Ssm nts#5

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Ssm nts#5

  1. 1. Séminaire SSM-NTS#5L’approche Fusion Primersmise en place au SSM1SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013Régis DebruynePostdoc ADNa et NTSSSM, UMS 2700
  2. 2. Plan• 2 types de banques• Histoire des Fusion Primers• Pour faire du ciblé TAS• Pas tous les amplicons• Approche SSM2SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013
  3. 3. Ajout d’adaptateursaux terminaisons moléculairesSSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 3AAPar ligation Par PCRAvantages :ADN cible non connuInconvénients :Coût élevé du multiplexageindividuelSéquençage à la volée sansciblage préalableAvantages :Ciblage des données produitesCoût maitriséInconvénients :Temps de préparationADN cible connu
  4. 4. Genèse du multiplexage individuelSSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 4Meyer M, Stenzel U, Myles S, Prüfer K, Hofreiter M (2007) Targeted high-throughput sequencing of tagged nucleic acid samples.Nucleic Acids Res 35: e97 doi:10.1093/nar/gkm566.Double ligation (1-barcode, 2-adaptateur)
  5. 5. Genèse du multiplexage individuelSSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 5PCR taggéepuis ligationSSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 5Binladen J, Gilbert MTP, Bollback JP, Panitz F, et al. (2007) The Use of Coded PCR Primers Enables High-Throughput Sequencing of MultipleHomolog Amplification Products by 454 Parallel Sequencing. PLoS ONE 2(2): e197. doi:10.1371/journal.pone.0000197http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0000197
  6. 6. Genèse du multiplexage individuelSSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 6Approche Fusion Primers stricto sensuSSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 6
  7. 7. SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 7Bybee S M et al. Genome Biol Evol 2011;3:1312-1323Le TAS (Targeted Amplicon Sequencing):une approche Fusion Primers optimiséeMulti-locusMulti-individusProtocolebon marchéà 2 étapesde PCR
  8. 8. SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 8Le TAS (Targeted Amplicon Sequencing):une approche Fusion Primers optimiséeBybee S M et al. Genome Biol Evol 2011;3:1312-1323
  9. 9. SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 9Le TAS adapté au PGM du SSM
  10. 10. SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 10Le TAS adapté au PGM du SSM
  11. 11. Approche Fusion Primers non dédiéeà toutes les banques d’ampliconsSSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 11SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 11Pour les amplicons longs (>800 pb), et pourles projets d’amplicons aboutissant à unegrosse couverture génomique (>10kb), Lasolution de création de banque par ligationdemeure actuellement la seule approcheexpérimentalement raisonnable etéconomiquement viable.
  12. 12. 11010010001E+2 1E+3 1E+4 1E+5 1E+6 1E+7 1E+8 1E+9GénomemétagénomeCapture parhybridationRadSeqAmpliconscourtsAmpliconslongsNombred’individusTotal desséquencesen pbExemple 1: projet amplicon – 3kb – 50 spécimens• amplicons courts (<400pb)approche par FP• amplicons >400pb ; Namplicons <5approche par pool/fragmentation/ligation1112SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013
  13. 13. Analyse comparative de la qualité desséquences en FP et via SangerSSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 13SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 13Séquençage SangerAmplicon 700 pbSéquençage PGMQV <20QV >30
  14. 14. Le TAS du SSM en pratique pour lesutilisateursSSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 14SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 14PCR1 avec amorces rallongées en 5’pour tous les individus et amplicons différentsCommande des amorces rallongées en 5’ par PreFet PreF pour tous les amplicons nécessairesPossible nécessité de ré-optimiser lesconditions de PCR (Ta, additifs…)Limiter les cyclesDilution des PCR1 favorablesAmplification par PCR2 en parallèle de tous lesindividusPool des PCR par tag avant ou aprèsPCR2 en fonction des différences detaille et de Tm des ampliconsQuantification et pool équimolaire des PCR2individuelles favorablesNi dimers ni produit aspécifiqueLa qualité du pool joue sur ladistribution des reads partag/amplicon
  15. 15. Le coût (prospectif)SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 15Projet 150 éch.10 ampl. courts3 kbCoût (€)[couv.100X]Amorces Pre-Fet Pre-R pour 10amplicons(PCR1)140Contributionadaptateurs(PCR2)50?emPCR 117Séquençage(400pb)2351 puce 314 77TOTAL 620Total / éch. 12,5

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