Curso de cultivo celular BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro

Curso de cultivo celular
Curso de cultivo

BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in
vitro
Dr. Juan Carlos Munévar Niño

BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES.

LA CELULA
Las células son altamente complejas y organizadas.
Átomos moléculas polímeros biológicos
Complejos subcelulares organelos células
Cada célula tiene una apariencia compleja: localización y
forma de los organelos y cada organelo tiene una
composición consistente y similar de macromoléculas.
Ej. Células epiteliales intestinales.
Cultivos celulares: células HELA
Las células poseen un programa genético y los mecanismos para
utilizarlo.
Las células se reproducen por división, proceso en el cual una
célula madre da origen a dos células hijas

Juan Carlos Munévar N


LA CELULA
Las células adquieren y utilizan energía.
En los animales la glucosa se encuentra empacada.
En los humanos la glucosa es liberada por el hígado a la sangre
para distribuirse a las células del cuerpo. ATP
Las células efectúan reacciones bioquímicas: necesita energía.
Metabolismo
Actividades mecánicas: transporte de materiales, ensamble y
desensamble de estructuras.
Cambios dinámicos y mecánicos dentro de la célula . Desplazamiento
Las células son capaces de responder a estímulos
Receptores para hormonas, factores de crecimiento etc.
Vías de señalización en respuesta a estímulos: Actividades
metabólicas, división celular, movimiento celular, apoptosis,
envejecimiento.
Autorregulación: reparación del DNA, apoptosis,


PROCARIOTAS- EUCARIOTAS SIMILITUDES
Membrana plasmática de diseño similar

Presencia de ADN

Mecanismos de trascripción y transducción similares

Vías metabólicas compartidas: glicólisis, ciclo de krebs

Aparatos similares para la conservación de la energía química como ATP

PROTEOSOMAS

PROCARIOTAS- EUCARIOTAS DIFERENCIAS
División de la célula en núcleo y citoplasma, separadas por una envoltura nuclear que contiene un complejo de
poros
Cromosomas complejos: ADN + proteínas asociadas
Complejos organelos membranosos citoplasmáticos: RER, Aparato de Golgi,
Lisosomas, endosomas, peroxisomas, glioxisomas
Organelos citoplasmáticos especializados en la respiración aerobia
Sistema de citoesqueleto: Microfilamentos, filamentos intermedios, microtubulos
Flagelos y cilios
Endocitosis y fagocitosis
Paredes celulares que contiene celulosa
Diploidia. Meiosis


vitro
INTRODUCCION

BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro

INTRODUCCION
¿Validez de la célula cultivada como modelo de la
función fisiológica in vivo?
 Las células no expresan las
mismas propiedades in vitro que
in vivo.
 El ambiente celular se modifica:
1. Proliferación celular
2. Interacciones célula –
célula, célula – matriz
extracelular (M.E.C.)
3. La arquitectura 3D y 50 µm
heterogeneidad in vivo
4. El medio nutricional y
factores solubles
(estímulos)


 Se crea un microambiente in vitro que favorece la diseminación,
migración, y proliferación de células no especializadas
pero no favorece la expresión de funciones diferenciadas.

 LA INFLUENCIA DEL MEDIO
AMBIENTE EN UN CULTIVO
CELULAR DEPENDE DE:

1. La naturaleza del sustrato o fase.
2. La composición fisicoquímica y
fisiológica del medio de cultivo.
3. La constitución de la fase
gaseosa.
4. La temperatura de incubación.

Proveer el ambiente apropiado: adhesión al sustrato, nutrientes, factores solubles y sustrato
es fundamental para la expresión de funciones especializadas.



La regulación del fenotipo celular en cultivo esta influenciado por:

 Interacciones célula – célula
 Interacciones célula – M.E.C.
 Factores solubles (hormonas,  Afectara:
factores de crecimiento, La adhesión celular
nutrientes, iones inorgánicos) La proliferación
La diferenciación
La morfología celular
La migración celular

Proveer el ambiente apropiado: adhesión al sustrato, nutrientes, factores solubles y sustrato
es fundamental para la expresión de funciones especializadas.


Percepción y Transducción de señales; Cross-talk

Las principales vías de señalización se intercomunican


vitro
ADHESION CELULAR


Membrana plasmática

 Bicapa fosfolipídica: compartimentos, superficie para reacciones
bioquímicas esenciales.
 Integridad estructural de la célula
Control del paso de sustancias: permeabilidad selectiva
 Regula las interacciones entre las células
Reconocimiento por medios de Rc de Ag, células extrañas y alteradas.
Interfase entre le citoplasma y el ambiente externo.
 Sistema de transporte para moléculas específicas
 Efectúa transducción de señales físicas, químicas, mecánicas en
acontecimientos intracelulares.



COMPOSICION MOLECULAR Y BIOQUÍMICA

 En la membrana celular existen otras moléculas anfipáticas:
glucolípidos y colesterol.
 Los ácidos grasos insaturados la fluidez de la membrana y el
colesterol la disminuye: difusión lateral de proteínas de
membrana y movilidad celular.
 Proteínas Integrales: transmembrana que a menudo forman canales
iónicos o sirven como transportadores. Proteínas de membrana
multipaso. Receptores de membrana
Proteína de superficie: periféricas. Ubicadas sobre la cara
citoplasmática de la membrana celular, en ocasiones en la
superficie extracelular. A menudo se relacionan con el sistema de
segundos mensajeros o con el citoesqueleto.


GLUCOCALIZ
 Cubierta externa de la membrana celular.
 Constituida por carbohidratos unidos covalentemente a las proteínas
transmembranales y a los fosfolípidos de la cara externa.
 Protegen contra la interacción con proteínas inapropiadas, lesiones
químicas, físicas.
 Reconocimiento y adhesión entre células.
Neutrófilo-Endotelio
Cascada de coagulación sanguínea
Proceso Inflamatorio



ADHESION CELULAR
 Las células que provienen de tejidos sólidos crecen en MONOCAPA, después de
la disgregación necesitan anclaje para diseminarse sobre el SUSTRATO, antes
de comenzar a proliferar.
excepto las células transformadas (anclaje independientes)

 Las células en cultivo adhieren a
1. Vidrio
(carga negativa)

2. Plástico (polistireno)
(descarga eléctrica radiación ionizante)
 La adhesión celular está mediada por receptores de superficie
celular específicos para moléculas de la M.E.C.
la diseminación está precedida por la secreción de
proteoglicanos y proteínas de la M.E.C.


La superficie del vidrio o plástico puede condicionarse mediante:

 Previo crecimiento celular
PRINCIPAL REQUISITO
Provee una superficie
adecuada para la adhesión Para las células semejantes a
celular fibroblastos:
Adhesión al sustrato
 Pre - tratamiento del sustrato diseminación
Para las células epiteliales:
Moléculas de la M.E.C. Correcto contacto célula – célula
crecimiento
Colágeno,Fibronectina,laminina,
gelatina

Al lograr la adhesión al sustrato las células comienzan a crecer y posteriormente
proliferan.


MOLECULAS DE ADHESION CELULAR
TIPOS DE PROTEINAS TRANSMEMBRANALES
Interacciones célula – célula y célula M.E.C.
 Moléculas de adhesión celular (CAM’s)
(Ca2+ independientes) INTERACCIONES ENTRE
 Cadherinas CELULAS HOMOLOGAS

(Ca2+ dependientes) Proteínas interactivas

INTERACCIONES CELULA
 Integrinas. SUSTRATO
(Receptores para M.E.C.) Motivo RGD.

 Proteoglicanos INTERACCIONES CELULA SUSTRATO

(Receptores para factores de crecimiento)


 Familia de proteínas que permiten contacto célula-
célula o célula-matriz extracelular.
 Glicoproteínas
Grupo COOH unido al citoesqueleto Grupo
NH2 especificidad de unión al ligando .
 Monoméricas (Cadherinas),
 diméricas,
 heterodiméricas (integrinas).
 Uniones homofílicas (Cadherinas),
heterofílicas (integrinas)




 Funciones: desarrollo tisular, migración
celular, procesos inflamatorios e inmunológicos.

 Selectinas: Lectinas
L-selectina: Leucocitos, adhesión al
endotelio en procesos inflamatorios.
E-selectina: Endotelio, permite la unión
de neutrófilos
P-selectina: Plaquetas y endotelio.


 Súper familia de las Inmunoglobulinas
ICAM, VCAM, pueden secretarse y
anclarse a la MEC.
 Integrinas: son GP de membrana, son
heterodímeros, uniones covalentes.
La unión del ligando-integrina resulta en
reorganización del citoesqueleto,
migración o división celular, apoptosis.
 Β1 Integrinas: crecimiento, maduración,
migración, proliferación, citotoxicidad y
fagocitosis.



 Β2 Integrinas: quimiotaxis del fagocito.
Adhesión al endotelio.
 Β3 Integrinas: permiten la unión al MEC, su
ligando es colágeno o fibronectina.
 Proteoglicanos: Interactúan con las
proteínas de MEC y factores de
crecimiento.



UNIONES INTERCELULARES
 Tight junctions: (Zonula occludens)
Fusión de las membranas celulares como “cremallera”.
Previenen el movimiento de material entre las células.
 Adhering junctions: (Zonula / Macula)
- Se conserva un espacio de 20 nm entre membranas opuestas
- Ocupado por material filamentoso anclados al lado citoplásmico
de la unión (Zonula adherens)
- Desmosomas, hemidesmosomas (Macula adherens)
 Gap junctions:
Región de unión de 2 membranas opuestas, en donde se conserva un
espacio de 3 nm.
Permite el paso de iones / moléculas hidrofilicas

Las uniones intercelulares se clasifican según su forma y extensión:
Zonula (Zonula adherens, zonula occludens)
Macula (Macula occludens, macula adherens)


LA DISOCIACION ENZIMATICA DE UN TEJIDO O DE UNA MONOCAPA
digiere la M.E.C.
dominios extracelulares de proteínas transmembranales

1. LAS CELULAS EPITELIALES
Son resistentes a la disociación enzimática
Poseen fuertes uniones intercelulares
Desmosomas, uniones adherentes, uniones
estrechas
2. LAS CELULAS MESENQUIMATOSAS
Son fáciles de disociar enzimáticamente
Dependen de interacciones con la M.E.C.
Colágeno, fibronectina, entactina,
laminina, nidogéno, etc.

Las células deben volver a sintetizar las proteínas de la M.E.C. antes de adherirse o
debe incorporarse un sustrato revestido con M.E.C


CITOESQUELETO
 Las moléculas de adhesión celular están unidas a
elementos del citoesqueleto.

 Red de filamentos proteicos que presenta
funciones mecánicas;

1. Mantener la forma celular,
2. Movimiento celular,
3. Desplazamiento intracelular organélos



CITOESQUELETO
 Sus estructuras principales son:
 Microtúbulos
 Filamentos intermedios
 Microfilamentos

 Integrinas. SEÑALIZACION
Microfilamentos de ACTINA Superficie celular - Núcleo

 Cadherinas ADHERENS JUNCTIONS
Microfilamentos de ACTINA
Morfología celular

Filamentos intermedios. DESMOSOMAS
(Placa intracelular) ¿Estructural / Señalización?


MICROTUBULOS
 Se encuentran dispersos en el citoplasma,
o formando estructuras estables como
cilios, flagelos o centríolos.
 Pueden formarse y destruirse según las
necesidades de la célula.
 Tubulina, (a-tubulina y b-tubulina)
protofilamento, y cada microtúbulo consta
de 13 protofilamentos paralelos que forman
un cilindro



MICROTUBULOS
 Brindan rigidez y conservan la forma celular

 Regulan el movimiento intracelular de organelas y vesículas

 Contribuyen a formar los compartimentos intracelulares

 Constituyen el huso mitótico, responsable de organizar el
movimiento de los cromosomas durante la división celular

 Distribuyen el retículo endoplásmico y aparato de Golgi en los
lugares apropiados

 Son los elementos estructurales y generadores del movimiento
de cilios y flagelos (MOVIMIENTO CELULAR)


FILAMENTOS INTERMEDIOS
 FUNCIONES:

° brindar sostén estructural a la célula.
° resistencia tensil.
° protección celular contra las presiones y las tensiones.

 Específicos de líneas celulares. (Marcadores)

‫ق‬ Queratina (células epiteliales),
‫ق‬ Vimentina (células mesenquimatosas),
‫ق‬ Desmina (células musculares)
‫ق‬ Filamentos de la lámina nuclear (Refuerzan la membrana
nuclear)
‫ق‬ Neurofilamentos (ubicados en células nerviosas), etc.



MICROFILAMENTOS
 Filamentos delgados
(microfilamentos)

Formados por dos
cadenas de
subunidades
globulares, actina G,
enrolladas entre sí
para formar una
proteína filamentosa
o actina F.



ACTINA
 Contracción muscular, al asociarse a filamentos
de miosina y otras proteínas.

 Fagocitosis mediante la formación de seudópodos

 Citocinesis: forman el anillo contráctil que
finalmente da lugar a la separación de las
células hijas durante la mitosis

 Refuerzan la membrana plasmática, formando
justo por debajo de la misma una densa red de
filamentos conocida como cortex celular



vitro
PROLIFERACION CELULAR


CICLO CELULAR
ARN, Proteína M itosis,
Lamina Cytocinesis
H1
Abl
Cyc B/A G2 M Cyc D’s G0
CDK1 3-4 h 1 h CDK4,6
G1
ADN, S
ARN, 6-12 h ARN, Proteína
6-8 h
Proteína p53
Cyc A Cyc E pRb
CDK2 CDK2



REGULACION DEL CICLO CELULAR
1. fosforilació n CDC Daño al DNA

2. Degradació n
ciclinas Activa p53
3. C & CDK síntesis

4. Inhibició n CDK2
CDC CE p21

P
pRb
pRb

Enzimas para
E2F Paso de G1 a
síntesis DNA
S


CICLO CELULAR
Clasificación de acuerdo a la capacidad
de PROLIFERACIÓN

1. CELULAS LABILES.

2. CELULAS ESTABLES.

3. CELULAS PERMANENTES.

La capacidad de renovación celular está relacionada con su potencial de diferenciación.


vitro
DIFERENCIACION CELULAR


DIFERENCIACIÓN CELULAR

 La expresión de propiedades diferenciadas en cultivo celular a
menudo depende de la promoción de la proliferación celular.
* Necesario para propagar la línea celular
* La expansión de stocks para el laboratorio
 Condiciones para inducir diferenciación in vitro:
* Elevada densidad celular
+ Promoción de interacciones célula – célula / célula – M.E.C.
* Factores de diferenciación.

CONDICIONES REQUERIDAS PARA LA DIFERENCIACION
1. Optimizar la proliferación celular
2. Optimizar la diferenciación celular



DIFERENCIACIÓN CELULAR
 Mecanismo por el cuál una célula adquiere un
fenotipo específico.
 La morfología de una célula varia, pero el
material genético permanece intacto.
 Las células madre primordiales o Stem cells
definidas como células clonogénicas
+ capaces de auto-renovarse
+ de diferenciarse en múltiples líneas celulares según el
estímulo recibido



CELULAS MADRE
 Autorenovación ilimitada.
 Potencial de diferenciación

In situ. In vitro.
Thomson y col. 1998. Embryonic stem cells lines
derived from human blastocysts. SCIENCE.

Células vecinas
 Las células madre responden a
señales externas
Factores solubles
Stem cells: Scientific progress and future research directions. NIH, 2001


CELULAS MADRE
 TOTIPOTENCIALES: es decir, que pueden
dar lugar a todo un individuo
 PLURIPOTENCIALES: capacidad de una
célula para convertirse en todas las posibles
líneas celulares.
 MULTIPOTENCIALES: capacidad de generar
células, pero sólo del tipo celular del tejido al
que pertenecen o en donde residen



STEM CELLS

 Embrionarias
 Germinales
Embrionarias
 Adultas

Stem cells: Scientific progress and future research directions. NIH, 2001


DIFERENCIACIÓN
 El citoplasma de una célula puede contener moléculas que
controlen los genes expresados en el núcleo.
 Generar señales para la síntesis de diferentes clases de
proteínas y factores de transcripción.

Proteínas intracelulares

Destino celular Auto-renovación

Factores de transcripción
Expresión individual.

CONTROLES INTERNOS

FACTORES DE TRANSCRIPCION RELOJES

(+) cul-1 C. elegans
Ovario de Drosophila:
incs, espectrosoma (espectrinas y ciclina A) (-) CDK inhibidor p27/Kip1
Mamíferos: CSL/tal-1, Tcf/Lef.
Act. telomerasa

-Factores secretados: TGFß y Wnts
CONTROLES EXTERNOS -Interacciones célula - célula
-Integrinas y matriz extracelular

M. Fiona, y col. Out of Eden: Stem cells and their niches. Science 2000 287: (25). 1427-1430


AUTORENOVACION DIFERENCIACIÓN

MECANISMO MECANISMO
INVARIANTE REGULADO

División asimétrica División simétrica

Células Stem Progenitores Células Stem Progenitores

M. Fiona, y col. Out of Eden: Stem cells and their niches. Science 2000 287: (25). 1427-1430


IMPLICACIONES CLINICAS

Células madre Clonación:
Células madre Células embrionarias embriones
fetales y madre producidas por producidos por
adultas embrionarias técnica SCNT técnica SCNT

Obtener células Producir
madre embriones para
Obtener células
Obtener células genéticamente
madre para la implantarlos in
madre para la compatibles con un
investigación y utero
investigación y receptor para la
Uso terapia
terapia
investigación y
terapia

Células de un
Células de blastocisto Cigoto
embriones o desarrollado de un enucleado con
Aislar células núcleo de una
estado de cigoto enucleado
Fuente madre de tejidos
blastocisto de suplementado con célula somática
fetales y adultos del donante
fertilización in un núcleo de una
vitro célula somática del (SCNT)
pcte (SCNT)

Células Células
Embriones
producidas en producidas en Células producidas
derivados de un
cultivo para cultivo para en cultivo para
Resultado cigoto,
repoblar un tejido repoblar un tejido repoblar un tejido
implantado y
enfermo o enfermo o enfermo o lesionado
evaluado
lesionado lesionado



DESDIFERENCIACION
La incapacidad de las líneas celulares de expresar el
fenotipo in vivo de las células de donde derivan:
Las células diferenciadas pierden
sus propiedades especializadas
in vitro. •La continua proliferación
 Las células indiferenciadas de la
selecciona los precursores
misma línea originan células indiferenciados.
terminales diferenciadas con •En ausencia de un
capacidad proliferativa reducida.
 La ausencia de estímulos
microambiente inductor
apropiados causan desadaptación. adecuado no se
diferencian.



DESDIFERENCIACION
 Desdiferenciación
Pérdida irreversible de las propiedades especializadas de la célula
Hepatocito pierde enzimas características (aminotransferasas) y no almacena
glicógeno ni secreta proteínas séricas.

 Desadaptación
Síntesis de productos específicos o la expresión de funciones especializadas
reguladas pueden reinducirse si se crean las condiciones adecuadas.
Presencia de una matriz de colágeno induce la tirosina aminotransferasa en
hepatocitos
El Matrigel estabiliza el fenotipo diferenciado de los hepatocitos.

 Selección.
Establecer las condiciones adecuadas para favorecer la proliferación de un tipo
celular específico.
Incapacidad de expresar las propiedades de los hepatocitos por crecimiento de
fibroblastos o endotelio Juan Carlos Munévar N


vitro
METABOLISMO ENERGETICO


METABOLISMO ENERGETICO
La mayoría de los medios de cultivo contienen 4 a 20 mM de glucosa, utilizado como
la principal fuente de carbono para la glicólisis.
genera ácido láctico como producto final.

 En condiciones normales de cultivo
1. Oxígeno atmosférico
2. Cultivo sumergido

 En ausencia de un transportador apropiado (hemoglobina) que
mantenga la tensión de O2
Se generan ROS tóxicos para la célula

El O2 se conserva a niveles atmosféricos, generando
condiciones anaeróbicas y la glicólisis para el metabolismo
energético.


El ciclo del ácido cítrico permanece activo

 Los aminoácidos
Oxidación de glutamato por la
Glutamina; Pueden utilizarse glutaminasa.
Entrada en el ciclo de Krebs por
como fuente de carbono transaminación a 2- oxoglutarato

La desaminación de la glutamina produce amoniaco
tóxico para la célula,
limitando el crecimiento celular

 El uso de dipéptidos (glutamil-alanina / glutamil–glicina)
Minimiza la producción de amoníaco
Es más estable en el medio de cultivo.



SENESCENCIA
 Las células normales tienen un número limitado de mitosis
Las líneas celulares derivadas de tejidos normales mueren después de
un número limitado de divisiones

 Evento determinado genéticamente:
SENESCENCIA
Determinado por la incapacidad de replicarse las secuencias
terminales del ADN en el TELOMERO en cada división celular
Acortamiento progresivo del TELOMERO
Finalmente la célula no puede dividirse

EXCEPCIONES:
1. LAS CELULAS GERMINALES
2. LAS CELULAS MADRE (STEM CELLS) Actividad Telomerasa +
3. LAS CELULAS NEOPLASICAS.

 Los telómeros representan secuencias repetitivas de ADN
que se encuentran en los extremos de los cromosomas.

 Humanos ATTAGGG
 Estabilidad a los cromosomas
 “Antipegajoso"

 TELOMERASA
Ribonucleoproteína
 Función:
Síntesis y adición de secuencias
teloméricas.


SENESCENCIA


vitro
CONCLUSIONES


CONCLUSIONES
Trabajar en condiciones estándar (componentes celulares)
Células finitas
Líneas celulares de proliferación continúa.
Capacidad de expresar marcadores de diferenciación celular bajo la
influencia de condiciones inducidas puede significar:
Las células cultivadas son maduras
Requieren inducción para sintetizar proteínas especializadas

Las Stem cells o células precursoras.
Proliferan indefinidamente permaneciendo indiferenciadas hasta aplicar
las condiciones inductoras adecuadas para adquirir un fenotipo especifico
 En un cultivo celular se mantiene un equilibrio entre
Células madre multipotentes Condiciones
Células precursoras comprometidas pero indiferenciadas. ambientales
Células maduras diferenciadas



CONCLUSIONES
 Subcultivos en serie a bajas densidades celulares
Promueven la proliferación celular
Restringen la diferenciación celular.
 Subcultivos en serie a elevadas densidades celulares, < [suero]°
Promueven la diferenciación celular
Inhiben la proliferación celular.

 La fuente del cultivo determina los componentes celulares presentes:
Embrión Células madre y precursoras AUTORENOVACION
Tejidos Células lábiles / estables RENOVACION LIMITADA
Células precursoras comprometidas
LA IDENTIDAD DE LAS CELULAS EN CULTIVO DEPENDE DE:
Línea celular in vivo
(hepatocitos, epidermis, cartílago)
La posición dentro de la línea celular
(Stem cell, célula precursora, célula madura)


CONCLUSIONES
LAS CELULAS TRANSFORMADAS: (Neoplásicas)
Hepatoma (rata)
Proliferan in vitro
Expresan aspectos de diferenciación.

 A mayor similitud con células de fenotipo normal
Mayor grado de diferenciación inhibirá la proliferación

 No es probable que las células se transdiferencien
Posiblemente cambian de posición en la línea celular. (reversiblemente)

EL ÉXITO EN EL MANEJO DE LOS PROTOCOLOS DE CULTIVO CELULAR
DEPENDE EN GRAN PARTE DE LA COMPRENSION DE LA BIOLOGIA DE
LAS CELULAS ANIMALES in vitro.


¡GRACIAS!

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