50 ans de systèmes dispersés, de la naissance des liposomes aux nanotechnologies : objectifs atteints et chemins restants.

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50 ans de systèmes dispersés, de la naissance des liposomes aux nanotechnologies : objectifs atteints et chemins restants.

  1. 1. 50 ans de systèmes dispersés, de la naissance desliposomes aux nanotechnologies : objectifs atteints et chemins restants. Auteurs : N. Bernard ; A. Chan ; G. de la Frégonnère ; C. Téofilo Tuteur : S. Bourgeois Soutenu le vendredi 21 Décembre 2012
  2. 2. Table des matières1 Introduction ..................................................................................................................................... 42 L’intérêt de vectoriser et définitions ............................................................................................... 43 Historique et attentes ..................................................................................................................... 7 3.1 Historique des nanoparticules (4) ........................................................................................... 7 3.2 Les générations de vecteurs .................................................................................................. 114 Exemples de nanomédicaments (existants et futurs) ................................................................... 17 4.1 Les antifongiques (13) ........................................................................................................... 19 4.2 Anticancéreux (15) ................................................................................................................ 20 4.3 Les nanoparticules en imagerie médicale (18) ...................................................................... 225 Les méthodes de préparation des systèmes d’encapsulation ...................................................... 24 5.1 Préparation des liposomes (19) (20) ..................................................................................... 24 5.2 Les méthodes de préparation des nanoparticules (21) (22) ................................................. 29 5.3 Scale-up (23) .......................................................................................................................... 34 5.4 Méthodes de préparation utilisant des monomères ............................................................ 36 5.5 Nouveau procédé de fabrication de nanocapsules en ligne sur membranes (24)................ 386 Les limites des systèmes nano particulaires.................................................................................. 39 6.1 Les limites physiologiques (25).............................................................................................. 39 6.2 Les limites en santé publique ................................................................................................ 397 Conclusion ..................................................................................................................................... 428 Bibliographie.................................................................................................................................. 43 2 Master D2P
  3. 3. Figure 1 : Evolution de la concentration plasmatique du principe actif en fonction du temps avec ousans vectorisation. ................................................................................................................................... 6Figure 2 : Paul Ehrlich ............................................................................................................................ 8Figure 3 : Schéma du principe de préparation de nanoparticules dans larticle de Birrenbach, 1976.Micelles polymérisées et leur utilisation comme adjuvants en immunologie. ......................................... 9Figure 4 : Structure d’un liposome. ....................................................................................................... 12Figure 5 : Structure d’une nanosphère. ................................................................................................. 12Figure 6 : Structure d’une nanocapsule. ................................................................................................ 13Figure 7 : Modèle théorique traduisant les interactions entre une protéine et un substrat hydrophobe(par exemple surface de nanoparticules) recouvert de chaine de POE. A : Attraction hydrophobe entrela protéine et le substrat hydrophobe ; B : Attraction de Van Der Waals entre la protéine et la surfacehydrophobe ; C : Attraction de Van Der Waals entre la protéine et les chaînes de POE ; D : Répulsionstérique résultant de la densité, de l’épaisseur et de la flexibilité des chaînes de POE présents à lasurface du substrat. ............................................................................................................................... 15Figure 8 : Représentation schématique de l’adressage moléculaire d’un vecteur à une cellule ciblegrâce à un ligand de reconnaissance. ................................................................................................... 16Figure 10 : Liste des AMM Liposomes et Micelle. ................................................................................. 17Figure 11 : Listes des AMM, Autres nanosystémes de délivrance. ........................................................ 18Figure 12 : Ambisome® ........................................................................................................................ 20Figure 13 : Daunoxome®....................................................................................................................... 21Figure 14 : Doxil® ................................................................................................................................. 21Figure 15 : Particule d’oxyde de fer enrobée de dextrane. .................................................................... 22Figure 16 : Pharmacocinétique en fonction de la taille des particules. ................................................. 23Figure 17: Les différentes classes de liposomes..................................................................................... 24Figure 18: Exemple d’un schéma de préparation de MLV .................................................................... 24Figure 19: Préparation de SUV par sonication ..................................................................................... 25Figure 20: Méthode de fabrication de liposomes par injection déthanol ou déther ............................ 26Figure 21: Schéma dune presse de French ........................................................................................... 27Figure 22 : Schéma du processus de microfluidisation .......................................................................... 27Figure 23 : Tableau récapitulatif des méthodes de préparation de liposomes ...................................... 28Figure 22 : Méthode émulsification-évaporation de solvant.................................................................. 29Figure 23 : Méthode de nanoprécipitation ............................................................................................. 30Figure 24 : Salting out ou relargage ...................................................................................................... 31Figure 25 : Méthode d’émulsification-diffusion. ................................................................................... 32Figure 28 : Tableau récapitulatif des méthodes de fabrication des nanoparticules ............................. 33Figure 26 : Proposition de scale-up utilisant la méthode d’émulsification diffusion de solvant ........... 34Figure 27 : Proposition de scale-up utilisant la méthode de nanoprécipitation .................................... 35Figure 28 : polymérisation interfaciale .................................................................................................. 36Figure 29 : Formation de l’oligo-radical en phase aqueuse.................................................................. 37Figure 30 : méthode par polymérisation en suspension ......................................................................... 37Figure 31 : Méthode d’industrialisation sur membrane ........................................................................ 38Figure 33 : Pénétration cutanée de nanoparticules ............................................................................... 41Figure 32 : Relation entre pénétration et taille particulaire. ................................................................. 41 3 Master D2P
  4. 4. 1 Introduction A loccasion du 50ème anniversaire de lIPIL c’est le moment de réfléchir sur les progrèsréalisés dans le domaine des nanotechnologies en pharmacie et notamment sur lencapsulation et lavectorisation de principes actifs (1).Les nanotechnologies intéressent particulièrement lacommunauté biomédicale, en raison des nombreuses applications possibles à venir (thérapiegénique, vectorisation de principes actifs, imagerie médicale...). Des efforts multidisciplinaires ontpermis de réaliser les premiers pas en ce sens et de réaliser de nombreux progrès. (2) En ce qui concerne le domaine de la vectorisation, la conception de nanoparticules capables detransporter des principes actifs dans l’organisme et de les libérer de manière spécifique au niveau dusite d’action permet d’augmenter l’activité thérapeutique et de réduire la toxicité de nombreuxmédicaments. Cette vectorisation permettrait également de faciliter labsorption de principes actifsprésentant des caractéristiques physico-chimiques peu favorables au passage des nombreusesbarrières cellulaires (hydrophilie, hauts poids moléculaires, etc.). Ces « nanovecteurs » sont capables également de protéger la molécule active de ladégradation par les enzymes de l’organisme, de l’adresser sélectivement vers le tissu ou la cellulecible et d’en contrôler la libération (amélioration de l’activité, réduction de la toxicité). Plusspécifiques que les formulations pharmaceutiques traditionnelles, les vecteurs colloïdaux permettentde concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la lutte contre des maladies sévères :cancers, infections intracellulaires, maladies métaboliques ou neurodégénératives, etc. Extrêmement modulables, ces nanovecteurs restent néanmoins définis par leur taille compriseentre 10 et 1000 nm. Il existe actuellement une grande variété de vecteurs ayant des compositions etdes structures très diverses (micelles, liposomes, nanoparticules polymériques, nanoparticuleslipidiques, dendrimères, nanoparticules inorganiques, etc.). Ces systèmes sont principalementadaptés à l’encapsulation de principes actifs lipophiles l’encapsulation de molécules hydrophiles avecde bons rendements restant difficile à obtenir. Les procédés de fabrication de ces nanovecteursimpliquent généralement l’utilisation de grandes quantités de solvants organiques, des polymères oudes méthodes hautement énergétiques. Enfin nous verrons quelles sont les techniques de préparation et dindustrialisation ainsi queles limites techniques et physiologiques.2 L’intérêt de vectoriser et définitions 4 Master D2P
  5. 5. 2.1.1.1 Pourquoi vectoriser ? De nombreux principes actifs présentent des caractéristiques physico-chimiques (hydrophilie,poid moléculaire, etc.) peu favorables au passage des barrières cellulaires, physico-chimiques etbiologiques qui séparent le site d’administration du médicament de son site d’action. Ces principesactifs sont donc mal absorbés, souvent très rapidement dégradés, métabolisés ou éliminés et doncincapables d’atteindre leur cible au niveau tissulaire ou cellulaire. On doit donc administrer des dosesimportantes de médicament pour qu’une petite proportion atteigne finalement sa cible d’action. Ilen découle une moindre performance thérapeutique et des effets secondaires, car les cellules sainessubissent parfois autant que les cellules malades les conséquences de l’administration dumédicament. C’est particulièrement le cas dans le traitement des cancers, de certaines maladiesinfectieuses ou de pathologies d’origine génétique entraînant un dysfonctionnement précis dansl’organisme. Les nanomédicaments visent à contourner ces obstacles pour rendre les traitementsplus spécifiques, plus efficaces et moins toxiques. Les principaux bénéfices de ce concept sonténumérés ci-dessous :  Protection du principe actif : Certaines molécules biologiquement actives sont physico-chimiquement et/oubiochimiquement instables dans l’environnement biologique (pH, enzymes, protéines). Leurencapsulation dans des nanoparticules permet une protection contre l’inactivation chimique,enzymatique ou immunologique. Ainsi, les caractéristiques pharmacocinétiques du médicament sontoptimisées. Cela est particulièrement intéressant pour les principes actifs de faible durée de vie invivo.  Réduction des effets toxiques potentiels du médicament : De nombreuses thérapies par voie intraveineuse, en particulier le traitement du cancer,utilisent des molécules toxiques. Pour assurer l’efficacité thérapeutique d’un principe actif, il estnéanmoins nécessaire d’injecter une quantité importante de médicament et/ou de répéter l’injectionpour obtenir l’efficacité souhaitée, ce qui peut provoquer des effets indésirables liés à la toxicité dela molécule. La libération progressive et parfois ciblée permet une diminution du nombre d’injectionset améliore le confort du patient.  Amélioration du franchissement des barrières : 5 Master D2P
  6. 6. La vectorisation entraine une augmentation de la pénétration tissulaire ou cellulaire duprincipe actif inaccessible par simple diffusion.  Obtention de profils pharmacocinétiques plus favorables : Les fluctuations de concentration en principe actif dans le sang peuvent être réduites encontrôlant la libération de celui-ci, ce qui permet de la maintenir dans la zone d’efficacitéthérapeutique. Figure 1 : Evolution de la concentration plasmatique du principe actif en fonction du temps avec ou sans vectorisation. En effet, la concentration en médicament doit dépasser le niveau minimum d’efficacité, touten restant inférieure au niveau toxique. Le contrôle de la vitesse de libération du principe actifencapsulé dans un vecteur particulier peut alors permettre d’assurer une concentration quasiconstante, comprise entre ces deux niveaux, pendant une durée bien supérieure à celle obtenueavec une administration classique. Le principe actif encapsulé dans un vecteur pourra être libéréprogressivement par dégradation de la particule sous l’effet de certains facteurs précis pH,température, présence de certaines enzymes, magnétisme) ou par diffusion du principe actif. Cecipermet de maintenir la concentration en principe actif dans la fourchette souhaitée.  Sélectivité de la libération : Dans certaines conditions, la vectorisation peut apporter un ciblage du médicament grâce àdes ligands à la surface des vecteurs qui sont capables d’interagir avec des cellules cibles (3). Celapermet à la fois de limiter la biodistribution du médicament au sein de l’organisme et ainsi de ledétourner des tissus sains pour lesquels il est toxique. Ainsi, la sélectivité et la spécificité de cesparticules vis-à-vis de la cible peuvent permettre d’améliorer l’efficacité du principe actif. 6 Master D2P
  7. 7. 2.1.1.2 Quelques définitions… - Nanotechnologie : l’ensemble des techniques ayant pour but de concevoir, fabriquer etutiliser des structures à l’échelle du nanomètre (milliardième de mètre). - La vectorisation : La vectorisation est une technique visant à moduler voire à totalementmaîtriser la distribution dune substance, en lassociant à un système approprié appelé vecteur. Ainsi,la distribution in vivo est rendue aussi indépendante que possible des propriétés de la substance elle-même, pour se soumettre à celles du vecteur. - Liposomes : structures vésiculaires constituées de bicouches phospholipidiques quidélimitent une cavité centrale aqueuse. - Nanosphere (NS) : structure continue, taille comprise entre 10 et 1000 nm, le principe actifest piegé ou adsorbé. - Nanocapsules (NC) : enveloppe externe délimitant un compartiment central aqueux ouhuilieux taille comprise entre 10 et 1000 nm, le principe actif est encapsulé ou adsorbé. - Les micelles : les micelles sont des auto-assemblages de molécules amphiphiles qui formentdes structures colloidales de type cœur-coquille en milieu aqueux. - Les nanoparticules polyméres : les nanoparticules polyméres sont des systèmes colloïdauxdont la taille est comprise entre 10 et 1000 nm, à base de polymères généralement biodégradables,capables de retenir une ou plusieurs molécules actives par séquestration et/ou adsorption. - Les nanoparticules lipidiques : ces nanoparticules sont constituées d’un cœur lipidique,généralement à base de triglycérides biodégradables, bioassimilables et non toxiques. - Les nanoparticules inorganiques : très répandues, ce sont les nanoparticules métalliquesd’or ou d’argent, les nanoparticules magnétiques, les nanoparticules de silice et les nano-cristauxsemi-conducteurs, les nano-cristaux semi-conducteurs fluorescents, plus connus sous leurdénomination anglaise « Quantum dots » (boîtes quantiques en français).3 Historique et attentes3.1 Historique des nanoparticules (4) 7 Master D2P
  8. 8. Le concept de nanoparticules et de ciblage de médicaments a été inspiré par une visite de l’undes géants de la science, Paul Ehrlich, à l’Opéra de Carl Maria von Weber (1954) qui a joué un rôlecentral. Paul Ehrlich, qui avait longtemps travaillé sur la coloration de bactéries et tissus, a penséaprès avoir assisté à cet opéra que ce concept de distribution ciblée pourrait énormément améliorerla pharmacothérapie. Il a appelé ce système de distribution « Magic Bullets », le concept denanoparticules et de ciblage de médicaments est né. Figure 2 : Paul Ehrlich Les années 1950 et 1960 ont été caractérisées par dextraordinaires évolutions dans ledomaine pharmaceutique. La pharmacocinétique a fait dénormes progrès et les formes à libérationmodifiées ont été développées et sont devenues une préoccupation majeure. Le professeur PeterPaul Speiser (d’ETH, Institut Fédéral Suisse de Technologie, à Zürich) a été l’un des pionniers dans cedomaine. La stratégie de libération retardée et contrôlée de Speiser a mis en avant des systèmes delibération miniaturisés. Son groupe de recherche a étudié dans un premier temps les propriétés desexcipients de la famille des polyacryliques pour l’administration orale (1969 et 1970), puis leurcapacité à former des microcapsules (1973). A la fin des années 1960 ils ont développé les premièresnanoparticules dans le but de vectoriser des médicaments et pour des vaccins Bien que son objectif final fût une libération prolongée du médicament à partir denanocapsules qui seraient capables de circuler dans le sang après une injection intraveineuse, Speisers’est concentré sur le développement de nanoparticules à des fins de vaccination. Les vaccins contrele tétanos, la diphtérie et dautres infections nécessitent plusieurs injections pour quel’augmentation des niveaux danticorps dans l’organisme soit suffisante pour la protection. Onespérait quen raison des propriétés de libération prolongée de nanocapsules ou de nanoparticules,une constante stimulation immunitaire serait atteinte après une seule injection. Gerd Birrenbach était le premier étudiant diplômé de Speiser à étudier sur ce concept, à partirde 1969. L’étude a mis en place lemploi dun processus quils ont appelé «polymérisation micellaire»(Figure 3). Les réponses des anticorps obtenues avec cette préparation ont été très prometteuses. 8 Master D2P
  9. 9. Néanmoins, ces préparations nont jamais été développées, probablement en raison des quantitésélevées de la phase organique et des tensio-actifs nécessaires, ainsi que la haute toxicité demonomère dacrylamide utilisé dans la préparation. Plus tard il a été constaté que ce processus napas donné de nanocapsules en forme de coquille comme on le pensait plus tôt, mais plutôt desnanoparticules monolithiques avec une matrice continue (1981, 1983). Schéma du principe de préparation de nanoparticules dans larticle de Birrenbach,Figure 3 :1976. Micelles polymérisées et leur utilisation comme adjuvants en immunologie. Helmut Kopf a été le deuxième étudiant diplômé de Speiser à travailler sur le même processus.Toutefois, sa tâche était dobtenir les premières nanoparticules pour obtenir un système delibération prolongée par voie intraveineuse (1975,1976, 1977). Le troisième étudiant diplômé de Speiser a fait sa thèse sur les nanoparticules, son sujetconsistait à encapsuler ou lier le virus entier inactivé ou les sous-unités d’antigènes du virus grippalaux nanoparticules. Car les grandes quantités de tensioactifs dans le dernier processus auraientdétruit le virus grippal. Il a employé un autre procédé, la polymérisation en émulsion oupolymérisation hétérogène en milieu aqueux. Une bonne protection a été obtenue lorsque les virusont été ajoutés après la polymérisation. Le développement industriel de la préparation de cettenanoparticule pour la vaccination humaine a été arrêté lorsque la Société Sandoz a quitté le domainedes vaccins dans les années 1980. Richard Oppenheim de Melbourne, en Australie, a rejoint le groupe du professeur Speiser en1974 en tant que chercheur invité pour environ un an et, par conséquent, est également devenu lun 9 Master D2P
  10. 10. des pionniers dans les nanoparticules. Après son retour à Melbourne, Oppenheim a poursuivi letravail quil a commencé à Zürich et a développé des particules de gélatine et dalbumine (formationde microcapsules) (1978). Près de 20 ans plus tard, le processus a été amélioré (2000) et utilisé pourle transport à travers les membranes cellulaires des oligonucléotides, les acides nucléiquespeptidiques, et même des gènes. Un autre pionnier des nanoparticules, Patrick Couvreur a rejoint le groupe de professeurSpeiser pour quelques mois en 1976. Il a travaillé sur le procédé développé par Birrenbach et Speiser,et après son retour à Bruxelles, a trouvé l’effet lysosomotropique des nanoparticules (1977). Un autre type de nanoparticules a été développé dans le Département de ScienceRadiologique à l’Institut Médical Johns Hopkins de Baltimore. Ce groupe a mis en place un processusdans lequel lalbumine a été dissoute dans leau, puis cette solution a été émulsionnée dans de lhuilede graine de coton permettant la formation de nanoparticules. Vers la fin des années 1980, la définition des nanoparticules pour lindustrie pharmaceutiqueet médicale a été développée. Oppenheim (1981) et, plus globalement, Kreuter (1983,1994) aprésenté une définition qui plus tard a été adoptée par l’Encyclopédie de technologiepharmaceutique et lEncyclopédie de la nanotechnologie. Lavantage de cette définition est que lesnanoparticules pourraient être définies indépendamment de leur structure respective et de laméthode de production. Définition des nanoparticules: Les nanoparticules utilisées à des fins pharmaceutiques sontdéfinies par lEncyclopédie de la Technologie Pharmaceutique comme des particules colloïdalessolides ayant une taille de 1 à 1000 nm (1 µm). Elles sont constituées de matériauxmacromoléculaires et leurs utilisations thérapeutiques peuvent être des vecteurs de médicamentsdans lesquels le principe actif (médicament ou substance biologiquement active) est dissous, piégé ouencapsulé, ou dans lesquels le principe actif est adsorbé ou attaché. Lapplication la plus importante des nanoparticules est leur emploi en cancérologie. Dansplusieurs cas, une efficacité améliorée de façon significative et, dans d’autres, une réduction deseffets secondaires ont tous deux été observés. La possibilité de tirer parti de laugmentation de laperméabilité et de la rétention avait déjà été décrite auparavant. Plus tard, il a été démontré quenplus des médicaments anticancéreux, les nanoparticules ont permis une amélioration dans ladélivrance des médicaments anti-infectieux ainsi que des acides nucléiques, pour le traitement duSIDA. Une des applications les plus prometteuse des nanoparticules est leur utilisation pour letransport de médicaments à travers la barrière hémato-encéphalique. Cette barrière constitue unobstacle insurmontable pour un grand nombre de médicaments, y compris les médicaments 10 Master D2P
  11. 11. anticancéreux, antibiotiques, et une variété des actifs pour le système nerveux central, en particulierdes médicaments à base de neuropeptides. Des nanoparticules pour la libération oculaire ont aussi été développées. Les solutionsophtalmiques nont pas une biodisponibilité suffisante, autour de 1% et au maximum 5%. Afindaméliorer la biodisponibilité de celles-ci, un des médicaments ophtalmiques les plus importants, lapilocarpine, a été liée à des nanoparticules, ce qui a amélioré sa biodisponibilité. Le développement des nanoparticules liées de manière covalente aux chaînes de poly éthylèneglycol (PEG) a été très important parce quelles prolongent significativement leur présence dans lacirculation sanguine et réduisent leur dégradation par le foie. Les nanoparticules pour les applications pharmaceutiques et médicales sont autour de nousmaintenant. Il y a de nombreux rapports et études menées chaque année, et leur nombre augmentetoujours. Le premier médicament contenant des nanoparticules commercialisé était l’Abraxane,(nanoparticules de sérum dalbumine humaine, le principe actif était le paclitaxel). Il est apparu sur lemarché en 2005. Les nanoparticules à des fins de diagnostic sont maintenant commercialisées depuisplus de 15 ans.3.2 Les générations de vecteurs En 1986 Benoît et al. décrivent 3 générations de vecteurs classés selon leur taille, la cibleenvisagée et le mécanisme de ciblage. Au cours de ces dernières années, le développement desvecteurs de médicaments a connu un essor considérable et un nouveau concept de classification aété mis au point (5). Il concerne les systèmes colloïdaux de taille submicronique. Les vecteurs sonttoujours classés en trois générations, mais en fonction de leur biodistribution in vivo.3.2.1 Vecteurs de première génération : les vecteurs hépato-spléniques Les vecteurs de la première génération sont des systèmes colloïdaux développés spécialementen vue de leur utilisation thérapeutique. Ces systèmes sont classés selon la nature des éléments quiles constituent et leur structure. On distingue ainsi les liposomes, les nanosphères et lesnanocapsules. Après administration intraveineuse, les opsonines, des protéines cationiques plasmatiques,s’adsorbent rapidement à la surface de ces vecteurs particulaires qui présentent généralement ensurface une hydrophobie et une charge de surface négative. Cette opsonisation favorise leur capturepar les organes du SPM (système des phagocytes-mononucléés) comme le foie, la rate, le rein et lamoelle osseuse. Ces vecteurs sont réservés pour le traitement de certaines infections du SPM, des 11 Master D2P
  12. 12. métastases hépatiques, de l’hépatocarcinome, de la leishmaniose viscérale, des maladies de Pompeet de Gaucher, etc.3.2.1.1 Les liposomes Figure 4 : Structure d’un liposome. Les liposomes possèdent une structure vésiculaire constituée de bicouches phospholipidiquesqui délimitent une cavité centrale aqueuse (figure 4). Leurs diamètres se situent dans l’intervalle20nm et 1µm. Il s’agit du système de vectorisation le plus étudié et le premier apparu il y a une quarantained’années sur le marché (6). Ils peuvent véhiculer des principes actifs de nature hydrophile, sousforme dissoute dans la phase centrale, ou de nature hydrophobe par insertion dans la bicouche. Lesliposomes possèdent une bonne biocompatibilité en raison des matières premières qui lescomposent (phospolipides naturels, stérols, glycérophospholipides…) et peuvent se comportercomme des formes médicamenteuses à libération contrôlée. Cependant, ces structures vésiculairessont instables chimiquement (oxydation et hydrolyse des phosphololipides) et physiquement(agrégation, fusion et perte de contenu).3.2.1.2 Les nanosphères Figure 5 : Structure d’une nanosphère. Les nanosphères sont des structures matricielles, de forme sphérique, constituées depolymères de préférence biodégradables (figure 5). Les premières nanosphères ont été développéesen 1976 par Birrenbach et Spieser (7) en utilisant le polyacrilamide réticulé, un polymère non 12 Master D2P
  13. 13. biodégradable. Par la suite, les systèmes dégradables, à base de PACA, ont été développés parCouvreur et al. dès 1979 (8). Dans le cas des nanosphères, le principe actif est soit incorporé à l’intérieur du réseaupolymère durant la formation des nanosphères, soit adsorbé à la surface par l’intermédiaire deliaisons de type hydrophobe, électrostatique ou covalente. Il est libéré par simple diffusion ou à lasuite de la dégradation du polymère dans l’organisme.3.2.1.3 Les nanocapsules Figure 6 : Structure d’une nanocapsule. Les nanocapsules (NC) (9) sont des structures réservoires et sphériques de taille compriseentre 10 et 1000nm. Elles sont constituées d’un cœur généralement huileux entouré par une minceparoi de polymère dont l’épaisseur n’excède pas quelques nanomètres. Le principe actif estgénéralement dissous dans le cœur huileux, mais, peut être adsorbé à la surface des nanocapsules.Des nanocapsules à contenu aqueux permettant l’encapsulation de principes actifs hydrophiles.fontaussi l’objet de nombreuses études.3.2.2 Vecteurs de deuxième génération : les vecteurs furtifs3.2.2.1 Principe La modification de la distribution naturelle des vecteurs de première génération vers dautresorganes que le foie et la rate peut être obtenue avec les vecteurs dits de deuxième génération. Cesont des vecteurs colloïdaux recouverts d’agents de furtivité, ce qui leur permet d’échapper à lacapture par les cellules du système immunitaire en esquivant la fixation des opsonines. La grandemajorité des agents de furtivité utilisés pour créer une couche protectrice autour des transporteurs,sont des polymères hydrophiles et flexibles. Les PEG (polyéthylènes glycol), ou les POE(polyoxyéthylènes), sont les plus couramment utilisés car ils ont l’avantage d’être biocompatibles, 13 Master D2P
  14. 14. solubles en milieu aqueux, non toxiques et ont en outre une faible immunogénicité et antigénicité. Ilssont de plus autorisés dans les formes injectables chez l’homme par la FDA (« Food and DrugAdministration »). Les poloxamères et poloxamines sont également utilisés. L’utilisation depolymères saccharidiques de type dextrane pour augmenter la furtivité des particules a égalementété rapportée. L’utilisation d’agents de furtivité permet à ces vecteurs d’avoir un temps de séjour dans lacirculation sanguine suffisamment important pour relarguer lentement un agent thérapeutique dansle sang, ou pour qu’il se produise une accumulation passive au sein des tissus pour lesquelsl’endothélium vasculaire est discontinu (comme les zones d’angiogénèse). Ces nanovecteurs sontainsi capables de tirer profit de l’effet « enhanced permeability and retention » (EPR), qui favorisel’accumulation des nano-objets et leur rétention au niveau des tissus cancéreux. Comme au niveaud’une tumeur ou d’une infection l’endothélium des vaisseaux sanguins est endommagé et non jointif,sa perméabilité est augmentée. Les vecteurs de deuxième génération ont ainsi une probabilitéimportante de le traverser et de s’accumuler dans ces zones malades où il est libéré. Ce type devectorisation est nommé vectorisation passive.3.2.2.2 Mécanisme Les protéines sont des macromolécules amphiphiles composées d’acides aminés. La fonctionhydrophile et la charge des protéines sont les facteurs principaux influençant leur adsorption sur dessurfaces hydrophobes. La modification de la surface hydrophobe des particules est une étapeimportante pour diminuer leur accumulation dans la sphère hépatique et prolonger leur temps decirculation dans le sang. Pour diminuer les interactions hydrophobes et électrostatiques entre les protéines et lesparticules on dépose à la surface des particules une couche hydrophile, neutre qui joue le rôle debarrière stérique qui masque l’hydrophobie et les charges de surface (10) et rend les particuleshydrophobe « invisibles » au SPM (« stealth » effet = furtivité) (11) (figure 7). 14 Master D2P
  15. 15. Modèle théorique traduisant les interactions entre une protéine et un substrat Figure 7 :hydrophobe (par exemple surface de nanoparticules) recouvert de chaine de POE. (10) A : Attraction hydrophobe entre la protéine et le substrat hydrophobe ; B : Attraction de Van Der Waals entre la protéine et la surface hydrophobe ; C : Attraction de Van Der Waalsentre la protéine et les chaînes de POE ; D : Répulsion stérique résultant de la densité, de l’épaisseur et de la flexibilité des chaînes de POE présents à la surface du substrat. Les nombreuses études menées montrent que les conditions de répulsion sont remplieslorsque la somme des énergies attractives (Van Der Waals, électrostatiques, hydrophobes et liaisonshydrogènes de surface) est plus petite que la somme des énergies répulsives (entropie des chaînes eténergie libre d’hydratation) dues au mouvement des chaînes de polymère et des molécules desolvant.3.2.3 Vecteurs de troisième génération : les vecteurs à reconnaissance moléculaire Les vecteurs de 2ème génération permettent de contrôler la libération du principe actif, dediminuer le nombre de prises en prolongeant la durée de vie du médicament. Cependant, le ciblagespécifique reste difficile à réaliser avec ce type de vecteurs. Les vecteurs de 3ème génération ont étédéveloppés dans l’optique de mettre au point des nanoparticules capables de véhiculer le principeactif jusqu’au site d’action désiré. Ce concept permet de mettre en place, de façon physique ouchimique, un traitement ciblé avec les notions combinées de furtivité et de ciblage. Il a été conçuplus spécifiquement pour traiter les cellules cancéreuses ou infectées qui ont à leur surface desrécepteurs spécifiques hyper-exprimés. En effet pour traiter ces pathologies, il est nécessaired’utiliser des médicaments relativement toxiques et donc de contrôler les quantités administrées.Ainsi, la troisième génération de nanoparticules pour le vivant se caractérise par la présence d’unebarrière stérique associée à l’ajout d’agents de ciblage liés à la surface par un bras espaceur. 15 Master D2P
  16. 16. La notion de ciblage est importante à définir. Nous pouvons parler de vecteur de ciblagetissulaire ou cellulaire quand celui-ci permet, de façon chimique ou physique, d’augmenter de façontrès significative le rapport de la quantité de principe actif. Les vecteurs de troisième génération sont des systèmes relativement complexes comprenantune nanoparticule encapsulant le principe actif, une couche de vecteurs « furtifs » (5) (polymèrehydrophile comme les PEG) qui évite la reconnaissance par les macrophages du foie, et enfin unligand capable de reconnaître certaines molécules spécifiques de la membrane des cellules malades.Les ligands peuvent être des anticorps, des peptides, des saccharides, des oligonucléotides oud’autres molécules comme le folate. Ces ligands sont capables de reconnaître de manière sélectivedes marqueurs spécifiques (antigènes ou récepteurs) qui sont hyperexprimés à la surface des cellulescibles (cellules cancéreuses, cellules infectées, etc.). Les interactions spécifiques entre les ligands et leurs récepteurs permettent au vecteur dedélivrer son principe actif au plus près de la cellule cible, voire de favoriser l’internalisation de celui-cipar des phénomènes d’endocytose propres à chaque tissu. Figure 8 : Représentation schématique de l’adressage moléculaire d’un vecteur à une cellule cible grâce à un ligand de reconnaissance. (5) 16 Master D2P
  17. 17. 4 Exemples de nanomédicaments (existants et futurs) En 2006, environ 5000 brevets étaient enregistrés dans le domaine des nanotechnologies,toutes catégories confondues. Au niveau mondial, les brevets déposés sur les nanotechnologiesappliquées à la médecine concernent essentiellement les systèmes de délivrance de médicaments(trois quarts des dépôts), mais il y a également un grand nombre de dépôts concernant le diagnosticin vitro et les produits d’imagerie. En outre les Etats Unis dominent largement le domaine desapplications des nanotechnologies à la médecine en termes de dépôts de brevets (32% des brevetsde ce secteur ont été déposés par les Etats Unis entre 1994 et 2004) (12). Les nanotechnologies représentent un réel enjeu économique avec un marché mondial desapplications médicales des nanotechnologies qui pourrait atteindre les 170 milliards de dollars d’ici à2015 et les projections concernant le marché de l’imagerie moléculaire estimaient ce marché à 45milliards de dollars en 2010 (12). Il existe déjà un certain nombre de médicaments sous forme colloïdale présents sur le marché.Des exemples de ces médicaments sont présentés dans les figures 10 et 11. Figure 9 : Liste des AMM Liposomes et Micelle (12). 17 Master D2P
  18. 18. Figure 10 : Listes des AMM, Autres nanosystémes de délivrance. (12) 18 Master D2P
  19. 19. Nous allons détailler quelques-uns de ces exemples afin de voir plus en détail lesproblématiques qui ont poussé à l’utilisation de ces nanotechnologies.4.1 Les antifongiques (13) Depuis les trente dernières années la proportion d’infections fongiques mettant en jeu la viedu patient a fortement augmenté, particulièrement chez les patients atteints de cancer, de diabèteou les immunodéprimés…Plusieurs facteurs ont contribué à cette augmentation : - Augmentation des moyens de diagnostiques ; - Survie prolongée des patients avec un déficit de leurs défenses immunitaires ; - Interventions chirurgicales plus invasives ; - Augmentation importante de la nutrition parentérale des patients ; - Développement de résistances des agents infectieux aux antifongiques existants ; - Augmentation du nombre de patients atteints du SIDA ; - Utilisation de dialyse péritonéale et hémodialyse ;Avec un facteur de mortalité de près de 30% pour ces patients. Les antifongiques tels que l’Amphotericine B (AmB) et la Nystatine obtenus par fermentationde Streptomyces restent les plus efficaces et les plus utilisés. Cependant leur administration estlimitée par leur toxicité dose dépendante et principalement leur toxicité rénale. Ainsi la questions’est posée de trouver comment mieux diriger la substance active jusqu’au pathogène en évitantégalement les sites de toxicité. L’utilisation de liposomes est une voie intéressante car elle permet d’augmenter la doseadministrée sans effet secondaire et d’éviter les organes sensibles à la toxicité de la molécule. Leschercheurs ont travaillé sur l’incorporation d’Amphotericine B dans des liposomes constitués dedimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) et de dimyristoyl phosphatidylglycérol (DMPG) et ontobtenu des L-AmB (liposomal Amphotericine B). Des essais précliniques ont montré que l’utilisationde L-AmB permet d’augmenter la dose administrée car il y a une diminution de la toxicité, maiségalement que l’efficacité à dose équivalente, entre L-AmB et AmB libre, est légèrement diminuée. On ne connait pas bien à ce jour le mécanisme responsable de la diminution de toxicité rénaledes L-AmB, mais plusieurs hypothèses sont explorées. Parmi les différentes possibilités on trouvel’hypothèse d’un transfert sélectif des liposomes aux pathogènes fongiques suffisamment importantpour limiter la toxicité rénale. Une autre hypothèse a été avancée selon laquelle la fixation des 19 Master D2P
  20. 20. molécules d’AmB aux lipoprotéines de type LDL ou VLDL pouvait être responsable de lanéphrotoxicité. Son encapsulation au sein de liposomes permettrait ainsi de contrer ce phénomène. Figure 11 : Ambisome® (14) Plusieurs exemples de liposomes d’Amphotericine B sont aujourd’hui sur le marché ou enessais clinique. Exemple de l’Ambisome®, mais également l’Abelcet® obtenu après reformulation enAmphotericin B Lipid Complex (ABLC).4.2 Anticancéreux (15) Dans le domaine des anticancéreux il existe d’autres exemple de molécules déjà mises sur lemarché, la Doxorubicine (Doxil®) et la Daunorubicine (DaunoXome®). Dans ces deux cas il a étéobservé qu’une fois ces molécules encapsulées dans des liposomes, leur toxicité chez l’animal étaitdiminuée, avec une activité anti-tumorale en général conservée. La diminution de la toxicité de cesmolécules est principalement due à la diminution de leur fraction libre dans le plasma parl’encapsulation. Cependant, il y a une élimination rapide de ces liposomes une fois dans le sang pardes agents tel que les macrophages, ainsi des chercheurs se sont penchés sur la protection desliposomes contre les macrophages afin d’augmenter leur temps de circulation et leur actionpotentielle. Des études ont montré qu’une certaine protection pouvait être apportée par le mélangede lipides et de cholestérol, mais ces formes posent un problème de taille des particules. Deuxmodèles ont abouti avec des tailles d’environ 50 nm, l’un de DSPC/cholestérol, l’autre desphingomyéline/cholestérol. Le DaunoXome® qui est basé sur la formulation DSPC/cholestérol est leseul médicament à avoir émergé de ce modèle. Il est aujourd’hui approuvé en Europe et aux USApour le traitement du sarcome de Kaposi. 20 Master D2P
  21. 21. Figure 12 : Daunoxome® (16) Insatisfait du gain apporté par cette approche une autre voie de recherche s’est développéesur le camouflage des liposomes. Le développement de liposomes furtifs recouverts de polymères aété une grande avancée, notamment avec le polyéthylène glycol, utilisé depuis des années dans lebut d’augmenter le temps de circulation des systèmes colloïdaux. Les liposomes pégylés deDoxorubicine (Doxil®) sont aujourd’hui approuvés eux aussi en Europe et aux USA dans le traitementdu sarcome de Kaposi. Figure 13 : Doxil® (17) 21 Master D2P
  22. 22. 4.3 Les nanoparticules en imagerie médicale (18) Les produits de contraste nanoparticulaires sont un des rares domaines enpharmacie/médecine où les « nanotechnologies » ont abouti à des applications concrètes (produitscommercialisés). Cependant ils ne concernent qu’un nombre restreint de produits limités audomaine de l’IRM et tous à base du même agent de contraste qui est l’oxyde de fer.  1973 : IRM  1981 : Utilisation du gadolinium (1ères AMM 1988/1989)  1989 : Utilisation des nanoparticules d’oxyde de fer - Lumirem®-Feruxomil (VO) : imagerie du tube digestif (1993, Guerbet/AMAG) - Feridex®/Endorem® -Feruxomides (IV) : Imagerie du foie (1994, Guerbet/AMAG) - Resovist®/Cliavist®-Ferucarbotran (IV) : Imagerie du foie (2001, Bayer-Schering) Figure 14 : Particule d’oxyde de fer enrobée de dextrane. Les applications et indications diagnostiques des nanoparticules utilisées en imageriedécoulent directement de leurs propriétés pharmacocinétiques et en particulier du profil dedistribution tissulaire. Aujourd’hui ces produits sont administrés uniquement par voie orale et intraveineuse. Par voie orale ils ne seront pas absorbés et seront éliminés par voie fécale en totalité. Enintra veineuse, l’introduction d’une particule insoluble étrangère dans la circulation systémique vaentraîner sa reconnaissance par le système réticulo-endothélial (SRE) pour l’éliminer. La fonctionphagocytaire du SRE est essentiellement assurée par les macrophages et donc les principaux organesconcernés sont le foie (cellules de Kupffer), la rate, les ganglions lymphatiques, la moelle osseuse etles poumons. L’importance de la phagocytose, sa vitesse et l’importance relative de chaque organedu SRE va dépendre des facteurs qui influencent la pharmacocinétique, cest-à-dire la taille de laparticule et la nature de l’enrobage. En effet, plus une particule est grosse et plus l’épurationplasmatique par captation macrophagique va être rapide (figure 16). De même la nature de 22 Master D2P
  23. 23. l’enrobage peut influer sur la vitesse de captation, d’épuration plasmatique et le type cellulaireimpliqué pour la captation. Figure 15 : Pharmacocinétique en fonction de la taille des particules. Les avantages des nanoparticules en imagerie médicale sont qu’elles sont biodégradables etqu’elles permettent d’augmenter le temps de résidence du produit dans les organes cibles chezl’homme avec une absence de toxicité tout en évitant une accumulation. Le produit cible les macrophages grâce à leur activité phagocytaire. Cela permet lediagnostique dans la sclérose en plaques, les plaques d’athérome, le rejet de greffe et les pathologiesinflammatoires rénales, les infiltrations macrophagiques dans l’infarctus cérébral, l’arthrite et lespathologies ostéoarticulaires, la maladie d’Alzheimer, l’épilepsie, les diabètes… 23 Master D2P
  24. 24. 5 Les méthodes de préparation des systèmes d’encapsulation5.1 Préparation des liposomes (19) (20) Dans cette partie nous allons nous attacher à étudier les méthodes de préparation desliposomes. Les liposomes peuvent être de différents types décrits figure 17. Figure 16: Les différentes classes de liposomesToutes les techniques de préparation des liposomes ont en commun 4 étapes :-la préparation d’une solution organique de phospholipides : phase lipidique-lévaporation du solvant de la phase lipidique-la dispersion des lipides en milieux aqueux-la purification des liposomes formésLa principale différence entre les différentes techniques est la manière de disperser les liposomesdans la phase aqueuse pouvant aboutir à la formation de MLV, LUV ou SUV…5.1.1 Préparation des MLV Figure 17: Exemple d’un schéma de préparation de MLV 24 Master D2P
  25. 25. La lécithine constitue la phase lipidique avec le cholestérol qui servira à renforcer la membranedes liposomes. Le dicethylphosphate est une molécule amphiphile chargée négativement empêchantlagrégation des liposomes. Dans un premier temps on procède à lévaporation du solvant afin de former un film lipidiquesec sur le ballon. Ensuite, on hydrate le film lipidique sous agitation à une température supérieure àcelle de la transition de phase lipidique afin dobtenir des liposomes. Lajout de billes de verrespermet daméliorer lopération. Enfin on procède à la purification du milieu afin de récupérer lesliposomes formés.Cette technique met en jeu un processus de dispersion mécanique sous agitation.5.1.2 Méthode de préparation par sonicationOn peut préparer des SUV par sonication à partir de MLV. Figure 18: Préparation de SUV par sonication Les SUV sont préparées à partir dune suspension de MLV à une température en-dessous de latransition de phase des phospholipides. Dans ces conditions, des défaillances au niveau de lastructure lipidique sont observées. On peut corriger ce phénomène en incubant les liposomes à unetempérature supérieure à celle de la transition de phase des phospholipides. Il en résultera alors unefusion des SUV entre elles formant des LUV stables. 25 Master D2P
  26. 26. 5.1.3 Méthode par injection déthanol ou déther Cette méthode permet déviter les problèmes rencontrés avec celle de la sonication, Leslipides dissous dans léthanol sont injectés dans la solution aqueuse où les SUV se formentinstantanément. Il est également possible de former des LUV en fonction des conditionsexpérimentale notamment lors de linjection. On peut également moduler la taille et lhomogénéitédes liposomes en incorporant de léthanol dans la phase aqueuse, par la rapidité de linjection et parlagitation du milieu réactionnel. Figure 19: Méthode de fabrication de liposomes par injection déthanol ou déther Linconvénient de cette méthode est le faible rendement dencapsulation mais léthanol est unsolvant bien connu et accepté par les différentes autorités de santé.5.1.4 La presse de French La taille des MLV en suspension peut être réduite par extrusion sous forte pression à laidedune presse de French. Lextrusion à laide le presse se fait à 4°C sous pression déterminée ; un seulpassage aboutit à lobtention dune population hétérogène dont environ 30% contenant encore desLMV. Après de multiples passage ont peut réduire lhétérogénéité et après 4 passages successifs 94%des vésicules ont un diamètre compris entre 30 et 50 nm (19). 26 Master D2P
  27. 27. Cette technique simple, reproductible et non destructive peut sappliquer à toute une variétéde phospholipides. Elle permet dobtenir des volumes importants de liposomes. De plus avec de forteconcentration lipidique, lencapsulation de la phase aqueuse est relativement efficace. Figure 20: Schéma dune presse de French5.1.5 Méthode de microfluidisationUne suspension de MLV est envoyée à travers un filtre à forte pression dans une chambred’interaction. Dans cette chambre, les fluides sont séparés en deux canaux qui se rejoignent au boutde la chambre à très haute vitesse (>500m/s). Le choc des particules entre elle provoque leurdiminution de taille et après 10 passages ont obtient des SUV de taille <0.1 μm. Figure 21 : Schémadu processus de microfluidisation 27 Master D2P
  28. 28. Tableau récapitulatif Méthodes de préparation Avantages Limites Inadaptée à la production Hydratation d’un film industrielle, faible taux Simple, rapide phospholipidique d’encapsulation, taille hétérogène Simple, rapide, adaptée à Injection d’une solution l’industrie, homogénéité de Faible taux d’encapsulation éthanolique taille Inadaptée à l’industrie, préparation préalable de MLV, Petites vésicules de taille faible taux d’encapsulation, Ultrasons homogène production d’aérosol pouvant être toxique pour le manipulateur Adaptée à la production industrielle, concentrations Coût et maintenance de microfuidisation lipidiques et taux l’appareil, préparation de MLV d’encapsulation en PA nécessaire hydrophiles élevés Figure 22 : Tableau récapitulatif des méthodes de préparation de liposomes 28 Master D2P
  29. 29. 5.2 Les méthodes de préparation des nanoparticules (21) (22) Dans cette partie nous allons étudier les techniques de préparation des nanoparticulesformées soit à partir dun polymère préformé soit à partir de la polymérisation de monomères.5.2.1 Les méthodes de préparation utilisant des polymères préformés Ces méthodes consistent à insolubiliser un polymère préalablement dissous dans un solvantpour former des nanoparticules. Elles diffèrent par la manière de précipiter le polymère ou sur le faitde préparer ou non au préalable une émulsion.5.2.1.1 Emulsification-évaporation de solvant Ici le polymère et le principe actif sont dissous dans une phase organique non miscible à l’eau.La phase organique est introduite dans une phase aqueuse pour former une émulsion L/H.L’émulsion est ensuite traitée pour obtenir des gouttelettes plus fines (homogénéisateurs, ultrasons).L’élimination de la phase organique volatile sous l’effet de la chaleur, et/ou du vide conduit àl’obtention des nanosphères : chaque gouttelette de l’émulsion donne naissance à une nanoparticuleaprès évaporation de la phase organique (figure 22). Figure 23 : Méthode émulsification-évaporation de solvant 29 Master D2P
  30. 30. Avantages : méthode adaptée aux principes actifs lipophiles.Inconvénients : utilisation de solvants organiques. Faible taux d’encapsulation des principes actifshydrophiles.5.2.1.2 Nanoprécipitation Figure 24 : Méthode de nanoprécipitation Dans cette méthode le polymère, insoluble dans leau, et le principe actif sont dissous dans unsolvant miscible à l’eau. Lors de l’injection de cette solution dans l’eau, le solvant diffuse dans laphase aqueuse faisant précipiter le polymère emprisonnant par la même occasion le principe actif.Avantages : méthode ne nécessitant pas beaucoup de forces d’agitation, méthode adaptée auxprincipes actifs lipophiles, taille obtenue entre 100 et 500nm, faible concentration de tensio-actifs,facilité de transposition déchelle.Inconvénients : manque de contrôle de la taille des particules liés aux conditions de fabrication(nature du solvant, quantité…), faible encapsulation des principes actifs hydrophiles. 30 Master D2P
  31. 31. 5.2.1.3 Salting out Figure 25 : Salting out ou relargage Pour cette méthode, il faut préparer une solution de solvant miscible à l’eau contenant le polymère et le principe actif dissous et une solution d’eau saturée en sel qui empêchera la diffusion du solvant. Sous agitation les deux solutions sont mélangées, le solvant ne pouvant pas diffuser forme une émulsion avec des gouttelettes renfermant le polymère et le principe actif. Cette émulsion est ensuite diluée ce qui va permettre au solvant de diffuser faisant précipiter le polymère qui va piéger le principe actif. Les sels sont ensuite éliminés par des étapes de purification. Avantages : méthode adaptée aux principes actifs lipophiles, meilleur contrôle de la taille des particules, rendements dencapsulation satisfaisants Inconvénients : étapes de purification/lavages nécessaires pour éliminer les sels et les solvants, compatibilité des constituants avec les sels à vérifier, emploi de stabilisants (PVA) non acceptés pour ladministration IV. 31 Master D2P
  32. 32. 5.2.1.4 Emulsification-diffusion Figure 26 : Méthode d’émulsification-diffusion. Cette technique est assez semblable à la précédente mais permet de ne pas utiliser de sels. Ala place, elle utilise un solvant partiellement miscible à l’eau. Les deux phases sont préparées ensaturant chacune d’elle soit par du solvant soit par de l’eau de sorte que lorsqu’on les mélange il n’yait pas de diffusion. Ainsi en agitant on forme une émulsion qui conditionnera la taille des particulesformées. La dilution de cette émulsion permet ensuite la diffusion du solvant organique dans laphase aqueuse , le polymère précipite piégeant le principe actif.Le solvant est éliminé par évaporation ou filtration selon ses propriétés.L’ajout d’huile dans la phase organique permet de former des nanosphères ou des nanocapsules.Avantages : méthode adaptée aux principes actifs lipophiles, bon contrôle de la taille des particules(de 100 à 1000nm), solvants organiques acceptables pour la voie parentérale, facilité detransposition industrielle.Inconvénients : grands volumes deau à éliminer et linstabilité éventuelle des principes actifs dansla phase aqueuse saturée durant lémulsification. 32 Master D2P
  33. 33. Tableau r écapitulatif Méthodes de préparation Avantages Limites Inadaptée au PA hydrophiles Utilisation d’unEmulsification évaporation de Adaptée aux PA lipophiles homogénéiseur de taille, solvant énergie d’agitation Adaptée à l’industrie, Faible taux d’encapsulation nanoprécipitation instantanée, peu d’énergie des principes actifs nécessaire hydrophiles Bon contrôle de la taille des Utilisation de sels, Salting out particules, compatible avec compatibilité avec ces sels les PA lipophiles Permet la fabrication de Grands volumes d’eau à Emulsification diffusion nanosphères ou de éliminer nanocapsules Figure 27 : Tableau récapitulatif des méthodes de fabrication des nanoparticules 33 Master D2P
  34. 34. 5.3 Scale-up (23) Dans cette partie, nous nous proposons d’expliquer le scale-up de deux méthodes depréparations des nanoparticules.5.3.1 Scale-up de la méthode émulsification-diffusion du solvant Figure 28 : Proposition de scale-up utilisant la méthode d’émulsification diffusion de solvantUn exemple de scale-up pour la préparation de nanoparticules par la technique d’émulsification-diffusion est présenté en figure 26. Les différentes étapes sont les suivantes :-Dans le réservoir A on mélange les deux solvants afin de les saturer puis on les sépare pardécantation en laissant au repos.-La phase aqueuse située en bas du réacteur A est transférée dans le réacteur B par force gravitaireen ouvrant la vanne V-1.-Le tensio-actif est ajouté dans le réacteur B tandis que le polymère, l’huile et le principe actif sontajoutés dans le réacteur A.-Le réacteur A est ensuite vidangé dans B sous agitation élevée de manière à obtenir une émulsionavec les caractéristiques désirées, il est à noter que le choix du mobile d’agitation est d’une grandeimportance afin d’y parvenir.-L’agitation est maintenue au moins 30 min puis l’émulsion est transférée dans le réacteur C quicontient la quantité d’eau requise pour permettre la diffusion du solvant. 34 Master D2P
  35. 35. 5.3.2 Scale-up de la méthode par nanoprécipitation Figure 29 : Proposition de scale-up utilisant la méthode de nanoprécipitationLa figure 27 représente un exemple de scale up pour la technique de nanoprécipitation. Ici le solvantest miscible avec la phase aqueuse ce qui permet la précipitation du polymère, le point essentiel decette méthode est de gérer le mélange des deux phases contenues séparément dans les réacteurs Aet B. Pour cela le « T-system » permettra le mélange des solutions. Les paramètres critiques de cetteméthode sont les débits des deux solutions qui alimentent le système de mélange. Des pompespéristaltiques P-1 et P-2 permettent de réguler les débits. Les nanoparticules en suspension sontrécupérées dans la cuve C en continue. L’inconvénient de cette méthode est la faible quantité de polymère contenu dans la solutionorganique qui doit rester dans un régime dilué, ce qui limite la quantité de nanoparticules récupéréesen C. 35 Master D2P
  36. 36. 5.4 Méthodes de préparation utilisant des monomères5.4.1 Polymérisation interfaciale La membrane polymérique est créée par synthèse du polymère in situ. La technique repose surla présence de deux monomères réactifs lun avec lautre et solubles chacun dans une des phases delémulsion. La réaction de polymérisation se déroule à linterface Eau / Huile créant ainsi la paroidune capsule. Figure 30 : polymérisation interfacialeLes avantages de cette méthode sont : la rapidité, la facilité et lefficacité dencapsulation (prochede 100% pour les PA lipophiles).Les inconvénients sont la présence de résidus de monomères, oligomères ou réactifs, et lesinteractions du principe actif avec les monomères utilisés pour former la membrane.5.4.2 Polymérisation en émulsion Cette technique consiste à émulsionner un monomère insoluble à leau dans une phaseaqueuse additionnée dune quantité importante de tensio-actif. Le monomère est introduit sous viveagitation. Lamorceur (ions, radical ou agent irradient) lui est soluble dans leau, sa rencontre avec lafaible fraction de monomère dissous provoque lamorçage et un début de polymérisation. Le principeactif peut être rajouté dans le milieu réactionnel après formation des nanosphères, il est alorsadsorbé en surface. 36 Master D2P
  37. 37. Figure 31 : Formation de l’oligo-radical en phase aqueuse (29)5.4.3 Polymérisation en suspension Elle peut être réalisée à partir dune émulsion H/E ou E/H ou par dilution dune émulsion H/E.Linitiateur est soluble dans le monomère mais les deux composés sont insolubles dans le milieu depolymérisation. La phase comprenant le monomère est mélangée dans une phase agitée contenantun tensio-actif, la polymérisation est initiée par la température, les microgouttes sont directementdes microsphères de polymère. Figure 32 : méthode par polymérisation en suspensionAvantages : facilité de mise en œuvre et rapidité de la technique.Inconvénients : la taille des particules est particulièrement grosse (jusquà 500 micromètres). En conclusion, malgré les efforts mis en œuvre pour diminuer les quantités de solvantsorganiques et de tensio-actifs, la présence de monomères et doligomères restants en solutionpotentiellement toxiques restent un frein majeur à ces techniques. De plus, le contrôle de la polymérisation et donc de la taille des particules est difficile et lesrisques de dégradation du principe actif sont une autre limite. 37 Master D2P
  38. 38. 5.5 Nouveau procédé de fabrication de nanocapsules en ligne sur membranes (24) Ce nouveau procédé, mis au point par l’équipe du Pr. Fessi, est un procédé de fabrication encontinu de nanocapsules lipidiques ou polyméres.La première phase (lipidique ou organique) passe à travers les pores dune membrane formant ainside fines gouttelettes. La phase aqueuse circule à lintérieur de la membrane et entraîne lesgouttelettes formées précédemment. Les nanocapsules sont formées dans la phase aqueuse parnanoprécipitation ou polymérisation interfaciale. (figure 31) Figure 33 : Méthode d’industrialisation sur membrane Un prototype est opérationnel avec différentes tailles et longueurs de membrane et il estpossible de produire 1 litre de suspension de nanocapsules en environ 5 minutes. Un circuit fermépermet la concentration des nanocapsules. En conclusion, des méthodes de fabrication des nanoparticules, se sont celles utilisant lephénomène de nanoprécipitation qui sont les plus faciles à transposer industriellement. En effet, lananoprécipitation est une réaction quasi instantanée, ne demandant pas beaucoup dénergiedagitation, et nutilisant pas de sels compliquant les étapes de purification. Bien que cette techniquepermette dencapsuler les principes actifs lipophiles, le rendement dencapsulation diminue avec lesprincipes actifs hydrophiles qui diffusent dans la phase aqueuse lorsque les deux solutions entrent encontact. Le deuxième point critique est la taille des nanoparticules produites, contrôlée grâce à lataille des pores de la membrane. 38 Master D2P
  39. 39. 6 Les limites des systèmes nano particulaires6.1 Les limites physiologiques (25) Pour la voie intraveineuse le choix des constituants de la nanoparticule est crucial en regarddes différentes propriétés chimiques et biologiques qui déterminent leur biocompatibilité. Latoxicologie des nanoparticules utilisées en médecine est maintenant bien comprise grâce à desétudes réalisées sur la cytotoxicité, l’hémotoxicité, l’activation du complément et l’immunogénicitéhumoral ou cellulaire de beaucoup de nanoparticules. Ces études ont montré que les polycations sont en générale cytotoxiques, hématolytiques etpeuvent être activateurs du complément. Les polyanions sont moins cytotoxiques, mais peuventavoir une action anti coagulante et peuvent stimuler la libération de cytokines par les lymphocytes etles mononucléaires. Toutes ces réponses biologiques semblent avoir un rapport avec le poidsmoléculaire des constituants des nanoparticules. Il ne doit également pas être perdu de vue quel’absorption, la distribution et le métabolisme des polymères peuvent être modifiés lors de l’ajout desubstances actives, qui peuvent se lier aux polymères de façon plus ou moins importante et ainsi enmodifier les caractéristiques. La taille des particules est elle aussi un élément limitant, pour plusieurs raisons, dont laprincipale est le risque lié a l’administration de particules de trop grandes tailles pouvant entrainerdes risques d’embolie. La clairance plasmatique est obtenue principalement par les reins en raison de la faible tailledes nanoparticules mais également par le foie pour les nano vecteurs et les particules de taille tropimportante (21). Idéalement la nanoparticule devrait être entièrement biodégradable, mais cela n’estpas toujours le cas. Donc il faut privilégier des constituants de poids moléculaire inférieur à 40000Da, ou bien dont les produits de dégradation sont inférieurs à 40000Da, pour permettre uneélimination rénale.6.2 Les limites en santé publique6.2.1 Environnement (26) Depuis longtemps on sait que la pollution atmosphérique peut tuer ; plusieurs épisodes l’ontrappelé au vingtième siècle, par exemple le fameux épisode du « smog » de décembre 1952 àLondres, lequel a provoqué, en quatre jours, de l’ordre de 4000 décès de plus qu’attendu dans lesconditions usuelles. La recherche et l’étude de corrélations entre décès ou morbidité et variations deconcentrations de particules (évalué en fumé noire) ou de dioxyde de soufre ont indiqué la très 39 Master D2P
  40. 40. probable responsabilité de ces agents et constitué un premier lien entre exposition à des particulesfines ou ultra fines et effets sur la santé humaine, à l’origine de la fixation d’une valeur limiteenvironnementale pour les particules fines par l’EPA en 1987 (POST, 1996). Les recherches ontprogressé depuis, dans le domaine environnemental, tant en extension (dans de nombreux pays)qu’en performances techniques (nombres et qualité des mesurages, méthode de dépouillementstatistique). Or, bien que des particules fines ou ultra fines ait été présentes sur les lieux de travail depuistoujours, l’intérêt à leur égard, ainsi que les recherches méthodologiques ou toxicologiques, sontrestées limitées. Actuellement, la naissance partout saluée des « nanotechnologies » et autres« nanoparticules », et leur développement très rapide, ont provoqué des réactions d’inquiétudedevant des risques qui semblaient nouveaux, en tout cas mal connus. L’un des constituants de la pollution répétitivement mis en cause est l’aérosol,particulièrement urbain ou d’origine industrielle, dans lequel on distingue conventionnellement desparticules grossières, fines ou ultrafines. Raison pour laquelle il est difficile de n’étudier que l’effetdes nanoparticules, car dans la nature elles font partie d’un ensemble de particules de différentestailles. Par ailleurs de nombreux travaux expérimentaux, in vitro comme in vivo, ont montré que lesparticules ultrafines ont des propriétés physicochimiques et toxicologiques particulières, liéesnotamment à leur taille et à leur surface.Les voies de pénétration des nanoparticules dans l’organisme sont multiples : - Pénétration et dépôts pulmonaires (figure 32) ; - Pénétration nasale et passage jusqu’au cerveau ; - Pénétration percutanée étudiée sur peau saine et potentialisée par des lésions possibles (figure 33). 40 Master D2P
  41. 41. Figure 34 : Pénétration cutanée de nanoparticules (28)Figure 35 : Relationentre pénétration et taille particulaire. (27) Une grande partie des informations disponibles se rapporte à des particules de taille supérieure à 100nm, sans qu’on sache encore si, et dans quelle mesure, elles sont extrapolables au domaine des particules ultrafines. Le recul scientifique est insuffisant pour s’exprimer de façon générale sur ce point. 41 Master D2P
  42. 42. 7 Conclusion En 50 ans, les systèmes dencapsulation de principes actifs ont beaucoup évolués, et sontpassés du simple concept à la réalité. Leur définition cest affinée au cours du temps, en fonction desproblématiques. Les différentes générations de liposomes en sont le reflet, allant de la simpleencapsulation pour la première génération, aux liposomes dit "furtifs», jusquà l’avenir, avec desparticules ciblant des récepteurs spécifiques. Ces systèmes permettront des progrès dans lestraitements des cancers en limitant les effets indésirables et en ciblant mieux les cellules tumoralespar exemple. La recherche travail pour que dans le futur, les systèmes nanométriques puissent être utilisésnon plus uniquement par voie IV mais également par voie topique notamment par voie oculaire oupulmonaire afin dadministrer des acides nucléiques ou de franchir le mucus des cellules épithélialespulmonaire. Ces évolutions sont accompagnées davancées techniques de préparation à grande échelle,sans lesquelles ces innovations ne pourraient être mises sur le marché. Cependant comme nouslavons vu au préalable il reste des obstacles comme par exemple lutilisation de solvants toxiques, oùdes difficultés de transposition déchelle qui font que les méthodes les plus utilisées actuellementsont les méthodes de précipitation comportant elles aussi leurs limites (faible rendementdencapsulation de principes actifs hydrophiles ou contrôle de la taille des particules difficile parexemple). Ainsi des techniques innovantes comme celle des tubes membranaires devront êtreaméliorées et les efforts de recherche accentués pour développer de nouveaux moyens deproduction de systèmes dencapsulation. 42 Master D2P
  43. 43. 8 Bibliographie1. Duncan, Ruth and Vincent, Maria J. Polymer therapeutics-prospects for 21st century: The end ofthe beginning. Advanced Drug Delivery Reviews . 2012.2. Forrest, M. Laird and Kwon, Glen S. Clinical developments in drug delivery nanotechnology.Advanced Drug Delivery Reviews. 2008.3. I. Brigger, C. Dubernet, and P. Couvreur. Nanoparticules in cancer therapy and diagnosis. 2002.4. Kreuter, Jörg. Nanoparticles - a historical perspective. Internationa Journal of Pharmaceutics.2007.5. K. Andrieux, D. Desmaele, J. DAngelo, and P. Couvreur. Nanotechnologies and new drugs. 2003.6. A.D. Bangham, M.M. Standish, and J.C. Watkins. Diffusion of univalent ions across the lamellae ofswollen phospholipids. 1965.7. Speider, G.Birrenbach and P. Polymerized micelles and their use as adjuvants in immunology.1976.8. P. Couvreur, M. Roland, and P. Speiser. Submicroscopic biodegradable particles containing abiogically-active substance. 1979.9. P. Couvreur. P. Tulkends, M. Roland, A. Trouet, and P. Speiser. Nanocapsules: a new type oflysosomotropic carrier. 1977.10. S.I. Jeon, J.H. Lee, J.D. Andrade, and P.G. De Gennes. Protein-surface interactions in the presenceof polyethylene oxide. I. Simplified theory. 1991.11. C.K. Weiss, M.R. Lorenz, K. Landfester, and V. Mailaender. Cellular uptake behavior ofunfunctionalized and functionalized poly(n-butylcyanoacrylate) particules prepared in a miniemulsion.2007.12. Bionest partners. Applications des nanotechnologies à la médecine. 2009.13. Agatha W. K. Ng, Kishor M.Wasan, Gabriel Lopez-Berestein. Development of liposomal polyeneantibiotics: an historical perspective. J Pharm Pharmaceut Sci. 2003.14. http://www.rxlist.com. [En ligne] 16 Mars 2012. [Citation : 16 Novembre 2012.]http://www.google.fr/imgres?um=1&hl=fr&sa=N&biw=1440&bih=775&tbm=isch&tbnid=N7L-RN9MV1FA6M:&imgrefurl=http://www.rxlist.com/ambisome-drug.htm&docid=PGHaLlYFKb6Y9M&imgurl=http://images.rxlist.com/images/rxlist/ambisome1.gif&w=362&h=247&ei=dUqlUMK7Buiq0QWv1.15. Martin, Francis J. www.cancernetwork.com. [En ligne] 19 Octobre 1997. [Citation : 16 Novembre2012.] http://www.cancernetwork.com/display/article/10165/80198.16. Galen. www.daunoxome.com. [En ligne] [Citation : 16 Novembre 2012.]http://www.daunoxome.com/?page=a-daunoxome. 43 Master D2P
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