Comparaison des Profils des Alvéolites Lymphocytaires en Immunocytochimie et en Cytométrie en Flux dans le Lavage Broncho- Alvéolaire

1. UNIVERSITE DE TUNIS EL MANAR
FACULTE DES SCIENCES DE TUNIS
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
Master de Recherche en Biologie Fonctionnelle
Parcours: Physiologie Appliquée et Physiopathologies
Présenté et soutenu publiquement le /09/2014
Par
Rihem KASMI
Comparaison des Profils des Alvéolites
Lymphocytaires en Immunocytochimie et en
Cytométrie en Flux dans le Lavage Broncho-
Alvéolaire
Jury:
Président: Pr. MARRAKCHI Raja
Membres: Pr. MEZNI Faouzi
Dr. MLIKA Mouna
Dr. SAFRA Inès
Encadreur: Dr. MLIKA Mouna
Co -Encadreur: Dr. SAFRA Inès

3. « Soyons reconnaissants aux personnes qui nous donnent
du bonheur ; elles sont les charmants jardiniers
par qui nos âmes sont fleuries. »
Le seul moyen de se délivrer d’une tentation, c’est d’y céder paraît-il ! Alors j’y cède en
disant un grand Merci aux personnes qui ont cru en moi et qui m’ont permis d’arriver au bout
de ce projet.
Mes premiers remerciements vont tout d’abord à mon président de Jury, Madame le
Professeur MARRAKCHI Raja. Je vous remercie de l´honneur que vous me faites en acceptant
de juger ce travail. Veuillez trouver en ce mémoire un modeste témoignage de mon profond
respect, de mon immense gratitude et de ma haute reconnaissance.
Je remercie très sincèrement Monsieur le Professeur MEZNI Faouzi, Chef de service
d´anatomie pathologique de l´hôpital Abderrahmen Mami de l´Ariana, pour m’avoir accueillie
dans son laboratoire et permise de parfaire ma formation en m’initiant aux différentes
expériences nécessaires pour ce travail.
Je tiens à exprimer mes plus vifs remerciements au Docteur MLIKA Mouna, Assistante
Hospitalo-Universitaire au service d´Anatomie pathologique de l’Hôpital Abderrahmen Mami
de l’Ariana, qui fut pour moi un encadrant attentif et disponible. Sa compétence, sa rigueur
scientifique et sa clairvoyance m’ont beaucoup appris. Ils ont été et resteront des moteurs de
mon travail de recherche. J’espère avoir été digne de la confiance qu’elle m’avait accordée et
que ce travail soit finalement à la hauteur de ses espérances. Quoi qu’il en soit, j’ai beaucoup
appris à ses côtés et je suis très honorée de l’avoir eu pour encadrant.
J’adresse de chaleureux remerciements à mon Co-encadrant de mémoire, Docteur SAFRA
Inès, Professeur agrégée en hématologie à l’Institut Pasteur de Tunis, pour son attention de
tout instant sur mes travaux en cytométrie en flux, pour ses conseils avisés et son écoute qui
ont été prépondérants pour la bonne réussite de cette mémoire. J’ai pris un grand plaisir à
travailler avec elle.

4. Mes remerciements s’adressent ensuite à Monsieur CHOKRI Chebbi, technicien supérieur
principal en cytomorphologie au service d´Anatomie pathologique de l’Hôpital Abderrahmen
Mami de l’Ariana, qui m’a dirigée tout au long de ce mémoire et précisément dans la partie
expérimentale. Sans lui je n’aurais jamais appris les techniques d’analyse cytologique du
lavage bronchoalvéolaire ainsi que les techniques immunocytochimiques. Il a toujours été
disponible, à l’écoute de mes nombreuses questions et s’est toujours intéressé à l’avancée de
mes travaux. Sa capacité d’analyse et son enthousiasme m’ont montré que le monde de la
recherche pouvait être un univers passionnant. Enfin, ses nombreuses relectures et corrections
de ce mémoire ont été très appréciables. Pour tout cela un grand merci.
Je remercie Madame BARMAT Mbarka, technicienne supérieure en cytomorphologie à
l’Institut Pasteur de Tunis, avec qui j’ai eu la chance de pouvoir m’initier à l’acquisition des
données par cytométrie en flux. Sa rigueur, sa capacité d’analyse des problèmes et ses très
nombreuses connaissances m’ont permis de progresser et ont répondu à plusieurs de mes
préoccupations.
J’exprime toute ma gratitude à l’ensemble des membres de mon jury : Professeur
MARRAKCHI Raja, Professeur MEZNI Faouzi, Docteur SAFRA Inès, Docteur MLIKA
Mouna, d’avoir accepté d’assister à la présentation de ce travail.
Je tiens à présenter mes remerciements les plus chaleureux à toute l’équipe du service
d’anatomie pathologique, pour le climat sympathique dans lequel ils m’ont permis de
travailler.
Je souhaiterais aussi adresser ma gratitude à tous mes enseignants en Master, qui par la
richesse de leurs enseignements, leurs encouragements, leurs conseils et leurs grandes qualités
humaines m’ont toujours guidé le long de mon Cursus Universitaire.
De plus, mes remerciements seraient incomplets, si je ne fais pas mention de ma plus chère et
merveilleuse sœur Hadhemi et sa petite ange Rekaya. Même si votre présence près de moi me
manque énormément, sachez que vos coups de fil et vos messages m’ont beaucoup aidée à
affronter ce manque et à continuer ce travail.

5. Je n’oublie pas aussi d’exprimer ma gratitude à tous mes amis en particulier Amal et Asma
pour leurs précieux conseils dans la réalisation de ce travail, en témoignage de l’amitié sincère
qui nous lie.
Enfin, les mots les plus simples étant les plus forts, j’adresse toute mon affection à ma famille,
et en particulier à mes parents, avec cette question récurrente, « quand est-ce que tu le
soutiens ce mémoire ? ». Bien qu’angoissante en période fréquente de doutes, cette question
m’a permis de ne jamais dévier de mon objectif final. Leur confiance, leur tendresse, leur
amour me portent et me guident tous les jours. Merci pour avoir fait de moi ce que je suis
aujourd’hui. Est-ce un bon endroit pour dire ce genre de choses ? Je n’en connais en tous cas
pas de mauvais. Je vous aime.
Ces remerciements ne peuvent s'achever, sans une pensée très spéciale pour mes plus chers
cousins Baya, Othman et Yassine, surtout pour toutes les soirées « cinéma » durant lesquelles
je n’ai pu ni travailler ni dormir.

6. TABLE DES MATIERES
TABLE DES MATIERES
REMERCIEMENTS
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
INTRODUCTION…………………………………………………………………………….1
Rappel théorique…………………………………………………………………………….2
1. Définition ……………………………………………………………………………2
2. Rappel anatomique…………………………………………………………………..2
3. Principales étiologies………………………………………………………………...4
4. Epidémiologie………………………………………………………………………..6
5. Physiopathologie……………………………………………………………………..6
6. Démarche diagnostique……………………………………………………………...9
6.1. Manifestations cliniques…………………………………………………….10
6.2. Aspects radiologiques……………………………………………………….10
6.3. Apport du lavage broncho-alvéolaire………………………………………..12
OBJECTIF…………………………………………………………………………………...27
PATIENTS ET METHODES………………………………………………………………28
1. Patients…………………………………………………………………………..….28
2. Méthodes……………………………………………………………………………28
2.1. Protocole d’analyse cytologique du lavage broncho-alvéolaire…………….28
2.2. Protocole de marquage par cytométrie en flux……………………………...35
3. Etude statistique…………………………………………………………………….37
RESULTATS………………………………………………………………………………...38
1. Epidémiologie………………………………………………………………………38
2. Répartition selon le sexe…………………………………………………………....38

7. TABLE DES MATIERES
3. Répartition selon l’âge………………………………………………………………..38
4. Répartition selon l’âge et le sexe …………………………………………………….39
5. Le tabagisme……………………………………………………………………….....39
6. Expositions professionnelles………………………………………………………….39
7. Les antécédents…………………………………………………………………….....39
8. Les signes cliniques…………………………………………………………………..40
9. Aspects radiologiques………………………………………………………………...41
10. Diagnostic radio-clinique suspecté………………………………………………...…41
11. Résultats du lavage broncho-alvéolaire………………………..……………………..46
11.1. Aspect du lavage broncho-alvéolaire…………………………...…………...46
11.2. Volume total récupéré…………………………………………………….…46
11.3. Vitalité cellulaire…………………………………………………………….46
11.4. Numération cellulaire………………………………………………………..46
11.5. Formule cellulaire…………………………………………………………...47
11.6. Immunocytochimie sur étalements………………………………………….47
11.7. Immunocytochimie sur cytoblocs…………………………………………...48
11.8. Cytométrie en flux…………………………………………………………..49
11.9. Comparaison des résultats en immunocytochimie sur étalements et en
immunocytochimie sur cytoblocs…………………………………………...50
11.10. Comparaison des résultats en immunocytochimie sur étalements et en
cytométrie en flux………………………………………………………...…50
11.11. Comparaison des résultats en immunocytochimie sur cytoblocs et en
cytométrie en flux………………………………………………………...…51
FIGURES…………………………………………………………………………………….51
DISCUSSION………………………………………………………………………………..62
CONCLUSION………………………………………………………………………………67
ANNEXE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
RESUME / ABSTRACT

8. Liste des abréviations
LISTE DES ABREVIATIONS
ABPA: Aspergillose Broncho-Pulmonaire
Allergique.
Ac : Anticorps.
AcM: Anticorps Monoclonaux.
ADP: Adénopathies.
AEC : 3-Amino-9-Ethyl-Carbazole
AFA: Alcool-Formol-Acide acétique.
Ag: Antigène.
AIP: Pneumopathie Interstitielle Aigüe
ALI: Acute Lung Injury.
ATCDs: Antécédents.
ATS: American Thoracic Society.
BOOP: Bronchiolitis Obliterans
Organizing Pneumonia.
CD3: Classe de Différenciation 3.
CD4: Classe de Différenciation 4.
CD8: Classe de Différenciation 8.
CMV : Cytomégalovirus.
COP: Pneumopathie Organisée
Cryptogénique.
DAB: 3,3-Diaminobenzidine.
DIP: Pneumopathie Interstitielle
Desquamative.
EFR: Examens Fonctionnels
Respiratoires.
ERS: European Respiratory Society.
FITC: Fluorecéine Isothiocyanate.
FSC: Forward Scatter.
H2O2: Peroxyde d’hydrogéne.
HRP: Horse radish peroxydase
HTA: Hypertension Artérielle.
IFNγ: Interféron gamma
IL-2: Interleukine 2
IL-15: interleukine 15
kPa: kilo pascal.
L: Lymphocytes
LAM: Lymphangioléiomyomatose
LBA: lavage Broncho-Alvéolaire
LID: Lobe Inférieur Droit.
LIG: Lobe Inférieur Gauche.
LIP: Pneumopathie Lymphoïde
Interstitielle.
LM: Lobe Moyen
LT: Lymphocyte T
M: Macrophages.

9. Liste des abréviations
MGG: May Grünwald Giemsa.
PaO2: Pression artérielle en Oxygène.
PAP : peroxydase-anti-peroxydase.
PBS: Phosphate Buffered Saline.
PCIE: Pneumopathie Chronique
Idiopathique à Eosinophiles.
PE: Phycoérythrine.
PerCP-Cy5.5: Peridinin Chlorophyll-
protein Complex Conjugate with a cyanine
dye.
PHS: Pneumopathie d’Hypersensibilité.
PID: Pneumopathies Interstitielles
Diffuses
PINS: Pneumopathies Interstitielles Non
Spécifiques
PM: Pneumopathie Médicamenteuse.
PMT: Photomultiplicateurs.
PNE: Polynucléaires Eosinophiles.
PNN: Polynucléaires Neutrophiles.
PR: Polyarthrite Rhumatoïde.
RAS: Rien à Signaler.
RB-ILD: Bronchiolite Respiratoire avec
Pneumopathie Interstitielle
SDRA: Syndrome de Détresse
Respiratoire Aiguë.
SSC: Side Scatter.
TBS: Tris Buffered Saline.
TDM-HR: Tomodensitomértrie Haute
resolution.
TNFα: Tumor Necrosis Factor α.
TNK: Lymphocyte Natural Killer.
UIP: Usual Interstitial Pneumonia.
VEMS: Volume Expiratoire Maximal par
Seconde.

10. Liste des tableaux
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Aspects radiologiques des PID
Tableau 2 : Valeurs habituelles du LBA (sujet adulte, sain, non-fumeur)
Tableau 3 : Score de GOLDE
Tableau 4 : Les principaux diagnostics suggérés selon le profil cellulaire observé au LBA
Tableau 5 : Caractéristiques des deux chromogènes de la peroxydase
Tableau 6 : Volume mis selon la richesse cellulaire
Tableau 7 : Les principales colorations du LBA
Tableau 8 : La formule du LBA
Tableau 9 : Les anticorps utilisés pour le marquage immunocytochimique
Tableau 10 : Les anticorps utilisés pour l’acquisition par cytométrie en flux
Tableau 11 : Grille d’interprétation du Kappa
Tableau 52 : Les signes cliniques des patients
Tableau 13 : Diagnostic radio-clinique suspecté des patients
Tableau 14 : Caractéristiques cliniques des patients
Tableau 15 : Rapport CD4/CD8 évalué par Immunocytochimie sur étalements
Tableau 16 : Rapport CD4/CD8 évalué par Immunocytochimie sur cytoblocs
Tableau 17 : Rapport CD4/CD8 évalué par Cytométrie en flux
Tableau 18 : Rapport CD4/CD8 évalué par les deux techniques : Immunocytochimie sur
étalements et Immunocytochimie sur cytoblocs
Tableau 19 : Rapport CD4/CD8 évalué par les deux techniques : Immunocytochimie sur
étalements et Cytométrie en flux
Tableau 20 : Rapport CD4/CD8 évalué par les deux techniques : Immunocytochimie sur
étalements et Cytométrie en flux
Tableau 21 : Les résultats du LBA

11. Liste des figures
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Présentation schématique de l'interstitium pulmonaire
Figure 2 : Classification des PID : A : Classification de 2002 ; B : Classification de 2012
Figure 3 : Hypothèse du processus pathogénique de la FPI
Figure 4 : Hypothèse de processus pathogénique de la PHS
Figure 5 : Formation du granulome au cours de la PHS
Figure 6 : Démarche diagnostique devant une PID
Figure 7 : Les différents types d’anticorps
Figure 8 : Mode d’action de la peroxydase
Figure 9 : Les différentes méthodes de marquage immunocytochimique
Figure 10 : Le système PAP
Figure 11 : Le système Biotine/Streptavidine
Figure 12 : Le système d’amplification polymérique
Figure 13 : Les composants d'un cytométre
Figure 14 : Le principe de centrage hydrodynamique
Figure 15 : Le principe du systéme optique
Figure 16 : Les méthodes d'immunofluorescence
Figure 17 : Cellule de Malassez vue au microscope à faible grossissement
Figure 18 : Méthode immuno-enzymatique avec amplification du signal par un polymère
Figure 19 : Les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission des différents fluorochromes
utilisés dans le marquage par cytométrie en flux
Figure 20 : La répartition selon le sexe

12. Liste des figures
Figure 21 : La répartition selon l’âge
Figure 22 : Le tabagisme
Figure 23 : Les antécédents respiratoires des patients
Figure 24 : Aspect du LBA
Figure 25 : Cellularité du LBA
Figure 26 : Formule du LBA
Figure 27 : Immunocytochimie sur étalements
Figure 28 : Immunocytochimie sur cytoblocs
Figure 29 : Cytométrie en flux
Figure 30 : Quelques phénotypes rares observés dans l’analyse lymphocytaire par cytométrie
en flux

13. INTRODUCTION
1
LES PNEUMOPATHIES INTERSTITIELLES
DIFFUSES
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) sont considérées comme un groupe
d’affections multiples, généralement chroniques et diverses par leurs aspects cliniques,
radiologiques et microscopiques ; ce qui rend leur approche diagnostique souvent difficile.
Les modalités de cette approche ne peuvent être codifiées et comportent un facteur personnel
fondé sur l’expérience acquise de cette pathologie. Les données de la littérature (1)
témoignent la diversité de la démarche diagnostique des PID avec néanmoins un consensus
sur l’importance de l’anamnèse et de l’examen clinique. Une concertation multidisciplinaire
entre pneumologues, radiologues et pathologistes est à la base de la démarche diagnostique
face à une PID (2,3).
Grâce à l’amélioration des techniques d’endoscopie bronchique, le lavage broncho-alvéolaire
(LBA) permet d’orienter le diagnostic des PID. Il s’agit d’un acte non invasif, facile, rapide et
peu onéreux d’exploration du poumon profond. Il fournit une image représentative des
modifications inflammatoires et immunitaires observées au niveau des alvéoles en distinguant
le type cellulaire prédominant dans le poumon profond. Il permet aussi de distinguer les
alvéolites macrophagiques, à polynucléaires neutrophiles, à polynucléaires éosinophiles ainsi
que les alvéolites lymphocytaires (4,9). Ces dernières font l’objet de notre travail de
recherche.
Les données de la littérature (10) témoignent de la nécessité du phénotypage dans toute
alvéolite lymphocytaire afin d’orienter le diagnostic vers une pathologie impliquant
l’immunité humorale ou cellulaire. Un marquage immunocytochimique ou par cytométrie en
flux est donc nécessaire pour évaluer les sous-populations lymphocytaires dans le but
d’éliminer ou d’ajouter des éléments d’enquête orientant vers un groupe restreint d’affections.

14. INTRODUCTION
2
RAPPEL THEORIQUE
1. Définition:
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) représentent un groupe hétérogène de
pathologies pulmonaires diffuses dont la caractéristique histologique est l’atteinte de
l’interstitium pulmonaire, c’est à dire des espaces entre les cellules alvéolaires et des
membranes basales endothéliales, par de l’inflammation et de la fibrose en proportions
variables ; néanmoins, d’autres structures histologiques peuvent être affectées comme les
lumières alvéolaires, les bronchioles ou encore les vaisseaux (11).
Malgré des différences notables concernant leur étiologie et leur évolution, les PID partagent
certains aspects cliniques, radiologiques, fonctionnels et histopathologiques. Les PID sont
ainsi subdivisées en PID de cause connue, les PID de cause inconnue mais bien
individualisables et les PID de cause inconnue ou idiopathiques (11).
2. Rappel anatomique :
D’une façon schématique, le poumon est constitué par une charpente conjonctive
correspondant à l’interstitium pulmonaire et un ensemble de conduits aériens comprenant les
différentes ramifications de l’arbre bronchique, les canaux alvéolaires et les alvéoles.
A l’intérieur de cet ensemble, se ramifient les vaisseaux fonctionnels du poumon. Les
vaisseaux lymphatiques principaux siègent en regard des pédicules broncho-vasculaires, des
septa interlobulaires et dans les régions sous-pleurales (12).
Weibel subdivise l’interstitium pulmonaire en trois secteurs (13):
 Un secteur axial péribroncho-vasculaire.
 Un secteur périphérique comprenant l’interstitium sous-pleural et les septa
interlobulaires.
 Un secteur intralobulaire en continuité avec les deux précédents.
Le lobule pulmonaire secondaire constitue l’unité anatomique et physiologique de base du
poumon. Il est de forme polyédrique et mesure environ 1 à 2,5 cm de long. La bronchiole
aérant le lobule pulmonaire secondaire et l’artère homologue au centre du lobule, ont un
diamètre d’environ 1 mm. Les septa conjonctifs interlobulaires au sein desquels cheminent les
veines pulmonaires et les lymphatiques, constituent les bords. Le cortex du poumon,

15. INTRODUCTION
3
d’environ 3 à 4 cm d’épaisseur comporte une ou deux rangées de lobules pulmonaires
secondaires. Il constitue la région périphérique du poumon. A ce niveau, les lobules sont
relativement larges et ont une forme de cônes tronqués avec une base pleurale et un apex de
direction centrale. Dans la zone centrale ou médullaire du poumon, les lobules pulmonaires
secondaires sont plus petits et de forme polygonale ou hexagonale. Les trois secteurs
interstitiels sont parfaitement représentés au niveau du lobule pulmonaire secondaire. Les
septa interlobulaires appartiennent au secteur interstitiel périphérique de Weibel. Au centre du
lobule pulmonaire secondaire, la branche artérielle pulmonaire et la bronchiole sont entourées
par du tissu conjonctif appartenant au secteur axial de Weibel. Ce tissu conjonctif représente
en fait la continuation de l’interstitium entourant les éléments broncho-vasculaires du hile et
leurs branches de division plus distales jusqu’au centre du lobule pulmonaire secondaire et
plus en aval. Le troisième secteur de Weibel siège au sein des septa alvéolaires. Il s’agit des
fibres septales qui relient les systèmes axial et périphérique. Un squelette fibreux continu est
ainsi constitué au sein du poumon (Figure 1) (14,15).
Figure 1 : Présentation schématique de l’interstitium pulmonaire (D’après www.studyblue.com, 34)

16. INTRODUCTION
4
3. Principales étiologies :
Les PID sont classées en PID de cause connue (pneumoconiose, lymphangite carcinomateuse,
PHS, pneumopathies médicamenteuses, PID associées aux connectivites …), les PID de cause
inconnue mais représentant des entités bien déterminées (sarcoïdose) et les PID idiopathiques.
Ces-dernières font l’objet d’une classification multidisciplinaire par les Sociétés Américaine
Thoracique et Européenne Respiratoire (ATS et ERS) qui ont publié en 2002 des définitions
consensuelles des sous types de PID idiopathiques.
Les PID idiopathiques regroupent par ordre de fréquence décroissante : La fibrose pulmonaire
idiopathique (UIP), les pneumopathies interstitielles non spécifiques (NSIP), la pneumopathie
organisé cryptogénique (COP), la pneumopathie interstitielle aigüe (AIP), la bronchiolite
respiratoire avec pneumopathie interstitielle (RB-ILD), la pneumopathie interstitielle
desquamative (DIP) et la pneumopathie interstitielle lymphoïde (LIP) (figure 2A) (16).
Une révision de la classification de 2002 a été proposée par ATS et ERS en 2012. Les PID ont
été ainsi divisées en PID de cause connue (connectivite, médicament, exposition…), les
granulomatoses, les formes particulières et les PID idiopathiques. Ces-dernières ont
également été subdivisées en pneumopathies interstitielles idiopathiques majeures, rares et
inclassables. Parmi les pneumopathies rares, une nouvelle entité a été identifiée : la fibro-
élastose pleuro-pulmonaire idiopathique (figure 2B) (17).

17. INTRODUCTION
5
Figure 2 : Classification des PID ; A : Classification de 2002 ; B : Classification de 2012 (D'après
ATS et ERS ; 16, 17)
Pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Collagénose(sclérodermie, PR..)
Pneumoconiose (asbestose, silicose)
PM
Pneumopathies interstitielles
idiopathiques
UIP
RB-ILD
NSIP
DIP
COP
LIP
AIP
Granulomatose
Sarcoïdose
Alvéolite allergique
Histiocytose X ;LAM
Pneumopathie à éosinophiles
lipoprotéinose alvéolaire
ALI(Acute Lung Injury)
SDRA
Pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Cause connue
Connectivite, médicament,
exposition ...
Pneumopathies
interstitielles
idiopathiques
Pneumopathies
interstitielles
idiopathiques
majeures
Chroniques
fibrosantes:
UIP, PINS
Aiguës,
subaiguës:
POC, PIA
Liées au tabac:
DIP, RB-ILD
Pneumopathies
interstitielles
idiopathiques rares
Pneumopathie
interstitielle
lymphoïde
idiopathique
Fibroélastose
pleuro-pulmonaire
idiopathique
Pneumopathies
interstitielles
idiopathiques
inclassables
Granulomatose
Sarcoïdose
Formes particulières
HPCL, LAM, lipoprotéinose
alvéolaire, PCIE…
A
B

18. INTRODUCTION
6
4. Epidémiologie :
L’étude épidémiologique des PID repose sur plusieurs critères comme l’âge, le sexe, les
expositions environnementales et le tabagisme. Peu d’études ont été publiées sur l’incidence,
la prévalence et la mortalité des PID dans le monde en raison des problèmes de classification,
de diversité des manifestations cliniques, des signes radiologiques et microscopiques rendant
l`approche diagnostique laborieuse (18).
Des registres ont été mis en place au Nouveau- Mexique, en Flandres, en Allemagne, en Italie,
au Royaume-Uni, en Espagne et en Grèce (19-25). Selon Coultas (19), la prévalence globale
des PID est estimée à 67-81/100 000 avec une incidence autour de 26-32/100 000 et l’âge
moyen des patients est compris entre 51 et 69 ans.
Une autre étude menée en France par Cottin (26), a rapporté une prévalence des PID de 30
cas/100 000 habitants avec 300 décès annuels. En France, il y a 12 à 15 000 nouveaux cas de
PID/an.
En Tunisie, nous disposons de peu de données épidémiologiques sur les PID. Une étude a été
menée dans la plupart des services de pneumologie de la capitale de 2000 à 2005 et a
répertorié 1707 cas de pneumopathies interstitielles diffuses représentant 7.2% des motifs
d’hospitalisation. L’âge moyen des patients était de 50,9 ans avec un sex-ratio de 0,51. Selon
cette étude, les cas asymptomatiques non diagnostiqués sont dix fois plus fréquents que les
cas symptomatiques (27).
5. Physiopathologie :
Les mécanismes physiopathologiques des PID demeurent méconnus. Plusieurs hypothèses
pathogéniques ont été proposées par certains auteurs (28).
 La fibrose pulmonaire idiopathique (UIP) :
L’UIP demeure de cause inconnue. Elle résulterait de processus superposés de détérioration
tissulaire, de phénomènes inflammatoires et de réparation. Une altération de la perméabilité
de l’épithélium et des lames basales, alvéolaires et capillaires conduit à une infiltration
inflammatoire interstitielle avec œdème et diffusion des cellules inflammatoires et
mésenchymateuses. Les cellules inflammatoires sont recrutées à partir du sang circulant,
libérant des cytokines qui agissent sur le recrutement et la prolifération des cellules
mésenchymateuses (les fibroblastes) et leur synthèse de collagène. Cette exagération des
mécanismes physiologiques de réparation tissulaire serait à l’origine de la fibrose pulmonaire
idiopathique (Figure 3) (29-32).

19. INTRODUCTION
7
Figure 3 : Hypothèse du processus pathogénique de FPI (29,32)
 La pneumopathie d’hypersensibilité (PHS) :
Plusieurs antigènes sont impliqués dans le processus pathogénique (champignons, bactéries,
protozoaires, insectes, produits chimiques de bas poids moléculaire…). La majorité des
individus exposés à ces antigènes développent une tolérance immunitaire médiée par les
cellules T régulatrices et l’antigène inhalé produit une augmentation du nombre des
lymphocytes sans avoir de conséquences cliniques. La coexistence de facteurs génétiques et
environnementaux provoque une réaction immunitaire exagérée ce qui induit un processus
inflammatoire pulmonaire (Figure 4) (33). Trois formes de PHS sont distinguées:
 Forme aiguë : Granulome interstitiel non caséeux avec cellules géantes.
 Forme subaiguë : Granulome, bronchiolite avec ou sans pneumonie organisée, fibrose
interstitielle.
 Forme chronique : Inflammation interstitielle chronique, destructions alvéolaires,
fibrose dense, emphysème.

20. INTRODUCTION
8
Figure 4 : Hypothèse du processus pathogénique de PHS (33)
La formation du granulome inflammatoire est le résultat d’une réponse immunitaire Th1
secondaire à une stimulation antigénique avec production de nombreux médiateurs pro-
inflammatoires qui interviennent dans le recrutement de plusieurs cellules : les lymphocytes,
les macrophages, les monocytes et les cellules épithélioïdes qui vont former un granulome.
Ce dernier involue dans la majorité des cas. Néanmoins, la présence d’une exposition répétée
à un antigène avec une prédisposition génétique et des changements immunopathologiques
dans le microenvironnement pulmonaire incitent le recrutement et l’activation des fibroblastes
et l’accumulation de la matrice extra cellulaire induisant une évolution chronique vers une
fibrose (Figure 5) (33).

21. INTRODUCTION
9
Figure 5 : La formation du granulome au cours de la PHS (33)
6. Démarche diagnostique :
La démarche diagnostique dans les PID est le résultat d’une confrontation multidisciplinaire
entre pneumologues, radiologues et pathologistes. En effet, le diagnostic des PID est porté
selon un faisceau d’arguments cliniques, radiologiques et anatomopathologiques. Selon les
nouvelles recommandations de l’ATS et de l’ERS, le LBA doit être réalisé dans toute PID
confirmée radiologiquement (figure 6) (4).

22. INTRODUCTION
10
Figure 6 : Démarche diagnostique devant une PID (4)
6.1. Manifestations Cliniques :
Les symptômes débutent le plus souvent de façon insidieuse avec une dyspnée d’effort
d’installation progressive et une toux non productive. Ces symptômes ne sont pas typiques
des PID et ne permettent pas d’orienter le diagnostic étiologique (2). Des signes extra
pulmonaires en faveur d’une connectivite (sclérodermie, lupus érythémateux disséminé,
polyarthrite rhumatoïde) peuvent être observés et doivent être pris en considération afin de
guider le diagnostic des PID.
6.2. Aspects radiologiques :
En cas de suspicion de PID, le bilan diagnostique comprend la radiographie du thorax et le
scanner thoracique de haute résolution.
6.2.1. Radiographie standard du thorax :
L’image radiographique permet de donner une vision globale de l’atteinte parenchymateuse,
de préciser la topographie des lésions par rapport aux structures anatomiques normales, la
présence ou non d’une atteinte pleurale ou médiastinale. Elle permet surtout de surveiller
l’évolution des lésions dans le temps (34).
Dans 90% des cas, les PID ont un aspect d’infiltration pulmonaire diffuse. Dans les 10%
restant, l’atteinte parenchymateuse n’est pas détectable et la radiographie parait normale (34).
6.2.2. La tomodensitométrie haute résolution (TDM-HR) :

23. INTRODUCTION
11
La TDM-HR en coupes fines est l’examen de référence pour confirmer le diagnostic d’une
PID. Elle permet l’exploration fine du parenchyme avec une description détaillée des lésions
élémentaires et de leur distribution topographique, ainsi qu’une analyse du médiastin et de la
plèvre à la recherche de lésions pleurales, d’adénomégalies hilaires et/ou médiastinales (35).
L’atteinte interstitielle est caractérisée par des opacités à limites nettes non confluentes non
systématisées sans bronchogramme aérien et comporte divers éléments. L’aspect réticulé est
constitué d’opacités linéaires plus ou moins régulières qui correspondent à un épaississement
des septa interlobulaires et/ou à l’interstitium des parois alvéolaires. L’aspect nodulaire est
fait d’éléments de taille variable (micronodules, nodules ou masses) et peut s’associer aux
opacités linéaires pour former un infiltrat réticulonodulaire diffus. Il peut exister des lésions
kystiques avec des cavités aériques à paroi fine plus ou moins juxtaposées (Rayons du miel).
L’étendue de ces lésions est variable selon les PID. Les principales caractéristiques des
lésions scannographiques des PID sont regroupées dans le tableau 1 (16,35).

24. INTRODUCTION
12
Diagnostics
Radiographie
thoracique
TDM-HR
Topographie
des lésions
Fibrose
Pulmonaire
Idiopathique
(FPI)
Réticulation basale
Rétraction
pulmonaire
Réticulations, rayons de miel
(++), bronchectasies de
traction, distorsion
architecturale, verre
dépoli (+/-)
Périphérique,
sous pleurale,
basale
symétrique
Pneumopathie
Interstitielle Non
Spécifique
(PINS)
Verre dépoli
Réticulations
Verre dépoli ++,
consolidation, opacités
linéaires
Irrégulières
Périphérique,
sous pleurale,
basale,
symétrique
Pneumopathie
Organisée
Cryptogénique
(COP)
Consolidation
« patchy » :
Bilatérale
Condensations alvéolaires
migratrices
Bronchogramme aérien
Sous pleurale,
Péri bronchique
Pneumopathie
Interstitielle
Desquamative
(DIP)
Verre dépoli
Verre dépoli, opacités
linéaires
Basale,
Périphérique
Bronchiolite
Respiratoire
avec
Pneumopathie
Interstitielle
(RB-ILD)
Épaississement
parois bronchiques,
Verre dépoli
Épaississement parois
bronchiques, verre dépoli
Nodules centrolobulaires
Diffus
Pneumopathie
Interstitielle
Lymphoïde
(LIP)
Opacités
réticulaires, Nodules
Opacités réticulaires,
nodules,
verre dépoli,
épaississement
péribronchovasculaire et
septal
Diffus
Tableau 1 : Aspects radiologiques des PID (16)
6.3. Apport du Lavage Broncho-Alvéolaire :
6.3.1. Définition du LBA :
Le LBA est un outil diagnostique peu invasif qui permet d’explorer le poumon profond. Les
informations qu’il fournit sont fiables sous couvert d’une technique rigoureuse tant au niveau
de sa réalisation au cours de la fibroscopie bronchique que dans son analyse dans le

25. INTRODUCTION
13
laboratoire d’anatomie pathologique. Grâce à la reproductibilité de ses résultats, le LBA s’est
imposé comme un outil fondamental du diagnostic positif des PID (4,36).
Le LBA possède une excellente valeur diagnostique étiologique pour les pneumopathies
infectieuses, les hémorragies intra-alvéolaires, les lipoprotéinoses alvéolaires, les
pneumopathies chroniques à éosinophiles et accessoirement les tumeurs. Le plus souvent, il
n’a qu’une valeur d’orientation et permet d’identifier la formule cellulaire: alvéolite
lymphocytaire, à polynucléaires neutrophiles, à polynucléaires éosinophiles, mixte (4).
6.3.2. Intérêt du LBA :
Le LBA permet tout d’abord une analyse de la cytologie normale alvéolaire aussi bien
quantitative que qualitative. Il permet également la détection des cellules (inflammatoires,
néoplasiques …) ou du matériel acellulaire (lipoprotéines) anormal et la mise en évidence de
nombreux agents pathogènes. C’est un outil très pratique pour le suivi de l’évolution des
processus pathologiques ou pour évaluer la réponse à un traitement (36).
Certains auteurs (4) soulignent l’importance de corréler les données du LBA aux aspects
radiologiques. Le LBA permet en effet, d’accéder facilement à une analyse plus fine des
processus pathologiques mis en cause.
Etant donné qu’il s’agit d’un acte non invasif, facile, rapide et peu onéreux, il est tout à fait
justifié de l’entreprendre en présence de tout signe de PID avant d’envisager d’autres moyens
diagnostiques plus invasifs tels que la biopsie Trans-pariétale ou la biopsie Trans-bronchique
ou encore la biopsie chirurgicale.
6.3.3. Réalisation et interprétation du LBA :
Le LBA est réalisé au cours de la fibroscopie soit sous anesthésie locale afin de prévenir la
toux soit sous anesthésie générale d’un patient intubé. Du liquide isotonique stérile est instillé
à travers le canal de travail directement dans une bronche obstruée par l’extrémité du
fibroscope. Il n’y a pas de consensus établi sur la quantité exacte de liquide à instiller. On
admet généralement des aliquots de 20-60 ml pour un volume total de 100-300 ml. Le retour
du liquide est d’environ 40-70%, mais il peut être inférieur à ce volume dans les troubles
ventilatoires obstructifs (37).
En cas d’atteinte diffuse du parenchyme pulmonaire, le LBA est réalisé dans le lobe moyen
ou la lingula. En effet, la corrélation entre les deux lobes est excellente et ces localisations
antérieures permettent un bon rendement. En cas d’atteinte focale dans un lobe ou un segment

26. INTRODUCTION
14
pulmonaire, on s’appuie sur la documentation radiologique pour «laver» la zone d’intérêt
(37).
Le LBA est peu invasif et n’a pas de contre-indication absolue. Les complications les plus
fréquentes sont une aggravation transitoire de l’hypoxémie due au liquide résiduel du LBA
dans les alvéoles et plus rarement, un pneumothorax. Les facteurs de risque de survenue
d’une complication sont : des infiltrats pulmonaires étendus, une PaO2< 8 kPa (< 60 mm Hg),
une saturation en oxygène < 90%, un VEMS <1 litre, une thrombocytopénie <20 G/l et une
hyperréactivité bronchique (37).
Après la réception des écouvillons contenant le liquide à analyser, des études cytologiques et
microbiologiques rigoureuses sont faites, des colorations spéciales sont réalisées à la
recherche d’agents opportunistes, de sidérophages, de substance extracellulaire anormale ou
de cellules tumorales. Le diagnostic est orienté selon le profil cellulaire objectivé. Il est
recommandé dans certains profils de continuer l’analyse par un marquage
immunocytochimique ou une acquisition par cytométrie en flux (Comme le profil
lymphocytaire, ou le profil macrophagique s’il y a une suspicion clinique d’histiocytose X)
(8,9).
L’interprétation du LBA doit être minutieuse. Elle fournit d’une part, des éléments de
certitude diagnostique devant la présence de cellules malignes, d’agents infectieux
pathogènes, de sidérophages (indice de Golde > 100 signant une hémorragie alvéolaire),
d’une substance amorphe intercellulaire en faveur d’une lipoprotéinose alvéolaire. D’autre
part, cette interprétation fournit des éléments d’orientation étiologique devant une alvéolite
(augmentation harmonieuse de la cellularité totale ou de l’une des populations cellulaires
normalement présentes dans l’alvéole (macrophages, polynucléaires neutrophiles,
lymphocytes) ou devant l’apparition de cellules normalement absentes (éosinophiles,
mastocytes)) (8,9).
 Orientation diagnostique du LBA :
Les valeurs habituels du LBA chez un sujet adulte, sain, non-fumeur sont regroupées dans le
tableau ci-dessous (Tableau 2).

27. INTRODUCTION
15
Tableau 2 : Valeurs habituelles du LBA (Sujet adulte, sain, non-fumeur) (8,9)
Le LBA peut confirmer dans certains cas le diagnostic suspecté d’une hémorragie intra-
alvéolaire diffuse devant des images d’érythrophagocytose (macrophages alvéolaires qui ont
phagocyté des hématies et deviennent chargés en fer) ou devant le score de GOLDE >100. Le
score de GOLDE est une évaluation qui tient compte de la charge des macrophages en fer
estimée selon l’intensité de la coloration par le Perls. On effectue une numération-formule des
macrophages de valeur 0 à 4 sur 200 éléments reconnus selon leur couleur (Tableau 3) (38).
 Indice 0 : Négatifs
 Indice1 : Faiblement bleus
 Indice 2 : Modérément bleus (diffus) ou avec quelques grains (moins de 50% de la
surface du cytoplasme)
 Indice 3 : Granulations dans plus de 50 % du cytoplasme ou forte positivité diffuse
 Indice 4 : Forte positivité et masquage du noyau
Indice 0 1 2 3 4
% des sidérophages sur 200 macrophages a b c d e
Score de GOLDE = (ax0) + (bx1) + (cx2) + (dx3) + (ex4)
Le score de GOLDE varie de 0 à 400.
Tableau 3 : Score de GOLDE
La charge en fer est normale ou faible de 0 à 20, intermédiaire de 20 à 70, élevée à plus de 70
et une hémorragie alvéolaire occulte est diagnostiquée si le score est supérieur à 100.
 Profil cytologique du LBA :
Le profil cytologique du LBA varie en fonction de la pathologie suspectée et les différents
profils observés sont regroupées dans le tableau ci-dessous (Tableau 4) (4).
Richesse cellulaire 150 à 200 000 cellules/ml
Macrophages 90 à 95 %
Lymphocytes <20%
Polynucléaires neutrophiles <5%
Polynucléaires éosinophiles <1%
Mastocytes <1%0

28. INTRODUCTION
16
Type cellulaire Anomalie Diagnostic suggéré
Macrophages >90% Histiocytose X
Lymphocytes
>25%
Sarcoïdose
PINS
PHS
PM
Collagénose
Pneumopathie radique
LIP
Lymphome
COP
Bérylliose
Pneumoconiose
Pneumonie virale
>50%
PHS
PINS
Neutrophiles
>3%
Dommage alvéolaire diffus
Pneumonie bactérienne,
fongique
Asbestose
Collagénose
FPI
Bronchiolite oblitérante
SDRA
>50%
Dommage alvéolaire diffus
Pneumonie bactérienne
Eosinophiles
>1%
Pneumonie à éosinophiles
Maladie de Churg-Strauss
Syndrome
hyperéosinophilique
ABPA
>25% Pneumonie à éosinophiles
Cellules épithéliales >5% Contamination
Cellules bronchiques >5% Prélèvement inadéquat
Cellules malignes Néoplasie
Tableau 4 : Les principaux diagnostics suggérés selon le profil cellulaire observé au LBA (4)
On va s’intéresser dans notre étude aux alvéolites lymphocytaires qui sont observées dans
nombreuses affections (sarcoïdose, PHS, tuberculose, connectivites …). Il est recommandé
devant toute alvéolite lymphocytaire de continuer l’analyse par un marquage
immunocytochimique ou une acquisition par cytométrie en flux.

29. INTRODUCTION
17
6.3.4. Immunocytochimie :
L’immunocytochimie est une technique qui permet la détection in situ d’un antigène (Ag) à
l’aide d’anticorps de reconnaissance spécifique. Elle consiste à révéler sur un étalement ou
une coupe cytologique, par réaction antigène-anticorps, la présence des récepteurs
antigéniques cellulaires intranucléaires, membranaires ou cytoplasmiques (39,40).
Le marqueur recherché ou l’antigène (Ag) peut être intracellulaire ou membranaire ou
extracellulaire. Les anticorps utilisés sont soit polyclonaux, c’est à dire un mélange
d’anticorps reconnaissant différents épitopes sur un antigène donné, soit monoclonaux ne
reconnaissant qu’un seul type d’épitope sur un antigène donné (41). L’arrivé des anticorps
monoclonaux, à partir des années 1980, a contribué significativement à l’essor de
l’immunocytochimie même si, pour certains antigènes, les anticorps polyclonaux restent
d’actualité (42).
Figure 7 : Les différents types d’anticorps (D’après www.dako.com)
La visualisation du complexe antigène-anticorps doit être réalisée in situ à l’aide d’un
marqueur morphologique. Plusieurs méthodes sont possibles : radio-isotopiques, fluorescence,
métallique, enzymatique (43). En anatomie pathologique, la méthode la plus appropriée pour
révéler le complexe Ag/Ac sur étalements ou coupes cytologiques, est la mise en évidence
d’une activité enzymatique. La plus communément utilisée est la peroxydase extraite de
raifort (cruciféracée), car elle est disponible en grande quantité, stable, peu couteuse et
détectable par plusieurs chromogènes et elle est couplée de façon stable à des protéines
(figure 8) (43). La première technique immuno-peroxydasique a été décrite par Nakane et
Pierce (44). Depuis, elle a fait l’objet de nombreux développements qui ont conduit à une
augmentation de la sensibilité par rapport aux techniques plus précoces.

30. INTRODUCTION
18
En outre, La peroxydase peut être présente de façon endogène dans certains tissus biologiques
et permet la décomposition de l’H2O2 et cette activité est présente dans toutes les
hémoprotéines comme l’hémoglobine (les hématies), les cytochromes (les polynucléaires, les
macrophages) et les catalases (foie/rein) ; elle peut donc donner un signal non spécifique lors
de la révélation du complexe antigène-anticorps. Il est nécessaire alors de l’inhiber durant la
technique immunocytochimique. L’inhibition de ces peroxydases endogènes se fait par une
incubation des étalements dans le H2O2 avant le marquage immunocytochimique (43).
Figure 8 : Mode d’action de peroxydase (41)
Les chromogènes les plus utilisés en immunocytoperoxydase sont le 3-Amino-9-Ethyl-
Carbazole (AEC) et la 3,3-Diaminobenzidine (DAB) (Tableau 5) (45,46).
AEC DAB
Produit de réaction rouge facilitant
l’observation.
Précipité marron.
Soluble dans les alcools et les solvants
organiques.
Précipité insoluble.
Les contre-colorants ne doivent pas contenir
de l’alcool.
Tout contre-colorant peut être utilisé.
Le milieu de montage doit être aqueux. Tout milieu de montage utilisé.
Peut perdre son intensité de coloration
(diffusion dans le milieu de montage).
Intensité de coloration pratiquement
permanente.
Tableau 5 : Caractéristiques des deux chromogène de la peroxydase (46)
On distingue:
 L’immunoperoxydase directe : Une seule étape et une seule espèce animale :
l’anticorps primaire est directement couplé à la peroxydase (43) ;
Ac primaire conjugué + antigène → marquage direct (Figure 9).

31. INTRODUCTION
19
 L’immunoperoxydase indirecte : Deux étapes et deux espèces animales : l’anticorps
primaire est détecté par un second anticorps couplé à la peroxydase (43);
Ac secondaire conjugué + Ac primaire + antigène → marquage indirecte (Figure 9).
Figure 9 : Les différentes méthodes de marquage immunocytochimiques (D’après www.dako.com)
Il existe de nombreux systèmes d’amplifications utilisés en immunocytochimie, on distingue
ainsi :
 Le système PAP :
Trois étapes et trois espèces animales : un second anticorps sert de liaison entre l’anticorps
primaire et le complexe peroxydase-anti-peroxydase (Figure 10) (47).
Figure 10 : Système PAP (D’après www.dako.com)

32. INTRODUCTION
20
 Système Biotine/Streptavidine :
Trois étapes et deux espèces animales : la caractéristique de ce système biotine (vitamine B1)
streptavidine (avidine = protéine) est la haute affinité de la streptavidine pour la biotine. La
streptavidine sert de pont entre le second anticorps biotinylé et plusieurs peroxydases
biotinylées (43). Le principal avantage de ce système est l’amplification considérable du
signal sans augmenter le bruit de fond (45). Il permet de plus une utilisation à de très faibles
concentrations des réactifs et en particulier de l’anticorps primaire du fait de la forte
interaction existant entre la biotine et la streptavidine (47).
La biotinylation d’un anticorps n’altère pas ses propriétés de liaison à l’antigène. L’avidine
est extraite du blanc d’œuf et possède 4 sites de liaison à haute affinité pour la biotine. La
streptavidine est une protéine isolée à partir d’une bactérie Streptomyces avidini, elle a les
mêmes propriétés de l’avidine (4 sites de liaison à haute affinité pour la biotine) (Figure 11)
(47).
Figure 11 : Système Biotine/Streptavidine (D’après www.dako.com)
 Système d’amplification polymérique :
L’emploi d’un marquage polymérique constitue un développement récent. Ce système
emploie une nouvelle technologie de polymérisation contrôlée pour préparer des conjugués
polymérique HRP-anticorps de liaison. Par conséquent, le problème du au marquage non
spécifique susceptible de se produire avec les systèmes de détection biotine/streptavidine en
raison de la présence de biotine endogène, ne se pose plus (Figure 12).

33. INTRODUCTION
21
Figure 12 : Système d’amplification polymérique (D’après www.dako.com)
 Apport de l’immunocytochimie dans le diagnostic des PID :
Un protocole immunocytochimique est une technique complexe composée de nombreuses
étapes successives. Son résultat - le dépôt coloré obtenu -, est influencé par des événements
préalables à l’acte immunocytochimique proprement dit, en particulier la fixation (48) et le
temps de restauration antigénique (49). Ces caractéristiques expliquent combien, il est
difficile d’assurer une reproductibilité parfaite du signal immunocytochimique (50).
L’immunocytochimie a pour objet la mise en évidence d’antigène in situ, sur des étalements
ou coupes cellulaires à l’aide d’anticorps marqués. L’immunocytochimie est maintenant
utilisée en routine et a un grand apport pour le diagnostic en oncologie, en pneumopathologie
et plus spécifiquement dans le diagnostic de certaines PID : pour aider à orienter le diagnostic
devant un profil cellulaire lymphocytaire (marquage CD4/CD8) et dans certains cas pour
confirmer un diagnostic suggéré (marquage CD1a en cas de suspicion d’une histiocytose X)
ou pour mettre en évidence des agents infectieux (CMV…).
Les résultats immunocytochimiques sont habituellement intégrés dans un ensemble de
données cliniques, radiologiques et biologiques, pour permettre le diagnostic (49). Ainsi, le
pathologiste écartera rarement une possibilité diagnostique sur la base d’un marqueur absent
si les autres paramètres cliniques et radiologiques sont en faveur de ce diagnostic (49).
L’absence d’un marqueur peut être due à une particularité dans la procédure technique.

34. INTRODUCTION
22
6.3.5. Cytométrie en flux :
a. Définition :
La cytométrie en flux est une technologie qui permet la mesure et l’analyse, qualitative et
quantitative, de multiples paramètres à l’échelon cellulaire dans une population hétérogène en
suspension dans un liquide (51,52).
Elle consiste à analyser les signaux optiques ou physiques émis par une particule coupant le
faisceau lumineux d’un laser. Les propriétés mesurées par le cytométre en flux incluent la
taille relative de la cellule, sa granularité ou sa complexité interne relative et enfin son
intensité relative de fluorescence (51,52).
Ce procédé d’analyse individuelle (cellule par cellule) peut être mono- ou multi-
paramétriques et peut s’effectuer à la vitesse de plusieurs milliers d’événements par seconde.
Les résultats sont représentés sous la forme d’histogrammes (un paramètre) ou de
cytogrammes (deux paramètres).
L’apport majeur de la cytométrie est de pouvoir aborder les populations cellulaires dans leur
grande diversité et complexité.
b. Principe :
 Les composants d’un cytométre :
Le cytométre en flux est un appareil complexe qui possède trois grands systèmes: le système
fluidique qui introduit et positionne les cellules à analyser, le système optique comprenant
les lasers comme source de lumière et les filtres optiques qui séparent la lumière émise par la
cellule et la dirigent vers les détecteurs et le système électronique qui va convertir les
signaux optiques en signaux électroniques analysables par l’ordinateur (Figure 13) (53).

35. INTRODUCTION
23
Figure 13 : Les composants d’un cytométre (D’après www.selectscience.net)
 la composante fluidique :
Les cellules doivent être mises en suspension pour pouvoir être analysées. L’analyse par la
cytométrie en flux est basée sur la focalisation hydrodynamique par le liquide de gaine, ce
dernier s’écoule à une vitesse constante ce qui entraine et focalise un deuxième flux liquide
contenant l’échantillon et ainsi aligne les cellules une à une. Ces cellules seront excitées par le
laser et émettront de la lumière qui sera collectée par le système optique (Figure 14) (54,55).
Figure 14 : Principe de centrage hydrodynamique (D’après www.abcam.com)

36. INTRODUCTION
24
 Le système optique :
Il est composé d’une ou plusieurs sources lumineuses, de détecteurs de type photodiode (Pour
la diffusion de la lumière), de photomultiplicateurs et de filtres optiques qui permettent de
quantifier les diverses fluorescences émises par chaque cellule (54).
Le laser est la source lumineuse utilisée par le cytométre pour ces propriétés de puissance, de
stabilité et de focalisation avec une longueur d’onde étroite, bien définie et spécifique. Il
existe plusieurs types de lasers disponibles et les plus couramment utilisés sont des lasers à
argon (bleus ; 488 nm), lasers à hélium-néon (rouges ; 633nm) et des lasers ultra-violet (355
nm).
Le cytomètre en flux analyse les cellules en les faisant défiler à grande vitesse à travers un ou
plusieurs lasers. Les signaux optiques émis par la cellule coupant le faisceau lumineux d’un
laser sont mesurés par l’appareil et sont essentiellement relatifs :
- Aux propriétés optiques intrinsèques des cellules qui correspondent aux phénomènes de
diffusion lumineuse liés aux dimensions de la cellule et à leur structure interne. Le signal est
capturé par deux photodiodes. La première est disposée dans le prolongement du laser (FSC :
Forward Scatter) à faible angle. Le signal capté reflète approximativement la taille de la
cellule. La seconde est placée latéralement à 90 ° (SSC : Side Scatter). Le signal capté reflète
l’hétérogénéité des cellules (granularité du cytoplasme).
- Aux propriétés optiques induites de fluorescence obtenues par des marquages spécifiques de
structure ou de fonction cellulaire. En général, des anticorps monoclonaux couplés à des
fluorochromes sont nécessaires pour ces mesures optiques. Le fluorochrome absorbe
l’énergie du laser et réémet l’énergie absorbée par vibration et dissipation de chaleur, d’où
une émission de photons ayant une longueur d’onde plus élevée.
Les différents signaux optiques émis par la cellule doivent être focalisés, séparés, puis
acheminés vers des systèmes de détection, photomultiplicateurs ou photodiodes. Ils sont pour
cela, sélectionnés par différents circuits optiques, composés d’une alternance de miroirs et de
filtres. Ces signaux sont ensuite stockés par un ordinateur (Figure 15) (54).

37. INTRODUCTION
25
Figure 15 : Principe de système optique (D’après www.abcam.com)
 Analyse des données :
Une fois les signaux optiques convertis de façon proportionnelle en signaux électroniques
puis en chiffres, les données sont stockées dans l’ordinateur sous forme de fichier FCS (flow
cytometry standard).
Les données peuvent être représentées sous forme :
- d’histogrammes mono-paramétriques où l’axe des abscisses représente l’intensité du signal
analysé et l’axe des ordonnées le nombre de cellules.
- d’histogrammes bi-paramétriques ou cytogrammes présentant deux signaux simultanément
(54).
c. Applications :
La cytométrie en flux entame un champ d’application très large dans des disciplines très
variées telles que l’hématologie, l’immunologie, la cancérologie et la génétique autant dans
les domaines de la recherche scientifique que dans ceux de la recherche et l’application
clinique. Elle est également utilisée dans des domaines d’étude autres que celui de la cellule
animale. C’est le cas par exemple de la biologie végétale, de la microbiologie ou la biologie
marine (56).
La cytométrie en flux est de plus en plus utilisée pour le typage des leucémies, la numération
de très nombreux sous-types cellulaires, par exemple pour le suivi du sida ou des traitements
immunosuppresseurs et des greffes. De plus, les états d’activation, de maturation et de
prolifération des cellules peuvent être mesurés. La haute précision et la large utilisation de la
cytométrie a déjà permis de décrire de nouveaux sous-types cellulaires tels que les

38. INTRODUCTION
26
lymphocytes T gamma delta, muqueux, les cellules TNK, les lymphocytes régulateurs dont
l’action est ciblée au sein de la réponse immune (56).
L’association de l’immunofluorescence et de la cytométrie en flux est devenue un élément
essentiel dans l’étude des systèmes biologiques, surtout dans la discrimination entre cellules
d’une population hétérogène. En effet, l’utilisation des anticorps monoclonaux (AcM), dirigés
contre des composants membranaires spécifiques permet de distinguer par exemple des sous-
populations lymphocytaires. Ces dernières années, l’identification et la caractérisation des
antigènes (Ag) de surface des lymphocytes ont progressé très rapidement. Cependant, il
n’existe pas d’AcM pouvant reconnaître à lui seul une cellule particulière pourvue de
certaines fonctions. Cette limitation a conduit les utilisateurs de la technique
d’immunofluorescence à préférer les marquages multiples en utilisant des combinaisons
d’AcM révélés par des fluorochromes différents. Il y a deux méthodes
d’immunofluorescence :
- les réactions directes où l’AcM est directement couplé à un fluorochrome (Figure 16A).
- les réactions indirectes où l’AcM est révélé par un second réactif couplé au fluorochrome
(Figure 16B) (56).
Figure 16 : Méthodes d’immunofluorescence
Par rapport aux investigations initiales réalisées au microscope, la cytométrie en flux apporte
en plus la quantification à l’échelon cellulaire individuel du nombre de sites reconnus et la
possibilité de trier ces cellules selon l’intensité de leur marquage en vue d’études
fonctionnelles ultérieures. Enfin, elle peut se combiner à l’analyse d’autres paramètres (cycle
cellulaire, Calcium) et donc nous informer sur l’état fonctionnel des cellules (56).

39. OBJECTIF
27
OBJECTIF
Le but de notre travail est de comparer le
profil en immunocytochimie et en
cytométrie en flux des alvéolites
lymphocytaires dans le lavage
broncho-alvéolaire

40. PATIENTS ET METHODES
28
1. Patients :
Nous rapportons une étude comparative entre l’immunocytochimie et la cytométrie en flux
dans le cadre du phénotypage des alvéolites lymphocytaires. Pour ce faire, nous avons colligé
32 cas d’alvéolites lymphocytaires diagnostiquées et prises en charge au service d’Anatomie
Pathologique de l’Hôpital Abderrahmen Mami de l’Ariana pour l’analyse cytologique du
LBA et le marquage immunocytochimique et dans le département d’Hématologie (Unité de
Cytométrie en Flux) de l’Institut Pasteur de Tunis pour le phénotypage par cytométrie en flux.
2. Méthodes :
2.1. Protocole d’analyse cytologique du lavage broncho-alvéolaire :
Le LBA est reçu dans des flacons siliconés et numérotés. Le premier flacon est considéré
comme un liquide bronchique et les autres sont considérés comme un liquide alvéolaire et
constituent le véritable LBA.
Après la réception des écouvillons contenant le liquide à explorer, on note l’aspect du liquide
qui peut nous aider à suggérer un diagnostic précis (Par exemple : L’aspect hémorragique
oriente vers une hémorragie alvéolaire, l’aspect laiteux ou gras oriente vers une
lipoprotéinose). Il faut noter aussi s’il y a un dépôt au fond du flacon ou la présence de
poussières, de pigments ou de petits grains de sable (micro-lithiase alvéolaire).
Par la suite, on mesure le volume du LBA en versant la totalité du liquide dans une éprouvette
graduée en plastique stérile sans filtration car la filtration altère les cellules, notamment les
lymphocytes et des agrégats de cellules ou d’agent pathogènes peuvent être retenus dans le
filtre et on note le volume en ml.
Après avoir noté l’aspect et le volume du liquide, on fait une homogénéisation du LBA à
l’aide du Vortex Mixer (de DRAGON Laboratory Instruments). On évalue ensuite la richesse
cellulaire à l’aide de la cellule de Malassez (la richesse cellulaire est évaluée si le volume est
supérieur à 30 ml).
La cellule de Malassez est une lame en verre comprenant une plage centrale gravée et
quadrillée (Figure 17) surmontée par deux rebords. Le volume compris entre la plaque gravée,
la lamelle épaisse et se projetant dans les champs quadrillés est de 10-3
ml. Pour monter la
cellule on fait glisser la lamelle épaisse sur les rebords humectés. On prélève un peu de
liquide, après l’avoir bien remis en suspension par un geste d’agitation circulaire et on dépose
une à deux gouttes de LBA entre lame et lamelle de façon à recouvrir la zone gravée en
évitant d’inonder le tout. Par la suite, on compte les cellules déposées dans la zone

41. PATIENTS ET METHODES
29
quadrillée (toutes les cellules sont comptées sauf les hématies, les cellules bronchiques, les
cellules bucco-pharyngées ou les débris). La surface de comptage de la cellule est gravée en
10 lignes et 10 colonnes verticales qui forment 100 cases. Une case sur deux est redivisée en
20 petits carrés. On compte les cellules sur toute la surface en suivant les colonnes au
microscope. Pour ne pas compter deux fois une même cellule située sur un trait entre deux
colonnes, il suffit de compter les cellules à gauche de la colonne en montant ou descendant.
On compte les cellules sur la première ligne en haut et pas en bas.
Figure 17 : Cellule de Malassez vue au microscope à faible grossissement
2.1.1. Cytocentrifugation et préparation des lames :
On prépare environ cinq lames : trois pour les colorations standards (MGG, Perls,
Papanicolaou) et deux pour le marquage immunocytochimique.
a. Cytocentrifugation :
Nous avons utilisé une cytocentrifugeuse de type SHANDON CYTOSPIN 4® avec des cyto-
chambres à usage unique qui permettent la préparation de deux échantillons sur une seule
lame. Ces chambres sont maintenues contre des lames Super Frost à l’aide de cytoclips
métalliques. Au cours de la Cytocentrifugation, les cellules en suspension viennent se
déposer sur une lame porte-objet et l’excès de fluide est absorbé par une carte filtre.
Le volume mis dans les chambres à échantillon est lié essentiellement à la richesse cellulaire
et le tableau ci-dessous récapitule le volume mis en fonction de la richesse cellulaire (Tableau
6).

42. PATIENTS ET METHODES
30
Tableau 6 : Volume mis selon la richesse cellulaire
La durée et la vitesse de Cytocentrifugation est de 1200 tours/min pendant 10 minutes.
b. Coloration :
Après séchage à l’air pendant environ une à deux heures, trois colorations standards sont
réalisées (tableau 7) (Annexe1).
Richesse cellulaire Volume mis dans les chambres à échantillon
<100 000 cellules/ml 4 à 5 gouttes
100 à 200 000 cellules/ml 3 à 4 gouttes
200 à 300 000 cellules/ml 2 à 3 gouttes
300 à 400 000 cellules/ml 1 à 2 gouttes
400 à 500 000 cellules/ml 1 goutte
>500 000 cellules/ml Diluer avec du sérum physiologique (1 goutte
de LBA + 1 goutte de sérum)
Non déterminée 2 à 3 gouttes

43. PATIENTS ET METHODES
31
Tableau 7 : Les principales coloration du LBA
c. Inclusion du culot dans la paraffine :
Le liquide du LBA est centrifugé à 1500 tours/min pendant 3 minutes, après une fixation par
l’AFA (Alcool-Formol-Acide acétique) pendant au minimum 3 heures. Ensuite, on glisse les
culots dans une cassette à inclusion entre deux tissus mousses en regroupant les différents
culots. Cette étape est suivie par un enrobage en paraffine. Les blocs sont ainsi préparés pour
le marquage immunocytochimique sur cytoblocs (Annexe2).
2.1.2. Protocole de marquage immunocytochimique :
Dans notre étude, deux procédures de marquage immunocytochimique ont été réalisées :
Marquage sur des coupes incluses en paraffine (Cytoblocs) et marquage sur des étalements
cytologiques frais (Annexe 3).
Coloration Réactifs utilisés Résultats Intérêt
MGG - kit RAL 555 :
o Fix-RAL 555.
o Eosine-RAL 555.
o Bleu-RAL 555.
NoyauxBleu/Violet.
CytoplasmeRose/
Violet.
HématiesRose pale
Mettre en évidence
les composants
cellulaires en
jouant sur l’action
des ions
acides/basiques
Perls - Ferrocyanure de
potassium.
- Acide chloridrique à
2%.
- Phloxine : Le rouge
nucléaire, un contre
colorant.
Noyaux,
cytoplasmeRose
Hémosidérine (sels
ferriques) Bleu
turquoise
Mettre en évidence
les complexes
insolubles
contenant du fer
(exemple :
hémosidérine)
Papanicolaou - Hématéine.
- OG6
- EA50
NoyauxBleu/Violet
Cytoplasme :
 Eosinophiles
Rose/Rouge
/Orangé
 Cynophiles
Bleu verdâtre
 Orangéophiles
Orangé
brillant
OG6  permet de
détecter la présence
de la kératine.
Diagnostic de la
présence des
cellules
cancéreuses.

44. PATIENTS ET METHODES
32
a. Les étapes particulières aux coupes incluses en paraffine (Cytoblocs) :
Les coupes sur les cytoblocs ont été réalisées à l’aide d’un microtome Sakura Cut SRM
(épaisseur entre 3 et 4 microns) et sont montées sur des lames silanisées.
 Déparaffinage :
Les coupes montées sur des lames silanisées sont séchées à l’air libre puis portées à 56°C
dans une étuve pendant 12 à 24 heures au point de fusion de la paraffine. Elles subissent
ensuite les étapes suivantes :
 Déparaffinage des sections dans 3 bains de toluène (5 minutes pour chaque bain).
 Réhydratation dans 3 bains d’alcool éthylique de concentration décroissante
100%,70% et 50% (5 minutes chacun).
 Lavage des lames à l’eau distillée.
 Démasquage antigénique :
Le démasquage antigénique vise à rompre les liaisons moléculaires créées par le fixateur et
permet une accessibilité des sites antigéniques. Les lames ont été ainsi immergées dans un
tampon citrate (pH=6) puis chauffées au four à micro-ondes X-BIOGENEX (2 cycles durant 5
minutes à 90°C et 10 minutes à 97°C). Après avoir été refroidies sur la paillasse à température
ambiante pendant 20 minutes, les lames ont été rincées à l’eau distillée puis les coupes ont été
délimitées avec un crayon hydrophobe (Novocastra Pen).
b. Les étapes communes aux étalements et aux coupes incluses en paraffine
(Cytoblocs) :
 Blocage des peroxydases endogènes :
Les peroxydases endogènes peuvent être présentes dans certains tissus biologiques et donner
un signal non spécifique. Afin de réduire ce signal, les lames sont incubées avec le peroxyde
d’hydrogène à 3% pendant 10 minutes et lavées dans le TBS ‘Tris Buffered Saline’ (3 bacs de
5 minutes chacun) (Annexe3).
 Immunomarquage :
Les lames sont placées dans une chambre humide où elles sont incubées avec l’anticorps
primaire (tableau 9), dilué de façon optimale à température ambiante pendant une heure.
L’humidité de la chambre est nécessaire pour éviter l’évaporation de la solution de l’anticorps
(Annexe 3).

45. PATIENTS ET METHODES
33
Tableau 9 : Anticorps utilisés pour le marquage immunocytochimique
Ensuite, un lavage dans 3 bains de tampon TBS (3x5minutes) est effectué. Par la suite, les
lames sont incubées avec le Post Primary Block (10% de sérum animal dans une solution
saline tamponnée de Tris, Leica) pendant 30 minutes afin d’accroitre la pénétration du
polymère et un lavage dans 3 bains de tampon TBS (3x5 minutes) est effectué.
Après, on incube avec le polymère peroxydase qui renferme l’anticorps secondaire (IgG-poly-
HRP qui reconnait les immunoglobulines de souris et de lapin, Leica) pendant 30 minutes et
un lavage dans 3 bains de tampon TBS (3x5 minutes) est effectué (Annexe3).
 Révélation :
La révélation a été réalisée avec le chromogène DAB (diaminobenzidine) préalablement
préparé (Une goutte de ‘DAB Chromogen’ dans 1 ml de ‘DAB substrate Buffer’, Leica). Les
lames ont été recouvertes puis rincées à l’eau après l’obtention d’une coloration brune
satisfaisante (Annexe3).
 Contre coloration et montage :
La coloration de contraste a été réalisée avec l’hématéine de Mayer et les lames ont été par la
suite rincées sous l’eau pendant 5 minutes. La déshydratation des lames a été effectuée dans 3
bains d’alcool éthylique de concentration croissante 50%, 70% et 100% pendant 5 minutes
chacun et ont été montées avec un milieu de montage adapté au toluène/xylène (Annexe3).
Anticorps Firme Clone Classe
Ig
Dilution
Recommandée/utilisée
Marquage
Lapin anti-
CD3
Invitrogen,
camarillo, CA
Polyclonal - 1 :50/1 :50 Cytoplasmique
Les
lymphocytes T
Souris anti-
CD4
Leica
Biosystems
Newcastle Ltd
clone 4B12 IgG1,
kappa
1 :100/1 :20 Cytoplasmique
Les
lymphocytes
TCD4
Souris anti-
CD8
Leica
Biosystems
Newcastle Ltd
clone 1A5 IgG1 1 :20/1 :20 Cytoplasmique
Les
lymphocytes
TCD8

46. PATIENTS ET METHODES
34
Figure 18 : Méthode immuno-enzymatique avec amplification du signal par un polymère
(D’après www.leicabiosystems.com)
2.1.3 Lecture et interprétation des résultats :
- L’interprétation est faite à l’aide d’un microscope optique ZEISS et la formule est évaluée à
l’objectif x40 sur 200 à 400 éléments. On différencie sur un compteur électronique,
macrophages, lymphocytes, polynucléaires neutrophiles et polynucléaires éosinophiles. La
formule est exprimée en pourcentage (tableau 8) (Annexe1).
Formule Pourcentage
Macrophages 90 à 95%
Lymphocytes <20%
Polynucléaires neutrophiles <5%
Polynucléaires éosinophiles <1%
Tableau 8 : Formule du LBA
Une description cytologique précise est faite en précisant le pourcentage des cellules
bronchiques (>5%, le LBA est contaminé), la présence d’hématies, d’inclusions lipidiques, de
cellules spumeuses, de corps ferrugineux ou pseudo-ferrugineux, la charge en fer des

47. PATIENTS ET METHODES
35
macrophages (taux de sidérophages et score de GOLDE) et la présence ou non de cellules
tumorales.
- Le rapport CD4/CD8 est calculé et interprété selon les valeurs suivantes :
 Rapport CD4/CD8<1 : Rapport bas.
 Rapport 1 < CD4/CD8 < 1.6 : Rapport sub-normal.
 Rapport CD4/CD8> 1.6 : Rapport élevé
2.2 Protocole de marquage par cytométrie en flux :
2.2.1 Marquage des échantillons :
Afin d’avoir centrifugé 100 µl du liquide de LBA à 1200 tours/min pendant 10 minutes, on
ajoute au culot 100 à 200 µl du PBS (Phosphate Buffered Saline). Le liquide est ensuite
transféré dans deux tubes à fond rond de 5 ml, un pour le contrôle et un tube 2 pour le
marquage par les anticorps. Par la suite, le liquide est incubé avec les anticorps monoclonaux
couplés à des fluorochromes : CD8-FITC, CD4-PE et CD3-PerCP-Cy5.5, pendant 20minutes
à+4°C et à l’abri de la lumière. (Tous les anticorps sont de BD biosciences) (Tableau 10).
Tous les fluorochromes utilisés pour cette étude ainsi que leurs longueurs d’ondes
d’excitation et d’émission sont représentés dans la figure ci dissous (figure 19) (Annexe 4).
Anticorps-
fluorochromes
Marqueurs Laser
Longueur
d’onde
d’excitation
Longueur
d’onde
d’émission
CD8-FITC LT cytotoxiques Bleu 488 490 543
CD4-PE LT helper Bleu 888 565 578
CD3-PerCP-Cy5.5 LT Bleu 888 488 695
Tableau 10 : Les anticorps utilisés pour l’acquisition des données par cytométrie en flux.

48. PATIENTS ET METHODES
36
Figure 19 : les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission des différents fluorochromes utilisés dans
le marquage par cytométrie en flux (D’après www.bdbioscinces.com)
Les cellules marquées sont ensuite lavées avec 2 ml de PBS et centrifugées pendant 10
minutes à 1200 tours/min puis elles sont fixées en ajoutant 300 µl de fixateur 1x (3g de
paraformaldéhyde dans 100 ml de PBS 1x, dilué).
2.2.2 Acquisition des données et analyse des échantillons :
Les échantillons sont collectés sur un cytométre BD FACSCanto™ II (BD Biosciences).En
premier, l’acquisition par l’instrument de tube échantillon appelé « contrôle » (‘tube 1’) suivi
de tube marqué par chaque anticorps utilisé pour l’expérience. Les populations
lymphocytaires à étudier sont identifiées par le cytogramme FSC et SSC selon leur taille et
leur granularité relatives. Le logiciel d’analyse des données est utilisé afin de visualiser les
sous populations lymphocytaire identifiées.
Les chevauchements des spectres d’émission de certains fluorochromes utilisés induisent un
signal non spécifique sur les autres détecteurs. Ces artefacts sont corrigés par traitement
mathématique (compensations de fluorescence).
Les résultats sont représentés sous forme d’un cytogramme présentant simultanément deux
signaux.

49. PATIENTS ET METHODES
37
3 Etude statistique :
Le coefficient de concordance kappa a été calculé afin d’évaluer la concordance des
différentes techniques et interprété selon le tableau suivant.
Accord Kappa
Très bon >0.81
Bon 0.61-0.80
Moyen 0.41-0.60
Médiocre 0.21-0.40
Mauvais 0.0-0.20
Exécrable <0
Tableau 11 : Grille d’interprétation du Kappa

50. RESULTATS
38
1. Epidémiologie :
Notre étude a été réalisée du 4/03/2014 au 02/06/2014. Au cours de cette période, 97 LBA ont
été acheminés au laboratoire. Trente-deux LBA (soit 33%) présentaient un profil
lymphocytaire et ont fait l’objet de notre étude.
2. Répartition selon le sexe :
Notre série était constituée de 10 hommes (soit 31%) et 22 femmes (soit 69%). Le sex-ratio
(H/F) est estimé à 0.44 (Figure 20).
Figure 20 : La répartition selon le sexe
3. Répartition selon l’âge :
L’âge moyen dans notre étude était de 46.5 ans avec des extrêmes allant de 6 ans à 68 ans. La
médiane d’âge était de 52 ans.
Quatre patients étaient âgés de moins de 30 ans (16%), 11 avaient moins de 60 ans (34%) et 9
patients avaient moins de 70 ans (28%) (Figure 21).
Figure 21 : La répartition selon l’âge
0 2 4 6 8 10
0--9
10--19
30--39
40--49
50--59
60--69
Répartition selon l'âge
Nombre des patients
69%
31%
Répartition selon le sexe
Femme Homme

51. RESULTATS
39
4. Répartition selon l’âge et le sexe :
L’âge moyen des femmes était de 45 ans avec des extrêmes allant de 7 à 68. Pour les
hommes, il était de 51 ans avec des extrêmes allant de 6 à 68 ans.
5. Le tabagisme :
La notion de tabagisme a été mentionnée dans 2 cas de sexe masculin (soit 8%) (Figure 22).
Figure 22 : Le tabagisme
6. Expositions professionnelles :
Une exposition professionnelle a été rapportée dans 4 cas. Il s’agissait d’une exposition aux
volailles chez une femme, à la silice chez un homme, à la poussière de laine chez une femme
et au ciment chez un homme.
7. Les antécédents :
7.1. Les antécédents respiratoires :
Des antécédents respiratoires étaient notés chez 8 malades. Il s’agissait de:
 Un asthme (2 cas).
 Une miliaire fébrile (1 cas).
 Une sclérodermie avec localisation pulmonaire (1 cas).
 Une pneumopathie d’hypersensibilité traitée (1 cas).
 Une sarcoïdose traitée (3 cas).
0
50
100
Tabagiques Non tabagiques
Tabagisme
8%
92%

52. RESULTATS
40
Figure 23 : Les antécédents respiratoires des patients
7.2. Les antécédents extra-respiratoires :
Quatre patients ont présenté des antécédents extra respiratoires. Il s’agissait d’ :
 Une sinusite (1 cas).
 Une xérophtalmie avec polyarthralgie (1 cas).
 Une hypertension artérielle associée à un diabète (1 cas).
 Une coronoropathie (1 cas).
8. Les signes cliniques :
La toux représentait le symptôme le plus fréquent dans notre série et a été rapportée dans 66%
des cas. Quarante pourcent des patients ont présenté une dyspnée d’effort. La toux et la
dyspnée d’effort étaient associées dans 4 cas. Les autres signes étaient représentés par les
expectorations (2 cas), les douleurs thoraciques (1 cas) et la fièvre (2 cas) (Tableau 12).
Signes cliniques Nombre des cas Pourcentage (%)
Toux 10 66
Dyspnée d’effort 6 40
Douleurs thoraciques 1 6
Expectorations 2 13
Fièvre 2 13
Tableau 12 : Les signes cliniques des patients
75%
7%
3%
3%
3%
9%
Les antécédents respiratoires
Pas d'antécédents
respiratoires
Asthme
Miliaire fébrile
Sclérodermie
(pulmonaire)
PHS
sarcoidose

53. RESULTATS
41
9. Les aspects radiologiques :
La radiographie du thorax a été faite dans 18% des cas. Les anomalies observées étaient :
 Des opacités médiastinales bilatérales (1cas).
 Une condensation (1 cas).
 Un syndrome interstitiel (2 cas).
 Des infiltrations nodulaires et micronodulaires du champ pulmonaire gauche (1 cas).
La tomodensitométrie thoracique en coupes fines a été réalisée dans 43% des cas et a montré :
 Des adénopathies médiastinales (7 cas), parfois associées à des pseudonodules
bilatéraux (1cas) et des nodules ou des micronodules (5 cas).
 Une condensation alvéolaire entourée par des plages d’hyperdensité en verre dépoli
réalisant un signe de Halo (1 cas).
 Un épaississement des septa (1 cas).
 Un aspect de PHS persistante avec probable majoration d’une bronchiolite constructive
(1 cas).
10.Diagnostics radios-cliniques suspectés :
Les données radio-cliniques avaient permis de suspecter les diagnostics de :
 Sarcoïdose (9 cas).
 PID sans préciser l’étiologie (3 cas).
 PHS (2 cas).
 Pneumoconiose (2 cas).
 BOOP (1 cas) (Tableau 13).
Diagnostic suspecté Nombre des cas Pourcentages (%)
Sarcoïdose 9 53
PID 3 17
PHS 2 12
Pneumoconiose 2 12
BOOP 1 6
Tableau 13 : Diagnostic radio-clinique suspecté des patients
Les caractéristiques cliniques de nos patients sont récapitulées dans le tableau 14.

54. RESULTATS
42
Tableau 14 : Caractéristiques cliniques de nos patients, * : non mentionné
LBA
N°
Age
Sexe
Exposition
professionnelle
Antécédents
Signes
cliniques
Radiographie
standard
TDM-HR Fibroscopie
Diagnostic
radio-clinique
suspecté
1 * /F * *
Toux sèche
Dyspnée
d’effort
Opacités
médiastinales
bilatérales
* * Sarcoïdose
2 19/F * * * * * * *
3 54/F * Sans ATCDs * * ADP médiastinales Normale Sarcoïdose
4 68/F * * * * * Normale PID
5 */H * *
Toux
chronique
Dyspnée
*
Pseudonodules
pulmonaires bilatéraux
avec ADP
médiastinales
évoquant une
sarcoïdose.
* Sarcoïdose
6 41/F Exposition aux volailles RAS * * * Normale PHS
7 */F * *
Toux sèche
chronique
* *
Muqueuse
légèrement
inflammatoire
*
8 36/F * * Dyspnée *
Condensations
parenchymateuses
* Sarcoïdose
9 67/H * Sinusite coronarien * * * Normale PID
10 */H *
Sclérodermie avec
localisation
pulmonaire
* * * * PID
11 61/F * PID Hypoxémie * * * PID

55. RESULTATS
43
LBA
N°
Age
Sexe
Exposition
professionnelle
Antécédents
Signes
cliniques
Radiographie
standard
TDM-HR Fibroscopie
Diagnostic
radio-clinique
suspecté
12 53/F *
Xérophtalmie sous
larmes artificielles
Polyarthralgie non
étiquetées
Toux sèche
Dyspnée
PID
Epaississement des
septa
* *
13 61/F *
HTA
Diabète
Tous sèche
Dyspnée
Syndrome
interstitiel
Aspect des PID
ADP médiastinales
* *
14 7/F * * * * - * *
15 30/F * * Toux sèche * ADP médiastinales Normale *
16 52/H Silice * * *
PID avec des nodules
et des masses
pulmonaires
*
Pneumoconiose
Maladie de système
17 36/F *
Asthme persistant
légère
* *
Micronodules diffuses
au niveau du CP
Aspect
inflammatoire
de la muqueuse
bronchique
*
18 */H * * * *
ADP médiastinales
bilatérales
Aspect de fibrose
associé
LBA+ Biopsie
étagée
Sarcoïdose
19 */H * * * * * Normale Sarcoïdose
20 17/F *
Pneumopathie
hypoximiante
bilatérales
Hypoxémie *
Condensation
alvéolaire entourée par
des plages
d’hypodensité en verre
dépoli réalisant un
signe de Halo
* *

56. RESULTATS
44
LBA
N°
Age
Sexe
Exposition
professionnelle
Antécédents
Signes
cliniques
Radiographie
standard
TDM-HR Fibroscopie
Diagnostic
radio-clinique
suspecté
21 6/H * Asthme * * * * *
22 59/F * * * *
Nodules du foie
PID+ ADP
médiastinales
* Sarcoïdose
23 61/F * Sarcoïdose Dyspnée *
Nodules sous pleuraux
de LM et LID
Aspect hétérogène
micronodulaire du foie
et de la rate
* Sarcoïdose
24 */F * Miliaire fébrile
Toux sèche
Fièvre
* * * *
25 42/F *
Pneumopathies
bilatérales
Toux
Expectoration
* *
Aspect
inflammatoire
prédominant à
droite
*
26 61/H
Ancien ouvrier dans une
usine de Ciment
RAS
Douleurs
thoraciques
gauche
Syndrome
interstitiel
Quelques nodules
calcifiés
*
Aspect
inflammatoire
Pneumoconiose
27 61/F * PHS
Reprise de la
symptomatolo
gie
*
Aspect de PHS
persistante avec
probable majoration de
la bronchiolite
constructive
Aspect
inflammatoire
de la muqueuse
de LM/LID/LIG
PHS
28 40/F * * * * * * *

57. RESULTATS
45
LBA
N°
Age
Sexe
Exposition
professionnelle
Antécédents
Signes
cliniques
Radiographie
standard
TDM-HR Fibroscopie
Diagnostic
radio-clinique
suspecté
29 68/H * *
Toux sèche
Expectoration
blanchâtre
Infiltration
micronodulaire et
nodulaire du CP
gauche
* * *
30 66/F Poussière laine * *
Syndrome
interstitiel
* * BOOP
31 51/H * Sarcoïdose
Toux sèche
chronique
*
ADP médiastinales
Nodules
parenchymateuses
Normale
LBA au niveau
du LM
Sarcoïdose
32 */F * * * * * * *

58. RESULTATS
46
11.Résultats du lavage broncho-alvéolaire :
11.1. Aspect du liquide :
Le liquide de LBA était :
 Opalescent dans 23 cas (72 %).
 Clair dans 5 cas (16%).
 Rosé dans 4 cas (12%) (Figure 24).
Figure 24 : Aspect du liquide de LBA
11.2. Volume total récupéré :
Le volume total récupéré était dans la limite de la normale compris entre 27 et 163. Un seul cas
avait un volume inférieur à 30 ml.
11.3. Vitalité cellulaire :
La vitalité cellulaire a été évaluée à l’aide du bleu de Trypan chez les 32 patients avec une
moyenne de 58 % et des extrêmes allant de 2 à 90 % pour une normale de 86%.
11.4. Numération cellulaire :
La numération cellulaire était :
 Normale dans 6 cas (19%).
 Diminué dans 4 cas (12%).
 Elevée dans 22 cas (69%)
(Figure 25).
72%
16%
12%
Aspect du LBA
Opalesent Clair Rosé
12%
19%
69%
Cellularité
Hypocellulaie Normocellulaire Hypercellulaire
Figure 25 : Cellularité du LBA

59. RESULTATS
47
11.5. Formule cellulaire :
Une formule lymphocytaire était observée dans tous les cas avec une moyenne de 45% et des
extrêmes allant de 18 à 78% (Figure 26).
Figure 26 : Formule du LBA
11.6. Immunocytochimie sur étalements :
- Les résultats étaient interprétables dans 28 cas (87,5%) et non concluants dans 4 cas (12,5%).
- Une lymphocytose à CD4 était notée dans 20 cas (71,4%) et une lymphocytose à CD8 était
observée dans 8 cas (28,6%).
- La moyenne des lymphocytes T CD3 positifs était de 79% avec des extrêmes allant de 38 à
94 %, celle des lymphocytes T CD4 positifs était de 45% avec des extrêmes allant de 14 à 80%
et celle des lymphocytes T CD8 positifs était de 39% avec des extrêmes allant de 19 à 78%
(Figure 27).
Figure 27 : Immunocytochimie sur étalements
0
10
20
30
40
50
Macrophages Lymphocytes PNN PNE
45 % 45 %
8 %
2 %
Formule du LBA
0
20
40
60
80
LT CD3+ LT CD4+ LT CD8+
79 %
45 %
39 %
Immunocytochimie sur étalements

60. RESULTATS
48
- Le rapport CD4/CD8 était :
 Inférieur à 1 dans 8 cas (28%).
 Compris entre 1 et 1,6 dans 10 cas (36%).
 Supérieur à 1,6 dans 10 cas (36%) (Tableau 15).
Tableau 15 : Rapport CD4/CD8 évalué par Immunocytochimie sur étalements
11.7. Immunocytochimie sur cytoblocs :
- L’immunocytochimie sur cytoblocs a été réalisée chez 17 patients (53,1%). Les résultats
étaient interprétables dans 10 cas (58,8%) et non concluants dans 7 cas (41,2%).
- Une lymphocytose à CD4 a été notée dans 4 cas (40%) et une lymphocytose à CD8 était
observée dans 6 cas (60%).
- La moyenne des lymphocytes T CD3 positifs était de 53% avec des extrêmes allant de 7 à
81%, celle des lymphocytes T CD4 positifs était de 38% avec des extrêmes allant de 11 à 63%
et celle des lymphocytes T CD8 positifs était de 44% avec des extrêmes allant de 17 à 71%
(Figure28).
Figure 28 : Immunocytochimie sur cytoblocs
- Le rapport CD4/CD8 était :
 Inférieur à 1 dans 6 cas (60%).
 Compris entre 1 et 1,6 dans 2 cas (20%).
 Supérieur à 1,6 dans 2 cas (20%) (Tableau 16).
CD4/CD8 <1 1<CD4/CD8>1,6 CD4/CD8>1,6
28% 36% 36%
0
10
20
30
40
50
60
LT CD3+ LT CD4+ LT CD8+
53 %
38 %
44 %
Immunocytochimie sur cytoblocs

61. RESULTATS
49
CD4/CD8 <1 1<CD4/CD8<1.6 CD4/CD8>1,6
60% 20 20%
Tableau 16 : Rapport CD4/CD8 évalué par Immunocytochimie sur cytoblocs
11.8. Cytométrie en flux :
- Les résultats étaient interprétables dans 24 cas (75%) et non concluants dans 8 cas (25%).
- Une lymphocytose à CD4 a été détectée dans 17 cas (70,8%) et à CD8 dans 7 cas (29,2%).
- La moyenne des lymphocytes T CD3 positifs était de 60% avec des extrêmes allant de 0 à
91%, celle des lymphocytes T CD4 positifs était de 38% avec des extrêmes allant de 0 à 80%
et celle des lymphocytes T CD8 positifs était de 22% avec des extrêmes de 2.7% à 44% (Figure
29).
Figure 29 : Cytométrie en flux
- Le rapport CD4/CD8 était :
 Inférieur à 1 dans 7 cas (29%).
 Compris entre 1 et 1,6 dans 3 cas (12%).
 Supérieur à 1,6 dans 14 cas (59%) (Tableau 17).
CD4/CD8 <1,6 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8≥1,6
29% 12% 59%
Tableau 17 : Rapport CD4/CD8 évalué par Cytométrie en flux
0
10
20
30
40
50
60
LT CD3+ LT CD4+ LT CD8+
60 %
38 %
22 %
Cytométrie en flux

62. RESULTATS
50
11.9. Comparaison des résultats en immunocytochimie sur étalements et
en immunocytochimie sur cytoblocs :
- Les deux techniques ont été réalisées simultanément dans 17 cas avec des résultats
interprétables dans 8 cas (47%).
- Le rapport CD4/CD8 était :
 Inférieur à 1 dans les deux techniques dans 2 cas (25%%).
 Compris entre 1 et 1,6 dans les deux techniques dans un cas (12.5%)
 Supérieur à 1,6 dans les deux techniques dans un cas (12,5%).
 Discordant dans 4 cas (Tableau 18).
Immunocytochimie sur étalements
Total
CD4/CD8<1 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8>1,6
Immunocytochimie
sur cytoblocs
CD4/CD8<1 2 2 2 6
1<CD4/CD8<1,6 0 1 0 1
CD4/CD8>1,6 0 0 1 1
Total 2 3 3 8
Tableau 18 : Rapport CD4/CD8 évalué par les deux techniques : Immunocytochimie sur étalements et
Immunocytochimie sur cytoblocs
Selon ces résultats, 4 cas étaient concordants (50%) et 4 cas étaient discordants (50%).
Le coefficient de concordance kappa est estimé à 0.7 cadrant avec une bonne reproductibilité
entre les deux techniques.
11.10.Comparaison des résultats en immunocytochimie sur étalements et
en cytométrie en flux :
- Dans notre série d’étude, 23 cas avaient des résultats interprétables avec les deux techniques
(71,8%) et étaient donc comparables.
- Le rapport CD4/CD8 était :
 Inférieur à 1 dans les deux techniques dans 5 cas (21%).
 Compris entre 1 et 1,6 dans les deux techniques dans 7 cas (30%)
 Supérieur à 1,6 dans les deux techniques dans 2 cas (9%).
 Discordants dans 9 cas (40%) (Tableau 19).

63. RESULTATS
51
Immunocytochimie sur étalements
Total
CD4/CD8<1 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8>1,6
Cytométrie en
flux
CD4/CD8<1 5 1 0 6
1<CD4/CD8<1,6 0 2 1 3
CD4/CD8>1,6 2 5 7 14
Total 7 8 8 23
Tableau 19 : Rapport CD4/CD8 évalué par les deux techniques : Immunocytochimie sur étalements et
Cytométrie en flux
Selon ces résultats, 14 cas étaient concordants (61%) et 9 cas étaient discordants (39%).
Le coefficient de concordance kappa est estimé à 0.34 cadrant avec une reproductibilité
médiocre.
11.11.Comparaison des résultats en immunocytochimie sur cytoblocs et
en cytométrie en flux :
- Les deux techniques ont été réalisées dans 17 cas et 5 cas uniquement avaient des résultats
interprétables dans les deux techniques (29%).
- Le rapport CD4/CD8 était :
 Inférieur à 1 dans les deux techniques dans 2 cas (40%).
 Supérieur à 1,6 dans les deux techniques dans 1 cas (20%).
 Discordants dans 2 cas (Tableau 20).
Immunocytochimie sur cytoblocs
Total
CD4/CD8<1 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8>1,6
Cytométrie en
flux
CD4/CD8<1 2 0 0 2
1<CD4/CD8<1,6 1 0 0 1
CD4/CD8>1,6 1 0 1 2
Total 4 0 1 5
Tableau 20 : Rapport CD4/CD8 évalué par les deux techniques : Immunocytochimie sur cytoblocs et
Cytométrie en flux
Le coefficient de concordance kappa est estimé à 0.3 cadrant avec une reproductibilité
médiocre.
Les résultats du LBA de notre étude sont récapitulés dans le tableau 21.

64. RESULTATS
52
Tableau 21: les résultats du LBA : * non exécuté ;- : Non concluant
LBA N°
Formule Immunocytochimie sur étalements Immunocytochimie sur cytoblocs Cytométrie en flux
M
(%)
L
(%)
PNN
(%)
PNE
(%)
CD3
(%)
CD4
(%)
CD8
(%)
CD4/CD8
CD3
(%)
CD4
(%)
CD8
(%)
CD4/CD8
CD3
(%)
CD4
(%)
CD8
(%)
CD4/CD8
1 33 66 1 0 * 31 46 0,7 81,5 36,5 67,5 0,5 82,2 19 43,7 0,4
2 57 24 18 1 * 57 33 1,7 32 40,5 17 2,4 39,6 36,8 12,6 2,9
3 55 30 15 0 * 40,5 37 1,1 * 43,5 30,5 1,4 - - - -
4 65 23 8 4 * 31 39,5 0,8 77 32 71 0,5 - - - -
5 55 39 6 0 - - - - 52,5 35,5 31 1,1 - - - -
6 17 78 3 2 60,5 55,5 33,5 1,7 - - - - 83,7 57,2 32,9 1,7
7 30 56 14 1 90 56,5 33,5 1,7 - - - - 68,7 62,4 16,4 3,8
8 57 40 3 0 - - - - - - - - - - - -
9 72 18 7 3 - - - - - - - - 21 8,7 11,5 0,8
10 58 24 18 0 - - - - 38 63 29 2,2 - - - -
11 47 28 24 1 63 35,5 30,5 1,2 - - - - 34,2 20 15,3 1,3
12 62 36 2 0 51,5 54,5 36,5 1,5 61 43.5 45.5 0.79 36,3 14 22,8 0,6
13 48 49 3 0 91 68,5 33,5 2,0 64 47 51 0.92 5,3 47,7 30,5 1,6
14 25 40 32 3 80,5 21 59 0,4 * * * * 58,7 37,2 13,7 2,7

65. RESULTATS
53
LBA N°
Formule Immunocytochimie sur étalements Immunocytochimie sur cytoblocs Cytométrie en flux
M
(%)
L
(%)
PNN
(%)
PNE
(%)
CD3
(%)
CD4
(%)
CD8
(%)
CD4/CD8
CD3
(%)
CD4
(%)
CD8
(%)
CD4/CD8
CD3
(%)
CD4
(%)
CD8
(%)
CD4/CD8
15 60 38 2 0 90 44 36 1,2 * * * * 70,8 49,8 27,8 1,8
16 61 32 7 0 87 57 41,7 1,4 * * * * 81,7 61,2 21,8 2,8
17 74 23 3 0 84 47,5 40 1,2 * * * * 43 30,7 16 1,9
18 17 71 8 4 90 32 62 0,5 * * * * 79,2 36,3 41,6 0,9
19 64 33 2 1 74 46 34,5 1,3 * * * * 59,4 48,8 11 4,4
20 31 39 28 2 85 62 30 2,1 * * * * 75,6 70,6 2,7 26,1
21 41 49 1 9 38 14 33 0,4 * * * * 75,6 40,8 17,5 2,3
22 52 45 1 2 90 80 19 4,2 * * * * 89,9 80,3 11,4 7,0
23 68 24 8 0 77 46 32 1,4 64 27 41 0.65 - - - -
24 26 74 0 0 92 63,5 29 2,2 * * * * - - - -
25 18 76 0 6 44,5 20 52 0,4 - - - - 46,2 1,4 39,8 0,0
26 70 29 1 0 76 41 40 1,0 * * * * 23 12 9 1,3
27 13 67 15 5 94 69 34 2,0 * * * * - - - -
28 38 54 3 5 93 17 78 0,2 - - - - 64,2 13,6 43,6 0,3
29 58 33 8 1 71,5 34 30 1,1 * * * * 60,3 40,5 17,1 2,4
30 21 69 1 0 83 26 68 0,4 * * * * 82,5 36,2 39,4 0,9

66. RESULTATS
54
LBA N°
Formule Immunocytochimie sur étalements Immunocytochimie sur cytoblocs Cytométrie en flux
M
(%)
L
(%)
PNN
(%)
PNE
(%)
CD3
(%)
CD4
(%)
CD8
(%)
CD4/CD8
CD3
(%)
CD4
(%)
CD8
(%)
CD4/CD8
CD3
(%)
CD4
(%)
CD8
(%)
CD4/CD8
31 34 63 3 0 91,5 69 26,5 2,6 7 11 45 0.24 62,1 50,4 11,3 4,5
32 36 60 4 0 89,5 54,5 28,5 1,9 * * * * 91,5 70,9 19,4 3,7

67. FIGURES
55
Colorations utilisées sur étalements
Coloration Papanicolaou
Coloration MGG
Macrophages
Lymphocytes
Macrophages
Lymphocytes

68. FIGURES
56
Immunocytochimie sur étalements
Marquage membranaire des lymphocytes par l’anticorps anti CD3
Marquage membranaire des lymphocytes par l’anticorps anti CD4
Lymphocyte TCD3+
Lymphocyte TCD3-
Lymphocyte TCD4-
Lymphocyte TCD4+

69. FIGURES
57
Marquage membranaire des lymphocytes par l’anticorps anti CD8
Lymphocyte TCD8-
Lymphocyte TCD8+

70. FIGURES
58
Immunocytochimie sur cytoblocs
Marquage membranaire des lymphocytes par l’anticorps anti CD4
Marquage membranaire des lymphocytes par l’anticorps anti CD8
Lymphocyte TCD4-
Lymphocyte TCD4+
Lymphocyte TCD8-
Lymphocyte TCD8+

71. FIGURES
59
Cytométrie en flux
Analyse lymphocytaire par cytométrie ne flux
a) Distribution des lymphocytes selon leur taille et leur granularité relatives ; b) Sélection des sous
populations lymphocytaires CD4+ou CD8+ ; c) Sélection des sous populations lymphocytaires
CD3+CD8+ ; d) Sélection des sous populations lymphocytaires CD3+CD4+

72. FIGURES
60
Profils lymphocytaires observés
Deux populations lymphocytaires CD4+ observées en cytométrie en flux

73. FIGURES
61
Quelques phénotypes rares observés dans l’analyse lymphocytaire par
cytométrie en flux

74. DISCUSSION
62
DISCUSSION
Les PID posent de réels problèmes diagnostiques vu l’absence de consensus quant à leur
diagnostic et prise en charge. La nouvelle classification établie par l’ATS et l’ERS a mis
l’accent sur la nécessité d’une collaboration multi-disciplinaire impliquant les cliniciens, les
radiologues, les pathologistes et les biologistes (17). Les progrès dans le domaine de
l’imagerie ont révolutionné l’approche diagnostique des PID. Selon certaines équipes (16, 34,
35), les données scannographiques permettent d’établir un diagnostic dans 60 à 80% des cas.
Cependant, la place du LBA demeure importante selon les nouvelles recommandations de
l’ATS et l’ERS, surtout dans les cas où l’imagerie parait peu concluante (4). Selon ces
recommandations, 3 impératifs sont cités : Le site d’injection du liquide de LBA doit être
choisi selon les données scannographiques récentes au lieu de choisir un site traditionnel (lobe
moyen droit ou lingula) souvent peu informatif, le comptage cellulaire doit concerner toutes
les populations cellulaires (les macrophages, les lymphocytes, les PNN et les PNE) et
l’analyse des sous populations lymphocytaires dans le liquide du LBA ne peut être réalisée
que si une alvéolite lymphocytaire est objectivée.
Les alvéolites lymphocytaires sont définies par un afflux de lymphocytes dans les espaces
aériens. Elles sont observées dans des PID de cause connue mais représentant des entités bien
déterminées (pneumopathies infectieuses, PHS, pneumoconioses…), les PID de cause
inconnue (la sarcoïdose…) et les PID idiopathiques (UIP, PINS, PHS, DIP…).
L’identification d’un profil lymphocytaire dans le LBA peut donc orienter vers de
nombreuses étiologies. Par ailleurs, le rapport CD4/CD8 est important et permet d’orienter le
diagnostic vers une alvéolite à CD8 observée dans les pneumopathies infectieuses ou
d’hypersensibilité (33) ou une alvéolite à CD4 observée dans la sarcoïdose. Le phénotypage
lymphocytaire est donc une étape cruciale dans l’établissement du diagnostic. Deux
techniques peuvent être utilisées : l’immunocytochimie ou la cytométrie en flux. La
concordance entre ces deux techniques a fait l’objet de nombreuses publications avec des
résultats variables. Pour la réalisation de ces deux techniques, un matériel de très bonne
qualité avec une préservation cellulaire optimale sont indispensables. L’acheminement du
LBA doit être fait 1 heure au maximum après le prélèvement du liquide et l’analyse
cytologique doit être pratiquée le jour même. Pour la cytométrie en flux, la fixation des

75. DISCUSSION
63
cellules par le paraformaldéhyde doit être faite au maximum 24 heures après la réception des
écouvillons contenant le liquide et le marquage immuno-cytochimique doit être pratiqué le
jour suivant la réception du LBA (les lames doivent être séchées à l’air pendant au moins 3 à
4 heures avant le marquage).
L’immunocytochimie dans notre étude est une technique immuno-enzymatique utilisant un
procédé indirect peroxydase polymère avec une révélation par le chromogène DAB (couleur
brunâtre). Cette technique a l'avantage de nécessiter peu de matériel et permet le blocage des
peroxydases endogènes ainsi que l’étape de démasquage antigénique pour les coupes incluses
en paraffine afin de réduire le signal non spécifique et d’augmenter le nombre d’épitopes
antigéniques à la surface des cellules. La cytométrie qui requiert plus de matériel, permet une
simplification de l'immunophénotypage des lymphocytes alvéolaires tout en augmentant la
fiabilité des résultats. En effet, un fenêtrage sur la région lymphocytaire ainsi que l'étude des
populations lymphocytaires doublement marquées par le CD3 et le CD4 permettent d'éliminer
l'analyse des macrophages porteurs du récepteur CD4 et auto-fluorescents.
Les limites techniques de l’immunocytochimie sur étalements :
Dans notre série de 32 cas, les résultats étaient non interprétables dans 4 cas. Ce fait pourrait
être expliqué par des problèmes d’acheminement et de conservation du liquide de lavage qui
sont tributaires des services cliniques. D’autre part, l’étalement frais de liquide du LBA même
après un séchage minimum de 3-4 heures n’est pas suffisant pour la fixation des cellules ce
qui induit un marquage faible ou non concluant. Ce problème était à l’origine de 4 cas non
concluants dans notre étude.
Les limites techniques de l’immunocytochimie sur cytoblocs :
Cette technique a été possible dans 17 cas. Les autres cas n’ont pas pu être étudiés vu
l’absence du culot lors de l’inclusion en paraffine. Les résultats étaient non interprétables dans
7 cas. Ceci peut être lié à une fixation insuffisante des lames, un mauvais séchage ou à un
démasquage insuffisant secondaire à un tampon de pH inapproprié. Le temps de fixation
optimal doit être de moins de 6 heures (57) afin d’éviter la sur-fixation qui peut entrainer la
dénaturation de certains antigènes et donc la diminution ou l’absence de marquage. D’autre
part, le séchage des lames est une étape très importante pour l’adhésion des bandes de
paraffine et il faut un temps de séchage d’au moins 12 heures à 37° C. Par ailleurs,
L’anticorps anti-CD4 (de Leica Biosystems) est adapté à un tampon citrate de pH égal à 8,

76. DISCUSSION
64
alors que le tampon citrate utilisé dans notre travail est de pH égal à 6. Ceci pourrait donc être
à l’origine de l’absence de marquage (dans les 7 cas non interprétables).
Les limites techniques de la cytométrie en flux :
Les données de la cytométrie en flux étaient non interprétables dans 8 cas. Ces résultats non
interprétables peuvent être expliqués par l’hypo-cellularité des culots ou une faible viabilité.
En effet, la cytométrie en flux nécessite une suspension hyper-cellulaire pour avoir un nuage
des cellules représentatif et concluant. Selon Wenxin Ma et al, la cytométrie en flux ne peut
pas distinguer les lymphocytes des autres cellules par le ‘Light Scattering’ quand le liquide est
hypo-cellulaire. La cellularité nécessaire pour avoir une bonne acquisition est de l’ordre de
centaines des milliers au minimum. Parmi les 8 cas non interprétables, 4 cas étaient hypo-
cellulaires. D’autre part, la vitalité cellulaire est un élément crucial lors de
l’immunophénotypage en cytométrie en flux. Dans notre série, elle était inférieure à la
normale (environ 86%) dans 4 cas.
Reproductibilité du profil des alvéolites lymphocytaires en immunocytochimie et en
cytométrie en flux :
Selon nos résultats, une bonne reproductibilité a été objectivée entre l’immunocytochimie sur
étalements et sur cytoblocs dans l’analyse des sous-populations lymphocytaires CD3+, CD4+
et CD8+ (ƙ=0,7). Ces deux techniques sont pratiquées dans le même laboratoire avec les
mêmes conditions d’acheminements et de conservation. Ceci peut expliquer les résultats
observés. En revanche, la corrélation entre l’immunocytochimie (sur étalement et sur
cytoblocs) et la cytométrie en flux était médiocre (ƙ=0,3). Ces résultats sont comparables à
ceux rapportés par plusieurs auteurs. En effet, selon Thomas M, et al (58), le comptage
lymphocytaire par immunocytochimie est fait sur un nombre bien limité de cellules
(maximum de 400 éléments). Par ailleurs, la fiabilité des résultats dépend fortement de
l’expérience de l’observateur. Ainsi, un signal non spécifique détecté sur les PNN peut donner
lieu à une fausse interprétation. Selon Diederichsen AC et al, (59) et Pérez-Arellano JL et al,
(60), la cytométrie en flux est plus apte à détecter des épitopes faiblement présents dans les
cellules. L’immunocytochimie paraît donc avoir un grand intérêt dans la mise en évidence
d’antigènes fortement exprimés au niveau cellulaire. Thalheim L et al, (61), ont rapporté que
la cytométrie en flux était plus performante que l’immunocytochimie dans l’évaluation des
populations lymphocytaires dans le liquide du LBA. Pour Wenxin Ma et al (62), la cytométrie