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Quantification des phages par qPCR : Optimisation <ul><li>Traitement à la DNase I: </li></ul><ul><ul><ul><li>DNase I : Sig...
Quantification des phages par qPCR <ul><li>Production de phages pour toutes les souches (sauf VTH7 et 90.0105)  </li></ul>...
Expression des gènes stx1 et eae : Optimisation Choix du kit d’extraction :  RNeasy ®  Mini kit (Qiagen) , Pure Link™ RNA ...
Profil d’expression des gènes  stx1  et  eae Profil 1   Profil 2   Profil 3 Profil 1   Profil 2   Profil 3    Augmentatio...
Conclusions <ul><li>Sensibilité différente des souches à la mitomycine    Profil 1, 2 et 3 </li></ul><ul><li>Souches alim...
Perspectives <ul><li>Etudier l’impact des phages stx sur la cinétique de croissance (mécanisme de lyse) </li></ul><ul><li>...
Merci de votre attention
Perte de phage Testé sur la souche 277.2 (stx1/stx2) à T24h après dénombrement : Sur 30 colonies en  condition A  :    To...
Dénombrement de la souche 277.2 En condition B, les dénombrement effectués à T8h et T24h ne sont pas corréler aux DO     ...
Epidémie en Allemagne <ul><li>  Source :  graines  </li></ul><ul><li>  germées </li></ul><ul><li>Sérotype :  O104:H4 </li>...
Epidémie en France Source :  Steak haché Sérogroupe :   O157 Séropathotype :  A
Bilan des connaissances <ul><li>Induction/acquisition de phages stx:  in vitro </li></ul><ul><li>Production de phage </li>...
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Appréciation moléculaire du risque lié à la présence d’E. coli O26:H11 dans les aliments

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  • EDB : Ecophysiologie et détection Bactérienne
  • E. Coli = bactérie Gram – de la famille des Enterobacteriaceae et genre Escherichia Cause des pathologies tel que des colites hémorragiques, SHU, PTT Les STEC responsable de pathologies sont appelées EHEC pour E. coli entérohémorragiques Réservoir principal sont les bovins. Contamination par produit contaminé et contamination interhumaine traitement symptomatiques. Antibiothérapie controversée Dans les années 40, Kaufmann caractérise les E. coli par la combinaison O:H de leur antigènes lipopolysaccharidiques de paroi (O) et flagellaires (H) pour définir les sérotype.
  • Parmi les différents sérotypes de STEC, le sérotype O157:H7 est le plus connu et retrouvé lors d’épidémie. Cependant On retrouve aussi les sérotypes O26:H11, O103:H2, O111:H8, O145:H28… En 2003, Karmali établit une nouvelle classification des sérotypes de STEC en séropathotype basée sur la sévérité des pathologies engendrées et la fréquence d’apparition d’une pathologie provoquée par les STEC d’un sérotype donné. O26 se classe dans Séropathotype B  Dangerosité non négligeable car associé à des SHU et CH et incidence tout de même modérée.
  • La virulence des STEC est dû à différents facteurs de virulence localisées sur des éléments génétiques mobiles tels que les bactériophage, des plasmides et des îlots de pathogénicité acquis par transfert horizontaux. Parmi ces facteurs nous allons voir plus précisément les shigatoxines aussi appelée vérotoxines, facteur principal de virulence, et le LEE . Les shigatoxines sont codés par deux gènes, stxA et stxB. Le gène stxA code pour la sous unité A qui constitue le domaine catalytique (33kDa). Le gène stxB code pour 5 sous unité B qui forme le domaine de liaison nécessaire à la fixation au récepteur Gb3. Il existe 2 grands types de shigatoxines : stx1 et stx2. stx1 présente une forte homologie avec la toxine de shigella dysenteriae. Stx2 est 1000 fois plus cytotoxique que stx1. Les gènes codant pour les shigatoxines sont portés par des bactériophages de type lambda
  • Comme tout phage de type lambda, le phage stx présent dans le génome de la bactérie peut suivre un cycle lysogénique où le phage est sous forme de prophage dans le génome de la bactérie ; ou un cycle lytique. Le cycle lytique est du à un dommage de l’ADN qui va activer le système SOS et cliver le répresseur cI du génome phagique. Ce qui induit l’expression dans un premier temps des gènes précoce, ce qui permet une multiplication du génome virale et l’expression des antiterminateur N puis Q, ainsi l’antiterminateur Q permet dans un second temps l’expression des gènes tardifs pour l’expression des toxines, l’encapsidation des génomes phagiques et la lyse de la bactérie permettant une libération des phages nouvellement synthétisés et des toxines Stx. Les toxines libérées vont grâce à la circulation sanguine aller se fixer sur des récepteurs Gb3 présent au niveau du rein et du cerveau et provoquer l’inhibition de la synthèse protéique.
  • Afin d’atteindre les objectifs précisés précédemment le mode expérimentale mis au point au laboratoire est le suivant: Tout d’abord chaque souche est ensemencé sur une boîte de TSAYE à partir de culture pure conservé à -20°C. A l’issu d’une incubation de 24h à 37°C, une préculture est réalisé en prélevant une colonie et en incubant la culture. Un nouveau bouillon de culture est ensemecé à 5% avec la préculture. A DO = 0.3, la culture est séparé en 2 suspensions Suspension A = sans ATB et Suspension B où l’on ajoute de la mitomycine C à une concentration final de 0.5µg/ml, un antibiotique ciblant les activités topoisoméras et ADN gyrase donc responsable de lésions d’ADN. Une cinétique sur 24h est réalisé afin de voir les différences de croissance en absence et présence de MitoC et établir des profils de croissance A T24h, après centrifugation, le surnageant de chaque suspension est récupéré, filtré et traité à la Dnase pour quantifier les phages stx par qPCR Et enfin a T0, T2 et T6h, 1ml de chaque suspension est centrifugé pour récupéré uniquement le culot et extraire les ARN totaux. Après Traitement à la Dnase et reverse transcription, les ARN stx sont quantifié par qPCR pour établir des profils d’expression
  • L’étude des cinétiques de croissances des 26 souches O26:H11 nous a permis d’établir 3 profils de croissance en présence de mitomycine C: Profil 1 : La DO 600nm de la culture stagne autour de 1.5 dès 2h de culture et présente parfois une faible diminution entre 8 et 24h jusqu’à une valeur de 1. Profil 2 : La culture atteint son maximum de croissance entre 2 et 6h avec une DO 600nm d’environ 1-1.5 puis la DO diminue jusqu’à 24h pour atteindre une valeur de 0.1-0.6. Profil 3 : Les bactéries atteignent une croissance maximale dès 2h d’incubation autour d’une DO 600nm 1.5 puis cette DO stagne jusqu’à 8h pour ensuite diminuer plus ou moins fortement (valeur finale de 0.2-0.8) entre 8 et 24h. En terme de variant stx, la composition des profils est hétérogène. La répartition des souches est homogène dans les 3 profils : 9, 7 et 10. Cependant on constate que les souches alimentaires sont davantage associées au profil 1 et les souches humaines au profil 3. La cinétique de ces profils laissent penser à une faible libération de phage pour le profil 1 car pas ou faible diminution de DO donc logiquement faible lyse des bactéries ; et une forte libération de phage pour le profil 3 car forte diminution de DO.
  • Afin de pouvoir quantifier les phages présent dans les surnageant de culture après filtration, certaines mise au point ont été effectué, notamment au niveau du traitement à La DNase pour éliminer l’ADN bactérien et le traitement à 100°C pour libérer l’ADN phagique. Différentes Dnase ont été testé et il s’avère que le kit TURbo été le plus efficace, car les échantillons traités présentaient un Ct plus tardif qu’avec les autres Dnase. Ensuite la quantité de DNASE à également été testé. La concentration 2U/µl à été choisi à la suite de ces test. La présence d’un tampon d’incubation pour le traitement à également été testé. Et il s’avère qu’en présence d’un tampon d’incubation contenant des sels, l’enzyme est plus efficace. Enfin des traitements successifs ont été effectué pour voir si l’ADN non dégradé lors du premier traitement pouvait être dégradé lors d’un second voir troisième traitement de 30 minutes à 37°C, mais il a été observé une faible diminution de la quantité d’ADN bactérien après plusieurs traitements successifs par rapport à un traitement unique de 30min. Cependant malgré ces différents point d’optimisation, on peut observé sur ce graphe qu’il n’y a pas une dégradation de 100% des ADN bactérien. De plus selon la reproductibilité du traitement, l’efficacité du traitement diffère. Afin de quantifier l’ADN phagique nous avons donc choisi de soustraire l’ADN bactérien restant (quantifier par qPCR sur le gène O26) à l’ADN phagique quantifier par qPCR sur le gène stx.
  • Ce mode de quantification induit cependant une limite de quantification pour les faibles valeurs de gène stx quantifiés. De ce fait les résultats obtenus en induction spontanée sont souvent faibles voir nuls. Les résultats de quantification des phages obtenus et présents dans ce tableau nous montre que d’une manière générale, le nombre de phages obtenus en condition B est supérieur au nombre de phage obtenu en condition A. Il y a donc une induction, sauf pour les souche VTH7 et 90.0105 où aucun phages n’a été détecté. Cela peu être du à la limite de quantification observée pour les faibles valeurs. On a également pu constater que les phages stx2 était plus induit que les phages stx1 que ce soit en absence ou en présence de mitoC De plus si on considère uniquement le variant stx1, il a été observé que 81% des souches alimentaires présentaient une induction supérieur à 2log/µl en condition B et seulement 22% des souches humaines présentaient une induction supérieur à 2log/µl en condition B. Une comparaison entre profil de croissance et quantité de phages libérés a également été effectué et il s’avère qu’il n’y a pas la forte diminution de DO n’est pas forcément inversement proportionnelle à la quantité de phages libérés, comme cela avait été décrit dans la litératture.
  • Dans le but d’étudier le niveau d’expression du gène stx1 parmi les 26 souches O26:H11, une mise au point des expériences de RT-PCR a été nécessaire. En effet ici ce sont les ARN qui sont analysés. Et ceux-ci étant très fragiles et rapidement dégradés, une optimisation a été réalisé afin d’obtenir une quantité d’ARN totaux la plus importante possible et une intégrité la meilleure possible. Pour cela différents kit d’extraction ont été testé. Les Kit RNeasy et High pure ont donc été choisi. Une optimisation au niveau du traitement à la Dnase et de l’étape de dénaturation lors de la QPCR ont été effectué.
  • Des expériences de RT-PCR ont été réalisé sur un nombre limité de souches appartenant à chacun des trois profils de croissance. Les souches 51.2 (profil 1), ED21 (profil 2) et 260.3 (profil 3), ont été choisies pour faire les profils d’expression. L’expression d’un autre gène de virulence est également inclus (gène eae ) L’expression des gènes stx1 et eae est analysée à différents temps de culture : T15 min, T30 min, T1h, T2h et T8h. Le temps T15min sert de condition contrôle pour la quantification relative de l’expression. Les histogrammes (Fig. 10) montrent nettement une différence d’expression des gènes en fonction de la présence ou non de mitomycine. En effet pour le gène stx1, on constate une nette augmentation de l’expression d’un facteur 7 à 10 en présence de mitomycine. Il en est de même pour le gène eae, avec un facteur cependant un peu moins élevé, allant jusqu’à 5. De plus l’expression du gène eae est plus aléatoire par rapport au gène stx1.
  • Appréciation moléculaire du risque lié à la présence d’E. coli O26:H11 dans les aliments

    1. 1. Appréciation moléculaire du risque lié à la présence d’ E. coli O26:H11 dans les aliments Master de Sciences et Technologies Mention Biologie Moléculaire et Cellulaire Spécialité Microbiologie Niveau 2 Parcours Microbiologie - Appliquée – Environnement - Santé Masson Patricia ANSES – Laboratoire de sécurité des aliments de Maisons-Alfort Unité EDB Encadrant de stage : Frédéric Auvray
    2. 2. Les STEC : E. coli producteurs de Shiga toxines Mb cytoplasmique Paroi/mb externe: Lipopolysaccharides (LPS) antigène somatique « O » ou sérogroupe (n=181) Flagelle: antigène flagellaire « H » (n=56) E.coli cytoplasme Colites hémorragiques, SHU STEC
    3. 3. Les STEC : E. coli producteurs de Shiga toxines (Karmali et al, 2003) King et al , 2009 Séro pathotype Association épidémies Association SHU, CH Sérotypes Incidence relative A fréquente oui O157:H7, O157:NM élevée D rare non multiple E multiple n.a. n.a. faible non humain C rare oui O91:H21, O113:H21, O104 :H21, etc… faible B moins fréquente oui O26:H11, O103:H2, O111:H8, O145:H28 O121:H19 modérée Dangerosité Principaux sérogroupes de STEC responsables de SHU chez l’enfant de moins de 15 ans en France 1996 - 2009
    4. 4. Les facteurs de virulence chromosome Plasmide pEHEC ehxA katP catalase-peroxydase enterohémolysine Locus d’effacement des entérocytes (LEE ) Système de sécrétion de type III O Islands (OI-122, OI-71, OI-57…) Effecteurs de type III (N= 32) (ex: TccP, NleB, NleE, EspL…) Intimine Effecteurs de type III Prophage - stx2  7 sous-types - stx1  4 sous-types espP Serine protease Rosenshine et al . 1996 Gyles et al . 2008 Pedroso et al . 1993 Atteintes intestinales, rénales et neurologiques eae stxA stxB
    5. 5. Les facteurs de virulence : Les shiga toxines Prophage Division Division Multiplication du génome phagique Perte du prophage (très rare) 1ère étape: attachement du phage à la bactérie hôte Capside ADN phage Injection ADN phage Encapsidation des génomes phagiques Cycle lytique Cycle lysogénique Lyse de la bactérie et libération des phages * Lésions ADN (UV, antibiotique, etc…)  Mise en place du système SOS libération Stx SHU induction stx * infection d’autres E.coli émergence de nouveaux clones
    6. 6. <ul><li>Préciser le risque associé à la présence d’ E. coli O26:H11 dans les aliments </li></ul><ul><li>Analyse de la stabilité des phages stx chez les STEC O26:H11 ( in vitro, au cours de l’isolement ?) </li></ul><ul><ul><li> Étude de la capacité à produire des phages (in vitro) </li></ul></ul><ul><ul><li> Étude du niveau d’expression des gènes stx (RT-PCR) </li></ul></ul>Contexte et Objectifs Etude sur 400 fromages au lait cru (2009) => Prévalence non négligeable de STEC O26:H11 et d’ E. coli O26:H11 stx- Induction de phages stx: in vitro => entre 18 % et 89% des STEC produisent des phages en présence de mitomycine C (Garcia-Aljaro et al . 2009; Muniesa et al . 2004) Induction des phages stx in vivo : => Isolement de souches stx- chez les animaux et chez l’homme Objectifs du stage:
    7. 7. Matériels et Méthodes Isolement sur boite de Pétri 24h à 37°C Préculture dans un bouillon de TSB 18-24h à 37°C 240rpm Ensemencement à 5% d’un nouveau bouillon TSB contenant 0,5 mM de CaCl 2 final À DO 600nm ≈ 0.3 A = Sans ATB B = MitoC 0.5µg/ml Cinétique sur 24h à 37°C 240rpm À T24h, Centrifugation, récupération du surnageant, Filtration, Traitement à la DNase et Traitement à 100°C Quantification des phages stx Profil de croissance des souches O26:H11 À T15, T30, T1, T2, T4 et T8h : 1ml pour Centrifugation, récupération du culot, Extraction des ARN totaux, Traitement à la DNase, Reverse Transcription Profil d’expression des gènes stx 1 et eae
    8. 8. Cinétique de croissance Exemple de la souche 51.2 (stx1 + ) Exemple de la souche 329 S 89 (stx1 + ) Exemple de la souche 6061/96 (stx2 + ) Profil 1 Profil 2 Profil 3 9 / 26 dont : 6 alimentaires 2 humaines 1 bovine 10 / 26 dont : 2 alimentaires 8 humaines 7 / 26 dont : 4 alimentaires 2 humaines 1 bovine
    9. 9. Quantification des phages par qPCR : Optimisation <ul><li>Traitement à la DNase I: </li></ul><ul><ul><ul><li>DNase I : Sigma, kit TURBO DNA- free™ ( Ambion) , DNase I recombinant (Roche) </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Quantité de DNase  2U/µl </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Incubation dans un tampon  OUI </li></ul></ul></ul><ul><li>Traitement efficace </li></ul><ul><li>Mais pas de dégradation à 100% </li></ul><ul><li> Soustraction de l’ADN bactérien (O26) à l’ADN phagique (stx) </li></ul>
    10. 10. Quantification des phages par qPCR <ul><li>Production de phages pour toutes les souches (sauf VTH7 et 90.0105) </li></ul><ul><li>Nb de phages en condition B > Nb de phages en condition A  Induction par la mitomycine C </li></ul><ul><li>Quantité Phages stx2 > stx1 </li></ul><ul><li>Pour stx1, différence souches alimentaires/humaines : la quantité de phages en condition B est supérieur à 2log/µl pour : </li></ul><ul><li>- 9/13 des souches alimentaires </li></ul><ul><li>- 2/9 des souches humaines </li></ul><ul><li>Pas de corrélation entre ∆DO et la quantité de phages libérés : </li></ul><ul><li>- 129.2 et L23A : ∆DO faible et stx élevé </li></ul><ul><li>93-624 et 96-723 : ∆DO élevé et stx faible </li></ul>
    11. 11. Expression des gènes stx1 et eae : Optimisation Choix du kit d’extraction : RNeasy ® Mini kit (Qiagen) , Pure Link™ RNA Mini Kit (Ambion) et High Pure RNA Isolation kit (Roche) Traitement à la DNase  dans la colonne selon kit et post-colonne avec Kit TURBO™ DNA- free Programme qPCR  Passage de 20 sec à 10min lors de l’étape de dénaturation pour l’activation de l’enzyme Echantillon ng/µl A260/A280 A260/A230 RN 170.2 A1 426,3 2,06 2,18 RN 170.2 A2 331,3 2,09 1,57 HP 170.2 A1 430 2,06 1,99 HP 170.2 A2 397,5 2,09 2,33 PL 170.2 A1 254,2 2,11 2,13 PL 170.2 A2 358,1 2,09 2,11 RN 170.2 A1 489,2 1,99 1,82 RN 170.2 A2 492 1,98 1,4 HP 170.2 A1 374,5 1,95 1,65 HP 170.2 A2 459,9 2 1,95 PL 170.2 A1 239,5 2,01 1,69 PL 170.2 A2 325,9 2 1,68 23 S (2,9kb) 16S (1.5kb) M RN PL HP M
    12. 12. Profil d’expression des gènes stx1 et eae Profil 1 Profil 2 Profil 3 Profil 1 Profil 2 Profil 3  Augmentation de l’expression de stx1 d’un facteur 7 à 10 en présence de mitomycine  Augmentation de l’expression de eae jusqu’à un facteur 5 en présence de mitomycine
    13. 13. Conclusions <ul><li>Sensibilité différente des souches à la mitomycine  Profil 1, 2 et 3 </li></ul><ul><li>Souches alimentaires  Profil 1 Souches humaines  Profil 3 </li></ul><ul><li>Pas de corrélation entre ∆DO et la quantité de phages synthétisés : Intervention d’autres facteurs? - Présence d’autres phages </li></ul><ul><li>- Taux de croissance de la bactérie </li></ul><ul><li> Patrimoine génétique de la bactérie </li></ul><ul><li>Libération de phages : - Toutes les souches ne produisent pas la même quantité de phages (conditions spontanée et induite) </li></ul><ul><li> - induite > spontanée  Mitomycine C </li></ul><ul><li> - stx2 > stx1 </li></ul><ul><li>RT-PCR : ↑ de l’expression stx1 et eae en présence de mitomycine </li></ul>
    14. 14. Perspectives <ul><li>Etudier l’impact des phages stx sur la cinétique de croissance (mécanisme de lyse) </li></ul><ul><li> Réalisation de dénombrements (en complément de la lecture de DO) </li></ul><ul><li>incluant un dénombrement des colonies stx- (hybridation sur colonies) </li></ul><ul><li> Cinétique de croissance de souches dépourvues de leur phage stx </li></ul><ul><li>Améliorer la méthode de quantification des phages </li></ul><ul><li> purification des phages par ultracentrifugation </li></ul><ul><li> conforter la quantification des ADN bactériens par un autre gène  fliC H11 </li></ul><ul><li>Dosage des toxines Stx </li></ul><ul><li> Test ELISA </li></ul><ul><li>Comparaison de l’expression des gènes stx et eae pour l’ensemble des souches </li></ul>
    15. 15. Merci de votre attention
    16. 16.
    17. 17. Perte de phage Testé sur la souche 277.2 (stx1/stx2) à T24h après dénombrement : Sur 30 colonies en condition A :  Toutes sont stx1/stx2 Sur 30 colonies en condition B :  29 sont stx1/stx2  1 est uniquement stx1 Testé sur les souches stx1 F15-313 et 238.2 à T24h après dénombrement : Sur 24 colonies de chaque souche:  Aucune stx- <ul><li>Dans la littérature : </li></ul><ul><li>Perte de phage: Fréquence de la perte spontanée des phages stx (sans mitomycine C) au sein d’une culture pure de STEC O26:H11 => 10 à 14% des cellules sont stx -négatives </li></ul><ul><li>- Perte des phages stx chez les animaux : 23 % souches O157:H7 stx -négatives (Wetzel and Lejeune 2007) </li></ul><ul><li>- Perte des phages stx chez les patients : isolement d’E.coli stx- chez 5.5% des patients (Bielaszewska et al . 2007) </li></ul>
    18. 18. Dénombrement de la souche 277.2 En condition B, les dénombrement effectués à T8h et T24h ne sont pas corréler aux DO  Filamentation ? T8h T24h A B A B DO600nm 2 1,54 2 0,62 Dénombrement (UFC/ml) 1,13E+09 2,69E+08 3,75E+09 2,63E+08 1,12E+09 4,50E+07 1,33E+09 1,21E+08
    19. 19. Epidémie en Allemagne <ul><li> Source : graines </li></ul><ul><li> germées </li></ul><ul><li>Sérotype : O104:H4 </li></ul><ul><li>Séropathotype : C </li></ul><ul><li>Jamais impliqués dans épidémie, seulement des cas sporadiques en Allemagne en 2001 et Corée en 2005 </li></ul><ul><li>93 % du génome de ces souches est identique à celui de bactéries E. coli enteroaggrégatif (EAggAC)  ont gènes permettant de se maintenir dans intestin de façon plus stable </li></ul><ul><li>Variant : stx2 </li></ul><ul><li>Transfert horizontale du phage stx2 des STEC vers EAggAC? </li></ul>
    20. 20. Epidémie en France Source : Steak haché Sérogroupe : O157 Séropathotype : A
    21. 21. Bilan des connaissances <ul><li>Induction/acquisition de phages stx: in vitro </li></ul><ul><li>Production de phage </li></ul><ul><li>=> entre 18 % et 89% STEC produisent des phages en présence de mitomycine C </li></ul><ul><li>Garcia-Aljaro et al . 2009 (79 STEC, eaux usées, 35 sérotypes) </li></ul><ul><li>Muniesa et al . 2004 (168 STEC, bovins, 71 sérotypes) </li></ul><ul><li>Bielaszewska et al . 2007 </li></ul>

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