20ème conférence plénière organisée par Quality Assistance s.a.
« Les Impuretés dans les Principes Actifs
d'Origine Biotec...
Exposé des travaux de la Commission SFSTP (Société Française des Sciences et
Techniques Pharmaceutiques) de 2011 à 2013
Pr...
PROGRAMME DE LA CONFERENCE
16:30 - 16:35 Accueil / présentation de la conférence - G.VanVyncht
16:35 - 16:43 Introduction,...
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PRESENTATION DES TRAVAUX DE LA COMMISSION SFSTP
Les impuretés da...
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INTRODUCTION
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Le contexte
Les produits biologiques ont une importance
médicale et économique croiss...
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Le contexte
De nombreuses questions se posent.
Quel niveau de caractérisation et à qu...
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Les membres de la commission
Alain Beck Pierre-Fabre
Jean-François Boé Pierre-Fabre P...
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Objectif de la commission
Établir un consensus sur la recherche des impuretés
dans le...
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La méthodologie retenue
Prise en compte de la particularité des produits
biologiques....
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Les Produits biologiques
Un médicament d’origine biologique est :
Un produit dont la ...
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Pureté des produits biologiques
La notion de pureté appliquée à un produit biologique...
www.sfstp.org 1Copyright SFSTP 2011
Importance thérapeutique et économique des
produits biologiques
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Importance thérapeutique et économique des produits
biologiques
Biothérapeutiques
246...
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Protéines & anticorps thérapeutiques recombinants:
chiffres d’affaires 2012/2013
La M...
4
6 mAbs sur les 10 biologiques les plus vendus
Biopharmaceutical benchmarks 2014, G. Walsh. Nat. Biotechnol 32, 992 (2014)
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Importance thérapeutique et économique des produits
biologiques
Biothérapeutiques
Chi...
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Anticorps thérapeutiques
Anticorps monoclonaux (AcM) et dérivés
Immunoglobulines de t...
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AcM: raisons du succès
Thérapies ciblées avec une très forte sélectivité
h7C10/ dalot...
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IgG approuvées: « nues » & conjuguées
Beck A et al, Médecine Sciences 2009
IgG:
Murin...
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Fab et
Protéines/Peptides de fusion Fc
Fab
Monovalent
½ vie courte
Fab Pegylé
Monoval...
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2014 ramucirumab (VEGFR2) siltuximab(IL6) vedolizumab (a4b7) + Secukimab, dinutuxima...
Biosimilaire
Copie d’un anticorps approuvé avec la même séquence en acides aminés
Produit par un clone et un procédé de fa...
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Structure / Fonction
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Structure des anticorps
Anticorps = Immunoglobuline (Ig)
Glycoprotéines
soluble dans ...
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Profil électrophorétique de protéines sériques
Structure des anticorps
Support de l’i...
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Structure des anticorps
Synthèse des immunoglobulines
Cellule souche Progenit. B Cell...
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Anticorps polyclonaux vs monoclonaux
Sélection
Hybridisation
Clones
Ab1
Ab2
Ab3
Ab4
S...
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Décrite en 1959 par Porter et Edelman (prix Nobel 1972)
4 chaînes polypeptidiques
2 c...
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Structure des anticorps monoclonaux
IgG1
16 ponts S-S (4 inter et 12 intra-chaines)
R...
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Structure-Fonction des anticorps monoclonaux
Fonctions
effectrices
Ag
Fixation aux ré...
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Structure-Fonction des anticorps monoclonaux
Les modes d’actions des anticorps monocl...
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Production des anticorps monoclonaux
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La production d’anticorps monoclonaux
Succès thérapeutiques et commerciaux des antico...
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Procédés de culture cellulaire pour
la production d’anticorps
La forte demande en ant...
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Développement de lignée cellulaire
1
•Transfection avec un vecteur d’expression conte...
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Développement d’Anticorps monoclonaux:
Optimisation de l’USP
Criblage de formulations...
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USP Platform
Centrifugation
WCB
Production
Bioreactor
Ex 15000L
Spinner
Flask
Seed cult...
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DSP platform : Example A-Mab
Protein A affinity
chromatography
Remove HCP, DNA,
small...
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2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pI
HCP
Virus
Endotoxins
DNA
Flow through
Capture
2 3 4 5 6 7 8 ...
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Conclusion
 Organisation du développement des anticorps
thérapeutiques en mode plate...
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Copyright SFSTP 2011
Hétérogénéité des produits biologiques
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Particularité des produits biologiques
Une des particularités des produits biologique...
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Complexité structurale
6 nm 16 nm1 nm
Aspirine
C9H8O4
= 180 Da
Interferon b 1a
(165 a...
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Hétérogénéité des IgG’s
N-term : PyroGlu
C-term clivage (-lys)
C-term amidation
Varia...
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Hétérogénéité des IgGs
Each half antibody has: 2 x 8 x 4 x 4 x 5 x 5 x 2 = 12800 poss...
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Hétérogénéité versus Pureté du produit
La notion de pureté appliquée à un produit
bio...
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Les contraintes pour le fabricant
Le fabricant doit définir le profil d’hétérogénéité...
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Les guidances ne définissent pas certains aspects:
Étendue de la caractérisation?
Niv...
STRATEGIE DE CONTRÔLE ET
CONTEXTE REGLEMENTAIRE
Profil de Qualité Cible du Produit (ICH Q8)
Un descriptif des caractéristiques qualité que
doit présenter un produit pharm...
Attribut de Qualité Critique –AQC (ICH Q8)
Un AQC est une propriété ou une
caractéristique physique, chimique, biologique
...
Identification des AQCs (ICH Q11)
Identification des AQCs est un challenge pour
les produits complexes
Large nombre d’AQCs...
Evaluation de risque et AQCs (ICH Q11)
Connaissance préalable utilisable en début de
développement
Connaissance liée au mé...
Classification des AQCs proposée
Classification de la criticité de l’AQC inspirée
du « A-Mab : a case study in Bioprocess
...
Classification des AQCs proposée
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Activité biologique
ou efficacité
PK/PD Immunogénici...
Stratégies de développement (ICH Q11)
Doit comprendre au minimum:
Identification des AQCs potentiels liés au principe acti...
Stratégie de contrôle (ICH Q10-ICH Q11)
Une stratégie de contrôle est un ensemble de
contrôles qui assure la performance d...
Stratégie de contrôle (ICH Q11)
Stratégie de contrôle peut comprendre:
Contrôles de différents matériaux (matières
premièr...
Approche suivie
La stratégie de contrôle présentée a pris en compte les
différents textes réglementaires disponibles (cf a...
Impuretés (ICH 11-ICH Q6B)
Les impuretés représentent une classe
importante d’AQCs potentiels à cause de leur
impact évent...
Approche suivie
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Impuretés
Attribut
qualité
Sécurité/
Efficacité
Limites généralement...
Evolution au cours du développement du
produit
L’établissement des spécifications est un processus
évolutif:
Qui prend en ...
Evolution au cours du développement du
produit
Changements du procédé de fabrication sont
inévitables
Echelle de productio...
Stratégie de contrôle prise en compte lors
études de comparabilité analytique
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Spécif...
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VARIANTS DE MASSE
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2
VARIANTS DE
MASSE
Catégorie
Attribut
qualité
Impact Limites acceptables
Méthodes
d’...
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Méthodes à utiliser dépendent de la taille des
aggrégats
Particle counter
nm
Size Exc...
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4
Separation basée sur la taille des molécules
Temps d’élution (min)
Detection (UV 28...
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-1,0
52,0
4,0
8,0
12,0
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UltraVioletResp...
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1) Mesure de la Masse Moléculaire
2) L’intensité de la lumière diffusée est liée à
...
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27,0
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33,0
36,0
RightAngleLightS...
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8
Sortie
Solvant
Port
d’injection
Entrée
Solvant
Fritté
Membrane cellulosique avec cu...
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9
Etape 1: Injection
Entrée
Sortie
Injection
Asymetric Flow Field Flow Fractionation:...
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Etape 2: Relaxation
Membrane UF
Injection
Entrée
Sortie
Asymetric Flow Field Flow...
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Membrane UF
Etape 3: Elution
Injection
Entrée Sortie
Asymetric Flow Field Flow Fr...
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Asymetric Flow Field Flow Fractionation:
exemple
Dimer
Monomère
~ 400kDa
200kD
― UV
...
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13
Coefficient de sédimentation
C(s) via logiciel SEDFIT
ABS acquisition in function...
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Analyse du même lot d’anticorps par 3 techniques:
1. SEC-LS
L’aggrégat majoritaire e...
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Analyse du même lot d’anticorps par 3 techniques:
2. A4F-LS
Dimère
Monomère
Aggrégat...
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Analyse du même lot d’anticorps par 3 techniques:
3. SV-AUC
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18...
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96.5%
3.5% (3.2% dimère)
ND
A4F
95.9%
3.4% (3.2% dimère)
0.8%
SEC
Monomère
Aggrégats...
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Diffusion dynamique de la lumière (DLS)
L'intensité diffusée par des grosses particu...
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DLS: comparaison de l’état d’aggrégation de
différents lots
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Comparaison des méthodes
Chromatographie
d’exclusion
A4F AUC (SV) DLS
Sensibilité de...
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VARIANTS DE MASSE
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Les fragments
Impuretés
Attribut
qualité
Sécurité /
Efficacité
Limites acceptables M...
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La fragmentation est une dégradation
omniprésente dans les protéines
Processus enzym...
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La fragmentation des anticorps monoclonaux est
fréquemment observée
Clivages des ant...
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Différents mécanismes de fragmentation décrits
Fragmentation de la région charnière ...
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Les méthodes de suivi de la fragmentation
SEC-UV : exemple
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Asymetric Flow Field Flow Fractionation
Exemple IgG1
molar mass vs. time
B200849_021...
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Les méthodes électrophorétiques : SDS-PAGE
Exemples IgG1
SDS-PAGE en condition rédui...
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Electrophorèse capillaire en gel CE-SDS
Principe :
Le gel de séparation utilisé en é...
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Electrophorèse capillaire en gel CE-SDS
Exemple :
Clivage de la région charnière d’u...
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Comparaison des techniques
Exemple IgG1
4 semaines à 40°C
SEC
CGE
En condition dénat...
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Les impuretés liées au procédé de fabrication
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Les protéines de l’hôte
Impuretés
Attribut
qualité
Sécurité/Efficacité
Limites généra...
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Les protéines de l’hôte : HCP’s
HCP « Host cell protein » : Protéines codées et produ...
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HCP. Les méthodes d’évaluation
Immuno essais :
Utilisation de kit de détermination
An...
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ELISA
Fixation Ac Iaire polyclonaux
Fixation HCP (échantillon)
Fixation Ac Iaire conj...
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Les Kits de détermination
Kits génériques commerciaux :
Mammifères : CHO, NS/0, PER.C...
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ADN RESIDUEL DE L’HOTE
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Impuretés
Attribut
qualité
Sécurité/Efficacité
Limites généralement
acceptées ou
régl...
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DNA Threshold:
1) Réaction: Incubation de l’ADN dénaturé
(simple brin) avec les réact...
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DNA Threshold:
Quantification générique d’ADN simple brin.
Haute sensibilité (2 pg)....
Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 11
PCR quantitative
 Principe: Amplification spécifique d’ADN et détection en temps ré...
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Ex. Elimination de l’ADN en cours de purification
En cours de purification l’ADN de ...
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ANALYSE DES ENDOTOXINES
ENDOTOXINESTEST DE
STERILITE RESIDUEL DE
L’HOTE
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Les endotoxines bactériennes
Impuretés
Attribut
qualité
Sécurité/Efficacité
Limites ...
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Les endotoxines sont des lipopolysaccharides faisant partie de la paroi
des bactérie...
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Le test Lapin et son successeur
En 1950, découverte de l’aptitude des cellules sangu...
Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 17
 Méthode de Gel clot:
Les différents types de tests LAL
Cascade enzymatique en prés...
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CONTAMINATION MICROBIENNE
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Impuretés
Attribut
qualité
Sécurité/Efficacité
Limites généralement
acceptées ou
rég...
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Contamination microbienne
Essai de dénombrement microbien
Essai de dénombrement micr...
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Test de sterilité
Le principe de la méthode est de mettre en contact l’échantillon à...
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 Comment réalise-t-on le test ?
L’échantillon est inoculé dans des milieux nutritif...
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ANTIBIOTIQUE RESIDUEL
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Antibiotique résiduel
Impuretés Attribut qualité Sécurité/Efficacité
Limites général...
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Ex. Dosage d’un antibiotique résiduel par U-HPLC /UV
Developpement d’une méthode de ...
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ANTIMOUSSE (ex. silicone)
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Technologie & principe de l’ICP-AES
Détermination de la concentration en Silicium (m...
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Technologie & principe de l’ICP-AES
• Système d’introduction de l’échantillon consti...
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Protéine A
Impuretés
Attribut
qualité
Sécurité/Efficacité
Limites généralement
accep...
VARIANTS DE CHARGE
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VARIANTS DE
CHARGE
Variants influençant la charge nette de la protéine, liés à des mo...
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CHROMATOGRAPHIE D’ECHANGE D’IONS
Interactions ioniques entre un support solide et les...
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CHROMATOGRAPHIE D’ECHANGE D’IONS
Séparation en fonction de la charge nette de
surface...
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Exemple pratique - WCX d’un mAb
Buts :
– Comparaison de lot à lot
– Etude de stabilit...
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Acquired By: EDERE
21/03/2009 23:07:11
WCX_complément
23/03/2009 9:11:53
hétérogénéit...
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IEF (IsoElectric Focusing) SUR GEL
Séparation dans un gel intégrant un gradient de
pH...
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Exemple pratique - IEF d’un mAb
pI
3
10
Variants de charge
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ELECTROPHORESE CAPILLAIRE - c-IEF
Séparation dans un capillaire / Gradient de pH
Les ...
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Exemple pratique : c-IEF d’un mAb
Minutes
27 28 29 30 31 32
AU
0.00
0.02
0.04
AU
0.0...
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Exemple pratique : c-IEF de 3 mAb
Variants de charge
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Comparaison WCX vs c-IEF
WCX
c-IEF
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
Minutes
0.00 10.00 20.00 3...
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Comparaison IEF vs c-IEF
IEF
c-IEF
Minutes
27 28 29 30 31 32
AU
0.00
0.02
0.04
AU
0....
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« Imaging » c-IEF
Même principe de base que la c-IEF
Pas de mobilisation car suivi d...
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Exemple pratique : ic-IEF d’un mAb
pI 5.12
pI 7.90
ic-IEF
IEF
Sensibilité : LOQ ~ 1 ...
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PEPTIDE MAPPING ET
SPECTROMETRIE DE MASSE
UPLC/UV, UPLC-UV-MS/MS,
MALDI-TOF, …
Prote...
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Exemple pratique - Cartographie peptidique
d’un mAb vs substance de référence
UPLC/U...
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Exemple pratique - Cartographie peptidique
du Trastuzumab - Séquences N et C-term.
V...
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Exemple pratique - Cartographie peptidique
du Trastuzumab - Séquence C-terminale
Séq...
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Exemple pratique - Cartographie peptidique
du Trastuzumab - Séquence N-terminale
Séq...
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DOSAGE D’ACIDES SIALIQUES
Peuvent induire de fortes variations de la charge
nette de...
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Exemple pratique - Dosage d’acides sialiques
Hydrolyse acide douce, puis dérivatisat...
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VARIANTS DE CHARGE - DISCUSSION
Résultats analytiques « comparables » et
complémenta...
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Variants conformationnels et autres variants
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Autres variants
Origine
Attribut
qualité
Impact Limites acceptables
Méthodes
d’analys...
Autres variants
Mésappariement des ponts disulfures
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Autres variants
Mésappariement des ponts disulfures
Changement de structure détectable par:
– Test d’activité,
– Test de s...
Autres variants
Thiols libres
Détermination par UV-visible après réaction au
DTNB (méthode Ellman).
– Problème de sensibil...
Autres variants
Asp / isoAsp
Changement de l’efficacité de la liaison de
l’anticorps détectable par:
– Test d’affinité
Mis...
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Oxydation
Oxydation principalement sur les Méthionines
et les Tryptophanes.
Ajout majoritairement de 16uma...
Autres variants
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ms
770 772 774 776 778 780 782 784 786
m/z0
100
%
ACRA30 25 (0.874) S...
Autres variants
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Exemple d’oxydation de la Méthionine détectée par MS
Spectre MS/MS
ms...
Autres variants
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HC
H2C
H
S
O
CH3
Mécanisme proposé pour la perte de
64uma depuis la ...
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Variants
conformères
La probabilité d’observer un variant conformationnel pour un an...
Autres variants
12
Exemple de spectres DC obtenus pour
5 échantillons différents
-10
-5
0
5
10
15
20
190 200 210 220 230 2...
Autres variants
13
Exemple de spectres FT-IR obtenus
pour 5 échantillons différents
1560 1600 1640 1680 1720
Wavenumber (c...
Variants conformationnels
et autres variants
CONCLUSION
Etude principalement faite en
caractérisation ou en investigation ...
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VARIANTS DE GLYCOSYLATION
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Glycosylation des IgGs
Introduction
Structures
Fonctions
Impact sur la PK et la sécur...
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Glycosylation des IgGs thérapeutiques
Les glycanes
Ne représentent que 2-3% de la mas...
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Glycosylation: structure de base
et formes majoritaires
Les N-glycoformes des domaine...
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Glycosylation: formes xenobiotiques
(liées aux systèmes de production)
Les AcM produi...
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Optimisation de la glycosylation
(par selection ou ingénierie)
Formes a-fucosylées
Au...
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1) IgG intacte ou réduite
LC-ESI-TOF
150 kDa LC: 25 kDa HC: 50 kDa
&
2) N-Glycanes (d...
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LC-ES-TOF: IgG intacte +/- PNGase F
(A) mAb-1 (NS0) (B) mAb-1 + PNGase F (- N-glycans...
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LC-ESI-TOF bottom-up: interpretation
(A) Chaîne Lourde (B) IgG (NS0)
IgG
Glycoforms
C...
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NanoLC-MS/MS fragmentation
12 glycoformes détectées et fragmentées par MS/MS
E. Wagn...
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NanoLC-MS/MS fragmentation
MS/MS information sur la séquence en acide-aminé et empre...
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Chromatographie en phase normale
Digestion séquentielle
(exoglycosidases)
a) Neurami...
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2-AB oligosaccharides (NP-HPLC + MALDI-TOF)
Peak isolation and
MALDI-TOF analysis
Ca...
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CE-SDS: taux d’IgG non glycosylée
(A)
Information rapide, sensible et quantitative :...
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Trastuzumab + PNGase F: CE-LIF
Trastuzumab (Herceptin) glyco-profile (production en ...
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Trastuzumab + PNGase F: CE-LIF
Trastuzumab (Herceptin) glyco-profile (production en ...
Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 17
IgGs glycosylation: résumé
 Beck A & Reichert JM, mAbs 2012
Présentationsuivante
CONCLUSION
Différentes catégories d’impuretés des P.A. d’origine biotechnologique :
Notion d’hétérogénéité des produits bi...
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Les Impuretés dans les Principes Actifs d'Origine Biotechnologique

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Lors de cette conférence, les différentes catégories d’impuretés potentiellement présentes dans une substance active d’origine biotechnologique ont été étudiées. Pour chacune d’entre elles, une évaluation de la criticité en termes de sécurité et d’efficacité, une ou plusieurs solutions analytiques et une stratégie de contrôle adaptée ont été présentées. Les anticorps monoclonaux ont été utilisés comme exemple mais les recommandations se voudront extrapolables à d’autres types de protéines recombinantes. Les différents sujets ont été abordés par des experts en ces matières.

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Les Impuretés dans les Principes Actifs d'Origine Biotechnologique

  1. 1. 20ème conférence plénière organisée par Quality Assistance s.a. « Les Impuretés dans les Principes Actifs d'Origine Biotechnologique » Jean-François BOE - Head of Analytical Section - Institut de Recherche Pierre Fabre Laurent DUHAU - Global Biotherapeutics / Head of Analytics & Formulation - Sanofi Aventis Olivier LALOUX - Technology Platform Analytical R&D, Director - GlaxoSmithKline Vaccines Nicolas MOUZ - CEO - Promise Advanced Proteomics Géry VAN VYNCHT - R&D Director - Quality Assistance 1 Géry Van Vyncht, R&D Director, S&I Dpt, Quality Assistance 09.12.2014
  2. 2. Exposé des travaux de la Commission SFSTP (Société Française des Sciences et Techniques Pharmaceutiques) de 2011 à 2013 Présentation à Paris le 24 mai 2013 Différentes catégories d’impuretés potentiellement présentes dans une substance active d’origine biotechnologique. Evaluation globale de la criticité en termes de sécurité et d’efficacité Une ou plusieurs solutions analytiques et une stratégie de contrôle adaptée 2 Géry Van Vyncht, R&D Director, S&I Dpt, Quality Assistance 09.12.2014
  3. 3. PROGRAMME DE LA CONFERENCE 16:30 - 16:35 Accueil / présentation de la conférence - G.VanVyncht 16:35 - 16:43 Introduction, contexte et objectifs - J-F.Boé 16:43 - 16:50 Importance thérapeutique et économique des produits biologiques - N.Mouz 16:50 - 17:00 Structure / Fonction des mAbs - J-F.Boé 17:00 - 17:10 Principe de production des mAbs - N.Mouz 17:10 - 17:20 Notion d’hétérogénéité des produits biologiques - O.Laloux 17:20 - 17:35 Stratégie de contrôle et contexte réglementaire - L.Duhau 17:35 - 17:45 Break 17:45 - 18:05 L’analyse des impuretés liées au procédé de fabrication - O.Laloux 18:05 - 18:25 L’analyse des impuretés liées au produit - Variants de masse - L.Duhau et J-F.Boé 18:25 - 18:50 L’analyse des impuretés liées au produit - Variants de charge, de glycosylation et variants conformationnels - G.VanVyncht 18:50 - 19:00 Conclusion et Q&A 3Présentationsuivante
  4. 4. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 1 Copyright SFSTP 2011 PRESENTATION DES TRAVAUX DE LA COMMISSION SFSTP Les impuretés dans les principes actifs biologiques et biotechnologiques
  5. 5. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 2 INTRODUCTION
  6. 6. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 3 Le contexte Les produits biologiques ont une importance médicale et économique croissante. Les technologies progressent rapidement Procédés de fabrication Techniques analytiques Les produits sont de mieux en mieux caractérisés. L’analyse reste complexe et le niveau de connaissance est à adapter au stade de développement. Émergence des biosimilaires Contexte réglementaire en évolution constante
  7. 7. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 4 Le contexte De nombreuses questions se posent. Quel niveau de caractérisation et à quel stade de la vie du produit ? Quelles méthodes choisir ? Définir une stratégie de contrôles C’est pour apporter des éléments de réponse que la commission a été mise en place
  8. 8. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 5 Les membres de la commission Alain Beck Pierre-Fabre Jean-François Boé Pierre-Fabre Président Aude Carrié Ceva Katia Chohbane Eusapharma Laurent Duhau Sanofi Aventis Olivier Laloux GSK BIO (Belgique) Nicolas Mouz Px-Therapeutics Elise Richard Avogadro Luc-Alain Savoy SGS (Suisse) Vice-président Gery Van Vyncht Quality Assistance (Belgique) Yannick Vuillamy Eurofins Vice président Maria Zanta-Boussif Novartis (Suisse)
  9. 9. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 6 Objectif de la commission Établir un consensus sur la recherche des impuretés dans les produits biologiques. Proposer des recommandations qui aideront à établir une stratégie de contrôle analytique, adaptée au stade de développement du produit.
  10. 10. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 7 La méthodologie retenue Prise en compte de la particularité des produits biologiques. Anticorps monoclonaux utilisés comme modèle Revue des différents types d’impuretés Évaluation de leur potentielle criticité Proposition de stratégies de contrôle adaptées: Revue des méthodes analytiques utilisables Choix des méthodes à mettre œuvre en caractérisation/libération/stabilité Limites d’acceptation
  11. 11. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 8 Les Produits biologiques Un médicament d’origine biologique est : Un produit dont la substance active a été produite ou extraite à partir d’une source biologique et dont la caractérisation et la détermination de la qualité nécessitent un ensemble d’essais physico-chimiques et biologiques, ainsi que la connaissance de son procédé de fabrication et de son contrôle (cf directive Européenne 2001/83). Une des particularités des produits biologiques réside dans leur complexité structurale et leur hétérogénéité: Hétérogénéité structurale liée à la nature de la molécule et au système de production. Le fabricant doit définir le profil d’hétérogénéité du produit et en démontrer la reproductibilité.
  12. 12. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 9 Pureté des produits biologiques La notion de pureté appliquée à un produit biologique est relative: 1. le produit n’existant pas sous forme d’un seule espèce moléculaire 2. la pureté mesurée est également fonction des méthodes analytiques utilisées. En conséquence la pureté doit être évaluée par une combinaison de méthodes basées sur des principes différents méthodes orthogonales Présentationsuivante
  13. 13. www.sfstp.org 1Copyright SFSTP 2011 Importance thérapeutique et économique des produits biologiques
  14. 14. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 2 Importance thérapeutique et économique des produits biologiques Biothérapeutiques 246 produits biologiques approuvés sur les marchés US et EU 54 nouveaux biologiques 2010-2014 dont 17 anticorps thérapeutiques Chiffres d’affaires Anticorps thérapeutiques Indications Raisons du succès Variétés de structures Anticorps et dérivés approuvés Biosimilaires, biobetters et nouvelles générations
  15. 15. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 3 Protéines & anticorps thérapeutiques recombinants: chiffres d’affaires 2012/2013 La Merie 2013
  16. 16. 4 6 mAbs sur les 10 biologiques les plus vendus Biopharmaceutical benchmarks 2014, G. Walsh. Nat. Biotechnol 32, 992 (2014)
  17. 17. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 5 Importance thérapeutique et économique des produits biologiques Biothérapeutiques Chiffres d’affaires Anticorps thérapeutiques Indications Raisons du succès Variétés de structures Anticorps et dérivés approuvés Biosimilaires, biobetters et nouvelles générations
  18. 18. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 6 Anticorps thérapeutiques Anticorps monoclonaux (AcM) et dérivés Immunoglobulines de type G (IgGs) Environ 50 AcM & dérivés approuvés (EMA/FDA) Indications thérapeutiques multiples Maladies inflammatoires et auto-immunes, cancers Transplantation, maladies infectieuses, cardiovasculaires, sanguines, allergies et ophtalmiques Plus de 400 en pré-clinique et en clinique Premiers biosimilaires anticorps approuvés Inflectra (Hospira) Remicade/infliximab Remsima (Celltrion) Remicade/infliximab
  19. 19. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 7 AcM: raisons du succès Thérapies ciblées avec une très forte sélectivité h7C10/ dalotuzumab = antagoniste de IGF-1R et non du récepteur à l’ Insuline (70 % homologie de séquence) Goetsch L, Beck A et al, Int J Cancer Res 2005 IgGs = PK favorable (jusqu’à 3 semaines) Faible toxicité (10 g/L IgG endogènes dans le plasma) Procédé de production mature et transférable (2 à 20,000 L) De nombreuses méthodes analytiques « génériques » Taux de succès plus important de la Phase I à l’AMM: AcM (25-29 %) vs petites molécules (11 %) Reichert JM, mAbs 2013
  20. 20. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 8 IgG approuvées: « nues » & conjuguées Beck A et al, Médecine Sciences 2009 IgG: Murine Chimerique Humanisée Humaine Isotype: 1, 2 ou 4 IgG- conjuguées: Cytotoxique Radio- isotope Hybr CHO NS0SP2/0
  21. 21. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 9 Fab et Protéines/Peptides de fusion Fc Fab Monovalent ½ vie courte Fab Pegylé Monovalent ½ vie longue TNFR-Fc Récepteur soluble Peptide-Fc Long ½ life Beck A et al, Médecine Sciences 2009 E. coli CHO E. coli
  22. 22. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 10 2014 ramucirumab (VEGFR2) siltuximab(IL6) vedolizumab (a4b7) + Secukimab, dinutuximab, nivolumab, pembrolizumab 2013 itolizumab(CD6)[Ind] ado trastuzumab emtansine(HER2) 2012 mogamulizumab[low Fuc] (CCR4)[Jpn] pertuzumab(HER2) ziv-aflibercept[PrFc] (VEGF) raxibacumab(antrax) 2011 brentuximab vedotin[IgG1-vcMMAE] (CD30) belatacept[PrFc] (CD80/86) aflibercept[PrFc] (VEGF) belimumab(BLysS) ipilimumab(CTLA-4) 2010 denosumab[IgG2] (RANK-L) 2009 golimumab(TNFa) catumaxomab(EpCAM/CD3) ustekinumab(IL12/23) canakinumab(IL1) ofatumumab(CD20) 2008 rinolacept[PrFc] (IL1) certolizumab[Fab-PEG] (TNFa) romiplostim[FcPe] (TPO)[Clotinab/”abciximab”, So-Ko] 2007 eculizumab[IgG2/4] (C5) [Reditux/”rituximab” Ind] 2006 ranibizumab[Fab] (VEGFA) panitumumab[IgG2] (EGFR) 2005 nimotuzumab[Chi](EGFR) abatacept[PrFc] (CD80/86) tocilizumab(IL6R)[Jpn] 2004 cetuximab(EGFR) bevacizumab(VEGFA) natalizumab[IgG4] (a4 integr) 2003 131I-tositumomab[mIgG2a] (CD20) omalizumab(IgE-Fc) efalizumab(CD11a)[withdrawn, 2009] alefacept[PrFc] (CD2) 2002 111In/90Y-ibritumomab tiuxetan[mIgG1] (CD20) adalimumab(TNFa) 2001 alemtuzumab(CD52) 2000 gemtuzumab ozogamicin[IgG4-calicheamycin] (CD33) )[withdrawn, 2010] 1998 basiliximab(CD25) palivizumab(RSV-F) infliximab(TNFa) trastuzumab(HER2) etanercept[PrFc] (TNFa) Technologies 1997 rituximab(CD20) daclizumab(CD25) Transgenic mice (10y) 1996 1995 edrecolomab[mIgG2a] (EpCAM) [Ger, withdrawn] 1994 abciximab[Fab] (GPIIb) Phage display (9Y) 1993 Humanization (11Y) 1986 muromomab[mIgG2a] (CD3) Chimerization (10 Y) 1984 [1984: Nobel Prize for mAbs] Therapeutic Antibodies & related- products landmarks (INN= International Non-proprietary Names, WHO) * FDA, EMEA, SFDA and /or DCGI (SFDA = China FDA; DCGI = Drugs Controller General of India) > 50 mAbs, Fabs, Fc-fusions, ADCs, RadioICs, Bispecs
  23. 23. Biosimilaire Copie d’un anticorps approuvé avec la même séquence en acides aminés Produit par un clone et un procédé de fabrication différents Différence de glycosylation et de micro-variants Biobetters (ou Biosuperiors) Anticorps avec une séquence en acide aminé identique ou proche et: Un profil de glycosylation optimisé (ex. Faible teneur en fucose => ADCC forte) Ou avec 2 ou 3 acides aminés mutés dans la partie Fc (augmenter la demi-vie) Nouvelle générations et dérivés Séquence en acides aminés, épitope, mécanisme d’action différents Copyright SFSTP 2011 11www.sfstp.org Présentationsuivante
  24. 24. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 1 Structure / Fonction
  25. 25. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 2 Structure des anticorps Anticorps = Immunoglobuline (Ig) Glycoprotéines soluble dans le plasma et dans de nombreuses sécrétions membranaire comme élément du récepteur de l’Antigène à la surface des lymphocyte B. Les anticorps sont sécrétés par des cellules dérivées des lymphocytes B : les plasmocytes.
  26. 26. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 3 Profil électrophorétique de protéines sériques Structure des anticorps Support de l’immunité humorale Concentration circulante = environ 15g/L Immunoglobulines appartiennent à la fraction g des protéines sériques Profil très hétérogènes traduisant la diversité structurale des immunoglobulines
  27. 27. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 4 Structure des anticorps Synthèse des immunoglobulines Cellule souche Progenit. B Cell. B matures Réarrangement gènes Cell. B mémoire Plasmocyte Ag Cell. B naïve Activation et différentiation Ag dépendante Maturation indépendante de l’Ag
  28. 28. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 5 Anticorps polyclonaux vs monoclonaux Sélection Hybridisation Clones Ab1 Ab2 Ab3 Ab4 Sérum polyclonal renferme un mélange d’anticorps spécifique d’un des quatre épitopes. 2 Ag 1 3 4 Epitopes 1 + Lignée myélome 1 3 4 2 Cellules isolées de rate Lymphocyte B Ab1 Ab2 Ab3 Ab4 Un anticorps monoclonal dérivé d’une cellule plasmatique unique est spécifique d’un seul épitope
  29. 29. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 6 Décrite en 1959 par Porter et Edelman (prix Nobel 1972) 4 chaînes polypeptidiques 2 chaînes légères (LC  25 kDa) 2 chaînes lourdes (HC  50 KDa) Chaînes oligosaccharides Masse moléculaire théorique 150 000 Da LC LC HC HC Structure des anticorps monoclonaux
  30. 30. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 7 Structure des anticorps monoclonaux IgG1 16 ponts S-S (4 inter et 12 intra-chaines) Régions constantes et régions variables Chaîne lourde = 1 domaine variable (VH) et 3 constants (CH) Chaîne légère = 1 domaine variable (VL) et 1 constant (CL) CH2CH3 3 régions hypervariables = CDR’S (complementary determining regions) CDR1 CDR3 CDR2Fab : Fragment antigen binding Fc : Fragment cristallisable
  31. 31. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 8 Structure-Fonction des anticorps monoclonaux Fonctions effectrices Ag Fixation aux récepteurs du Fc Fc g RIIIA, fixation des cellules NK Antibody Dependent cell cytotoxicity (ADCC) Cellule NK FcRn  demi-vie longue Activation du complément (CDC) Activités anti-inflammatoires Fixation de l’antigène Agoniste Antagoniste
  32. 32. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 9 Structure-Fonction des anticorps monoclonaux Les modes d’actions des anticorps monoclonaux thérapeutiques Complexes Contributions de mécanismes multiples Kress GB, modified from Hasmann M. 2009 Présentationsuivante
  33. 33. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 1 Production des anticorps monoclonaux
  34. 34. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 2 La production d’anticorps monoclonaux Succès thérapeutiques et commerciaux des anticorps monoclonaux ont induit des besoins en : Développement rapide de procédés de production Production en grande quantité d’anticorps thérapeutiques (doses élevées) Production à des coûts modérés La similarité des propriétés biochimiques et chromatographiques de la classe des anticorps ont permis aux industries biotechnologiques et pharmaceutiques d’organiser des: Plateformes de production (culture cellulaire): plateformes USP (Upstream processing) Plateformes de purification: plateformes DSP (Downstream processing)
  35. 35. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 3 Procédés de culture cellulaire pour la production d’anticorps La forte demande en anticorps monoclonaux a accéléré les développements en bioproduction notamment en culture de cellules mammifères. 20 ans de R&D intensive ont conduit aux développements de: Lignées cellulaires hautement productives (20 à 100 pg/cell/jour) Lignées cellulaires robustes en culture en bioréacteur (haute densité) Milieux chimiquement définis et optimisés Stratégies de feed optimisées Bioréacteurs plus performants (échanges gazeux, on-line monitoring…) Bioréacteurs de 20 000 L avec des rendements de 5 à 10 g/L d’anticorps
  36. 36. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 4 Développement de lignée cellulaire 1 •Transfection avec un vecteur d’expression contenant les gènes des chaînes lourdes et légères + un gène codant pour un marqueur de sélection 2 •Application d’une pression de sélection 3 •Clonage cellulaire par dilution limite, en présence d’une pression de sélection 4 •Criblage des clones producteurs 5 •Mise à l’échelle en erlen 6 • Amplification du gène 7 •Répétition des cycles d’amplification des gènes et sélection des clones hautement producteurs 8 • Sélection des meilleurs clones en terme de productivité et de qualité du produit 9 • Etablissement d’une banque cellulaire 10 • Evaluation de la stabilité de la lignée cellulaire 0 Lignées cellulaires utilisées : CHO, PER.C6, HEK, NS0, SP2/0
  37. 37. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 5 Développement d’Anticorps monoclonaux: Optimisation de l’USP Criblage de formulations de milieux (i.e. CHO Media Library) Analyse de milieux: Sucres, Acides Aminés, Métabolites  optimisation des milieux en bioréacteurs de 50 mL Optimisation des conditions de culture pour optimiser la productivité (i.e. Température, Impeller Speed, pH & DO)
  38. 38. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org USP Platform Centrifugation WCB Production Bioreactor Ex 15000L Spinner Flask Seed culture expansion in bags DSP platform Depth filtration Removal of suspended cells and cell debris Clarified bulk 0.2 µm filtration Seed culture expansion in bioreactor Seed culture expansion in bioreactor Ex 3000L Harvest 6
  39. 39. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 7 DSP platform : Example A-Mab Protein A affinity chromatography Remove HCP, DNA, small molecules Low pH viral Inactivation Filter 0.2 µm tank Cation exchange Chromatography Reduce aggregates and HCP Tank Tank Tank Tank Formulation: Ultrafiltration and Diafiltration UF/DF Bulk Drug substance Small virus retentive filtration Anion exchange Chromatography Remove HCP, DNA, Protein A and endotoxins Final filtration Clarified bulk Fill and freeze Filter 0.2 µm Filter 0.2 µm Filter 0.2 µm 25 kDa _ 50 kDa _ 150 kDa _
  40. 40. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 8 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pI HCP Virus Endotoxins DNA Flow through Capture 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11pH pI HCP Virus Endotoxins Capture Flow through Cation Exchange  Anion Exchange DSP platform mAbs mAbs DNA pH
  41. 41. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 9 Conclusion  Organisation du développement des anticorps thérapeutiques en mode plateformes USP et DSP – Lignées cellulaires hautement productives – Culture haute densité en bioréacteurs – Plateforme DSP robuste – Développement rapide de procédés de production – Capitalisation des connaissances Présentationsuivante
  42. 42. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 1 Copyright SFSTP 2011 Hétérogénéité des produits biologiques
  43. 43. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 2 Particularité des produits biologiques Une des particularités des produits biologiques réside dans leur complexité structurale et leur hétérogénéité: Hétérogénéité structurale liée à la nature de la molécule et au système de production.
  44. 44. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 3 Complexité structurale 6 nm 16 nm1 nm Aspirine C9H8O4 = 180 Da Interferon b 1a (165 amino acids) C908H1406N246O252S7 = 20 025 Da (Variant principal) Trastuzumab (IgG1) (1326 amino acids) C6560H10132O2090N1728S44 = 148 057 Da (Variant principal)
  45. 45. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 4 Hétérogénéité des IgG’s N-term : PyroGlu C-term clivage (-lys) C-term amidation Variants de N-glycosylation O-glycosylation Oxydation (Met, Trp) Deamidation (Asn  Asp) Isomerisation (Asp  IsoAsp) Succinimide (Asn/Asp  Suc) Glycation (Lys-Glc) Proteolyse (clivage Asp/Pro) Dimères et Agrégats Fragments d’IgG (H2L, H2, HL, H, L) Mésappariement Thiol libre Thioether Cystéinylation Remaniement ponts S-S
  46. 46. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 5 Hétérogénéité des IgGs Each half antibody has: 2 x 8 x 4 x 4 x 5 x 5 x 2 = 12800 possible states Assuming both halves of antibody are independent : (12800)² =~108 possible combinations D’après Kozlowski & Swann, Advanced Drug Delivery Review, 2006 (58) 707-722 Pyro-E 2 Deamidation 23 Methionine oxidation 2 x 2 Glycation 2 x 2 High mannose, G0, G1, G2 5 Sialylation 5 Clipping of C-term lysine 2 pE E M D O iD E OO O D D DD D GG K K G Structural variations #variation/IgG
  47. 47. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 6 Hétérogénéité versus Pureté du produit La notion de pureté appliquée à un produit biologique est dès lors relative: le produit n’existant pas sous forme d’un seule espèce moléculaire (présence de variants apparaissant lors de la production et/ou conservation du produit). la pureté mesurée est également fonction des méthodes analytiques utilisées. En conséquence la pureté doit être évaluée par une combinaison de méthodes basées sur des principes différents
  48. 48. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 7 Les contraintes pour le fabricant Le fabricant doit définir le profil d’hétérogénéité du produit et en démontrer la reproductibilité vis-à-vis des lots utilisés lors des études cliniques. En fonction de leurs propriétés (comparables ou non au produit recherché), les variants pourront être considérés comme faisant partie du produit ou bien comme impuretés. Si le profil d’hétérogénéité du produit est caractérisé et reproductible, une évaluation de l’activité, efficacité, sécurité (incluant l’immunogénicité) des formes individuelles (variants) peut ne pas être nécessaire.
  49. 49. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 8 Les guidances ne définissent pas certains aspects: Étendue de la caractérisation? Niveaux acceptables? Interprétation au cas par cas. Ce manque de « clarté » permet de prendre en compte: La capacité du process à éliminer certains variants. La diversité des hétérogénéités, certaines n’étant pas encore connues. L’évolution constante des technologies. Les contraintes légales Présentationsuivante
  50. 50. STRATEGIE DE CONTRÔLE ET CONTEXTE REGLEMENTAIRE
  51. 51. Profil de Qualité Cible du Produit (ICH Q8) Un descriptif des caractéristiques qualité que doit présenter un produit pharmaceutique pour obtenir la qualité cible, basée sur l’efficacité et la sécurité du produit (Quality Target Product Profile) Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 2
  52. 52. Attribut de Qualité Critique –AQC (ICH Q8) Un AQC est une propriété ou une caractéristique physique, chimique, biologique ou microbiologique qui doit être dans un intervalle ou limite donné pour assurer le profil de qualité cible du produit La liste des potentiels AQCs peut évoluer au cours du développement Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 3
  53. 53. Identification des AQCs (ICH Q11) Identification des AQCs est un challenge pour les produits complexes Large nombre d’AQCs pour les produits biologiques rend impossible une évaluation complète de chaque AQC sur l’efficacité et la sécurité Evaluation de risque peut être utilisée pour prioriser les AQCs. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 4
  54. 54. Evaluation de risque et AQCs (ICH Q11) Connaissance préalable utilisable en début de développement Connaissance liée au mécanisme d’action et à la caractérisation biologique (relation structure activité) peut aider Evaluation mise à jour au cours du développement Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 5
  55. 55. Classification des AQCs proposée Classification de la criticité de l’AQC inspirée du « A-Mab : a case study in Bioprocess development »,CMC Biotech Working group, version 2.1, 30th october 2009). Pour certains AQC (notamment les impuretés résiduelles), le risque doit être pondéré par la probabilité d’occurrence Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 6
  56. 56. Classification des AQCs proposée Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 7 Activité biologique ou efficacité PK/PD Immunogénicité Sécurité Action CRITICITE FORTE Changement important Changement important Impact fort sur la sécurité et/ou l’efficacité Effets indésirables Test de libération avec critères d’acceptation CRITICITE MOYENNE Changement modéré Changement modéré Impact modéré sur la sécurité et/ou l’efficacité Effets indésirables acceptables Possibilité de ne pas faire le test à libération, si justification Pas de test en libération. Test uniquement réalisé à des fins de caractérisation Pas d’effet CRITICITE FAIBLE Pas de changement ou changement acceptable Pas d’impact Pas d’immunogénicité
  57. 57. Stratégies de développement (ICH Q11) Doit comprendre au minimum: Identification des AQCs potentiels liés au principe actif afin qu’ils soient étudiés et contrôlés Définition d’un procédé de fabrication approprié Définition d’une stratégie de contrôle Peut comprendre en plus Compréhension approfondie du procédé (lien paramètres procédé - AQCs) Stratégie de contrôle adaptée (Gestion Risque qualité /Design space) Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 8
  58. 58. Stratégie de contrôle (ICH Q10-ICH Q11) Une stratégie de contrôle est un ensemble de contrôles qui assure la performance du procédé et la qualité du produit Basée sur la compréhension actuelle du produit et du procédé Stratégie de contrôle peut être développée par une approche combinée, traditionnelle pour certains AQCs/étapes et plus avancée pour d’autres. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 9
  59. 59. Stratégie de contrôle (ICH Q11) Stratégie de contrôle peut comprendre: Contrôles de différents matériaux (matières premières, réactifs, conditionnement primaire,..) Contrôles implicites liés au design du procédé de fabrication séquence des étapes de purification Contrôles en cours de fabrication contrôles et paramètres procédés Contrôles du principe actif tests à libération,.. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 10
  60. 60. Approche suivie La stratégie de contrôle présentée a pris en compte les différents textes réglementaires disponibles (cf article SFSTP) Une liste des différentes impuretés a été établie sous forme de tableaux: La criticité en termes de sécurité et d’efficacité du produit est proposée. Les méthodes analytiques les plus couramment utilisées Les limites généralement acceptées Une stratégie de contrôle est décrite L= test à libération S = test en suivi de stabilité C =test de caractérisation Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 11
  61. 61. Impuretés (ICH 11-ICH Q6B) Les impuretés représentent une classe importante d’AQCs potentiels à cause de leur impact éventuel sur la sécurité Les impuretés peuvent être: Liées au procédé de fabrication Protéines de la Cellule Hôte (HCP), ADN, constituant milieux de culture, protéine A résiduelle,… Liées au produit: variants moléculaires formés durant la fabrication ou le stockage et n’ayant pas des propriétés comparables à celle du produit recherché en terme d’activité, efficacité et sécurité Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 12
  62. 62. Approche suivie Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 13 Impuretés Attribut qualité Sécurité/ Efficacité Limites généralement acceptées ou réglementées Méthodes Utilisation du test ELISA (kit commercial) L (Ph1-2) ELISA (Kit spécifique) L (Ph3) SDS-PAGE Investigation Electrophorèse 2D Investigation Western blot Investigation HCP Fort Sécurité Mab <100 ng/mg[i]
  63. 63. Evolution au cours du développement du produit L’établissement des spécifications est un processus évolutif: Qui prend en compte l’amélioration de la connaissance de la substance active, du procédé et la relation liant les attributs qualité à la sécurité et l’efficacité du produit. Pour la phase 1, les spécifications sont: établies dans l’objectif essentiel de la sécurité du patient à partir d’une connaissance limitée. Pour les phases de développement ultérieures les spécifications permettront d’assurer la reproductibilité des lots en rapport avec l’efficacité clinique validée Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 14
  64. 64. Evolution au cours du développement du produit Changements du procédé de fabrication sont inévitables Echelle de production, amélioration du rendement, de la qualité,… Les études de comparabilité sont alors requises (ICH Q5E) pour vérifier l’impact de la modification sur la qualité du produit (attributs qualité). Comparaison analytique du produit avant et après changement avec les tests de libération/stabilité complétés par des tests de caractérisation Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 15
  65. 65. Stratégie de contrôle prise en compte lors études de comparabilité analytique Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 16 Spécifications Substance active (tests à libération +/_stabilité) Tests de caractérisation Substance active Contrôle du procédé (contrôles en cours fabrication,..) Reproductibilité Comparabilité Présentationsuivante
  66. 66. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 1 VARIANTS DE MASSE
  67. 67. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 2 2 VARIANTS DE MASSE Catégorie Attribut qualité Impact Limites acceptables Méthodes d’analyse Utilisat° du test Aggrégats solubles (oligomères ou assemblages hétérogènes) Fort Sécurité 5% d’aire (pratique courante) SEC UV L / S SEC MALS A4F MALS Ultra- centrifugation analytique DLS C Variants de masse Remarques : Le SDS-PAGE sera plutôt utilisée pour l’évaluation de l’intégrité de la molécule. Les critères sur les particules visibles et sub visibles sont principalement fixés au niveau du produit fini
  68. 68. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 3 Méthodes à utiliser dépendent de la taille des aggrégats Particle counter nm Size Exclusion Chromatography mm µm Soluble Insoluble 10-mer Release methods Irreversible / reversible / covalent aggregates IgG ~5 nm Dimer Sub-visible particles Visible particles Particle counter nm Size Exclusion Chromatography mm µm Soluble Insoluble 10-mer Release methods Irreversible / reversible / covalent aggregates IgG ~5 nm Dimer Sub-visible particles Visible particles DLS (Dynamic Light Scattering) FCM (Flow Cell Microscopy) A4F (Asymmetrical flow field flow fractionation) SV-AUC Velocity sedimentation Méthodes orthogonales pour caractérisation
  69. 69. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 4 4 Separation basée sur la taille des molécules Temps d’élution (min) Detection (UV 280nm) Principe de la chromatographie d’exclusion
  70. 70. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 5 5 -1,0 52,0 4,0 8,0 12,0 16,0 20,0 24,0 28,0 32,0 36,0 40,0 44,0 48,0 UltraVioletResponse(mV) 0,000 8,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 4,000 4,500 5,000 5,500 6,000 6,500 7,000 7,500 LogMolecularWeight 5,10 12,30 Retention Volume (mL) 5,4 5,7 6,0 6,3 6,6 6,9 7,2 7,5 7,8 8,1 8,4 8,7 9,0 9,3 9,6 9,9 10,2 10,5 10,8 11,1 11,4 11,7 Data File: _33_T0_6mois_010_01.vdt Method: cali BSA UV 18.09-0001.vcm Aggrégats Monomère Produits de fragmentation UV 280nm Méthode de routine pour la quantification des variants de masse Chromatographie d’exclusion avec détection UV
  71. 71. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 6 6 1) Mesure de la Masse Moléculaire 2) L’intensité de la lumière diffusée est liée à taille de la molecule : détection de trace d’aggrégats Mesure de la concentration UV/RI Laser Détecteur 1 Détecteur 2 Détecteur 3 I(θ)diffusée∝ MW C (dn/dc)2 Couplage chromatographie d’exclusion avec des détecteurs UV et à diffusion de lumière
  72. 72. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 7 7 -1,0 40,0 3,0 6,0 9,0 12,0 15,0 18,0 21,0 24,0 27,0 30,0 33,0 36,0 RightAngleLightScatteringResponse(mV) 0,000 8,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 4,000 4,500 5,000 5,500 6,000 6,500 7,000 7,500 LogMolecularWeight 5,10 12,30 Retention Volume (mL) 5,4 5,7 6,0 6,3 6,6 6,9 7,2 7,5 7,8 8,1 8,4 8,7 9,0 9,3 9,6 9,9 10,2 10,5 10,8 11,1 11,4 11,7 Data File: _33_T0_6mois_010_01.vdt Method: cali BSA UV 18.09-0001.vcm 150kDa 300kDa900kDa Dimère Monomère Aggrégats de Masse élevée ― UV (280nm) ― LS Couplage chromatographie d’exclusion avec des détecteurs UV et à diffusion de lumière
  73. 73. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 8 8 Sortie Solvant Port d’injection Entrée Solvant Fritté Membrane cellulosique avec cuttof 10KDa A4F: Séparation dans un canal sans phase stationnaire Elution selon la taille, mais dans l’ordre inverse à la SEC Asymetric Flow Field Flow Fractionation: principe
  74. 74. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 9 9 Etape 1: Injection Entrée Sortie Injection Asymetric Flow Field Flow Fractionation: principe
  75. 75. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 10 10 Etape 2: Relaxation Membrane UF Injection Entrée Sortie Asymetric Flow Field Flow Fractionation: principe
  76. 76. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 11 11 Membrane UF Etape 3: Elution Injection Entrée Sortie Asymetric Flow Field Flow Fractionation: principe
  77. 77. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 12 Asymetric Flow Field Flow Fractionation: exemple Dimer Monomère ~ 400kDa 200kD ― UV --- LS A4F avec détection UV et diffusion de lumière
  78. 78. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 13 13 Coefficient de sédimentation C(s) via logiciel SEDFIT ABS acquisition in function of radius C(s) distribution Monomer Oligomers Fragment produts Vitesse de sédimentation est fonction de la masse et de la forme des molécules Cellule Sv-AUC: principe de l’ultracentrigugation analytique
  79. 79. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 14 Analyse du même lot d’anticorps par 3 techniques: 1. SEC-LS L’aggrégat majoritaire est un dimère (300kDa) Dimère Monomère ~Trimère — UV LS — MW distribution
  80. 80. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 15 Analyse du même lot d’anticorps par 3 techniques: 2. A4F-LS Dimère Monomère Aggrégats> dimère — UV LS — MW distribution L’aggrégat majoritaire est un dimère (300kDa)
  81. 81. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 16 Analyse du même lot d’anticorps par 3 techniques: 3. SV-AUC 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 C(s) S Dimère Monomère Aggrégats> dimère X 30 L’aggrégat majoritaire est un dimère (300kDa)
  82. 82. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 17 96.5% 3.5% (3.2% dimère) ND A4F 95.9% 3.4% (3.2% dimère) 0.8% SEC Monomère Aggrégats LMW 96.5% (+/- 1.3%) 3.5% (3% +/- 0.7 dimère] ND SV-AUC (moyenne de 4 mesures) 96.5% 3.5% (3.2% dimère) ND A4F 95.9% 3.4% (3.2% dimère) 0.8% SEC Monomère Aggrégats LMW 96.5% (+/- 1.3%) 3.5% (3% +/- 0.7 dimère] ND SV-AUC (moyenne de 4 mesures) Bonne corrélation entre les 3 techniques pour la détection et la quantification des aggrégats Analyse du même lot d’anticorps par 3 techniques: quantification
  83. 83. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 18 Diffusion dynamique de la lumière (DLS) L'intensité diffusée par des grosses particules (moins mobiles) varie moins vite au cours du temps que pour des petites particules (mouvements browniens) La fonction d'autocorrélation permet de comparer le signal mesuré à lui-même, mais avec un petit décalage temporel. Le coefficient de diffusion des particules permet d’accéder au rayon hydrodynamique et à un indice de polydispersité
  84. 84. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 19 DLS: comparaison de l’état d’aggrégation de différents lots
  85. 85. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 20 Comparaison des méthodes Chromatographie d’exclusion A4F AUC (SV) DLS Sensibilité de détection des aggrégats Modéré modéré modéré Elevé Résolution Modéré à fort Modéré à fort Modéré à fort Faible Gamme de taille d’aggrégats Faible Modéré Modéré Elevé Débit d’échantillons Elevé Faible à modéré Faible Elevé Quantification Elevé Elevé Elevé Faible Difficulté technique Facile Expertise technique requise Expertise technique requise (y compris traiterment des données) Facile Développement de méthode nécessaire Faible à modéré Modéré Faible Faible Remarques Interférence possible de la phase stationnaire avec les aggrégats Méthode sans colonne Méthode sans colonne
  86. 86. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 21 VARIANTS DE MASSE
  87. 87. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 22 Les fragments Impuretés Attribut qualité Sécurité / Efficacité Limites acceptables Méthodes Utilisation du test Variants de masses [A1] Fragments Moyen Efficacité Ph1-2 : Profil des fragments et des valeurs quantitatives sont générées. A ce stade, vu le recul limité (faible nombre de lots) des critères d’acceptation ne sont généralement pas requis pour les fragments individuels. Ph3 : Identification des fragments. Spécification pour les fragments majeurs (critères quantitatifs d’acceptation) Une ( ou plusieurs méthodes) à sélectionner parmi les suivantes : -SDS-PAGE -CGE -SEC UV L et S Spectrométrie de masse A4F C
  88. 88. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 23 La fragmentation est une dégradation omniprésente dans les protéines Processus enzymatique ou spontané Observé malgré la grande stabilité de la liaison peptidique. Sites de clivages sont fonction de multiples facteurs L’enchaînement des acides aminés Les structures IIaire, IIIaire et IVaire modifiant la flexibilité l’accessibilité au solvant ou rapprochant des chaînes latérales d’acides aminés éloignées sur la séquence Différents mécanismes décrits : Hydrolyse enzymatique ou chimique, -élimination Catalyse par des métaux ou des radicaux Fonction du pH
  89. 89. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 24 La fragmentation des anticorps monoclonaux est fréquemment observée Clivages des anticorps monoclonaux localisés surtout : Régions constantes Région charnière Région peu structurée et flexible  accessible aux solvants Modifié d’après Cohen S. L. et al, JACS 2007 + IgG1 Fc-Fab Fab
  90. 90. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 25 Différents mécanismes de fragmentation décrits Fragmentation de la région charnière d’après Vlasak J. et al mAbs 2011) Facteurs déterminants dans le mécanisme : pH Chaîne latérale des acides aminés Métaux ou radicaux
  91. 91. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 26 Les méthodes de suivi de la fragmentation SEC-UV : exemple
  92. 92. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 27 Asymetric Flow Field Flow Fractionation Exemple IgG1 molar mass vs. time B200849_021[B200831-SS-120605-001] time (min) 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 molarmass(g/mol) 5 1.0x10 Fragment 2 Fragment 1 Agrégat
  93. 93. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 28 Les méthodes électrophorétiques : SDS-PAGE Exemples IgG1 SDS-PAGE en condition réduite sur mAb stressé Analyse par SDS-PAGE non réduite du pic SEC Fab Vlasak J et al,mAbs 2011 Cohen S. et al JACS 2007
  94. 94. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 29 Electrophorèse capillaire en gel CE-SDS Principe : Le gel de séparation utilisé en électrophorèse SDS-PAGE est remplacé par un capillaire rempli. Les protéines sont séparées selon leur taille, analysées intactes ou après réduction
  95. 95. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 30 Electrophorèse capillaire en gel CE-SDS Exemple : Clivage de la région charnière d’un IgG D’après Rustandi R. et al, Electrophoresis 2011 37°C, 28J
  96. 96. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 31 Comparaison des techniques Exemple IgG1 4 semaines à 40°C SEC CGE En condition dénaturante la présence de SDS détruit les interactions non covalentes de fragments ne provenant pas du clivage de la région charnière Présentationsuivante
  97. 97. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 1Copyright SFSTP 2011 Les impuretés liées au procédé de fabrication
  98. 98. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 2 Les protéines de l’hôte Impuretés Attribut qualité Sécurité/Efficacité Limites généralement acceptées ou réglementées Méthodes Utilisation du test HCP Fort Sécurité Mab <100 ng/mg ELISA (kit commercial) L (Ph1-2) ELISA (Kit spécifique) L (Ph3) SDS-PAGE Investigation Electrophorèse 2D Investigation Western blot Investigation ADN de l’hôte Moyen Sécurité < 10 ng/dose (WHO Taille < 200 paires de bases Q-PCR L (1 des 2 méthodes )Threshold® ou équivalent. Picogreen® ou équivalent Investigation Remarque : Picogreen , faible sensibilité (5ng/ml), plutôt en screening ou en contrôle procédé. Endotoxine Fort Sécurité 5 UI/kg masse corporelle pour la dose maximale administrée en 1 heure .(P h Eur.) LAL Ph EUR. L, S Contamination microbienne Fort Sécurité Contamination microbienne* ou stérilité L, S Remarque : * dans le cas où la stérilité du lot de principe actif vrac n’est pas revendiquée •:
  99. 99. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 3 Les protéines de l’hôte : HCP’s HCP « Host cell protein » : Protéines codées et produites par l’organisme hôte (cellule , bactérie,..) sans rapport avec le produit recombinant voulu. Composition est fortement dépendante du système d’expression – E. coli 4300 gènes – NS0 30000 gènes Lors du procédé de purification du produit, les protéines de la cellule hôte peuvent être co-purifiées. En raison de leur potentielle immunogénicité, les HCP’s doivent être analytiquement évaluées pour assurer : Sécurité du patient Constance du produit
  100. 100. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 4 HCP. Les méthodes d’évaluation Immuno essais : Utilisation de kit de détermination Anticorps polyclonaux – générés contre un lysat de la cellule hôte sans le gène nécessaire à l’expression du produit recombinant voulu – Purifiés par affinité contre le même lysat Q6B For host cell proteins, a sensitive assay e.g., immunoassay, capable of detecting a wide range of protein impurities is generally utilised. In the case of an immunoassay, a polyclonal antibody used in the test is generated by immunisation with a preparation of a production cell minus the product- coding gene, fusion partners, or other appropriate cell lines.
  101. 101. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 5 ELISA Fixation Ac Iaire polyclonaux Fixation HCP (échantillon) Fixation Ac Iaire conjugués Principe de l’essai : Réaction enzymatique S P
  102. 102. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 6 Les Kits de détermination Kits génériques commerciaux : Mammifères : CHO, NS/0, PER.C6, HEK 293, MRC5 Bactériens et levures : E.coli, Pichia, S.cerevesiae Différents fournisseurs : Cygnus, Lonza, Charles River Kits spécifiques : Spécifique d’un produit Multi-produits Plate-forme de production Avantages/Inconvénient Kit commerciaux pas de développement moins spécifiques Kits spécifiques Bonne spécificité 12 à 18 mois de développement Wang X. Biotech. Bioeng. 2009
  103. 103. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 7 ADN RESIDUEL DE L’HOTE
  104. 104. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 8 Impuretés Attribut qualité Sécurité/Efficacité Limites généralement acceptées ou réglementées Méthodes Utilisation du test HCP Fort Sécurité Mab <100 ng/mg ELISA (kit commercial) L (Ph1-2) ELISA (Kit spécifique) L (Ph3) SDS-PAGE Investigation Electrophorèse 2D Investigation Western blot Investigation ADN de l’hôte Moyen Sécurité < 10 ng/dose (WHO Taille < 200 paires de bases Q-PCR L (1 des 2 méthodes )Threshold® ou équivalent. Picogreen® ou équivalent Investigation Remarque : Picogreen , faible sensibilité (5ng/ml), plutôt en screening ou en contrôle procédé. Endotoxine Fort Sécurité 5 UI/kg masse corporelle pour la dose maximale administrée en 1 heure .(P h Eur.) LAL Ph EUR. L, S Contamination microbienne Fort Sécurité Contamination microbienne* ou stérilité L, S Remarque : * dans le cas où la stérilité du lot de principe actif vrac n’est pas revendiquée •Impuretés liées au procédé de fabrication :
  105. 105. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 9 DNA Threshold: 1) Réaction: Incubation de l’ADN dénaturé (simple brin) avec les réactifs: mAb anti-ADN /urease, Biotin-SSB (prot. E. coli), Streptavidine 2) Séparation: Transfert sur unités de filtration (membrane biotinylée). 3) Détection: Insertion de la membrane dans le système Threshold (contenant le substrat “urée”). L’hydrolyse de l’urée entraine un changement de pH qui est détecté par un sensor potentiométrique (µV/sec).
  106. 106. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 10 DNA Threshold: Quantification générique d’ADN simple brin. Haute sensibilité (2 pg). Validable. Largement accepté par les autorités.
  107. 107. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 11 PCR quantitative  Principe: Amplification spécifique d’ADN et détection en temps réel du produit amplifié par suivi de l’émission de fluorescence. Permet de réaliser la quantification et la mesure de la taille de l’ADN résiduel.  La détection d’une séquence génomique répétée permet d’améliorer la sensibilité jusqu’à 10fg / test.  Ex: 4 tailles ciblées (allant de 100 à 450 pb): Représentation schématique des amorces et de la localisation de la sonde:
  108. 108. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 12 Ex. Elimination de l’ADN en cours de purification En cours de purification l’ADN de grande taille est éliminé le plus rapidement que les acides nucléiques de petite taille (100bp). Dans cet exemple la quantité d’ADN résiduel de 300pb est de 2,5 pg/ml et les fragments ≥ 450 pb ne sont plus détectables. µg
  109. 109. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 13 ANALYSE DES ENDOTOXINES ENDOTOXINESTEST DE STERILITE RESIDUEL DE L’HOTE
  110. 110. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 14 Les endotoxines bactériennes Impuretés Attribut qualité Sécurité/Efficacité Limites généralement acceptées ou réglementées Méthodes Utilisation du test HCP Fort Sécurité Mab <100 ng/mg ELISA (kit commercial) L (Ph1-2) ELISA (Kit spécifique) L (Ph3) SDS-PAGE Investigation Electrophorèse 2D Investigation Western blot Investigation ADN de l’hôte Moyen Sécurité < 10 ng/dose (WHO Taille < 200 paires de bases Q-PCR L* (1 des 2 méthodes )Threshold® ou équivalent. Picogreen® ou équivalent Investigation Remarque : Picogreen , faible sensibilité (5ng/ml), plutôt en screening ou en contrôle procédé. Endotoxine Fort Sécurité 5 UI/kg masse corporelle pour la dose maximale administrée en 1 heure .(P h Eur.) LAL Ph EUR. L, S Contamination microbienne Fort Sécurité Contamination microbienne* ou stérilité L, S Remarque : * dans le cas où la stérilité du lot de principe actif vrac n’est pas revendiquée •Impuretés liées au procédé de fabrication :
  111. 111. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 15 Les endotoxines sont des lipopolysaccharides faisant partie de la paroi des bactéries Gram négatives. L’être humain est sensible à des quantités très faibles d’endotoxines (fièvre, inflammation, choc septique…). Pendant plus de 40 ans, le test pyrogène sur lapin = principal test de détection des endotoxines. Les endotoxines
  112. 112. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 16 Le test Lapin et son successeur En 1950, découverte de l’aptitude des cellules sanguines de la limule à coaguler en présence d’endotoxines  test LAL. Test LAL (« Limulus amebocyte lysate »): Test in-vitro d’analyse quantitative des endotoxines. Commercialement introduit en 1970. Accepté par la FDA depuis 1983 comme test standard. Avantages: Diminution de l’utilisation des animaux. Test plus fiable, plus facile et plus rapide. Test plus sensible (sensibilité de 0,05 EU/ml à 0,06 EU/ml pour les tests LAL contre une détection de 1 à 10 EU/ml pour le test lapin). Le test LAL
  113. 113. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 17  Méthode de Gel clot: Les différents types de tests LAL Cascade enzymatique en présence d’endotoxine résulte en la formation d’un gel  Méthode chromogénique/turbidimétrique Cascade enzymatique en présence d’endotoxine résulte en la formation d’un composé coloré détecté par densité optique/turbidité.
  114. 114. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 18 CONTAMINATION MICROBIENNE
  115. 115. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 19 Impuretés Attribut qualité Sécurité/Efficacité Limites généralement acceptées ou réglementées Méthodes Utilisation du test HCP Fort Sécurité Mab <100 ng/mg ELISA (kit commercial) L (Ph1-2) ELISA (Kit spécifique) L (Ph3) SDS-PAGE Investigation Electrophorèse 2D Investigation Western blot Investigation ADN de l’hôte Moyen Sécurité < 10 ng/dose (WHO Taille < 200 paires de bases Q-PCR L* (1 des 2 méthodes )Threshold® ou équivalent. Picogreen® ou équivalent Investigation Remarque : Picogreen , faible sensibilité (5ng/ml), plutôt en screening ou en contrôle procédé. Endotoxine Fort Sécurité 5 UI/kg masse corporelle pour la dose maximale administrée en 1 heure .(P h Eur.) LAL Ph EUR. L, S Contamination microbienne Fort Sécurité Contamination microbienne* ou stérilité L, S Remarque : * dans le cas où la stérilité du lot de principe actif vrac n’est pas revendiquée •Impuretés liées au procédé de fabrication :
  116. 116. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 20 Contamination microbienne Essai de dénombrement microbien Essai de dénombrement microbien selon Ph.Eur 2.6.12 et USP <61> Dénombrement des germes viables totaux par filtration sur membranes de 10mL d’échantillon et rinçage avec 3 fois 100mL de tampon pH7 Dénombrement des Germes Aérobies viables Totaux (DGAT) sur gélose aux peptones de caséine et de soja avec incubation à 30°C- 35°C pendant 3 à 5 jours Dénombrement de Moisissures et Levures Totales (DMLT) sur gélose Sabouraud avec incubation à 20°C-25°C pendant 5 à 7 jours Spécifications : – DGAT ≤ 1 UFC / 10 mL – DMLT ≤ 1 UFC / 10 mL
  117. 117. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 21 Test de sterilité Le principe de la méthode est de mettre en contact l’échantillon à tester avec des milieux de culture, d’incuber (14 jours) et de vérifier ensuite l’absence de croissance d’un germe contaminant. Plusieurs techniques sont disponibles (inoculation directe dans le milieu de culture liquide, filtration sur membrane….). Milieux: FTM (fluid thioglycollate medium) supporte la croissance de germes aérobes et anaérobes. SCDM (soybean casein digest medium) supporte la croissance d’une grande variété de bactéries aérobes/champignons (incluant levures et moisissures). L’environnement doit être particulièrement contrôlé (zone aseptique ou travail sous isolateur).
  118. 118. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 22  Comment réalise-t-on le test ? L’échantillon est inoculé dans des milieux nutritifs spécifiques aux microorganismes recherchés. Les milieux sont incubés 14 jours aux températures optimales pour la croissance de germes et observés régulièrement en face d’un écran lumineux. L’apparition d’un trouble dans le milieu révèle la présence de microorganismes. Test de stérilité
  119. 119. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 23 ANTIBIOTIQUE RESIDUEL
  120. 120. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 24 Antibiotique résiduel Impuretés Attribut qualité Sécurité/Efficacité Limites généralement acceptées ou réglementées Méthodes Utilisation du test Antibiotique Fort Sécurité Limite de quantification de l’ordre du ng/mg . Prévoir une justification lors d’un éventuel résultat > LOQ . Chromatographie liquide C avec pour objectif de démontrer l’élimination pendant le procédé de purificationELISA Tendance à éliminer ce type de molécules dans les procédés. Antibiotique à base de b-lactame interdit. Antimousse (PPG, PEG, Silicone, ..) Moyen à Faible Sécurité Non régulé, le dosage démontre la maitrise du procédé. Prévoir une justification lors d’éventuel résultat > LOQ. Chromatographie liquide C avec pour objectif de démontrer l’élimination pendant le procédé de purification ICP (Silcone)
  121. 121. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 25 Ex. Dosage d’un antibiotique résiduel par U-HPLC /UV Developpement d’une méthode de chromatographie liquide pour l’analyse d’antibiotiques aminoglycoside. Une dérivatisation est effectuée avec le phenylisocyanate. Détection à 240 nm. Equipement  U-HPLC  PDA detecteur  Colonne C18 Chromatogram: Kanamycin standard 5µg/ml Chromatogram: Residual kanamycin in tested lot Kanamycin Kanamycin
  122. 122. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 26 ANTIMOUSSE (ex. silicone)
  123. 123. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 27 Technologie & principe de l’ICP-AES Détermination de la concentration en Silicium (marqueur d’antimousse à base de silicone). Méthode ICP-AES/OES: •Inductively Coupled Plasma - Atomic/Optical Emission Spectrometry" •Méthode d'analyse par spectrométrie d'émission atomique dont la source est un plasma généré par couplage inductif.
  124. 124. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 28 Technologie & principe de l’ICP-AES • Système d’introduction de l’échantillon constitué d’une pompe péristaltique (1), d’un nébuliseur (2) et d’une chambre de nébulisation (3) • Système d’atomisation et d’excitation comprenant la torche (4), le générateur de courant alternatif couplé à la bobine d’induction (5) • Système optique (6) (système dispersif) • Système de détection (7) 6 1 2 3 4 5 7 Permet un dosage rapide de la pluparts des éléments chimiques. Energie  atomes → ions, ions excités, relaxation avec émission d’un photon dont l'énergie (donc la longueur d'onde) est caractéristique de l'élément. Ex: détermination de la concentration en Silicium (marqueur des antimousses à base de silicone). •Mesures réalisées à 4  d’émission différentes 251.611, 212.412, 288.158 & 252.851 nm. •Range de la droite de calibration: 0.05 à 1µg/ml •Prétraitement (minéralisation): fonction de la matrice de l’échantillon. Schéma d'un spectromètre ICP-AES
  125. 125. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 29 Protéine A Impuretés Attribut qualité Sécurité/Efficacité Limites généralement acceptées ou réglementées Méthodes Utilisation du test Inducteurs (IPTG,…) Agent de sélection (Methotrexate) ou tout autre composé CMR utilisé dans le procédé Moyen Sécurité Non régulé, le dosage démontre la maitrise du procédé. Prévoir une justification lors d’éventuel résultat > LOQ. Chromatographie liquide C avec pour objectif de démontrer l’élimination pendant le procédé de purification Constituant bioactif des milieux de cultures (Insuline, facteur de croissance,…) Moyen Sécurité Non régulé, le dosage démontre la maitrise du procédé. Prévoir une justification lors d’éventuel résultat > LOQ. Chromatographie liquide C avec pour objectif de démontrer l’élimination pendant le procédé de purification ELISA Protéine A Moyen Sécurité Non régulé, le dosage démontre la maîtrise du procédé (exemple de spécification : < 20 ppm) ELISA L Chromatographie liquide (LC/MS par exemple) Présentationsuivante
  126. 126. VARIANTS DE CHARGE
  127. 127. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 2 VARIANTS DE CHARGE Variants influençant la charge nette de la protéine, liés à des modifications survenant lors de la production et/ou de la conservation Origine Attribut qualité Impact Limites acceptables Méthodes d’analyse Utilisat° du test Variants Lys-term Déamidations Acides sialiques Pyro-Glu Variants de séquence primaire (formes élonguées, tronquées, mal processées) Fct localisation (fort si CDRs) Efficacité Variants regroupés par formes majeures (formes acides / basiques vs pic principal) Identification : vs subst.réf. Pureté : Ph1-2 : Valeurs quantitatives générées. Critères acceptation pas obligatoires (recul limité) Ph3 : Critères acceptation quantitatifs (absolus ou vs subst.réf.) IEF / c-IEF / i-CE IEX L / S Spectrométrie de masse Peptide mapping (LC/UV/MS) Dosage acides sialiques C Variants de charge
  128. 128. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 3 CHROMATOGRAPHIE D’ECHANGE D’IONS Interactions ioniques entre un support solide et les molécules à analyser. Echange de cations ou d’anions. pH de la phase mobile entre le pI de la protéine et le pKa des groupements fonctionnels chargés de la phase stationnaire. Variants de charge
  129. 129. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 4 CHROMATOGRAPHIE D’ECHANGE D’IONS Séparation en fonction de la charge nette de surface de la protéine. Gradient salin (ex.:NaCl pour WCX) pour l’élution. En chromatographie échangeuse de cations, les protéines ayant la charge nette positive la plus faible éluent en premier. Variants de charge
  130. 130. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 5 Exemple pratique - WCX d’un mAb Buts : – Comparaison de lot à lot – Etude de stabilité (dégradation du mAb par déamidation : Asn → Asp ; Gln → Glu ). Informations : – Détermination de l’hétérogénéité de charges – Détermination des proportions relatives des isoformes (% aire) Variants de charge
  131. 131. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 6 Acquired By: EDERE 21/03/2009 23:07:11 WCX_complément 23/03/2009 9:11:53 hétérogénéité de charges 3821 3822 2487Channel 1 Sample Name: A805564 répétabilité inj. Sample Type: Unknown Date Acquired: Vial: 7 Acq. Method Set: Injection #: 1 Date Processed: Processing Method:Injection Volume: 20.00 ul Proc. Method Id :Run Time: 75.0 Minutes Sample Set Name: A900626 validation XD_200309 Calibration Id : Channel Name :HPLC 24System Name : AU 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 Minutes 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 acid1 acid2 acid3 acid4 isoformemaj. basic1 basic2 basic3 basic4 -0.002 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 acid1 acid2 acid3 acid4 isoformemaj. basic1 basic2 basic3 basic4 Result Id 3843 Isoformes acides Isoformes basiques + Lys + 2 Lys Exemple pratique - WCX d’un mAb Sensibilité : LOQ ~ 0.1 % Variants de charge
  132. 132. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 7 IEF (IsoElectric Focusing) SUR GEL Séparation dans un gel intégrant un gradient de pH immobilisé Les protéines migrent sous l’effet d’un champ électrique jusqu’à atteindre le pH correspondant à leur pI Variants de charge
  133. 133. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 8 Exemple pratique - IEF d’un mAb pI 3 10 Variants de charge
  134. 134. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 9 ELECTROPHORESE CAPILLAIRE - c-IEF Séparation dans un capillaire / Gradient de pH Les protéines migrent sous l’effet d’un champ électrique jusqu’à atteindre le pH correspondant à leur pI Mobilisation après focalisation, puis détection UV Variants de charge
  135. 135. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 10 Exemple pratique : c-IEF d’un mAb Minutes 27 28 29 30 31 32 AU 0.00 0.02 0.04 AU 0.00 0.02 0.04 B1 B2 B3 B4 Majorpeak A1 A2A3 A4 A5 A6 A7 c-IEF IEF Sensibilité : LOQ ~ 1 % Variants de charge
  136. 136. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 11 Exemple pratique : c-IEF de 3 mAb Variants de charge
  137. 137. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 12 Comparaison WCX vs c-IEF WCX c-IEF AU 0.00 0.10 0.20 0.30 Minutes 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00Acid1-12.029 Acid2-13.972 Acid3-14.956Acid4-15.288 IsoformMaj-1 Basic1-17.516 Basic2-19.473 Basic3-24.456 AU 0.00 0.02 0.04 0.06 Minutes 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 Acid1-12.029 Acid2-13.972 Acid3-14.956 Acid4-15.288 IsoformMaj-16.582 Basic1-17.516 Basic2-19.473 Basic3-24.456 SampleWeight : 1.0000 Dilution : 1.0000 P E A K RE S UL TS 1 2 3 4 5 6 Name RT Area Height Int Type % Area Acid 1 Acid2 Acid3 Acid4 IsoformMaj Basic 1 12.029 13.972 14.956 15.288 16.582 17.516 317745 1926019 1768277 1336803 18095102 2336231 5511 28900 56532 54154 495304 69824 bv vv vv vv vv vv 1.19 7.24 6.65 5.03 68.02 8.78 7 8 Name RT Area Height Int Type % Area Basic 2 Basic 3 19.473 24.456 744789 76197 13971 879 vv vb 2.80 0.29 WCX (2 mg/mL) cIEF (0.2 mg/mL) Nom du pic % aire Nom du pic % aire Acid1 1.1 20 B1 1.7 10 Acid2 7.2 B2 6.0 Acid3 6.8 B3 1.5 Acid4 5.0 B4 1.0 Pic majoritaire 68.1 68 Pic majoritaire 54.7 65 Basic1 8.8 12 A1 10.0 Basic2 2.8 A2 2.8 25 Basic3 0.3 A3 1.8 A4 14.5 A5 4.9 A6 0.6 A7 0.6 Minutes 27 28 29 30 31 32 AU 0.00 0.02 0.04 AU 0.00 0.02 0.04 B1 B2 B3 B4 Majorpeak A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 Variants de charge
  138. 138. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 13 Comparaison IEF vs c-IEF IEF c-IEF Minutes 27 28 29 30 31 32 AU 0.00 0.02 0.04 AU 0.00 0.02 0.04 B1 B2 B3 B4 Majorpeak A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 IEF classique (5 µg/puits) cIEF (0,2 mg/mL) Nom du pic % aire Nom du pic % aire 1 1.2 8 B1 1.7 10 2 6.4 B2 6.0 Pic majoritaire 64.2 64 B3 1.5 4 22.9 28 B4 1.0 5 5.2 Pic majoritaire 54.7 65 A1 10.0 A2 2.8 25 A3 1.8 A4 14.5 A5 4.9 A6 0.6 A7 0.6 Variants de charge
  139. 139. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 14 « Imaging » c-IEF Même principe de base que la c-IEF Pas de mobilisation car suivi de la focalisation sur le capillaire entier (caméra UV) Variants de charge
  140. 140. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 15 Exemple pratique : ic-IEF d’un mAb pI 5.12 pI 7.90 ic-IEF IEF Sensibilité : LOQ ~ 1 % Variants de charge
  141. 141. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 16 PEPTIDE MAPPING ET SPECTROMETRIE DE MASSE UPLC/UV, UPLC-UV-MS/MS, MALDI-TOF, … Protease N-term C-term C-term N-term Dénaturation, réduction, alkylation Variants de charge
  142. 142. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 17 Exemple pratique - Cartographie peptidique d’un mAb vs substance de référence UPLC/UV ou MS Variants de charge
  143. 143. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 18 Exemple pratique - Cartographie peptidique du Trastuzumab - Séquences N et C-term. Variants de charge
  144. 144. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 19 Exemple pratique - Cartographie peptidique du Trastuzumab - Séquence C-terminale Séquençage du peptide C-terminal de HC : forme minoritaire (~ 5 %) avec Lys Variants de charge
  145. 145. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 20 Exemple pratique - Cartographie peptidique du Trastuzumab - Séquence N-terminale Séquençage du peptide N-terminal de HC : forme majoritaire (> 95 %) sous forme Glu Variants de charge
  146. 146. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 21 DOSAGE D’ACIDES SIALIQUES Peuvent induire de fortes variations de la charge nette de la protéine (formes « acides » en IEX ou (c)-IEF). Analyse souvent réalisée en complément / confirmation de la caractérisation de la glycosylation. Variants de charge
  147. 147. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 22 Exemple pratique - Dosage d’acides sialiques Hydrolyse acide douce, puis dérivatisation DMB et analyse UPLC/Fluo Standards Trastuzumab Variants de charge
  148. 148. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 23 VARIANTS DE CHARGE - DISCUSSION Résultats analytiques « comparables » et complémentaires pour IEX, IEF et (i)c-IEF. Au moins une de ces techniques doit être utilisée en routine pour l’étude des variants de charge. Puissance analytique et polyvalence de la spectrométrie de masse et de la cartographie peptidique pour tests de caractérisation (variants Lys-term, Pyro-Glu, déamidations, variants de séquence primaire mais aussi glycosylation, oxydation …) Variants de charge Présentationsuivante
  149. 149. Copyright SFSTP 2011 Variants conformationnels et autres variants
  150. 150. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 2 Autres variants Origine Attribut qualité Impact Limites acceptables Méthodes d’analyse Utilisat° du test Thiols libres. Mésappariement des ponts disulfures. Asp/isoAsp. Oxydation. Fort si impact potentiel sur l’activité, comme par exemple sur les CDRs Efficacité Ph1-2 : Quantification de la teneur en thiols libres. Vérification des appariements corrects des ponts disulfure. Mise en évidence des sites d’oxydation Ph3 : En cas d’évolution observée l’impact doit être documenté Spectrofluo- rescence ou Ellman (Thiols libres / totaux) Cartographie peptidique C
  151. 151. Autres variants Mésappariement des ponts disulfures Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 3
  152. 152. Autres variants Mésappariement des ponts disulfures Changement de structure détectable par: – Test d’activité, – Test de structure secondaire ou tertiaire p.ex. CD, FTIR, RMN…, Identification du mésappariement par: – Peptide mapping et séquençage MS/MS. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 4
  153. 153. Autres variants Thiols libres Détermination par UV-visible après réaction au DTNB (méthode Ellman). – Problème de sensibilité de détection avec les Anticorps Détermination par fluorescence après réaction au NPM. – 0.05 mol de thiols libres / mol d’Anticorps à 10mg/mL – 0.01 mol de thiols libres / mol d’Anticorps à 10mg/mL (en conditions non dénaturantes) Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 5
  154. 154. Autres variants Asp / isoAsp Changement de l’efficacité de la liaison de l’anticorps détectable par: – Test d’affinité Mise en évidence de la modification par: – HIC, IEX, test enzymatique Localisation de l’isoAsp par: – Peptide mapping et fragmentation MS/MS Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 6
  155. 155. Autres variants Oxydation Oxydation principalement sur les Méthionines et les Tryptophanes. Ajout majoritairement de 16uma, parfois de 32uma en cas de double oxydation. Sur le Tryptophane, possibilité d’un réarrangement après oxydation résultant en un ajout de 4uma. Mise en évidence de la modification par: – Peptide mapping et séquençage MS/MS Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 7
  156. 156. Autres variants Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 8 ms 770 772 774 776 778 780 782 784 786 m/z0 100 % ACRA30 25 (0.874) Sm (Mn, 2x2.00); Cm (17:25) TOF MS ES+ 652781.4 780.9 773.4 772.9 770.4 774.4 780.4775.4 777.4 779.4 781.9 782.4 783.8 784.5 784.9 786.4 ms 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z0 100 % ACRA30 25 (0.874) Sm (Mn, 2x2.00); Cm (17:25) TOF MS ES+ 5.17e3288.5 429.2 359.2 445.3 503.2 542.4 734.4542.9 781.4 1106.5991.5 Exemple d’oxydation de la Méthionine détectée par MS Spectre de masse Electrospray d’un peptide tryptique oxydé Zoom
  157. 157. Autres variants Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 9 Exemple d’oxydation de la Méthionine détectée par MS Spectre MS/MS msms781 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z0 100 % ACRA30R 1 (0.034) Sm (Mn, 2x2.00); Cm (1:13) TOF MSMS 781.00ES+ 39586.9 242.3 226.3 389.3 323.3 390.3 538.4 1173.5 1172.5587.4 850.4 587.9 786.4 660.4 1109.5 851.4 1011.5 1174.5 1175.5 1256.5 1320.5 msms781 790 800 810 820 830 840 850 860 m/z0 100 % ACRA30R 1 (0.034) Sm (Mn, 2x2.00); Cm (1:13) TOF MSMS 781.00ES+ 28850.4 786.4 787.4 832.4788.4 824.4817.2808.3 805.3 801.3 842.4837.3 845.4 851.4 852.4 853.4859.4 ---Pro-Val-Thr-Thr-Met --- ---Pro-Val-Thr-Thr-Met[O]--- Fragmentation attendue Fragmentation observée 834 436 850 452 - 64 mass units 786 - 64 mass units Zoom
  158. 158. Autres variants Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 10 HC H2C H S O CH3 Mécanisme proposé pour la perte de 64uma depuis la Méthionine oxydée
  159. 159. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 11 Variants conformères La probabilité d’observer un variant conformationnel pour un anticorps est très rare Origine Attribut qualité Impact Limites acceptables Méthodes d’analyse Utilisat° du test N/A N/A N/A Comparaison par rapport à un profil de référence Dichroisme circulaire FTIR Spectrométrie de masse avec mobilité ionique. Fluorescence intrinsèque ou extrinséque. C Il n’existe pas de méthode permettant de séparer et quantifier précisément les variants conformationnels d’un produit. Une ou plusieurs des méthodes proposées seront mises en œuvre à titre de caractérisation globale du produit
  160. 160. Autres variants 12 Exemple de spectres DC obtenus pour 5 échantillons différents -10 -5 0 5 10 15 20 190 200 210 220 230 240 250 260 Wavelength (nm) dEmol-1dm3cm-1 Sample A Sample B Sample C Sample D Sample E Sample % α- Helix % other helix % β- sheet % Turns % ‘Other’ A 70 13 0 6 12 B 70 11 0 9 14 C 68 12 0 8 13 D 67 12 0 8 13 E 68 12 0 8 13
  161. 161. Autres variants 13 Exemple de spectres FT-IR obtenus pour 5 échantillons différents 1560 1600 1640 1680 1720 Wavenumber (cm -1 ) Formulation A Formulation A Formulation B Formulation B Formulation C Formulation C Elements of Structural Components Sample α-Helix -Sheet A 6.6 59.8 B 6.5 59.6 C 7.0 59.3 D 6.7 59.8 E 6.5 59.4 Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org
  162. 162. Variants conformationnels et autres variants CONCLUSION Etude principalement faite en caractérisation ou en investigation si OOS ou OOT observé sur un autre test (activité, binding, IEX, HIC …), mais pas en libération. Méthode de référence : cartographie peptidique et spectrométrie de masse (MS et MS/MS) - Polyvalence et performance pour confirmation d’hypothèses. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 14 Présentationsuivante
  163. 163. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 1Copyright SFSTP 2011 VARIANTS DE GLYCOSYLATION
  164. 164. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 2 Glycosylation des IgGs Introduction Structures Fonctions Impact sur la PK et la sécurité Exemple de méthodes d’analyses Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse IgG, sucres libérés, cartes peptidiques/ glycopeptidiques Chromatographie liquide en phase normale Sucres libérés et dérivés, exo-glycosidases + spectrométrie de masse Electrophorèse Capillaire Conclusions Glycoformes principales, potentiellement immunogéniques, glyco-ingénierie
  165. 165. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 3 Glycosylation des IgGs thérapeutiques Les glycanes Ne représentent que 2-3% de la masse d’un anticorps 40% pour l’EPO Jouent un rôle essentiel dans les fonctions effectrices Cytotoxicité liée à l’anticorps (ADCC) Cytotoxicité liée au complément (CDC) Localisés sur l’Asn297 des chaînes lourdes (IgG humaines et murines) Au niveau d’un site de N-glycosylation consensus -Asn-X-Thr- (X different Pro) Environ 15-20% des IgG plasmatiques possèdent un second site de N- Glycosylation dans le domaine variable Cetuximab/ Erbitux (-Asn88-Asp-Thr-).
  166. 166. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 4 Glycosylation: structure de base et formes majoritaires Les N-glycoformes des domaines Fc sont composées d’un heptasaccharide commun constitué de 2 N-acetylglucosamines (GlcNAc) 3 mannoses (Man) formant 2 bras et liés à 2 N-acetylglucosamines Heptasaccharide généralement complété par un 1 Fucose-1,6 (Fuc) au niveau du premier GlcNac 0, 1 ou 2 unités de galactose (Gal) formant 3 glycoformes (G0F, G1F et G2F) 3 glycoformes majoritaires (> 80%) sur les Fc IgG produites en systèmes mammifères (CHO, NS0, SP2/0, HEK-293 ou PER.C6)
  167. 167. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 5 Glycosylation: formes xenobiotiques (liées aux systèmes de production) Les AcM produits en systèmes murins (NS0, SP2/0) possèdent des glycoformes supplémentaires en faible quantité (< 5 %) Gal-α-1,3-Gal Acide N-Glycolyl NeurAminique (NGNA) Peuvent êtres immunogéniques Les AcM produits dans des systèmes autres que de mammifères (levures, plantes, algues) auront des glycoformes non humaines Immunogéniques Limite leur usage thérapeutique
  168. 168. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 6 Optimisation de la glycosylation (par selection ou ingénierie) Formes a-fucosylées Augmentation de l’affinité pour les FcgammaRIII 40 à 100 x plus d’ADCC Nombreuses technologies (brevetées) Formes hyper-galactosylées Augmentation de la CDC Formes hyper-sialylées Augmentation des propriétés anti-inflammatoires
  169. 169. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 7 1) IgG intacte ou réduite LC-ESI-TOF 150 kDa LC: 25 kDa HC: 50 kDa & 2) N-Glycanes (digestion) ESI-MS/MS G0F, G1F & G2F : 1.5 to 1.8 kDa 3) Glycopeptides enrichis EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR HT23-G0F, HT23-G1F & HT23-G2F : 2.6 to 3.0 kDa « TOP-DOWN » « BOTTOM-UP» Glycoformes: Analyses par spectrométrie de masse
  170. 170. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 8 LC-ES-TOF: IgG intacte +/- PNGase F (A) mAb-1 (NS0) (B) mAb-1 + PNGase F (- N-glycans) mass 148500 149000 149500 150000 % 8 4.18e3149065.0 148905.0 148745.0 148580.0 149230.0 149390.0 149545.0 149695.0 149850.0  « Maxent » de-glycosylated Ab « Maxent » Masse polypeptidique calculée IgG = 145 685 Da (16 S-S, N-t. PyroGlu, - C-t. Lys) Pic princip. Exp. Mass = 149 065 Da (+ 3 380 Da) 9 pics équidistants (162 Da => hexose) Janin-Bussat MC, Beck A et al, 2010 Exp. Mass : 145 695 Da (+ 10 Da) (1 pic principal/ Digestion PNGase F) => La N-glycosylation représente la principale source d’hétérogénéité des IgGs
  171. 171. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 9 LC-ESI-TOF bottom-up: interpretation (A) Chaîne Lourde (B) IgG (NS0) IgG Glycoforms Calc. Mass (Da) Exp. Mass (Da) Difference (Da) G0F/G0F 148576.4 148580.0 +3.6 G0F/G1F 148738.5 148745.0 +6.5 G0F/G2F, G1F/G1F 148900.7 148905.0 +5.7 G1F/G2F 149062.8 149065.0 +2.2 G2F/G2F 149224.9 149230.0 +3.1 Heavy Chain Calc. Mass (Da) Exp. Mass (Da) Difference (Da) G0F 50241.4 50240 -1.4 G1F 50403.5 50402 -1.5 G2F 50565.6 50563 -2.6 G2FaGal 50727.7 50726 -1.7 « Maxent » G0F G1F G2F + aGal + aGal G0F/G0F G0F/G1F G1F/G2F G2F/G2F G1F/G1F Or G0F/G2F + 2 aGal + 3 aGal + 4 aGal  « Maxent »
  172. 172. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 10 NanoLC-MS/MS fragmentation 12 glycoformes détectées et fragmentées par MS/MS E. Wagner-Rousset, A. Beck et al, J Chrom B, 2008 1204.02 1297.59 1318.09 1399.14 1480.17 1561.17 +MS, 15.9-19.0min #(557-663) 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 7x10 Intens. 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 m/z EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR 1642.121379.08 EEQYN297STYR or EEQYN297STYR EEQYN297STYR or EEQYN297STYR and 1204.02 1297.59 1318.09 1399.14 1480.17 1561.17 +MS, 15.9-19.0min #(557-663) 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 7x10 Intens. 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 m/z EEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYREEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYREEQYN297STYREEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYR 1642.121379.08 EEQYN297STYREEQYN297STYR or EEQYN297STYREEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYR or EEQYN297STYREEQYN297STYREEQYN297STYREEQYN297STYR and Hz IgG1 (NS0)
  173. 173. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 11 NanoLC-MS/MS fragmentation MS/MS information sur la séquence en acide-aminé et empreinte caractéristique d’oligosaccharides Wagner-Rousset E., Beck A. et al, J Chrom B, 2008 Hz IgG1 (NS0) 366.16 528.26 690.36 961.04 1042.08 1189.73 1392.93 1538.86 1741.85 1919.89 2082.92 +MS2(1318.06), 16.6-17.8min #562-#605 0 2 4 6 5 x10 Intens. 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 m/z EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR or or or or or EEQYN297STYR or EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR MH+ HT23-G0F (A) 366.16 528.26 690.36 961.04 1042.08 1189.73 1392.93 1538.86 1741.85 1919.89 2082.92 +MS2(1318.06), 16.6-17.8min #562-#605 0 2 4 6 5 x10 Intens. 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 m/z EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR or or or or or EEQYN297STYR or EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR MH+ HT23-G0F 366.16 528.26 690.36 961.04 1042.08 1189.73 1392.93 1538.86 1741.85 1919.89 2082.92 +MS2(1318.06), 16.6-17.8min #562-#605 0 2 4 6 5 x10 Intens. 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 m/z 366.16 528.26 690.36 961.04 1042.08 1189.73 1392.93 1538.86 1741.85 1919.89 2082.92 +MS2(1318.06), 16.6-17.8min #562-#605 0 2 4 6 5 x10 Intens. 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 m/z EEQYN297STYREEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYR or or or or or EEQYN297STYR or EEQYN297STYREEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYR EEQYN297STYREEQYN297STYR MH+ HT23-G0F (A) E-E-Q-Y-N-S-T-Y-R y1y2y3y4y5y6y7y8 b8b7b6b5b4b3b2b1 Y1 Y3 C4B3 Y4 Z4 B1 C1 Y4a Z4a B1a C1a B4C3 Y2 Y1Z2 Z1 Z3 B2 C2 Y3a Z3a B2a C2a (C) E-E-Q-Y-N-S-T-Y-R y1y2y3y4y5y6y7y8 b8b7b6b5b4b3b2b1 Y1 Y3 C4B3 Y4 Z4 B1 C1 Y4a Z4a B1a C1a B4C3 Y2 Y1Z2 Z1 Z3 B2 C2 Y3a Z3a B2a C2a Y1 Y3 C4B3 Y4 Z4 B1 C1 Y4a Z4a B1a C1a B4C3 Y2 Y1Z2 Z1 Z3 B2 C2 Y3a Z3a B2a C2a (C) HT23 peptide fragmentation Biemann K, Annu Reb Biochem 1992 G0F glycan fragmentation Domon B. et al., Glycoconjugate J, 1988
  174. 174. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 12 Chromatographie en phase normale Digestion séquentielle (exoglycosidases) a) Neuraminidase b) a-galactosidase c) -galactosidase d) -hexoaminidase e) a-fucosidase f) a-mannosidase g) -mannosidase Bussat M, Beck A et al, Antibody Engineering, Springer 2010 Digestion: PNGase F (-Asn-/ -GlcNAc) ou IgGZERO Dérivation: oligosaccharide fluorescents (2-amino benzamide) (1) Phase Normale HPLC ou HILIC + détection fluorescence (2) Isolation de pics + MALDI-TOF (off-line) ou (2D)-LC-MS (en ligne) (3) Analyse biochimique : digestion sequentielle par exoglycosidases
  175. 175. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 13 2-AB oligosaccharides (NP-HPLC + MALDI-TOF) Peak isolation and MALDI-TOF analysis Calculated Mass (Da) Experimental Mass GlcNac = 203.19 Da Man, Gal = 162.14 Da Fuc = 146.14 Da NGNA = 291.09 Da NANA = 275.00 Da 2AB = 136.15 Da G0F G1F G1’F G2F Mono a1,3- GalGal Di a1,3- GalGal G1-GlcNac 1906.69 1906.71 1582.58 1582.63 1744.64 1744.51 2068.74 2068.94 2230.79 2230.90 1541.56 1541.62 G0-GlcNac 1379.50 1379.59 NGNA NGNA
  176. 176. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 14 CE-SDS: taux d’IgG non glycosylée (A) Information rapide, sensible et quantitative : IgG H2L2 integral structure (150 kDa) and non-glycosylated H2L2 (- 3 kDa) H2L (125), H2 (100), HL (75), H (50), L2 (50), L (25) (B)
  177. 177. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 15 Trastuzumab + PNGase F: CE-LIF Trastuzumab (Herceptin) glyco-profile (production en CHO) 4 N-glycoformes principales - Proche des IgGs humaines G0F G1F/G1’F G2F
  178. 178. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 16 Trastuzumab + PNGase F: CE-LIF Trastuzumab (Herceptin) glyco-profile (production en CHO) G0: glycoforme importante pour augmenter l’ADCC Man5: le plus faible possible (clearance plus rapide) Man5 (CHO, NS0)G0
  179. 179. Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 17 IgGs glycosylation: résumé  Beck A & Reichert JM, mAbs 2012 Présentationsuivante
  180. 180. CONCLUSION Différentes catégories d’impuretés des P.A. d’origine biotechnologique : Notion d’hétérogénéité des produits biologiques. Impuretés liées au procédé de fabrication. Impuretés liées au produit : Variants de masse. Variants de charge. Variants conformationnels. Variants de glycosylation. Evaluation globale de la criticité en termes de sécurité et d’efficacité. Une ou plusieurs solutions analytiques et une stratégie de contrôle adaptée. Publication : « Impuretés dans les substances actives d’origine biologique » STP Pharma Pratiques, mai-juin 2014, 24(3), 203-220 1 Géry Van Vyncht, R&D Director, S&I Dpt, Quality Assistance 09.12.2014
  181. 181. Contact us: +32 71 53 47 81 gery.vanvyncht@quality-assistance.be 2 Respect Commitment Excellence

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