrotestostérone. Elle peut être utilisée sous plusieurs formes galéniques. La 17β-boldénone peut donc être utilisée illégalement sous sa forme ester, dont le principal est l’undécylénate (ou undécanoate), en préparation injectable, mais également sous sa forme oxydée (boldione ou Androstadiènedione) active par voie orale (figure I-4). Comme nous l’avons dit précédemment, la boldénone undécylénate est largement utilisée dans les traitements médical à usage vétérinaire : l’équipoise® pour les chevaux, le ganabol® pour les bovins et le venobol® pour les chiens (http:// www.steroid.com). I.1.4.2.Excrétion naturelle de boldénone L’origine de cette molécule est en débat depuis 1996 (Arts et al., 1996). Depuis la publication de travaux hollandais démontrant la présence naturelle de 17α-boldénone dans l’urine d’animaux non traités par ce stéroïde anabolisant ou l’un de ses précurseurs, cette molécule est aujourd’hui considérée comme pouvant être excrétée naturellement par les animaux (Arts et al., 1996). En effet, lors de l’analyse d’une série d’urine de bovins appartenant à une banque d’échantillons blancs de référence, Arts et son équipe ont observé que 25 % des échantillons testés révélaient des traces de 17α-boldénone (0,1 à 2,7 µg/L). Suite à ces résultats, Van Puymbroeck et al. (1998) ont envisagé le choix de considérer des échantillons comme conformes malgré la présence de 17α-boldénone. De ce fait, les méthodes de contrôle ne peuvent désormais plus se baser sur la détection simple de cette molécule ou de ses métabolites dans l’urine pour déclarer la non- conformité des échantillons. D’autres études ont été réalisées sur différentes espèces. Des tests réalisés sur des hommes non traités ont révélé que la boldénone était belle et bien excrétée (Schanzer et al., 1994). En 1999, des études in vitro de fèces d’athlètes incubées avec de la testostérone ou de l’androstènedione ont été réalisées ; de la boldione a été trouvée mais en quantité infime. Elle a également été mise en évidence chez l’espèce porcine à des concentrations moyennes de 57 µg.L-1 et 120 µg.L-1 respectivement dans des urines de O CH3 CH3 O H H H A B
  17. 17. 17 cryptorchides et de verrats non traités. Cette présence a été aussi décelée dans le foie, les reins et les testicules de ces derniers (Deceunick Y., 2003). La présence naturelle de la boldénone sous forme sulfate a également été mise en évidence chez l’espèce équine, dans l’urine de chevaux mâles (Ho E.N.M., 2002). Lors d’une rencontre des différents laboratoires nationaux de référence européens (Bruxelles, 18 mars 2003), il a été rapporté que la 17α-boldénone et la 17β-boldénone ont été détectées dans des fèces d’animaux jamais traités avec de la boldénone. L’hypothèse émise alors était que certains précurseurs de la boldione, tels que les phytostérols contenus dans l’alimentation des animaux, pouvaient être à l’origine des excrétions de ce stéroïde « naturel » via des micro-organismes de l’intestin des animaux. L’un des phytostérols qui a fait l’objet d’une étude est le β-sitostérol (3β-stigma-5-en-3-ol) dont la structure chimique est présentée dans la figure I- 5. Figure I-5 : Structure chimique du β-sitostérol (3β-stigma-5-en-3-ol) Parallèlement des précurseurs de la boldénone comme la boldione ont été retrouvés dans les fèces de rats alimentés avec un mélange composé de 40% de β- sitostérol, 30% de campestérol et 30% de dihydrobrassicastérol (Song et al., 2000). Arioli et son équipe viennent appuyer cette conjecture en montrant que l’addition de β- sitostérol dans des fèces collecté pourrait favoriser la formation de boldione et de 17α- boldénone (Arioli et coll., 2005). D’autres travaux ont montré que certains micro-organismes pouvaient convertir le cholestérol et quelques phytostérols en métabolites de la boldénone. Les Pseudomonas sp. en condition aérobie transformaient ces stérols en androstadiènedione (ADD) et en androst-4-ène-3,17-dione (AED) (Owen et al., 1983 et 1985). Les mêmes résultats ont été mis en évidence avec Neomysis integer et Lucilia sericata chez les invertébrés, où le β- sitostérol et le stigmastanol ont été convertis en boldione (Poelmans et al., 2004). L’ADD et l’AED pouvaient être également convertis en boldénone et en testostérone. Cela nous laisse supposer que l’ADD peut être considéré comme une prohormone de la 17β- boldénone. En fait, de nombreux phytostérols ont souvent été reconnus comme de potentiels précurseurs de certains stéroïdes. Néanmoins, lors d’une expérience in vivo chez les veaux (Draisci et al. 2007), une quantité importante d’épiboldénone a été trouvée CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 H H HH
  18. 18. 18 dans l’urine des animaux après que ces derniers ont reçu du lait enrichi en phytostérols, mais aucune trace de boldénone, ni de boldione (ADD) n’ont été détectés. En résumé, ces métabolites de la boldénone pourraient être excrétés chez des animaux non traités. Ils peuvent être produites à partir de stérols végétaux tel que le β-sitostérol contenu dans l’alimentation. La présence de 17α-boldénone dans l’urine n’est plus une preuve d’un traitement frauduleux (DG SANCO Expert Meeting 30/09/2003). Aujourd’hui, l’origine endogène de la boldénone ne fait plus aucun doute au sein de la communauté scientifique. Le challenge est de distinguer de façon non ambiguë une présence naturelle de tels composés d’une utilisation frauduleuse. I.1.5. METABOLISME DE LA BOLDENONE Dans l’organisme, les hormones stéroïdes subissent des biotransformations catalysées par des enzymes spécifiques. Le plus souvent, les produits de synthèse formés acquièrent une certaine polarité et une hydrosolubilité supérieures aux composés initiaux. Ces métabolites perdent ainsi généralement une grande partie de leur activité biologique ou toxique. C’est pourquoi on les retrouve principalement dans la matrice urinaire, une matrice de prédilection pour des prélèvements non invasifs d’échantillons. Le noyau stérane n’est pas totalement affecté par cette perte d’activité mais plutôt ménagé puisque le catabolisme des anabolisants de type stéroïdien se limite à des réactions impliquant les groupements présents sur la structure polycyclique. Le principal organe dans lequel des biotransformations ont lieu est le foie. D’après une étude réalisée sur l’espèce bovine, il a été admis qu’après transformation les hormones stéroïdes sont éliminées pour environ 90% dans les urines et pour environ 10% par les fèces (Dumasia, 1983). Les métabolites résultant de cette élimination constituent donc un ensemble de composés devant être suivis pour dépister l’utilisation illégale des produits anabolisants. Le profil métabolique de la 17β-boldénone a été étudié chez différentes espèces : l’espèce équine, humaine et bovine. Toutes les études réalisées sur l’espèce humaine (Schanzer et Donike, 1992) et équine (Joos, 1999 et Draisci, 2001) ont démontré que le métabolite principal de la boldénone excrété dans l’urine est bel et bien la 17α- boldénone. Pour l’espèce bovine, différentes études complémentaires ont été menées. Van Pruymbroeck et al. ont réalisé, en 1998, une première étude concernant le métabolisme de la 17β-boldénone chez la vache après un traitement intramusculaire de 700 mg de 17β- boldénone undécanoate (Van Puymbroeck et al., 1998). Au même titre que les autres espèces, la 17α-boldénone est le métabolite majoritaire détecté dans l’urine. D’autres métabolites réduits, oxydés (telle la boldione) et hydroxylés, ont été également retrouvés. D’autres investigations ont été effectuées par les mêmes auteurs. Après une injection intramusculaire de 200 mg de boldénone undécylénate, la 17α-boldénone, 17β- boldénone, boldione mais également la 5β-androst-1-en-3,17-dione sont identifiées. Six
  19. 19. 19 autres métabolites isomères du 5ξ-androst-1-en-3ξ-ol-17-one et 5ξ-androst-1-en-3-one- 17ξ-ol ont été observés par cette équipe. De plus, une étude des métabolites de la boldénone dans l’urine de bovin après administration de la boldénone undécanoate et de la boldione a été réalisée sein du LABERCA (Courant F. 2003). En effet, l’étude démontre qu’à l’instar de la 17α-boldénone, M2 et M4 sont excrétés en quantité importante dans l’urine. Les métabolites identifiés dans l’urine de bovin par Frédérique Courant sont présentés dans le tableau I-1 : Tableau I-1 : Métabolites identifiés dans l’urine de bovin par Frédérique Courant. 2007 après administration de la boldénone undécanoate et de la boldione. Structure du métabolite M1 5-androst-1-en-3,17-dione M2 5-androst-1-en-17-ol-3-one M3 5-androst-1-en-17-ol-3-one M4 5-androst-1-en-17-ol-3-one M5 5-androst-1-en-3-ol-17-one M6 5-androst-1-en-3-ol-17-one M7 Androst-1,4-diene-3,17-dione M8 Androst-1,4-dien-17-ol-3-one M9 Androst-1,4-dien-17-ol-3-one Une équipe italienne a étudié le profil métabolique en fonction du composé administré (Draisci et al., 2003). Une administration orale de boldione donne des concentrations en 17β-boldénone et en 17α-boldénone largement supérieures de celles obtenues lors de l’administration d’esters de boldénone. En résumé, nous pouvons donc conclure que l’épiboldénone (17α-boldénone) est considéré comme le principal métabolite de la 17β-boldénone chez la plupart des espèces. La boldione est quant à elle considérée non seulement comme un métabolite dans l’urine de bovin mais aussi comme un des précurseurs de la 17β-boldénone. Enfin, d’autres métabolites pertinents tels que M2 et M4 ont été retrouvés majoritairement dans l’urine de bovin après administration. I.2. METHODES DE CONFIRMATION DE L’UTILISATION FRAUDULEUSE DE BOLDENONE Le contrôle des promoteurs de croissance en élevage est essentiel au respect de la réglementation en vigueur. Les matrices comme le foie, les reins, la graisse et le muscle
  20. 20. 20 sont typiquement analysées après abattage. Les poils, l’urine et les fèces peuvent quant à eux être facilement collectés sur les animaux vivants et être ainsi analysés avant que l’animal n’intègre la chaîne alimentaire. La matrice la plus couramment utilisée est l’urine car les concentrations en métabolites des substances prohibées y sont souvent importantes. Cependant, l’analyse de ces matrices demande des techniques à la fois sensibles et spécifiques permettant la détection des molécules d’intérêt à l’état de traces voire d’ultra-traces. Pour répondre aux exigences analytiques, les méthodes dites ciblées, c'est-à-dire basées sur la détection de composés connus, connaissent des développements constants. Une fois le prélèvement parvenu au laboratoire et après enregistrement et vérification des scellés et des documents, l’analyse peut alors être réalisée. Le contrôle des stéroïdes se fait en deux étapes, le dépistage en première intention (« screening ») et, en cas de suspicion, la confirmation en seconde intention. Cette dernière étape est cruciale car elle doit apporter la preuve irréfutable de la présence de l’analyte, voire de la concentration dans la matrice étudiée. La méthode permettant d’identifier un composé de façon indiscutable puisque basée sur la structure de la substance est la spectrométrie de masse. Cependant, concernant les hormones naturelles, la confirmation d’une administration frauduleuse est plus problématique. Il nous faut donc chercher d’autres techniques pour pallier à ces contraintes analytiques. I.2.1. RECHERCHE DE METABOLITES SPECIFIQUES DE PHASE I ET II MARQUEURS D’UNE ADMINISTRATION DE BOLDENONE Dans l’optique de la déclaration qui a été faite lors de la rencontre entre les experts de la DG SANCO en septembre 2003, plusieurs laboratoires ont mené en parallèle des études afin de trouver un critère discriminant et/ou un métabolite spécifique marqueur d’un traitement illicite de 17β-boldénone. Le métabolite de phase I, 6β- hydroxy-17α-boldénone (androsta-1,4-diene-6β,17α-diol-3-one) a ainsi été proposé comme un candidat potentiel signant une administration de 17β-boldénone (Blockland et al., 2007). Cependant, la stratégie de mesure associée, basée sur un métabolite de faible concentration, nécessite une approche de très bonne sensibilité afin de réduire les erreurs d’interprétation. En parallèle, certaines études ont également démontré la pertinence d’utiliser un conjugué de la 17β-boldénone pour différencier des animaux traités des animaux de contrôles (Nielen et coll., 2004 ; Le Bizec et coll., 2006). La fraction sulfate a retenu l’attention des laboratoires nationaux de référence car seulement quelques stéroïdes sont excrétés sous cette forme, la détection de la 17β-boldénone sulfate ajoute donc de la spécificité à la méthode. Cependant, ces métabolites sont excrétés en très faibles concentrations, ce qui le rend difficilement mesurable en LC-MS/MS quelques jours après administration. Pour s’affranchir de cette contrainte de sensibilité, l’analyse isotopique sera donc l’outil privilégié dans le cadre de notre projet. I.2.2. L’APPROCHE ISOTOPIQUE
  21. 21. 21 Une approche non quantitative a été développée et validée au sein du LABERCA sur la base des travaux de Southan et al., (1990), par chromatographie gazeuse couplé à la spectrométrie de masse de rapport isotopique via un four à combustion (GC-C-IRMS). Cette technique permet de déterminer l’origine – endogène ou exogène- d’une molécule organique donnée sur la base de son rapport isotopique 13 C/12 C. Chez les bovins, cette méthode a été employée en particulier pour la détection de la testostérone et ses métabolites (projet ISOSTER) et pourrait être utilisée également pour contrôler l’usage frauduleux de boldénone chez les bovins à partir de la mesure par GC-C-IRMS de ses métabolites urinaires majoritaires. I.2.2.1. Mesure par GC-C-IRMS La distribution isotopique d’une molécule peut être obtenue avec une grande précision par spectrométrie de masse de rapport isotopique (IRMS). En effet cet outil permet de déterminer le rapport isotopique (R) ou bien l’abondance isotopique (A) : Les variations isotopiques naturelles en carbone étant relativement faibles (de l’ordre de 0,03% pour les plantes), une notation spécifique à la spectrométrie de masse de rapport isotopique est utilisée pour exploiter les résultats. Les valeurs de rapports isotopiques sont comparées à une référence internationale, le VPDB : Vienna Pee Dee Belemnite et les résultats sont exprimés en delta pour mille (13 C ‰). Le 13 C est défini tel que : 13 C =   3 10x R RR VPDB VPDBnéchantillo  Réchantillon est le rapport isotopique 13 C/12 C mesuré pour un échantillon donné, et RVPDB est le rapport isotopique 13 C/12 C mesuré pour un standard défini calibré par rapport à l’échelle du VPDB. I.2.2.2. Origine de la discrimination isotopique végétale Le 12 C est l’isotope prédominant puisque son abondance relative naturelle est égale à 98,9 % alors que celle du 13 C représente seulement 1,1 %. L’abondance naturelle des isotopes n’est pas une constante figée ; elle peut afficher des degrés de variations sensibles allant jusqu’à 0,1 % en atome de 13 C. L’explication de ces différences tient à l’existence de différentes voies d’assimilation et de fixation du CO2 atmosphérique au cours de la photosynthèse. Ces étapes entraînent des fractionnements isotopiques naturels R = nombre d’atome isotopique lourd nombre d’atome isotopique léger A = nombre d’atome isotopique lourd nombre d’atome isotopique lourd + léger
  22. 22. 22 (appauvrissement ou enrichissement) en favorisant l’un ou l’autre des isotopes (constantes de vitesse légèrement différentes). Ce fractionnement se répercutera dans la chaîne alimentaire. On retrouve ainsi dans le règne animal des rapports isotopiques fonctions de l’alimentation. On peut classer du point de vue métabolisme photosynthétique les plantes en trois grandes catégories : les espèces de types C3, les espèces de types C4 et les espèces de types CAM. Suivant, le type de plante considéré, les déviations isotopiques obtenues seront plutôt enrichies en 13 C pour les plantes C4 et plutôt appauvries en 13 C pour les plantes C3. Les exemples de déviations isotopiques sont représentés en annexe 2. I.2.2.3. Application au contrôle de l’usage frauduleux des hormones stéroïdes La synthèse chimique des anabolisants est en fait une hémisynthèse dont le produit de départ est le plus souvent la diosgénine. Cette matière première végétale possède une proportion en 13 C qui est relativement pauvre et qui se trouve dans le produit final comme la testostérone. Les stéroïdes endogènes sont, quant eux, synthétisés à partir du cholestérol issu de l’alimentation de l’animal, enrichit en 13 C. La déviation isotopique des stéroïdes endogènes est donc principalement dépendante des produits alimentaires ingérés. Ainsi, un composé endogène de référence comme la DHEA sera analysé. Il permet de mesurer le rapport isotopique 13 C/12 C des stéroïdes endogènes produits par l’animal, rapport comparé à celui du métabolite de composé suspect afin de conclure à une administration.
  23. 23. 23 CHAPITRE II MATERIEL ET METHODES
  24. 24. 24 II.1. MATERIEL UTILISE II.1.1. MATERIEL ANIMAL La plupart des essais présentés dans ce rapport ont été réalisés en supplémentant par des standards de référence soit des échantillons d’urines « blanches » provenant d’animaux non traités aux stéroïdes soit des solutions aqueuses. Des échantillons d’urines prélevées sur des animaux auxquels de la boldénone undécylénate et de la boldione ont été administrés ont été utilisés une fois la totalité du protocole analytique finalisé. Les urines utilisées pour le développement méthodologique ont été collectées dans le cadre du projet BOLDIRMS. Des veaux de 3 mois, tous de race frison, ont été élevés dans une ferme expérimentale en Loire Atlantique. Les deux veaux choisis sont identifiés : - FR61 0988 1785 : traité par de boldénone undécylénate par voie intramusculaire, - FR49 1292 0056 : traité par de la boldione par voie orale. Les urines analysées dans cette étude ont été prélevées 1, 2 et 3 jours après administration. II.1.2. MATERIEL ET APPAREILLAGE II.1.2.1. Standards Les principaux standards de stéroïdes ont été fournis par Steraloid, Research Plus Sigma-Aldrich, Promochem ou bien auprès des laboratoires communautaires de référence (CRL) RIVM (bilthoven, NL): 5β-androst-1-en-3,17-dione (M1), 5β-androst-1-en-17α- ol-3-one (M2), 5β-androst-1-en-17β-ol-3-one (M4), boldione (M7), épiboldénone (M8), boldénone (M9), 6β-OH-boldénone. Pour des raisons de simplicité, le mélange de ces standards de boldénone et ses métabolites seront nommés « mix-boldénone » plus tard dans ce chapitre. D’autres standards ont également été utilisés dans le développement de méthode que sont la testostérone, l’estradiol, étiocholanolone, la DHEA, l’androst-5-ène-3β,17α-diol et le 5α- androstan-3β,17α-diol. Le mélange sera nommé « mix-irms ». Ces standards ont été dissous dans l’éthanol absolu afin d’obtenir des solutions allant de 1 à 100 ng.µL-1 .
  25. 25. 25 II.1.2.2. Produits chimiques et réactifs Tous les produits chimiques et réactifs utilisés sont de qualité analytique. Acides, bases : - Acide acétique glacial (SDS-0070515), hydroxyde de sodium 1N (SDS-3470015), - hydroxyde de potassium 1M (SDS- 3380015). Sels : - Dihydrogénophosphate de potassium (Merck-104873), Solvants : - Ethanol absolu, méthanol, n-pentane, diéthyléther (Carlo Erba RPE- 414607), - Méthanol, hexane 95%, acétate d’éthyle, hexane 99% HPLC grade, diéthyléther, Isopropanol 99% HPLC grade, Acétonitrile de qualité HPLC (SDS), - n-pentane (Promochem), - Cyclohexane de pureté >99,5% (Sigma-Aldrich) - Eau Ultra pure (>18mΩ.cm), Préparation enzymatique : - β-glucuronidase de Coli.E (Roche diagnostic GMBH) Phase d’extraction : - Silice greffée octadécyl, 2 g de phase, réservoir 12 mL (SDS, SPE C18, Peypin, France), - Silice, 1 g de phase, réservoir 6 mL (SDS, SPE SiOH, Peypin, France), Produits de dérivation : - Anhydride acétique pour analyse GC > 99,0 % (Fluka) stocké à température ambiante dans des flacons ambrés, - Pyridine anhydre 99,8 % (Aldrich) stockée à température ambiante dans des flacons ambrés. Gaz : - Helium (5.0) (Air Liquide),
  26. 26. 26 - Azote liquide (Air Liquide), - Dioxyde de carbone provient de Messer (Saint-Herblain, France), II.1.2.3. Matériel de laboratoire - Système d’aspiration par le vide pour colonne SPE (type VAC ELUT Prolabo - 07485001), - Pipettes automatiques, microseringues, pastettes, - Centrifugeuse GR 4.11® (Jouan, Saint-Herblain, France), - Blocs chauffants, évaporateurs : Pour vials, équipés d’évaporation à azote (C.I.L. - Therme-vap), pour vials, uniquement pour des réactions de dérivation (Pierce - 18780), pour tubes à hémolyse équipé d’un système d’évaporation à azote, Speed Vac (Savant SC 210 A) pouvant remplacer le système pour tubes à hémolyse, - Etuve thermostatée pour hydrolyse, agitateur type Vortex® , agitateurs magnétiques, bain à ultrasons (Bioblock Scientific, Illkirch, France), - Tubes en verre à usage unique (CML TVU 16) et leurs bouchons (CML – 0BA13) - Tubes à centrifuger à vis, capacité 50mL (CML – TC50BK) - Mesure du pH : Papier pH 7.5-14.0/0.5 (Merck – 1.09532.0001), Papier pH 4.0- 7.0/0.2 (Merck – 1.09542.0001), pH mètre (Corning - 125). II.1.2.4. Appareillage II.1.2.4.1. HPLC semi-préparative Un système HPLC Agilent 1100 composé d’une pompe à gradient (série 1100), d’un passeur automatique, d’un four pour colonne et d’un détecteur à barrette de diodes et d’un collecteur de fonction automatique a été utilisé pour réaliser de l’HPLC semi- préparative. Deux colonnes ont été testées : - une colonne diméthylaminopropyle: EC Nucléosil 100-5 N(CH3)2 4.0*250 mm, 5 µm (Macherey Nagel, 720994.40), d’une précolonne CC 8/4 Nucléosil 100-5 N(CH3)2 (Macherey Nagel, 721610.40). - une colonne RP C18: LiChroCART 25-4 LiChrospher 100 RP-18 (5 µm) (Merck 1.50995.0001). II.1.2.4.2. GC-MS Le couplage GC-MS (Hewlett Packard, Palo Alto, CA, Etats-Unis) utilisé au cours de ces travaux est constitué :
  27. 27. 27 - D’un chromatographe en phase gazeuse équipé d’une colonne capillaire : colonne capillaire de phase stationnaire à faible relarguage DB 5MS, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm (Agilent 122-5532) , d’un injecteur split/splitless, d’un four avec température programmable jusqu’à 320°C au moins (Agilent 6890) et d’un injecteur automatique (Agilent 7673). - D’un spectromètre de masse de basse résolution de type quadripolaire (Agilent MSD 5973) permettant l’ionisation des analytes par impact électronique équipé d’une station informatique et d’une imprimante. II.1.2.4.3. GC-C-IRMS La détermination des rapports isotopiques 13 C/12 C des molécules analysées se fait grâce à un spectromètre de masse de rapport isotopique couplé à un chromatographe en phase gazeuse via un four de combustion (cf. figure II-1) constitué : - d’un chromatographe en phase gazeuse équipé d’une colonne capillaire : colonne capillaire de phase stationnaire à faible DB 5MS, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm (Agilent 122-5532), d’un injecteur split/splitless, d’un four avec température programmable jusqu’à 320°C au moins (Agilent 6890) et d’un injecteur automatique (Agilent 7673), - d’un spectromètre de masse de rapport isotopique (ISOPRIME - Elementar) via un four à combustion (quartz 6 mm x 0.5 mm épaisseur, 60 cm x 65 mm (i.d.)) conditionné avec de l’oxyde de cuivre (GVI) et bien évidemment d’une station informatique reliée à une imprimante. Principe La détermination des rapports isotopiques des molécules analysées se fait grâce à un spectromètre de masse de rapport isotopique couplé à un chromatographe en phase gazeuse via un four à combustion (GC/C/IRMS). Sur la figure II-1, les différents éléments qui constituent cet appareil sont représentés.
  28. 28. 28 Figure II-1: Schéma du principe d’un spectromètre de masse de rapport isotopique couplé à un chromatographe en phase gazeuse via un four à combustion Les analytes vont parcourir un chemin bien défini au cours duquel ils vont subir les processus suivants : 1. Les molécules de l’échantillon sont séparées via la colonne du chromatographe en phase gazeuse. 2. Les composés élués sont convertis en gaz élémentaires CO2 et H2O dans le four à combustion. 3. Les molécules d’eau sont retenues dans le piège à eau et seules les molécules de CO2 atteignent la source du spectromètre de masse où elles subissent une ionisation par impact électronique. 4. Les ions formés dans la source sont séparés sur un secteur magnétique selon leurs masses caractéristiques ; les isotopomères du CO2 sont ainsi séparés. 5. La mesure des rapports isotopiques 13 C/12 C des analytes est effectuée par l’ordinateur en se basant sur la valeur du rapport isotopique du CO2 de référence introduit directement dans la source et calibré par rapport à une référence internationale (le VPDB). II.2. METHODE D’ANALYSE La méthode d’analyse développée comprend plusieurs étapes de purification. La méthode est représentée dans le schéma ci-dessous : Passeur automatique FID Hélium FID Hélium Colonne GC Chromatographie gazeuse Four à combustion Piège à eau CO2 de référence Hélium référence Boîtier de référence Vanne standby IRMS Atmosphère Atm urine Déconjugaison SPE C18 LLE NaOH SPE SiOH
  29. 29. 29 Figure II-2 : Stratégie analytique pour la purification des composés. II.2.1. PREPARATION ENZYMATIQUE Une enzyme est capable d’hydrolyser les stéroïdes sous formes conjuguées en forme libres, il s’agit de la β-glucuronidase. L’hydrolyse enzymatique s’effectue en ajoutant aux 20 mL d’urine tamponné par 6 mL de tampon phosphate à pH 6,8 100 µL de la β-glucuronidase d’E. Coli. La préparation est incubée pendant une nuit à 37 °C (au moins 15h). II.2.2. EXTRACTION SUR PHASE SOLIDE : SPE C18 Dans le cas de la SPE C18 en phase inverse, les groupements octadécyles (hydrophobes) greffés sur la phase stationnaire fonctionnent selon les interactions de type Van der Walls. Les étapes de rinçage et d’élution ainsi que la détermination des volumes des solvants sont nécessaires à l’élimination des impuretés et à l’élution complète des analytes. Le conditionnement d’une colonne C18 consiste à appliquer successivement deux solvants très polaires, le méthanol puis l’eau ultrapure (10 mL chacun). 20 mL d’urine sont ensuite déposés sur la colonne. L’étape de rinçage de la phase consiste à appliquer successivement 10 mL d’eau ultrapure puis 10 mL d’hexane consécutif à un séchage etde la phase pendant 5 minutes. L’élution est réalisée par 5 mL d’un mélange MeOH/AE (40:60, v/v). L’éluat est finalement évaporé à sec sous courant d’azote à environ 45°C. II.2.3. EXTRACTION LIQUIDE/LIQUIDE (LLE)
  30. 30. 30 Dans un premier temps, les androgènes libres sont isolés de l’estradiol et du 6β- OH-boldénone. Afin, de n’extraire dans un premier temps que les androgènes libres, 2 mL de NaOH puis deux fois par 5 mL de n-pentane sont ajoutés à l’extrait sec. Après agitation, les deux fractions de n-pentane sont assemblées et identifiées « AF » puis finalement évaporées à sec. Pour extraire dans un deuxième temps les estrogènes dont l’estradiol et le 6β-OH- boldénone tout en restant à pH14, une seconde phase d’extraction est effectuée par deux fois 5 mL d’éther. Les deux fractions d’éther combinées en « EF » sont évaporées à sec sous un flux d’azote à 45 °C. II.2.4. EXTRACTION SUR PHASE SOLIDE : SPE SIOH Le conditionnement d’une colonne de silice (phase normale) consiste à appliquer un solvant très apolaire comme l’hexane. Pour une bonne activation de la phase stationnaire, un minimum de 18 mL d’hexane est nécessaire. Le dépôt d’échantillon est réalisé dans 0,5 mL d’un mélange hexane/acétate d’éthyle (0,425/0,075 ; v/v). L’étape de rinçage de la phase consiste à appliquer sur la colonne un mélange d’hexane avec un solvant de force éluotropique plus élevée, du type acétate d’éthyle. En effet, le rinçage s’effectue avec 10 mL d’un mélange Hexane/AE (90:10, v/v) sans appliquer de vide. Deux étapes d’élution sont nécessaires pour éluer d’une part les androgènes et d’autres part l’estradiol et 6β-OH-boldénone. L’élution des androgènes libres est réalisée par 10 mL d’un mélange Hex/AE (50:50). Pour l’estradiol et le 6β-OH- boldénone, une étape d’élution est effectuée d’abord par 10 mL d’un mélange Hex/AE (50 :50) puis par 10 mL du mélange Hex/AE (30:70). A la fin de chaque étape d’élution, un vide est appliqué. II.2.5. HPLC SEMI-PREPARATIVE : PHASE NORMALE DIMETHYLE- AMINOPROPYLE Cette étape de purification est nécessaire car il reste toujours des interférents qui coéluent avec les stéroïdes d’intérêt après une SPE SiOH (voir spectre chap. III). Une colonne polaire N(CH3)2 a été utilisée afin que nos composés soient élués dans des fractions différentes. Les résidus récupérés sont dissous par 50 µL d’un mélange Hexane/Isopropanol (90:10). Les conditions chromatographiques qui nous a permis de récolter nos composés d’intérêt sur six tubes sont les suivantes : - Solvant A : hexane HPLC - Température de colonne : 50 °C - Solvant B : isopropanol HPLC - Volume injecté : 50 µL - Débit : 1 mL/min - Détecteur : 210 et 230 nm pour les androgènes ; 210 et 280 nm pour les estrogènes. - Gradient utilisé pour la purification des androgènes est le suivant:
  31. 31. 31 Tableau II-1 : Programme de gradient de solvants pour les stéroïdes Temps (min) % Solvant A % Solvant B 0 96 4 15 96 4 19 20 80 28 20 80 30 96 4 40 96 4 Post time 1,5 min 96 4 Comme il s’agit d’une purification HPLC semi-préparative, la fraction cible contenant l’analyte d’intérêt est collectée ainsi que les fractions limites précédant et suivant la fraction cible, ceci afin de vérifier la collection complète de chaque analyte. Tableau II.2 : Détermination de l’intervalle des fractions récoltées en HPLC II.2.6. DERIVATION La dérivation est une étape essentielle car les hormones stéroïdes sont des molécules très peu volatiles comportant des groupements hydroxyles et cétone. Dans le but de bien séparer nos molécules sur une colonne apolaire en modifiant leur polarité après une HPLC diméthyleaminopropyle, une étape de dérivation est nécessaire avant leur injection en GC-MS. Elle consiste en l’acétylation des fonctions alcool par 60 µL d’un mélange d’Anhydride acétique/Pyridine (50:50, v/v) pendant toute une nuit (au Fractions récoltées Intervalle des fractions « AF » Intervalle des fractions « EF » Fraction limite AF1 : 1,53 min – 3,03 min EF1 : Fractions cibles AF2 : 3,04 min – 5,50 min : M1 AF3 : 5,51 min – 9,00 min : M2, M4, DHEA, boldione, 17α -testotérone, andtrosènediol. AF4 : 9,6 min – 13,10 min : 17α -boldénone, b-boldénone. AF5 : 15, 38 min – 19, 38 min : EF2 : EF3 : EF4 : EF5: 6b-OH-boldénone, 17α- estradiol. Fraction limite AF6 : 19,39 min – 20,88 min
  32. 32. 32 moins 15h) à température ambiante. Ainsi, les pics sont plus fins, ce qui permet de gagner en intensité, facteur très important pour l’analyse en GC-C-IRMS où la sensibilité et la pureté des composés sont des facteurs primordiaux comme en capacité de pics. Cette étape permet finalement l’ajout d’une étape de purification supplémentaire ceci lié au fait de la stabilité des molécules dérivées. II.2.7. HPLC SEMI-PREPARATIVE : PHASE INVERSE C18 Au cours des différentes analyses d’urines effectuées lors du développement de la méthode nous avons parfois été confrontés à la présence de pics interférents aux temps de rétention de nos analytes ou bien à une mauvaise séparation de certains de ces composés. Dans ces conditions, les déviations isotopiques de certains analytes n’étaient pas mesurables en GC-C-IRMS. C’est pourquoi nous avons utilisé une colonne de phase inverse C18 comme ultime étape de purification avant analyse IRMS. Les conditions chromatographiques sont les suivantes : Débit 1 mL/min, température de la colonne 30°C, volume injecté 50 µL. Le gradient appliqué pour éluer et rincer la colonne est présenté dans le tableau II-3. Tableau II-3 : Programmation du gradient de solvants pour les stéroïdes acétylés temps (min) % H2O % ACN 0 70 30 25 0 100 35 0 100 39 70 30 45 70 30 Le fractionnement HPLC présenté dans le tableau suivant Tableau II-4 : Détermination de l’intervalle des fractions récoltées en HPLC C18 Fractions récoltées Intervalle des fractions « AF’ » Intervalle des fractions « EF’ » Fraction limite AF’1: 8,8 min – 9,79 min EF’1 : Fractions cibles AF’2: 9,80 min – 13,76 min : Boldione. AF’3: 13,77 min – 20,11 min : M1, 17α - boldénone,17β-boldénone, 17α - testostérone. AF’4: 20,12 min – 23,50 min : Etiocholanolone, DHEA, M2, M4,. AF’5: 23,51 min- 28,00 min : EF’2 : EF’3 : 6b-OH-boldénone EF’4 : EF’5 : 17α -estradiol
  33. 33. 33 II.2.8. PRECAUTIONS ANALYTIQUES II.2.8.1. Séparation et identification des composés par GC-MS Avant toute injection en GC-C-IRMS, les échantillons doivent être injectés en GC-MS. En effet, lors de l’injection d’échantillons biologiques, outre nos molécules cibles, d’autres molécules peuvent interférer. Il est donc nécessaire d’injecter en GC-MS les échantillons pour s’assurer de la pureté et de l’identité de chaque pic que l’on observera sur le chromatogramme en GC-C-IRMS. Les conditions chromatographiques nécessaires à l’identification des molécules sont les suivantes : - Gaz veteur : Helium, débit constant environ 1,5 mL/ min, pression en tête de colonne environ 140 kPa, - Injection : Mode splitless, 1min, - Volume injecté : 2 µL - Ligne de transfert : 280 °C - Programmation de température de la colonne : 60°C (1,5 min), 40°C.min-1 jusqu’à 220°C (0 min), 1°C.min-1 jusqu’à 240°C (1 min), 20°C.min-1 jusqu’à 300°C (2 min). - Scan : 50-800 m/z à 70 eV. II.2.8.2. Mesure des déviations isotopiques 13 C/12 C des composés par GC- C-IRMS Une fois que nous nous sommes assurés de l’identification et de la pureté des molécules d’intérêt présentes dans les fractions cibles ainsi que de leur absence dans les fractions limites. Elles peuvent être injectées en GC-C-IRMS. Les conditions chromatographiques et spectrométriques sont les suivantes : Conditions chromatographiques : - Gas vecteur : Helium - Débit : 1,5 mLmin-1 (débit constant) - Pression en tête de colonne : 140 kPa (20 psi) - Injection : Mode splitless, 1 min - Volume injecté : 2 µL - Températures de l’injecteur: 270°C - Four à combustion : 850°C - Piège à eau : -100 (  10) °C (azote liquide). - Température de l’interface colonne GC-Four à combustion : 350°C Androstènediol, androstanediol. Fraction limite AF’6: 28, 01 min – 32 min EF’6 :
  34. 34. 34 - Colonne : 60°C (1,5 min), 40°C.min-1 jusqu’à 220°C (0 min), 1°C.min-1 jusqu’à 240°C (1 min), 20°C.min-1 jusqu’à 300°C (4 min). Conditions spectrométriques : 1- Contrôles préliminaires  Vérifier la stabilité et la linéarité de l’IRMS par la mesure successive de gaz référence CO2 introduit sous forme de pulses dans la source.  Vérifier les performances globales du GC-C-IRMS en injectant un composé de référence (mélange de composés acétylés ou mélange d’alcanes) qui permettra d’évaluer sa sensibilité et sa calibration. 2- Acquisition du signal  Ordre de la séquence - Stabilités (10 pulses de CO2 en milieu de gamme de linéarité – environ 6 nA), - Linéarité (5 pulses de CO2 sur couvrant la gamme de linéarité – 2 à 10 nA), - Mélange de stéroïdes acétylés, standard injecté en début et au cours de la séquence (au moins toutes les dix injections), - Echantillons (contrôles et inconnus). Chaque fraction considérée pourra être injectée en double lorsque que les concentrations des analytes le permettent.
  35. 35. 35 CHAPITRE III RESULTATS ET DISCUSSION III.1. MISE AU POINT D’UNE METHODE D’ANALYSE DES METABOLITES DE BOLDENONE DANS L’URINE DE BOVIN PAR GC-C-IRMS Cette mise au point est basée en partie sur la méthode appelée « méthode IRMS ». III.1.1. MISE AU POINT DE LA METHODE DE DETECTION PAR GC-MS DES DIFFERENTS METABOLITES URINAIRES Le but est de mettre au point une méthode de détection des différents métabolites standard de la boldénone. Les objectifs ont donc été de : - Caractériser les standards, - Voir s’il est nécessaire de dériver les composés, - Optimiser la séparation chromatographique des différents métabolites. III.1.1.1. Optimisation de la séparation chromatographique L’étude consistait en l’injection de solutions standard de nos stéroïdes cibles avant dérivation et après dérivation. Sept molécules, 5β-androst-1-en-3,17-dione (M1), 5β- androst-1-en-17α-ol-3-one (M2), 5β-androst-1-en-17β-ol-3-one (M4), boldione (M7), épiboldénone (M8), boldénone (M9), 6β-OH-boldénone ont été injectées séparément avec une concentration de 20 ng identique pour tous les composés. Pour chacun des pics
  36. 36. 36 obtenus, les temps de rétention, les facteurs d’asymétrie et les largeurs à mi hauteur ont été relevés. III.1.1.2. Résultats Figure III-1 : Chromatogrammes (GC) de certains composés non dérivés (à l’état natif) et dérivés après injection en GC-MS (TIC, acquisition full scan) Lorsque nous comparons les deux pics du chromatogramme A, résultats de la superposition des deux TIC de la 17α-boldénone acétylé et à l’état natif, nous observons d’emblée que le signal de la molécule acétylée est bien plus abondant que celui à l’état natif. Ainsi, on ayant ajouté un groupement acétyle sur la fonction alcool de la 17α- boldénone, non seulement le signal a été multiplié par 4 par rapport au composé libre mais également la polarité de nos composés a été modifiée et donc leur temps de rétention aussi. Pour la DHEA et le 6β-OH-boldénone, la dérivation devient obligatoire pour pouvoir détecter ces composés en GC-MS (cf. figure III-1 : B et C). Enfin, certaines molécules ne possède pas de fonction dérivable ; c’est le cas des stéroïdes qui ne comportent pas de fonctions alcool comme la boldione (voir figure III-1 : D). 2 1 .0 0 2 2 .0 0 2 3 .0 0 2 4 .0 0 2 5 .0 0 2 6 .0 0 2 7 .0 0 2 8 .0 0 2 9 .0 0 3 0 .0 0 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 T im e --> A b u n d a n c e T IC : 0 4 0 8 1 0 0 4 .D 1 7 a -b o ld é n o n e a c é ty lé e 1 7 a -b o ld é n o n e n a tiv e T IC : 0 6 0 8 1 0 0 4 .D 2 0 .0 02 1 .0 02 2 .0 02 3 .0 02 4 .0 02 5 .0 02 6 .0 02 7 .0 02 8 .0 02 9 .0 03 0 .0 03 1 .0 0 0 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 T im e --> A b u n d a n c e T IC : 0 4 0 8 1 0 0 8 .D 6 b -O H -b o ld é n o n e a c é ty lé T IC : 0 6 0 8 1 0 0 8 .D 2 0 . 0 0 2 1 . 0 0 2 2 . 0 0 2 3 . 0 0 2 4 . 0 0 2 5 . 0 0 2 6 . 0 0 2 7 . 0 0 2 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 1 4 0 0 0 0 0 1 6 0 0 0 0 0 1 8 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 2 4 0 0 0 0 0 2 6 0 0 0 0 0 T i m e - - > A b u n d a n c e T I C : 0 4 0 8 1 0 0 9 . D D H E A a c é t y l é e T I C : 0 6 0 8 1 0 0 9 . D 2 2 . 0 0 2 2 . 5 0 2 3 . 0 0 2 3 . 5 0 2 4 . 0 0 2 4 . 5 0 2 5 . 0 0 2 5 . 5 0 2 6 . 0 0 2 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 1 4 0 0 0 0 0 1 6 0 0 0 0 0 1 8 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 T im e - - > A b u n d a n c e T I C : 0 6 0 8 1 0 0 3 . D b o ld io n e a v a n t d é r iv a t io n b o ld io n e a p r è s a c é t y la t io n T I C : 0 4 0 8 1 0 0 3 . D A B DC
  37. 37. 37 En conclusion, entre les deux alternatives (natif ou acétylé) seul la dérivation par acétylation a été retenue pour l’injection en GC-MS. III.1.2. MISE AU POINT DE LA METHODE DE PREPARATION D’ECHANTILLONS À PARTIR D’EAU ULTRAPURE SUPPLEMENTEE Dans un premier temps, l’optimisation de chaque étape de la méthode IRMS a été réalisée séparément sur des solutions aqueuses supplémentées de standards de référence purs. Il faut noter qu’au cours de cette préparation, des stéroïdes standards, autres que les métabolites de boldénone d’intérêt, ont été ajoutés, à savoir 17α-estradiol, 17α- testostérone, étiocholanolone, DHEA, Androst-5ène-3β,17α-diol, 5α- androstane-3β,17α- diol. Ceci est réalisé afin d’avoir une méthode permettant à la fois d’analyser les composés endogènes comme les métabolites de testostérone et les métabolites de boldénone. Le mélange de ces molécules sera appelé par la suite « mix-irms ». De même le mélange des métabolites de boldénone urinaires sera appelé: « mix-boldénone ». Chaque étape de la méthode accréditée a été optimisée pour inclure les métabolites de boldénone. III.1.2.1. Estimation du taux de récupération après une extraction sur colonne SPE C18 Le but est de mettre au point les conditions opératoires sur colonne SPE C18 permettant la préconcentration de l’échantillon. L’objectif est donc de vérifier s’il n’y a pas de perte lors des étapes de rinçage (par l’hexane) et en contrôlant également fraction d’élution des analytes. Dans l’étape d’extraction sur colonne SPE C18, la méthode initiale accréditée préconisait deux étapes de rinçage successives à l’eau ultrapure (10 mL) puis à l’hexane (10 mL) avec une phase de séchage entre les deux. La méthode préconise également une étape d’élution par 5 mL d’un mélange MeOH/AE (30:70). Nous avons donc réalisé un bilan des taux de récupération des molécules en collectant les fractions d’après le mode opératoire « SPE C18 » suivant :
  38. 38. 38 Figure III-2 : Protocole « SPE C18 » pour la détermination le taux de récupération des analytes dans les fractions F1, F2 et F3 Chaque fraction (F1, F2 et F3) est évaporée à sec sous courant d’azote à environ 45°C, l’extrait sec est repris par 300 µL de MeOH et transféré dans un vial. Après évaporation, l’extrait est dérivé par 30 µL de dérivant. Les résultats sont exprimés sous forme de rendements calculés approximativement de la façon suivante : Les rendements obtenus après cette expérience sont représentés sur la figure III-3. Remarque : Dans les fractions F1 et F3, aucune perte de composé n’a été observée après rinçage à l’hexane et après une deuxième élution par MeOH/AE (30 :70). Cela nous permettra de conclure quant à l’application de l’étape de rinçage puisqu’il n’y a pas d’élution des stéroïdes cibles. Conditionnement 1er - 10 mL MeOH 2ième - 10 mL H2O Dépôt d’échantillon Rinçage Elution 1er - 10 mL H2O 2ième - 10 mL Hexane F1 1ier - 5 mL MeOH/AE (30 :70) 2ième - 5 mL MeOH/AE (30 :70) F3 F2 0,5 µg de stéroïdes + 6 mL Tampon phosphate, pH 6,8 (Aire de l’ion principal de l’analyte) échantillon (Aire de l’ion principal du standard) référence Rdt (%) = × 100
  39. 39. 39 Figure III-3 : Bilan des taux de récupération (%) des analytes de mix-irms et de mix boldénone après une première élution sur SPE C18 Une perte comprise entre 5 et 25% des métabolites de boldénone est observée sauf pour la boldione qui, elle, est récupérée à 100%. Outre les métabolites de boldénone, une perte un peu plus élevée allant de 20 à 40 % environ est constatée pour les stéroïdes naturels. En conclusion, les conditions initiales d’utilisation de la SPE C18 ont donc été jugées satisfaisantes et conservées. III.1.2.2. Optimisation de l’étape d’extraction liquide/liquide L’objectif de cette étape est de fragmenter notre échantillon en un extrait contenant les androgènes et un extrait contenant les estrogènes et le 6β-OH-boldénone. Condition opératoire La stratégie analytique étant établie sur la base de la méthode initiale pour la séparation des différentes catégories de molécules, il nous a paru important de vérifier deux paramètres. Tout d’abord, nous avons voulu vérifier l’efficacité de deux extractions liquide/liquide consécutives. Nous avons voulu également voir si une troisième extraction par un solvant autre que celui de la méthode IRMS (n-pentane), par exemple l’éther, permettait d’optimiser l’extraction des stéroïdes. D’après la méthode initiale, travailler en milieu alcalin permettait d’ioniser les estrogènes sous forme de phénolate (pKa~ 10,7) et de les garder dans la phase aqueuse. Ainsi, les estrogènes sont isolés des androgènes extraits dans la phase organique. Deux tubes contenant chacun 0,5 µg de stéroïdes ont été respectivement ajustés à pH 14 et 5 et extrait successivement par 2 fois 5 mL de n-pentane et 5 mL d’éther. 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 M 1 Etiocholanolone D H EA Boldione (M 7) M 4 M 2 17a-Testostérone 5a-Androst-1-en-3b,17a diol 17a-boldénone (M 8) 5a-androstan-3b,17a-diol 17b-boldénone (M 9) 17a-estradiol 6b-O H-boldénone Rendementen% F2
  40. 40. 40 Déroulement du test 1ère partie du test à pH 14 : Figure III-4 : Schéma du test LLE en trois fois avec deux solvants à pH 14 2ième partie du test à pH 5,2 : Figure III-5 : Schéma du test LLE en trois fois avec deux solvants à pH 5, 2 Chaque fraction est évaporée à sec, dérivée puis injectée dans le cyclohexane en GC-MS. III.1.2.2.1. Résultats Dans un premier temps, la répartition des stéroïdes dans les différentes fractions extraites a été évaluée. Les résultats sont présentés dans la figure III-7 et III-8. Les aires des ions caractéristiques de chaque molécule ont permis d’estimer le pourcentage des molécules étudiées dans chacune des fractions extraites. T1 - 2 mL de NaOH (1M) - 0,5 µg mix-boldénone et mix-irms 5 mL n-pentane 1ère extraction 5 mL n-pentane 2ième extraction 5mL éther 3ième extraction FA1 FA2 FA3 Phase aqueuse Phase organique Agitation et centrifugation Agitation et centrifugation Agitation et centrifugation T2 - 2 mL de NaOH (1M) - 150 µL d’acide acétique glacial - 0,5 µg mix-boldénone et mix-irms 5 mL n-pentane Extraction 1 5 mL n-pentane Extraction 2 5mL éther Extraction 3 FE1 FE2 FE3 Phase aqueuse Phase organique Agitation et centrifugation Agitation et centrifugation Agitation et centrifugation
  41. 41. 41 Figure III-6 : Répartition des molécules dans les différentes fractions extraites à pH 14 (pourcentage de stéroïdes dans chaque fractions calculé à partir des intensités des ions) Figure III-7: Répartition des molécules dans les différentes fractions extraites à pH 5,2 (pourcentage de stéroïdes dans chaque fractions calculé à partir des intensités des ions) Tout d’abord, en une seule extraction à pH 14 la totalité des analytes n’est pas récupérée. C’est le cas des androgènes qui sont récupérés entre 50% et 97% après cette première étape excepté pour le 6β-OH-boldénone. Bien que lors de la deuxième extraction les analytes restants ne sont pas extraits totalement, il semble donc évident que deux extractions successives soient nécessaires à chaque étape. Toujours à pH 14, la fraction F-A2 contient l’estradiol. Or, cette étape permettait d’isoler les estrogènes des androgènes en jouant sur leurs pKa. De plus, après une troisième 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 M 1 E tiocholanolone D H E A B oldione (M 7) M 4 M 2 17a-Testostérone 5a-A ndrost-1-en-3b,17a diol 17a-boldénone (M 8) 5a-androstan-3b,17a-diol 17b-boldénone (M 9) 17a-estradiol 6b-O H -boldénone F-A1 F-A2 F-A3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 M 1 Etiocholanolone D H EA Boldione (M 7) M 4 M 2 17a-Testostérone 5a-Androst-1-en-3b,17a diol 17a-boldénone (M 8) 5a-androstan-3b,17a-diol 17b-boldénone (M 9) 17a-estradiol 6b-O H-boldénone F-E1 F-E2 F-E3
  42. 42. 42 extraction par l’éther à pH14, l’estradiol et le 6β-OH-boldénone sont récupérés avec un rendement correct d’environ 60% et 80% respectivement, ce qui n’est pas le cas en milieu acide. En outre, en deux extractions successives par le pentane à pH 5,2, la plupart des analytes sont récupérés avec un très faible rendement et d’autres ne sont tout simplement pas extraits. Le maximum de rendement est obtenu pour l’androstanediol (35% environ). On peut faire la même observation pour le cas d’une troisième extraction par l’éther où 10 % de l’estradiol et du 6b-OH-boldénone sont récupérés. En conclusion, nous avons choisi de ne travailler qu’à pH 14 et d’effectuer deux extractions liquide/liquide une première avec 2 fois 5 mL de pentane, fraction A (androgène), et une seconde avec 2 fois 5 mL d’éther, fraction E (estradiol + 6β-OH- boldénone). III.1.2.3. Extraction sur SPE SiOH en phase normale Dans le cas de la SPE en phase normale, les groupements polaires de la phase stationnaire induisent des liaisons faibles de type interactions dipôle-dipôle avec les groupement polaires (amines, hydroxyles, cétone,…) des analytes. Le choix du solvant est très important et influe directement sur le type d’interactions mis en œuvre pour la purification ainsi que le volume nécessaire à l’élimination des interférences et à l’élution complète des analytes. Nous avons conservé la colonne de silice, mais nous avons optimisé les conditions de rinçage et d’élution comme présenté dans les protocoles suivants (cf. figure III-8 et figure III-9). Figure III-8 : « Protocole SiOH fractions rinçage » ou « Sr » en vue d’optimiser l’étape de rinçage sur SPE SiOH Conditionnement 18 mL hexane Dépôt d’échantillon Rinçage 18 mL d’ Hex/AE (85/15) 6x (F=3mL) F1 à F6 500 µL Hex/AE (425:75)+ 0,5µg de stéroïdes Conditionnement Dépôt d’échantillon Rinçage 6x (F=3mL) F1 à F6 élution
  43. 43. 43 Figure III-9 : Protocole « SiOH fraction élution » ou « Se » en vue d’optimiser l’étape d’élution des analytes sur SPE SiOH Chaque fraction est évaporée, l’extrait sec est repris par 400 µL de méthanol et transféré dans un vial. Après évaporation, l’extrait sec est dérivé par 30 µL de dérivant (AA/Pyr) et injecté dans le cyclohexane en GC-MS. Le profil d’élution obtenu pour l’essai « SiOH fractions d’élution » est représenté sur la figure III-10. SiOH fraction d’élution Volumes d’élution : 1 fraction = 3 mL 3 6 9 12 15 18 M1 F1 F2 F3 F4 F5 F6 Etiocholanolone DHEA Boldione (M7) (M4) (M2) 17a-Testostérone 5a-Androst-1-en-3b,17a diol 17a-boldénone (M8) 5a-androstan-3b,17a-diol 17b-boldénone (M9) 17a-estradiol 6b-OH-boldénone Figure III-10 : Profil d’élution des mix-irms et mix boldénone étudiés en fonction de l’étape d’élution lors d’une purification SiOH Concernant le protocole « Sr », après récupération et analyse en GC-MS des six fractions, aucun composé n’a été décelé. Le rinçage est donc envisageable pour tous les composés jusqu’à 18 mL (85 :15). Pour le protocole « Se », le comportement de la 17b- boldénone est intéressant dans la mesure où la molécule commence à être éluée plus tardivement que les autres composés. On la retrouve dans la fraction F5 correspondant à une élution par 15 mL d’un mélange Hex/AE (60:40). Ce composé est donc beaucoup plus polaire que les autres entités étudiées, et proche de son épimère, la 6β-OH- boldénone. En effet, ce dernier n’est observé dans aucune des fractions analysées, avec une fonction hydroxy supplémentaire par rapport à la 17 β-boldénone, le 6 β-OH-
  44. 44. 44 boldénone est plus polaire et donc plus retenu sur SiOH que la boldénone. Au regard de ces résultats, il paraît important de revoir les conditions d’élution en modifiant éventuellement les proportions du mélange Hex/AE afin d’être en mesure d’éluer le 6 β- OH-boldénone mais également de travailler avec des volumes d’élution plus petits. Dans le but de connaître le mélange optimal de 10 mL Hex/AE qui, d’une part, ne provoque aucune de perte d’analytes lors du rinçage sur SPE SiOH et qui, d’autre part, permet une bonne élution des composés cibles, dix tests de différent mélange ont été effectués. La force éluotrope du mélange a été augmentée de 10 en 10 de 10 % d’AE à 100 %. La répartition des composés dans les différentes fractions est présentée dans la figure III-11. Figure III-11 : Taux de récupération des analytes en fonction des différents mélanges Hex/AE après une étape sur SPE SiOH D’après la figure III-11, aucune perte d’analyte n’est constatée lors du rinçage par un mélange de 10 mL d’Hex/AE (90:10). Les androgènes et l’estradiol sont également élués avec un mélange de 10 mL d’Hex/AE (50:50) alors que le 6β-OH-boldénone est élué à partir d’un mélange de 10 mL d’Hex/AE (40:60). Il parait judicieux d’utiliser deux colonnes de silice, d’une part, pour purifier les androgènes par 10 mL d’un mélange de Hex/AE (50 :50) et, d’autre part, pour purifier les estrogènes (estradiol) et le 6b-OH- boldénone par 10 mL d’un mélange de Hex/AE (50 :50) et par 10 mL d’un mélange de Hex/AE (30:70) respectivement. Au regard de ces résultats, on peut dire qu’il vaut mieux utiliser deux mélanges différent d’Hex/AE (50:50 puis 30:70) pour permettre l’élution des différentes catégories de molécules, ceci avec un rendement acceptable. Malgrè q’aucune perte n’ait été observée pour le mélange Hex/AE (85:15) lors du rinçage, le choix s’est, tout de même, porté sur (M1) Etio DHEA Boldione (M7) (M2) 17a-Test 5a-androst-1-en-3b,17a-diol 17a-boldénone(M8) 5a-androstan-3b,17a-diol 17b-boldénone 17a-estradiol 6a-OH-BOLD Se1(Hex/AE; 90:10) Se2 (Hex/AE;80:20) Se3 (Hex/AE;70:30) Se4 (Hex/AE; 60:40) Se5 (Hex/AE;50:50) Se6 (Hex/AE;40:60) Se7 (Hex/AE; 30:70) Se8 (Hex/AE; 20:80) Se9 (Hex/AE;10:90) Se10 (Hex/AE; 0:100)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 rendement en % Se1 (Hex/AE; 90:10) Se2 (Hex/AE;80:20) Se3 (Hex/AE;70:30) Se4 (Hex/AE; 60:40) Se5 (Hex/AE;50:50) Se6 (Hex/AE;40:60) Se7 (Hex/AE; 30:70) Se8 (Hex/AE; 20:80) Se9 (Hex/AE;10:90) Se10 (Hex/AE; 0:100)
  45. 45. 45 le mélange de 10 mL d’Hex/AE (90:10) pour un rinçage optimum sans perte des analytes (précaution par rapport à M1). III.1.3. OPTIMISATION DE LA PURIFICATION PAR HPLC SEMI-PREPARATIVE Dans notre développement de méthode deux colonnes ont été utilisées : une colonne polaire N(CH3)2 et une colonne apolaire C18. L’optmisation consiste à séparer les métabolites de boldénone, leur temps de rétention respectif sur chaque colonne devant être enregistré pour réaliser une stratégie de collecte de fractions. III.1.3.1. Identification et séparation des standards de mix-boldénone sur colonne HPLC diméthyleaminopropyle et sur colonne HPLC C18 Colonne HPLC N(CH3)2 : Un mélange de solution standard mix-boldénone a été injecté sur la colonne HPLC N(CH3)2 à une température de 50 °C. Les conditions chromatographiques sont décrites dans le chapitre 2. Colonne HPLC C18 : Le travail consistait en l’injection d’un mélange de stéroïdes standard mix-boldénone préalablement dérivé par un acétylant sur la colonne HPLC C18. Les conditions chromatographiques sont énoncées dans le chapitre 2. Les chromatogrammes obtenus après passage sur la colonne est représenté sur les figures III-12 et III-13. Les pics correspondant aux composés sont numérotés comme suit : 1: M1 2: M2 3: M4 4: Boldione (M7) 5 et 6: 17α-boldénone (M8), 17β-boldénone (M9) 7: 6β-OH-boldénone
  46. 46. 46 Figure III-12 : Chromatogramme d’un standard de mix-boldénone après injection sur la colonne HPLC diméthyleaminopropyle Figure III-13 : Chromatogrammes d’un standard de mix-boldénone après injection sur la colonne HPLC C18 On constate sur la figure III-12 que les composés M2, M4 et la boldione sont très mal séparés ainsi la 17α et la 17β-boldénone. Sur ce type de colonne, il est difficile de séparer les composés dont les structures chimiques sont identiques (isomères). D’après le chromatogramme, on peut déjà voir nos fractions se dessiner dans la mesure où l’on collectera quatre fractions dont la première contiendra le métabolite M1, puis les métabolites M2, M4 et la boldione dans la deuxième fraction, la 17α et la 17β-boldénone dans la troisième fraction et enfin, le 6β-OH-boldénone dans la dernière fraction. 0 5 10 15 20 mAU 0 20 40 60 80 100 120 140 160 DAD1 A, Sig =250,4 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D) 6.515 10.598 16.882 DAD1 B, Sig =200,16 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D) 2.519 2.817 4.034 6.0026.192 6.489 10.611 16.884 DAD1 C, Sig =210,8 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D) 2.519 2.813 4.034 6.0036.192 6.488 10.598 16.887 DAD1 D, Sig =230,16 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D) 2.6552.816 4.034 6.0036.192 6.503 10.598 16.882 DAD1 E, Sig =280,16 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D) 1 M 1 2 3 4 7 0 5 10 15 20 25 mAU 0 100 200 300 400 DAD1 A, Sig =250,4 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D) 11.309 15.832 16.594 17.458 21.004 DAD1 B, Sig =200,16 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D) 1.268 2.944 12.317 17.459 18.496 21.004 DAD1 C, Sig=210,8 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D) 1.267 2.497 2.8272.954 12.316 14.584 18.496 21.007 DAD1 D, Sig=230,16 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D) 2.961 11.309 14.584 15.832 16.594 17.458 21.009 DAD1 E, Sig =280,16 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D) 2.513 2.951 4 7 5 6 3 et 2 1 5 et 6
  47. 47. 47 Le fait est qu’avec cette première étape de séparation/purification par HPLC N(CH3)2, on ne réussisse pas à bien séparer nos métabolites de boldénone. Nous avons donc réalisé une étape supplémentaire de séparation/purification sur colonne HPLC apolaire C18. D’après le chromatogramme de la figure III-13, la boldione est bien séparée du M4 et du M2 qui eux sont difficilement séparables du fait de leur similitude structurale. La remarque est aussi valable pour la 17α et la 17β-boldénone. En conclusion, ces essais montre bien qu’il faut deux étapes HPLC semi-préparative, une en phase normale et une autre en phase inverse, pour pouvoir séparer les composés même si certains sont difficilement séparable. Malgré tout, ces analytes cibles, qui sont coélués lors d’une HPLC semi-préparative, seront facilement séparés en GC-MS. Enfin, l’identification des stéroïdes nous a alors permis de créer une méthode de collecte des analytes (cf. tableau II- 2 et II-4). III.1.4. MISE AU POINT DE LA METHODE DE PREPARATION D’ECHANTILLON DES DIFFERENTS METABOLITES URINAIRES D’INTERET SUR MATRICE (URINES BLANCHES SUPPLEMENTEES) Une fois la totalité du protocole développé sur standard, la mise au point sur matrice nous a permis de valider le protocole en ajoutant les interférents matriciels. Nous avons donc testé chaque étape séparément grâce à des urines blanches auxquelles le mix- boldénone a été ajouté. III.1.4.1. Optimisation de l’extraction sur phase solide C18 Le but est d’estimer le taux de récupération des analytes lors de l’élution de ces derniers en utilisant différents mélanges de MeOH/AE. La procédure est la même que celle décrite dans le §III.1.2.1, mais elle est réalisée sur six échantillons d’urines blanches supplémentées. Six cartouches C18 on été utilisées lors de cette procédure. L’élution est réalisée avec différents mélanges MeOH/AE. Les résultats sont présentés dans la figure III-14.
  48. 48. 48 Figure III-14 : Taux de récupération des analytes obtenu avec un mélange MeOH/AE différent pour chaque préparation d’échantillon Sur matrice urinaire, les analytes se comportent différemment qu’en solution aqueuse (Eau Ultrapure) puisque, de manière remarquable, la quasi-totalité des composés ne sont pas récupérés en utilisant un mélange MeOH/AE (30:70). Avec ce mélange, certaines molécules d’intérêt ne sont tout simplement pas récupérées comme la boldione et le 6β- hydroxyboldénone. Par contre, le rendement est bien meilleur avec les autres mélanges. Le choix du mélange MeOH/AE (40:60) semble le plus approprié dans la mesure où il permet de récupérer la plupart des composés cibles. Donc, ce nouveau résultat sur matrice nous a permis d’apporter plus de précision sur le développement de la méthode par rapport aux résultats obtenus sur standard. III.1.4.2. Optimisation de l’étape d’extraction liquide/liquide Nous avons réalisé des tests sur quatre urines « blanches » supplémentées par 0,5 µg de mix-boldénone et mix-irms. Une étape d’extraction sur phase solide C18 a été réalisée pour chaque test au préalable. Pour chaque test, les fractions sont combinées et identifiées comme suit: - A1: pH14, 2 mL de NaOH + 2x5 mL de pentane - A2: pH 14, 2 mL de NaOH + 2x5 mL d'éther - E1: pH 5,2, 2mL de NaOH + 150 µL d'acide acétique concentré + 2x5 mL de pentane - E2: pH 5,2, 2mL de NaOH + 150 µL d'acide acétique concentré + 2x5 mL d'éther Chaque fraction organique est évaporée à sec, dérivée puis injectée dans le cyclohexane en GC-MS. 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 rendement M1 Etio DHEA Boldione (M7) M2 17a-T 5a- Androst-1- en-3b,17a diol (M8) 5a- androstan- 3b,17a-diol (M9) 17a-E 6b-OH- BOLD analytes standards SPE C18 sur urine blanche supplémentée SPE C18-1: MeOH/AE(30:70) SPE C18-2:MeOH/AE(40:60) SPE C18-3:MeOH/AE(50:50) SPE C18-4:MeOH/AE(60:40) SPE C18-5:MeOH/AE(75:25) SPE C18-6:MeOH/AE(100:0)
  49. 49. 49 III.1.4.3. Résultats Tout d’abord, l’évaluation de la répartition des stéroïdes dans les différentes fractions extraites est présentée dans la figure III-15. Figure III-15 : Taux de récupération des stéroïdes cibles dans les différentes fractions extraites lors des tests près extraction liquide/liquide Seul les androgènes sont récupérés dans la fraction A1 avec un rendement allant de 30 jusqu’à 100% pour la 17α-boldénone. Comme les résultats obtenus sur standard, la 17α- estradiol et le 6β-OH-boldénone ne sont pas récupérés dans cette même fraction. En effet, d’après la figure, ces derniers sont extraits par l’éther aussi bien en milieu alcalin qu’en milieu acide. Néanmoins, en comparant les rendements de récupération du 6β-OH- boldénone entre les fractions A2 et E2, Il apparaît mieux extrait en milieu basique (violet) c'est-à-dire dans la fraction A2. Ces résultats confirment donc la conclusion émise sur standard. A l’issue de ces deux étapes d’extraction, deux fractions « A » et « E » sont récupérés pour subir chacune l’étape de purification sur SPE SiOH par la suite. La colonne SPE SiOH n'a pas été réoptimisée sur matrice, les interférents potentiels jouant sur l'adsorption sur la phase SiOH ayant été a priori éliminés lors des 2 étapes précédentes (SPE C18 et LLE). Conclusion : Les résultats obtenus sur des échantillons d’urine blanche supplémentée par des standards de référence purs nous ont permis soit de confirmer ceux obtenus pour les étapes réalisées sur des solutions aqueuses, c’est le cas de LLE, ou bien d’infirmer ceux 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 M 1 Etiocholanolone D H EA Boldione (M 7) M 2 17a-Testostérone 5a-Androst-1-en-3b,17a diol 17a-boldénone (M 8) 5a-androstan-3b,17a-diol 17b-boldénone (M 9) 17a-estradiol 6b-O H-BO LD rendementen% A1(extraction par pentane à pH 14) A2 (extraction par éther à pH14) E1(extraction par pentane à pH 5,2) E2 (extraction par éther à pH 5,2)
  50. 50. 50 obtenus pour la SPE C18. Par conséquent, des modifications des conditions de purification/extraction ont été apportées afin de valider le protocole. Ces modifications nous ont finalement conduits à établir un protocole définitif qui sera appliqué sur des urines provenant d’animaux traités (annexe 3). III.2. APPLICATION DE LA METHODE SUR DES ECHANTILLONS URINAIRES PROVENANT D’ANIMAUX TRAITES III.2.1. PROTOCOLE SUIVI Une fois le protocole finalisé (cf. annexe 3), plusieurs séries d’urine ont été analysées parallèlement en GC-MS et GC-C-IRMS. Ces séries proviennent des veaux (0056 et 1785) qui ont reçu un traitement soit par voie orale de boldione, soit par voie intramusculaire de boldénone undécylénate. Les urines ont été récoltées avant et après administration. Des urines ont été prélevées de quelque heures (J0) à six jour après administration. Dans notre étude, seulement un seul échantillon d'urine extraite trois jours après administration de boldénone undécylénate (veau 1785) a été analysé en GC-C- IRMS. D'autres urines extraites un jour et deux jours après traitement à la boldione par voie orale ont été analysées en GC-MS. Afin d'assurer la détection et la pureté des molécules d'intérêt, nous avons décidé de supprimer l'étape de purification semi- préparative sur HPLC (N(CH3)2). III.2.2. SYNTHESE DES RESULTATS OBTENUS Pour chaque urine analysée, le rapport isotopique des métabolites de la boldénone et des stéroïdes endogènes ont été mesurées lorsque les conditions d'analyse étaient satisfaisantes (stéroïdes assez concentrés et non coélués). III.2.2.1. Intérêt de l'HPLC C18 (veau 1785) Après purification des échantillons d’urine sur SPE SiOH, les échantillons sont dérivés, puis injectés dans le cyclohexane en GC-MS. Ils ont ensuite été repris et injectés sur HPLC C18 pour être purifiés avant analyse par GC-C-IRMS. Les chromatogrammes d’ions des échantillons d’urine naturellement traités par la boldénone avant et après une HPLC C18 sont présentés dans la figure III- 16:
  51. 51. 51 Figure III-16 : Chromatogramme d’ions de l’échantillon d’urine extrait à J3 après administration de boldénone undécylénate avant et après HPLC semi –préparative C18 Dans un premier temps, nous constatons que nos molécules cibles que sont l’étiocholanolone, la 17α-testostérone et la DHEA se trouvent dans une zone où le bruit de fond est omniprésent (cf : spectre du haut). Des pics correspondants à certains composés urinaires non identifiés et des pics de colonnes sont également observés. Certains d’entre eux sont coélués avec les molécules cibles comme la DHEA. En revanche, si nous réalisons une étape de purification via l’HPLC semi-préparative, le chromatogramme obtenu pour ce même échantillon est représenté sur le spectre du bas. Sur ce chromatogramme la première remarque qui s’impose est la quasi-disparition du bruit du fond dans la zone des temps de rétention des molécules cibles. De plus, le M4 et la DHEA ne sont plus coélués (cf : figure III-16). Dans ces conditions l’échantillon est tout a fait à même d’être injecté en GC-C-IRMS pour la mesure des déviations isotopiques des analytes. 1 4 . 0 01 6 . 0 01 8 . 0 02 0 . 0 02 2 . 0 02 4 . 0 02 6 . 0 02 8 . 0 03 0 . 0 0 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 6 5 0 0 0 0 0 T i m e - - > A b u n d a n c e T I C : 0 3 0 8 1 0 0 6 . D D H E A e t i o c h o l a n o l o n e 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 6 5 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 7 5 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 8 5 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 9 5 0 0 0 0 0 T i m e - - > A b u n d a n c e T I C : 2 1 0 7 1 0 0 6 . D 1 7 a - t e s t o s t e r o n e D H E A e t i o c h o l a n o l o n e 1 4 . 0 01 6 . 0 01 8 . 0 02 0 . 0 02 2 . 0 02 4 . 0 02 6 . 0 02 8 . 0 03 0 . 0 0 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 6 5 0 0 0 0 0 T i m e - - > A b u n d a n c e T I C : 0 3 0 8 1 0 0 6 . D D H E A e t i o c h o l a n o l o n e 1 4 . 0 01 6 . 0 01 8 . 0 02 0 . 0 02 2 . 0 02 4 . 0 02 6 . 0 02 8 . 0 03 0 . 0 0 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 6 5 0 0 0 0 0 T i m e - - > A b u n d a n c e T I C : 0 3 0 8 1 0 0 6 . D D H E A e t i o c h o l a n o l o n e 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 6 5 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 7 5 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 8 5 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 9 5 0 0 0 0 0 T i m e - - > A b u n d a n c e T I C : 2 1 0 7 1 0 0 6 . D 1 7 a - t e s t o s t e r o n e D H E A e t i o c h o l a n o l o n e 1 4 . 0 01 6 . 0 01 8 . 0 02 0 . 0 02 2 . 0 02 4 . 0 02 6 . 0 02 8 . 0 03 0 . 0 0 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 6 5 0 0 0 0 0 T i m e - - > A b u n d a n c e T I C : 0 3 0 8 1 0 0 6 . D D H E A e t i o c h o l a n o l o n e
  52. 52. 52 III.2.2.2. Conséquence de l'administration de boldénone 1- Identification des stéroïdes en GC-MS (veau 0056) Les fractions d’élution récupérées lors de l’étape sur SPE SiOH pour les échantillons d’urines extraites à J1 et à J2 après traitement à la boldione par voie orale, ont été analysées directement en GC-MS après dérivation. Les chromatogrammes d’ions obtenus pour les échantillons J1 et J2 sont présentés dans les figures III-17 et III-18 : Figure III-17 : Chromatogramme d’ions obtenus après une SiOH pour l’échantillon d’urine extraite à J1 après administration de boldione. Figure III-18 : Chromatogramme d’ions obtenu après SiOH pour l’échantillon d’urine extraite à J2 après administration de boldione. 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 6 5 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 T im e --> A b u n d a n c e T I C : 0 3 0 8 1 0 0 8 . D a n d ro s t è n e d io l 1 7 a -t e s t o s t é ro n e D H E A é t io c h o la n o lo n e 1 7 . 0 01 8 . 0 01 9 . 0 02 0 . 0 02 1 . 0 02 2 . 0 02 3 . 0 02 4 . 0 02 5 . 0 02 6 . 0 02 7 . 0 02 8 . 0 02 9 . 0 03 0 . 0 03 1 . 0 0 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 6 5 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 7 5 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 8 5 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 9 5 0 0 0 0 0 1 e + 0 7 1 . 0 5 e + 0 7 1 . 1 e + 0 7 1 . 1 5 e + 0 7 T i m e - - > A b u n d a n c e T I C : 0 3 0 8 1 0 0 9 . D 1 7 a - t e s t o s t é r o n e é p i a n d r o s t é r o n e D H E A é t i o c h o l a n o l o n e
  53. 53. 53 Sur ces deux figures, aucun métabolite de la boldénone n’a pu être observé. Néanmoins, après une analyse poussée du profil GC-MS de la figure III-17, deux pics sont observés au temps de rétention de la DHEA. Ce pic qui coélue avec celui de la DHEA semblerait correspondre à un métabolite dont la structure n’est pas connue. Pour pouvoir conclure sur l’élimination rapide d’une administration orale de boldione, il aurait fallu analyser l’échantillon d’urine extraite à J0 après administration. Finalement, grâce à cette méthode développée, nous avons pu extraire un métabolite de boldénone inconnu. Il serait intéressant d’étudier ce métabolite qui a été détecté. 2- Analyse en GC-C-IRMS (veau 1785) Les fractions d'HPLC C18 semi-préparative contenant les analytes cibles préalablement dérivés sont déterminées grâce à l'analyse en GC-MS. La fraction AF'3 contient la 17α-boldénone et la 17α-testostérone. La DHEA, l’étiocholanolone et le M4 sont contenu dans la fraction AF’4.Ces fractions ont été analysées en GC-MS. Le chromatogramme de la fraction AF’4 est présenté en illustration en figure III-19: Figure III-19 : TIC de la fraction AF’4 après injection en GC-MS Après vérification de la pureté des pics chromatographiques d’intérêt, chacune des deux fractions a été analysée en GC-C-IRMS. Les résultats des déviations isotopiques sont présentés dans le tableau III-1. 2 0 . 0 0 2 1 . 0 0 2 2 . 0 0 2 3 . 0 0 2 4 . 0 0 2 5 . 0 0 2 6 . 0 0 2 7 . 0 0 2 8 . 0 0 2 9 . 0 0 2 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 1 4 0 0 0 0 0 1 6 0 0 0 0 0 1 8 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 T i m e - - > A b u n d a n c e T I C : 0 3 0 8 1 0 0 6 . D M 4 D H E A é t i c h o l a n o l o n e

×