Virus de l'hépatite A et E
                 Virus et marqueurs diagnostiques




                                       Vi...
Hépatites virales
                  mode de transmission préférentiel


 parentéral                                       ...
Historique VHA
 “La Jaunisse”
 1745 : Cockayne, hépatites épidémiques
 1908 : McDonald, "notion de virus…"
 Reproduction d...
Virus de l'hépatite A




V.Thibault DU_janv.-2010   4
Virus de l’Hépatite A


                                                     •   Famille : Picornaviridae
                ...
P1 prot. Capside                   P2                           P3

         0                      Structurales          ...
Cycle de multiplication du VHA en culture de cellules
         Attachement

                                Libération    ...
VHA : physiopathologie

                                          Absence d'effet cytopathique direct :
                  ...
Propriétés Physiques du VHA
                   Agents                      Stabilité
                  Chaleur
    Autocla...
Variabilité génétique
                          P1 prot. Capside                P2                         P3

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Génotypes et
         phylogénie
    VP1/P2A
    Génotypes : >15% variations
    Sous types : 7.5% variations




     D'a...
Répartition mondiale des génotypes




Génotypes infectant l'homme en noir , les singes en rouge.
Souche PA21 (génotype II...
VHA : Paramètres Biologiques
Ac anti-VHA = hépatite A ancienne ou vaccination
IgM anti-VHA = hépatite aiguë A (clinique)

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VHA : Marqueurs disponibles
1- Sang : Marqueurs indirects
                IgM                            Marqueurs indirec...
IgM HAV uniquement à bon escient !



                                     1%
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Marqueurs biochimiques

                 Diagnostic                    Transaminases (ALAT, ASAT)
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Hépatite A : le vaccin
                                       virus inactivé
 AVAXIM 160U suspension injectable seringue p...
Difficultés diagnostiques
                                     En routine

                   Adresser prélèvements
      ...
SRAS ?




                                Hépatite E ?            Grippe




V.Thibault DU_janv.-2010   19
Historique VHE
       Découverte dépendante de la connaissance des virus des hépatites
         1955 : Inde, hépatite che...
V.Thibault DU_janv.-2010   21
VHE                            Virus non enveloppé
                                                  Sphérique (SRV)
 Fami...
Organisation génomique
                        Non structurales                      Structurales

                       ...
Hétérogénéité génétique

   Au moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés en 24 sous
   groupes dont hom...
NL (porc)
 301 nt 5' end of ORF2 sequences from 275 HEV strains,
                                                         ...
Similarités des
souches humaines et
      animales
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                2008, 8:61




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       81:1371–1379 (2009)




Phylog...
V.Thibault DU_janv.-2010   29
Culture et Modèles animaux

• Culture
        Difficile
       Culture primaire d’hépatocytes de macaques (cynomolgus)
   ...
VHE : Paramètres Biologiques

                                    Titre peu élevé
                             protection ...
HEV – virémie-                                       selle


   transmission
                                      serum
 ...
Immunodépression, hépatite chronique et
                stratégie diagnostique




     Dans le cadre d'une investigation ...
Stratégie Diagnostique
Marqueurs non biologiques
       circonstances de la maladie (voyage, autres causes, épidémie)
    ...
Spécificité et Sensibilité des ELISAs
    Epidémie Indonésie,
      82 symptomatiques; 174 asymptomatiques; 496 contrôles...
Performance des tests
                                                                            IgM anti-HEV

          ...
Stratégie Diagnostique
                   Se donner les moyens de faire le diagnostic

           Diagnostic Indirect     ...
VHE et vaccination
 20 µg d'antigène rHEV (capside exprimée
 dans baculovirus) dans 0.5 ml de PBS sur
 0.5 mg d'hydroxyde ...
Adresser les prélèvements
                              au
             Centre national de référence du VHE

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Thibault Virus A Et E

  1. 1. Virus de l'hépatite A et E Virus et marqueurs diagnostiques Vincent THIBAULT Laboratoire de Virologie Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière Assistance Publique Hôpitaux de Paris V.Thibault DU_janv.-2010 1
  2. 2. Hépatites virales mode de transmission préférentiel parentéral féco-oral B non A, non B A 1965 D 1972 1977 C E 1990 1991 F, G, TTV, autres… V.Thibault DU_janv.-2010 2
  3. 3. Historique VHA “La Jaunisse” 1745 : Cockayne, hépatites épidémiques 1908 : McDonald, "notion de virus…" Reproduction de la maladie 1942 : Volontaires (Voegt, Havens), Paul 1943 ingestion feces/serum Entité clinique : 17-18ème siècle - 1923 Blumer - 1947 McCallum (VHA "infectious"-VHB "serum") Visualisation : 1973 (Feinstone) Développement de la sérologie : épidémiologie 1979 : culture (Provost et Hilleman) 1981... : Clonage, Séquences nucléotidiques 1991… : Vaccination 2006 : Déclaration obligatoire V.Thibault DU_janv.-2010 3
  4. 4. Virus de l'hépatite A V.Thibault DU_janv.-2010 4
  5. 5. Virus de l’Hépatite A • Famille : Picornaviridae Capside (entérovirus type 72) • Genre : hépatovirus • Taille 27-32 nm 27-32nm ARN (+) • Non enveloppé • Structure icosaèdrique • ARN simple brin, Vpg • polarité positive • lié de façon covalente à une protéine Vpg V.Thibault DU_janv.-2010 5
  6. 6. P1 prot. Capside P2 P3 0 Structurales Non structurales 7478 1B 1C 1D 2A 2B 2C 3 3C (PRO) 3D (POL) AAA A-B Vpg 1A 2.5kDa IRES 3 Traduction 2A A-B VP2 VP3 VP1 2B 2C 3C (PRO) 3D (POL) poly- protéine VP4 2 227 AA ? Vpg Protéase Liaison NTP Hélicase ARN VP0 Polymérase VP2 VP3 VP1 Réplication VP4 2A VP2 VP3 VP1 X5 – X12 VP4 Protéines de surface 2A Maturation finale immunogénicité V.Thibault DU_janv.-2010 6
  7. 7. Cycle de multiplication du VHA en culture de cellules Attachement Libération Réplication du génome Espace + de Disse - ire Traduction cellula Synthèse + de la polyprotéine - rane Memb P3 Maturation P2 Réticulum endoplasmique P1 Empaquetage Canalicule Relargage biliaire V.Thibault DU_janv.-2010 7
  8. 8. VHA : physiopathologie Absence d'effet cytopathique direct : cytolyse résultant du processus immun de défense de l'hôte, médiation cellulaire médiation humorale V.Thibault DU_janv.-2010 8
  9. 9. Propriétés Physiques du VHA Agents Stabilité Chaleur Autoclavage (121°C, 20') Inactivation 100°C Inactivation 60°C Stable 1 heure température ambiante Stable 1 mois (selles, eaux, sols) Plusieurs jours sur surface sèche 4 h. Sur les mains 4°C Stable plusieurs mois Congelé Stable des mois ou années Acide-base pH 1 : stable 5 h. PH 3-11 : stable au moins 30' U.V. Inactivation Chimiques Chlore, ozone, Inactivation glutaraldéhyde, iode Alcool 70° 3' : inactivation partielle V.Thibault DU_janv.-2010 9
  10. 10. Variabilité génétique P1 prot. Capside P2 P3 0 Structurales Non structurales 7478 1B 1C 1D 2A 2B 2C 3 3C (PRO) 3D (POL) AAA A-B Vpg 1A 2.5kDa Comparaison nucléotidique 7 Génotypes : IA,B ; II; IIIA,B ; IV-VII Homme : génotype I (90%), (III, II=VII) Singes : IV, V, VI Sérotype unique Nombre limité d'épitopes antigéniques VP1, VP3 Tests immunologiques Vaccination (HM175, CR326) virus inactivé cultivé sur MRC-5 V.Thibault DU_janv.-2010 10
  11. 11. Génotypes et phylogénie VP1/P2A Génotypes : >15% variations Sous types : 7.5% variations D'après Nainan et al. 2006 Clin. Microb. Rev. ; 19:63-79 IV Nonhuman primate, Philippines V Nonhuman primate, Kenya VI Nonhuman primate, Indonesia Phylogenetic analysis of 3,582 HAV isolates in the VP1/P2B region (315-bp fragment). V.Thibault DU_janv.-2010 11
  12. 12. Répartition mondiale des génotypes Génotypes infectant l'homme en noir , les singes en rouge. Souche PA21 (génotype IIIA), isolée d'un singe Panamanian Owl en vert. Cristina J, Costa-Mattioli M. Virus Res. 2007 Aug;127(2):151-7. V.Thibault DU_janv.-2010 12
  13. 13. VHA : Paramètres Biologiques Ac anti-VHA = hépatite A ancienne ou vaccination IgM anti-VHA = hépatite aiguë A (clinique) protection contre réinfection Ag foie IgG Symptomes Ictère VHA Selles IgM VHA Sang 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24 V.Thibault DU_janv.-2010 13 Semaines
  14. 14. VHA : Marqueurs disponibles 1- Sang : Marqueurs indirects IgM Marqueurs indirects (+++) IgG (ELISA) Génome viral (RT-PCR) 105 virions/mL sang Salive : IgG (ELISA) 2- Selles : 109 virions/g selles Génome viral (RT-PCR) Génome viral (RT-PCR) - épidémiologie Particules virales IEM - EIA 3- Milieux : Marqueurs directs Génome viral (RT-PCR) (plus spécialisé) Particules virales IEM 4- Foie : Ag viral à la surface des hépatocytes Génome viral : hybridation, RT-PCR V.Thibault DU_janv.-2010 14
  15. 15. IgM HAV uniquement à bon escient ! 1% 11 % 82 % Faux positifs Roque Afonso et al. CID 2006:42 -887 Alaska : test "réflexe" si Ig-VHA totales + Ig M HAV 32 % de faux + (Castrodale CID 2005:41;e86) Vaccination : 8 à 20 % d'IgM VHA + dans les 2 à 3 semaines suivant l'injection… NE RECHERCHER L'IgM anti-VHA QU'EN CAS D'HEPATITE AIGUË V.Thibault DU_janv.-2010 15
  16. 16. Marqueurs biochimiques Diagnostic  Transaminases (ALAT, ASAT)  Bilirubine  Phosphatase alcaline  Facteurs de coagulation Sérologie +++ IgM anti VHA : infection récente IgG anti VHA : infection passée ou vaccination IgM et IgG anti VHA Diagnostic direct (-) [uniquement dans le cadre d'études] Virémie : techniques sensibles (105 v./mL) Recherche de virus dans les selles, prolongée, importante (109v./mL), épidémiologie Salive : IgG (ELISA) V.Thibault DU_janv.-2010 16 Génome viral (RT-PCR)
  17. 17. Hépatite A : le vaccin virus inactivé AVAXIM 160U suspension injectable seringue préremplie  Virus de l'hépatite A souche GBM cultivée sur cellules diploïdes humaines MRC- 5 , inactivé HAVRIX 1 440 U Elisa/ml susp inj IM Ad en seringue HAVRIX 720 U Elisa/0,5 ml susp inj IM Enf/Nour en seringue  Souche HM 175 du virus de l'hépatite A cultivée sur cellules humaines diploïdes MRC5 Le schéma vaccinal habituel comprend 1 dose suivie d'un rappel (1 dose) 6 à 12 mois plus tard. La persistance des anticorps anti-VHA après vaccination n'est actuellement pas connue . Les données disponibles suggèrent la persistance des anticorps anti-VHA à un niveau protecteur jusqu'à 10 ans (20 ans ?) après primo-immunisation. Hepatitis A Vaccine versus Immune Globulin for Post-exposure Prophylaxis V.Thibault DU_janv.-2010 17 Victor et al. 2007 N Engl J Med 357;17
  18. 18. Difficultés diagnostiques En routine Adresser prélèvements au Centre national de référence du VHA Pr E Dussaix Laboratoire de virologie Hôpital Paul Brousse 12-14 av Paul Vaillant Couturier 94804 Villejuif cedex Tel : 01 45 59 37 21 http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste V.Thibault DU_janv.-2010 18
  19. 19. SRAS ? Hépatite E ? Grippe V.Thibault DU_janv.-2010 19
  20. 20. Historique VHE Découverte dépendante de la connaissance des virus des hépatites 1955 : Inde, hépatite chez des personnes immunisées contre le VHA, épidémie particulière. "NANBH" Entité clinique 1980 - similitude avec l’hépatite A : Inde : prévalence de l’hépatite A importante Epidémie : autre virus des hépatites, contamination par l’eau 1983 : reproduction de l’hépatite non A-non B chez un volontaire immunisé contre VHA (Balayan) Hépatite à J36 J28-45, visualisation de particules virales > VHA (27-30nm) Reproduction de l’infection chez le singe (cynomolgus) Hépatite "non A - non B" à transmission entérique (ENANB) 1990 : Reyes et al. clonage et séquençage "VHE" 1991 : Tam et al. VHE 2000 : Panda et al. cDNA infectieux V.Thibault DU_janv.-2010 20
  21. 21. V.Thibault DU_janv.-2010 21
  22. 22. VHE Virus non enveloppé Sphérique (SRV) Famille : Hepeviridae Surface irrégulière Genre : Hepevirus Capside 27-34 nm Symétrie icosaédrique ARN simple brin hélice droite polarité + 7,5kb poly-A extrémité 3’ Stabilité Au laboratoire : instable(-70 à +8°C) Décongélation/congélation Tractus GI : stable (pH) V.Thibault DU_janv.-2010 22
  23. 23. Organisation génomique Non structurales Structurales 7 200 nt ARN polarité + 3’NC 5’ NC 28 5109 7124 Poly-A ORF3 MeT Y Pro P X Hel RdRp ORF2 Génotypes 1-3 Protéines DIAGNOSTIC immunogènes Hétérogénéité génétique Au moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés en 24 sous groupes dont homologues animaux : Epitopes majeurs : parties C-ter de l’ORF3 et ORF2 Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype  Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre les différents types ?)  Vaccin : ORF 2 recombinante V.Thibault DU_janv.-2010 23
  24. 24. Hétérogénéité génétique Au moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés en 24 sous groupes dont homologues animaux : I- Birmanie et certaines souches africaines et asiatiques II- Mexique et certaines souches du Niger III- Amérique, Italie, NZ, Autriche, Grèce, Argentine (+ souches porcines) IV- Chine, Taiwan et Japon (plus sévère que III ?) Epitopes majeurs : parties C-ter de l’ORF3 et ORF2  Connaissances limitées sur l’immunité contre les Ag natifs  Parties structurales variables  Grande homologie des parties non structurales  Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype  Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre les différents types ?)  Vaccin : ORF 2 recombinante V.Thibault DU_janv.-2010 24
  25. 25. NL (porc) 301 nt 5' end of ORF2 sequences from 275 HEV strains, 3c Taiwan (porc) Génotype < 20% hétérogénéité ORF2 Japon 3b 3d 3e France, UK, Japon, + porc Espagne + porc Espagne, UK, Grèce, NL, Japon + porc 3f 4e Inde (porc) 3 4a US, Japon, Corée, NL + porc 4 Chine, Taiwan 3a 1 2 Chine, Inde, 4b 1c Nepal, Russie Chine, Taiwan Japon, Vietnam Chine, Pakistan, 1b Bengladesh 4c Inde, Népal, Birmanie, 1a Japon, Espagne 1d 4d Algérie, Namibie, 1e Chine (porc) D'après Lu et al. Rev. Med. Afrique C. Virol. 2006;16:5-36 Mexico, Nigeria 0.05 Maroc, Algérie V.Thibault DU_janv.-2010 25
  26. 26. Similarités des souches humaines et animales Borgen et al. BMC Infectious Diseases 2008, 8:61 Genetic relatedness between HEV strains from human and non-human sources and from various countries. Minimal spanning trees of 81 sequences of 148 nucleotides HEV RNA showing genetic distances between genotype 3 HEV strains from humans and animals. Dutch cases are marked with ID numbers inside the colored circles. V.Thibault DU_janv.-2010 26
  27. 27. Similarités des souches humaines et animales Bilic et al. Journal of General Virology (2009), 90, 863–873 humaines aviaires Unrooted phylogenetic tree of four avian HEV and nine mammalian HEV isolates, based on the complete genome region V.Thibault DU_janv.-2010 27
  28. 28. Similarités des souches humaines et animales Zhao et al. Journal of Medical Virology 81:1371–1379 (2009) Phylogenetic tree of based on full-length sequences HEV genotypes 1, 2, 3, 4, and avian HEV and the new genotype from rabbits. V.Thibault DU_janv.-2010 28
  29. 29. V.Thibault DU_janv.-2010 29
  30. 30. Culture et Modèles animaux • Culture Difficile Culture primaire d’hépatocytes de macaques (cynomolgus) Cellules PLC/PRF/5 hépatocarcinome (Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007) Cellule embryonnaire • Modèles animaux Primates : reproduction de la pathologie humaine Volontaires... VHE du porc, du poulet Présence d’Ac chez poulet, porc, rat, souris, mouton... V.Thibault DU_janv.-2010 30
  31. 31. VHE : Paramètres Biologiques Titre peu élevé protection contre réinfection ? IgG Symptomes Ictère VHE Selles IgM VHE Sang 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 200 V.Thibault DU_janv.-2010 31 Jours
  32. 32. HEV – virémie- selle transmission serum salive Concentré de plaquettes à J0 Transfusé à un homme de 64 ans traité pour Lymphome non-Hodgkinien par GM IgG autologue IgM Matsubayashi K, et al. Transfusion. 2008 Jul;48(7):1368-75. V.Thibault DU_janv.-2010 32
  33. 33. Immunodépression, hépatite chronique et stratégie diagnostique Dans le cadre d'une investigation chez un patient immuno déprimé, La détection du génome viral (RT-PCR) sera privilégiée ! (ceci s'applique pour de nombreux diagnostics viraux - PCR) Kamar et al. American Journal of Transplantation 2008; 8: 1744–1748 V.Thibault DU_janv.-2010 33
  34. 34. Stratégie Diagnostique Marqueurs non biologiques circonstances de la maladie (voyage, autres causes, épidémie) A adapter en fonction de la zone géographique ? (Sud versus Nord ?) clinique : hépatite “classique”, absence de chronicité (chez l'immunocompétent ! ) Absence de marqueurs biologiques : diagnostic d'exclusion Absence des marqueurs des virus des autres hépatites (A, B, C, D) Notions sérologiques pour d’autres virus (EBV, CMV, herpès) Marqueurs sérologiques spécifiques IgM anti-HEV IgG anti-HEV (+++) RT-PCR : détection du génome viral (sang, selles) V.Thibault DU_janv.-2010 34
  35. 35. Spécificité et Sensibilité des ELISAs Epidémie Indonésie, 82 symptomatiques; 174 asymptomatiques; 496 contrôles Comparaison de 5 tests sérologiques Référence = RT-PCR Concordance IgM : 81% Concordance IgG : 85% Myint et al. JCM, 2006, p. 1581–1583 V.Thibault DU_janv.-2010 35
  36. 36. Performance des tests IgM anti-HEV Microplaque Microplaque Test rapide Adaltis MP Diagnostics MP Diagnostics anti-HEV IgG positif négatif positif négatif positif négatif Positif (n=41) 40 1 39 2 37 4 Negatif (n=9) 5 4 5 4 4 5 Total (n=50) 45 5 44 6 41 9 Panels Sensibilité Spécificité VPP VPN 50 sérums ARN HEV (+), G3 % % % % 406 sérums IgG ARN HEV (-) Microplaque Adaltis 90 100 100 98.8 Microplaque MP Diagnostics 88 99.5 95.7 98.5 Test rapide J. Izopet MP Diagnostics 82 100 100 97.8 Comm. Pers. CVV 2008 V.Thibault DU_janv.-2010 36
  37. 37. Stratégie Diagnostique Se donner les moyens de faire le diagnostic Diagnostic Indirect Diagnostic Direct Recherche de l'immunité antivirale Recherche du génome sur IgM anti VHE prélèvements sang et selles IgG anti VHE Diagnostic IgG IgM RT-PCR Certain ++ ++ + Probable - ou + - + Douteux +++ - - Immunité ancienne + - - V.Thibault DU_janv.-2010 37
  38. 38. VHE et vaccination 20 µg d'antigène rHEV (capside exprimée dans baculovirus) dans 0.5 ml de PBS sur 0.5 mg d'hydroxyde d'aluminium. 3 injections Moyenne géométrique du taux d'anticorps anti-VHE Efficacité : 95,5% après 3 doses Risque cumulé d'un premier épisode d'hépatite E Shrestha,et al 2007 N Engl J Med 356;9 V.Thibault DU_janv.-2010 38
  39. 39. Adresser les prélèvements au Centre national de référence du VHE Dr E Nicand Laboratoire de biologie HIA Val de Grâce Tel : 01 40 51 40 00 http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste V.Thibault DU_janv.-2010 39

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