UNIVERSITE DE TUNIS EL MANAR
FACULTE DES SCIENCES DE TUNIS
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
Master de Recherche en Biologie Fonctio...
« Soyons reconnaissants aux personnes qui nous donnent
du bonheur ; elles sont les charmants jardiniers
par qui nos âmes s...
Mes remerciements s’adressent ensuite à Monsieur CHOKRI Chebbi, technicien supérieur
principal en cytomorphologie au servi...
Je n’oublie pas aussi d’exprimer ma gratitude à tous mes amis en particulier Amal et Asma
pour leurs précieux conseils dan...
TABLE DES MATIERES
TABLE DES MATIERES
REMERCIEMENTS
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
INTRODUCTI...
TABLE DES MATIERES
3. Répartition selon l’âge………………………………………………………………..38
4. Répartition selon l’âge et le sexe …………………………...
Liste des abréviations
LISTE DES ABREVIATIONS
ABPA: Aspergillose Broncho-Pulmonaire
Allergique.
Ac : Anticorps.
AcM: Antic...
Liste des abréviations
MGG: May Grünwald Giemsa.
PaO2: Pression artérielle en Oxygène.
PAP : peroxydase-anti-peroxydase.
P...
Liste des tableaux
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Aspects radiologiques des PID
Tableau 2 : Valeurs habituelles du LBA (su...
Liste des figures
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Présentation schématique de l'interstitium pulmonaire
Figure 2 : Classifica...
Liste des figures
Figure 21 : La répartition selon l’âge
Figure 22 : Le tabagisme
Figure 23 : Les antécédents respiratoire...
INTRODUCTION
1
LES PNEUMOPATHIES INTERSTITIELLES
DIFFUSES
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) sont considérée...
INTRODUCTION
2
RAPPEL THEORIQUE
1. Définition:
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) représentent un groupe hét...
INTRODUCTION
3
d’environ 3 à 4 cm d’épaisseur comporte une ou deux rangées de lobules pulmonaires
secondaires. Il constitu...
INTRODUCTION
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3. Principales étiologies :
Les PID sont classées en PID de cause connue (pneumoconiose, lymphangite carcin...
INTRODUCTION
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Figure 2 : Classification des PID ; A : Classification de 2002 ; B : Classification de 2012 (D'après
ATS et...
INTRODUCTION
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4. Epidémiologie :
L’étude épidémiologique des PID repose sur plusieurs critères comme l’âge, le sexe, les
...
INTRODUCTION
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Figure 3 : Hypothèse du processus pathogénique de FPI (29,32)
 La pneumopathie d’hypersensibilité (PHS) :
...
INTRODUCTION
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Figure 4 : Hypothèse du processus pathogénique de PHS (33)
La formation du granulome inflammatoire est le r...
INTRODUCTION
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Figure 5 : La formation du granulome au cours de la PHS (33)
6. Démarche diagnostique :
La démarche diagnos...
INTRODUCTION
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Figure 6 : Démarche diagnostique devant une PID (4)
6.1. Manifestations Cliniques :
Les symptômes débutent...
INTRODUCTION
11
La TDM-HR en coupes fines est l’examen de référence pour confirmer le diagnostic d’une
PID. Elle permet l’...
INTRODUCTION
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Diagnostics
Radiographie
thoracique
TDM-HR
Topographie
des lésions
Fibrose
Pulmonaire
Idiopathique
(FPI)
R...
INTRODUCTION
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laboratoire d’anatomie pathologique. Grâce à la reproductibilité de ses résultats, le LBA s’est
imposé com...
INTRODUCTION
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pulmonaire, on s’appuie sur la documentation radiologique pour «laver» la zone d’intérêt
(37).
Le LBA est ...
INTRODUCTION
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Tableau 2 : Valeurs habituelles du LBA (Sujet adulte, sain, non-fumeur) (8,9)
Le LBA peut confirmer dans c...
INTRODUCTION
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Type cellulaire Anomalie Diagnostic suggéré
Macrophages >90% Histiocytose X
Lymphocytes
>25%
Sarcoïdose
PI...
INTRODUCTION
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6.3.4. Immunocytochimie :
L’immunocytochimie est une technique qui permet la détection in situ d’un antigè...
INTRODUCTION
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En outre, La peroxydase peut être présente de façon endogène dans certains tissus biologiques
et permet la...
INTRODUCTION
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 L’immunoperoxydase indirecte : Deux étapes et deux espèces animales : l’anticorps
primaire est détecté p...
INTRODUCTION
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 Système Biotine/Streptavidine :
Trois étapes et deux espèces animales : la caractéristique de ce système...
INTRODUCTION
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Figure 12 : Système d’amplification polymérique (D’après www.dako.com)
 Apport de l’immunocytochimie dans...
INTRODUCTION
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6.3.5. Cytométrie en flux :
a. Définition :
La cytométrie en flux est une technologie qui permet la mesure...
INTRODUCTION
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Figure 13 : Les composants d’un cytométre (D’après www.selectscience.net)
 la composante fluidique :
Les ...
INTRODUCTION
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 Le système optique :
Il est composé d’une ou plusieurs sources lumineuses, de détecteurs de type photodi...
INTRODUCTION
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Figure 15 : Principe de système optique (D’après www.abcam.com)
 Analyse des données :
Une fois les signa...
INTRODUCTION
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lymphocytes T gamma delta, muqueux, les cellules TNK, les lymphocytes régulateurs dont
l’action est ciblée...
OBJECTIF
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OBJECTIF
Le but de notre travail est de comparer le
profil en immunocytochimie et en
cytométrie en flux des al...
PATIENTS ET METHODES
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1. Patients :
Nous rapportons une étude comparative entre l’immunocytochimie et la cytométrie en f...
PATIENTS ET METHODES
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quadrillée (toutes les cellules sont comptées sauf les hématies, les cellules bronchiques, les
cel...
PATIENTS ET METHODES
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Tableau 6 : Volume mis selon la richesse cellulaire
La durée et la vitesse de Cytocentrifugation e...
PATIENTS ET METHODES
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Tableau 7 : Les principales coloration du LBA
c. Inclusion du culot dans la paraffine :
Le liquide...
PATIENTS ET METHODES
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a. Les étapes particulières aux coupes incluses en paraffine (Cytoblocs) :
Les coupes sur les cyto...
PATIENTS ET METHODES
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Tableau 9 : Anticorps utilisés pour le marquage immunocytochimique
Ensuite, un lavage dans 3 bains...
PATIENTS ET METHODES
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Figure 18 : Méthode immuno-enzymatique avec amplification du signal par un polymère
(D’après www.l...
PATIENTS ET METHODES
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macrophages (taux de sidérophages et score de GOLDE) et la présence ou non de cellules
tumorales.
...
PATIENTS ET METHODES
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Figure 19 : les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission des différents fluorochromes utilisés...
PATIENTS ET METHODES
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3 Etude statistique :
Le coefficient de concordance kappa a été calculé afin d’évaluer la concorda...
RESULTATS
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1. Epidémiologie :
Notre étude a été réalisée du 4/03/2014 au 02/06/2014. Au cours de cette période, 97 LBA o...
RESULTATS
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4. Répartition selon l’âge et le sexe :
L’âge moyen des femmes était de 45 ans avec des extrêmes allant de 7 ...
RESULTATS
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Figure 23 : Les antécédents respiratoires des patients
7.2. Les antécédents extra-respiratoires :
Quatre pati...
RESULTATS
41
9. Les aspects radiologiques :
La radiographie du thorax a été faite dans 18% des cas. Les anomalies observée...
RESULTATS
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Tableau 14 : Caractéristiques cliniques de nos patients, * : non mentionné
LBA
N°
Age
Sexe
Exposition
profess...
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LBA
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Age
Sexe
Exposition
professionnelle
Antécédents
Signes
cliniques
Radiographie
standard
TDM-HR Fibrosco...
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Signes
cliniques
Radiographie
standard
TDM-HR Fibrosco...
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Sexe
Exposition
professionnelle
Antécédents
Signes
cliniques
Radiographie
standard
TDM-HR Fibrosco...
RESULTATS
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11.Résultats du lavage broncho-alvéolaire :
11.1. Aspect du liquide :
Le liquide de LBA était :
 Opalescent ...
RESULTATS
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11.5. Formule cellulaire :
Une formule lymphocytaire était observée dans tous les cas avec une moyenne de 45%...
RESULTATS
48
- Le rapport CD4/CD8 était :
 Inférieur à 1 dans 8 cas (28%).
 Compris entre 1 et 1,6 dans 10 cas (36%).
 ...
RESULTATS
49
CD4/CD8 <1 1<CD4/CD8<1.6 CD4/CD8>1,6
60% 20 20%
Tableau 16 : Rapport CD4/CD8 évalué par Immunocytochimie sur ...
RESULTATS
50
11.9. Comparaison des résultats en immunocytochimie sur étalements et
en immunocytochimie sur cytoblocs :
- L...
RESULTATS
51
Immunocytochimie sur étalements
Total
CD4/CD8<1 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8>1,6
Cytométrie en
flux
CD4/CD8<1 5 1 0 ...
RESULTATS
52
Tableau 21: les résultats du LBA : * non exécuté ;- : Non concluant
LBA N°
Formule Immunocytochimie sur étale...
RESULTATS
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LBA N°
Formule Immunocytochimie sur étalements Immunocytochimie sur cytoblocs Cytométrie en flux
M
(%)
L
(%)
...
RESULTATS
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LBA N°
Formule Immunocytochimie sur étalements Immunocytochimie sur cytoblocs Cytométrie en flux
M
(%)
L
(%)
...
FIGURES
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Colorations utilisées sur étalements
Coloration Papanicolaou
Coloration MGG
Macrophages
Lymphocytes
Macrophages...
FIGURES
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Immunocytochimie sur étalements
Marquage membranaire des lymphocytes par l’anticorps anti CD3
Marquage membrana...
FIGURES
57
Marquage membranaire des lymphocytes par l’anticorps anti CD8
Lymphocyte TCD8-
Lymphocyte TCD8+
FIGURES
58
Immunocytochimie sur cytoblocs
Marquage membranaire des lymphocytes par l’anticorps anti CD4
Marquage membranai...
FIGURES
59
Cytométrie en flux
Analyse lymphocytaire par cytométrie ne flux
a) Distribution des lymphocytes selon leur tail...
FIGURES
60
Profils lymphocytaires observés
Deux populations lymphocytaires CD4+ observées en cytométrie en flux
FIGURES
61
Quelques phénotypes rares observés dans l’analyse lymphocytaire par
cytométrie en flux
DISCUSSION
62
DISCUSSION
Les PID posent de réels problèmes diagnostiques vu l’absence de consensus quant à leur
diagnostic...
DISCUSSION
63
cellules par le paraformaldéhyde doit être faite au maximum 24 heures après la réception des
écouvillons con...
DISCUSSION
64
alors que le tampon citrate utilisé dans notre travail est de pH égal à 6. Ceci pourrait donc être
à l’origi...
Comparaison des Profils des Alvéolites Lymphocytaires en Immunocytochimie et en Cytométrie en Flux dans le Lavage Broncho-...
Comparaison des Profils des Alvéolites Lymphocytaires en Immunocytochimie et en Cytométrie en Flux dans le Lavage Broncho-...
Comparaison des Profils des Alvéolites Lymphocytaires en Immunocytochimie et en Cytométrie en Flux dans le Lavage Broncho-...
Comparaison des Profils des Alvéolites Lymphocytaires en Immunocytochimie et en Cytométrie en Flux dans le Lavage Broncho-...
Comparaison des Profils des Alvéolites Lymphocytaires en Immunocytochimie et en Cytométrie en Flux dans le Lavage Broncho-...
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Comparaison des Profils des Alvéolites Lymphocytaires en Immunocytochimie et en Cytométrie en Flux dans le Lavage Broncho- Alvéolaire

  1. 1. UNIVERSITE DE TUNIS EL MANAR FACULTE DES SCIENCES DE TUNIS DEPARTEMENT DE BIOLOGIE Master de Recherche en Biologie Fonctionnelle Parcours: Physiologie Appliquée et Physiopathologies Présenté et soutenu publiquement le /09/2014 Par Rihem KASMI Comparaison des Profils des Alvéolites Lymphocytaires en Immunocytochimie et en Cytométrie en Flux dans le Lavage Broncho- Alvéolaire Jury: Président: Pr. MARRAKCHI Raja Membres: Pr. MEZNI Faouzi Dr. MLIKA Mouna Dr. SAFRA Inès Encadreur: Dr. MLIKA Mouna Co -Encadreur: Dr. SAFRA Inès
  2. 2. « Soyons reconnaissants aux personnes qui nous donnent du bonheur ; elles sont les charmants jardiniers par qui nos âmes sont fleuries. » Le seul moyen de se délivrer d’une tentation, c’est d’y céder paraît-il ! Alors j’y cède en disant un grand Merci aux personnes qui ont cru en moi et qui m’ont permis d’arriver au bout de ce projet. Mes premiers remerciements vont tout d’abord à mon président de Jury, Madame le Professeur MARRAKCHI Raja. Je vous remercie de l´honneur que vous me faites en acceptant de juger ce travail. Veuillez trouver en ce mémoire un modeste témoignage de mon profond respect, de mon immense gratitude et de ma haute reconnaissance. Je remercie très sincèrement Monsieur le Professeur MEZNI Faouzi, Chef de service d´anatomie pathologique de l´hôpital Abderrahmen Mami de l´Ariana, pour m’avoir accueillie dans son laboratoire et permise de parfaire ma formation en m’initiant aux différentes expériences nécessaires pour ce travail. Je tiens à exprimer mes plus vifs remerciements au Docteur MLIKA Mouna, Assistante Hospitalo-Universitaire au service d´Anatomie pathologique de l’Hôpital Abderrahmen Mami de l’Ariana, qui fut pour moi un encadrant attentif et disponible. Sa compétence, sa rigueur scientifique et sa clairvoyance m’ont beaucoup appris. Ils ont été et resteront des moteurs de mon travail de recherche. J’espère avoir été digne de la confiance qu’elle m’avait accordée et que ce travail soit finalement à la hauteur de ses espérances. Quoi qu’il en soit, j’ai beaucoup appris à ses côtés et je suis très honorée de l’avoir eu pour encadrant. J’adresse de chaleureux remerciements à mon Co-encadrant de mémoire, Docteur SAFRA Inès, Professeur agrégée en hématologie à l’Institut Pasteur de Tunis, pour son attention de tout instant sur mes travaux en cytométrie en flux, pour ses conseils avisés et son écoute qui ont été prépondérants pour la bonne réussite de cette mémoire. J’ai pris un grand plaisir à travailler avec elle.
  3. 3. Mes remerciements s’adressent ensuite à Monsieur CHOKRI Chebbi, technicien supérieur principal en cytomorphologie au service d´Anatomie pathologique de l’Hôpital Abderrahmen Mami de l’Ariana, qui m’a dirigée tout au long de ce mémoire et précisément dans la partie expérimentale. Sans lui je n’aurais jamais appris les techniques d’analyse cytologique du lavage bronchoalvéolaire ainsi que les techniques immunocytochimiques. Il a toujours été disponible, à l’écoute de mes nombreuses questions et s’est toujours intéressé à l’avancée de mes travaux. Sa capacité d’analyse et son enthousiasme m’ont montré que le monde de la recherche pouvait être un univers passionnant. Enfin, ses nombreuses relectures et corrections de ce mémoire ont été très appréciables. Pour tout cela un grand merci. Je remercie Madame BARMAT Mbarka, technicienne supérieure en cytomorphologie à l’Institut Pasteur de Tunis, avec qui j’ai eu la chance de pouvoir m’initier à l’acquisition des données par cytométrie en flux. Sa rigueur, sa capacité d’analyse des problèmes et ses très nombreuses connaissances m’ont permis de progresser et ont répondu à plusieurs de mes préoccupations. J’exprime toute ma gratitude à l’ensemble des membres de mon jury : Professeur MARRAKCHI Raja, Professeur MEZNI Faouzi, Docteur SAFRA Inès, Docteur MLIKA Mouna, d’avoir accepté d’assister à la présentation de ce travail. Je tiens à présenter mes remerciements les plus chaleureux à toute l’équipe du service d’anatomie pathologique, pour le climat sympathique dans lequel ils m’ont permis de travailler. Je souhaiterais aussi adresser ma gratitude à tous mes enseignants en Master, qui par la richesse de leurs enseignements, leurs encouragements, leurs conseils et leurs grandes qualités humaines m’ont toujours guidé le long de mon Cursus Universitaire. De plus, mes remerciements seraient incomplets, si je ne fais pas mention de ma plus chère et merveilleuse sœur Hadhemi et sa petite ange Rekaya. Même si votre présence près de moi me manque énormément, sachez que vos coups de fil et vos messages m’ont beaucoup aidée à affronter ce manque et à continuer ce travail.
  4. 4. Je n’oublie pas aussi d’exprimer ma gratitude à tous mes amis en particulier Amal et Asma pour leurs précieux conseils dans la réalisation de ce travail, en témoignage de l’amitié sincère qui nous lie. Enfin, les mots les plus simples étant les plus forts, j’adresse toute mon affection à ma famille, et en particulier à mes parents, avec cette question récurrente, « quand est-ce que tu le soutiens ce mémoire ? ». Bien qu’angoissante en période fréquente de doutes, cette question m’a permis de ne jamais dévier de mon objectif final. Leur confiance, leur tendresse, leur amour me portent et me guident tous les jours. Merci pour avoir fait de moi ce que je suis aujourd’hui. Est-ce un bon endroit pour dire ce genre de choses ? Je n’en connais en tous cas pas de mauvais. Je vous aime. Ces remerciements ne peuvent s'achever, sans une pensée très spéciale pour mes plus chers cousins Baya, Othman et Yassine, surtout pour toutes les soirées « cinéma » durant lesquelles je n’ai pu ni travailler ni dormir.
  5. 5. TABLE DES MATIERES TABLE DES MATIERES REMERCIEMENTS LISTE DES ABREVIATIONS LISTE DES TABLEAUX LISTE DES FIGURES INTRODUCTION…………………………………………………………………………….1 Rappel théorique…………………………………………………………………………….2 1. Définition ……………………………………………………………………………2 2. Rappel anatomique…………………………………………………………………..2 3. Principales étiologies………………………………………………………………...4 4. Epidémiologie………………………………………………………………………..6 5. Physiopathologie……………………………………………………………………..6 6. Démarche diagnostique……………………………………………………………...9 6.1. Manifestations cliniques…………………………………………………….10 6.2. Aspects radiologiques……………………………………………………….10 6.3. Apport du lavage broncho-alvéolaire………………………………………..12 OBJECTIF…………………………………………………………………………………...27 PATIENTS ET METHODES………………………………………………………………28 1. Patients…………………………………………………………………………..….28 2. Méthodes……………………………………………………………………………28 2.1. Protocole d’analyse cytologique du lavage broncho-alvéolaire…………….28 2.2. Protocole de marquage par cytométrie en flux……………………………...35 3. Etude statistique…………………………………………………………………….37 RESULTATS………………………………………………………………………………...38 1. Epidémiologie………………………………………………………………………38 2. Répartition selon le sexe…………………………………………………………....38
  6. 6. TABLE DES MATIERES 3. Répartition selon l’âge………………………………………………………………..38 4. Répartition selon l’âge et le sexe …………………………………………………….39 5. Le tabagisme……………………………………………………………………….....39 6. Expositions professionnelles………………………………………………………….39 7. Les antécédents…………………………………………………………………….....39 8. Les signes cliniques…………………………………………………………………..40 9. Aspects radiologiques………………………………………………………………...41 10. Diagnostic radio-clinique suspecté………………………………………………...…41 11. Résultats du lavage broncho-alvéolaire………………………..……………………..46 11.1. Aspect du lavage broncho-alvéolaire…………………………...…………...46 11.2. Volume total récupéré…………………………………………………….…46 11.3. Vitalité cellulaire…………………………………………………………….46 11.4. Numération cellulaire………………………………………………………..46 11.5. Formule cellulaire…………………………………………………………...47 11.6. Immunocytochimie sur étalements………………………………………….47 11.7. Immunocytochimie sur cytoblocs…………………………………………...48 11.8. Cytométrie en flux…………………………………………………………..49 11.9. Comparaison des résultats en immunocytochimie sur étalements et en immunocytochimie sur cytoblocs…………………………………………...50 11.10. Comparaison des résultats en immunocytochimie sur étalements et en cytométrie en flux………………………………………………………...…50 11.11. Comparaison des résultats en immunocytochimie sur cytoblocs et en cytométrie en flux………………………………………………………...…51 FIGURES…………………………………………………………………………………….51 DISCUSSION………………………………………………………………………………..62 CONCLUSION………………………………………………………………………………67 ANNEXE REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES RESUME / ABSTRACT
  7. 7. Liste des abréviations LISTE DES ABREVIATIONS ABPA: Aspergillose Broncho-Pulmonaire Allergique. Ac : Anticorps. AcM: Anticorps Monoclonaux. ADP: Adénopathies. AEC : 3-Amino-9-Ethyl-Carbazole AFA: Alcool-Formol-Acide acétique. Ag: Antigène. AIP: Pneumopathie Interstitielle Aigüe ALI: Acute Lung Injury. ATCDs: Antécédents. ATS: American Thoracic Society. BOOP: Bronchiolitis Obliterans Organizing Pneumonia. CD3: Classe de Différenciation 3. CD4: Classe de Différenciation 4. CD8: Classe de Différenciation 8. CMV : Cytomégalovirus. COP: Pneumopathie Organisée Cryptogénique. DAB: 3,3-Diaminobenzidine. DIP: Pneumopathie Interstitielle Desquamative. EFR: Examens Fonctionnels Respiratoires. ERS: European Respiratory Society. FITC: Fluorecéine Isothiocyanate. FSC: Forward Scatter. H2O2: Peroxyde d’hydrogéne. HRP: Horse radish peroxydase HTA: Hypertension Artérielle. IFNγ: Interféron gamma IL-2: Interleukine 2 IL-15: interleukine 15 kPa: kilo pascal. L: Lymphocytes LAM: Lymphangioléiomyomatose LBA: lavage Broncho-Alvéolaire LID: Lobe Inférieur Droit. LIG: Lobe Inférieur Gauche. LIP: Pneumopathie Lymphoïde Interstitielle. LM: Lobe Moyen LT: Lymphocyte T M: Macrophages.
  8. 8. Liste des abréviations MGG: May Grünwald Giemsa. PaO2: Pression artérielle en Oxygène. PAP : peroxydase-anti-peroxydase. PBS: Phosphate Buffered Saline. PCIE: Pneumopathie Chronique Idiopathique à Eosinophiles. PE: Phycoérythrine. PerCP-Cy5.5: Peridinin Chlorophyll- protein Complex Conjugate with a cyanine dye. PHS: Pneumopathie d’Hypersensibilité. PID: Pneumopathies Interstitielles Diffuses PINS: Pneumopathies Interstitielles Non Spécifiques PM: Pneumopathie Médicamenteuse. PMT: Photomultiplicateurs. PNE: Polynucléaires Eosinophiles. PNN: Polynucléaires Neutrophiles. PR: Polyarthrite Rhumatoïde. RAS: Rien à Signaler. RB-ILD: Bronchiolite Respiratoire avec Pneumopathie Interstitielle SDRA: Syndrome de Détresse Respiratoire Aiguë. SSC: Side Scatter. TBS: Tris Buffered Saline. TDM-HR: Tomodensitomértrie Haute resolution. TNFα: Tumor Necrosis Factor α. TNK: Lymphocyte Natural Killer. UIP: Usual Interstitial Pneumonia. VEMS: Volume Expiratoire Maximal par Seconde.
  9. 9. Liste des tableaux LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Aspects radiologiques des PID Tableau 2 : Valeurs habituelles du LBA (sujet adulte, sain, non-fumeur) Tableau 3 : Score de GOLDE Tableau 4 : Les principaux diagnostics suggérés selon le profil cellulaire observé au LBA Tableau 5 : Caractéristiques des deux chromogènes de la peroxydase Tableau 6 : Volume mis selon la richesse cellulaire Tableau 7 : Les principales colorations du LBA Tableau 8 : La formule du LBA Tableau 9 : Les anticorps utilisés pour le marquage immunocytochimique Tableau 10 : Les anticorps utilisés pour l’acquisition par cytométrie en flux Tableau 11 : Grille d’interprétation du Kappa Tableau 52 : Les signes cliniques des patients Tableau 13 : Diagnostic radio-clinique suspecté des patients Tableau 14 : Caractéristiques cliniques des patients Tableau 15 : Rapport CD4/CD8 évalué par Immunocytochimie sur étalements Tableau 16 : Rapport CD4/CD8 évalué par Immunocytochimie sur cytoblocs Tableau 17 : Rapport CD4/CD8 évalué par Cytométrie en flux Tableau 18 : Rapport CD4/CD8 évalué par les deux techniques : Immunocytochimie sur étalements et Immunocytochimie sur cytoblocs Tableau 19 : Rapport CD4/CD8 évalué par les deux techniques : Immunocytochimie sur étalements et Cytométrie en flux Tableau 20 : Rapport CD4/CD8 évalué par les deux techniques : Immunocytochimie sur étalements et Cytométrie en flux Tableau 21 : Les résultats du LBA
  10. 10. Liste des figures LISTE DES FIGURES Figure 1 : Présentation schématique de l'interstitium pulmonaire Figure 2 : Classification des PID : A : Classification de 2002 ; B : Classification de 2012 Figure 3 : Hypothèse du processus pathogénique de la FPI Figure 4 : Hypothèse de processus pathogénique de la PHS Figure 5 : Formation du granulome au cours de la PHS Figure 6 : Démarche diagnostique devant une PID Figure 7 : Les différents types d’anticorps Figure 8 : Mode d’action de la peroxydase Figure 9 : Les différentes méthodes de marquage immunocytochimique Figure 10 : Le système PAP Figure 11 : Le système Biotine/Streptavidine Figure 12 : Le système d’amplification polymérique Figure 13 : Les composants d'un cytométre Figure 14 : Le principe de centrage hydrodynamique Figure 15 : Le principe du systéme optique Figure 16 : Les méthodes d'immunofluorescence Figure 17 : Cellule de Malassez vue au microscope à faible grossissement Figure 18 : Méthode immuno-enzymatique avec amplification du signal par un polymère Figure 19 : Les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission des différents fluorochromes utilisés dans le marquage par cytométrie en flux Figure 20 : La répartition selon le sexe
  11. 11. Liste des figures Figure 21 : La répartition selon l’âge Figure 22 : Le tabagisme Figure 23 : Les antécédents respiratoires des patients Figure 24 : Aspect du LBA Figure 25 : Cellularité du LBA Figure 26 : Formule du LBA Figure 27 : Immunocytochimie sur étalements Figure 28 : Immunocytochimie sur cytoblocs Figure 29 : Cytométrie en flux Figure 30 : Quelques phénotypes rares observés dans l’analyse lymphocytaire par cytométrie en flux
  12. 12. INTRODUCTION 1 LES PNEUMOPATHIES INTERSTITIELLES DIFFUSES Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) sont considérées comme un groupe d’affections multiples, généralement chroniques et diverses par leurs aspects cliniques, radiologiques et microscopiques ; ce qui rend leur approche diagnostique souvent difficile. Les modalités de cette approche ne peuvent être codifiées et comportent un facteur personnel fondé sur l’expérience acquise de cette pathologie. Les données de la littérature (1) témoignent la diversité de la démarche diagnostique des PID avec néanmoins un consensus sur l’importance de l’anamnèse et de l’examen clinique. Une concertation multidisciplinaire entre pneumologues, radiologues et pathologistes est à la base de la démarche diagnostique face à une PID (2,3). Grâce à l’amélioration des techniques d’endoscopie bronchique, le lavage broncho-alvéolaire (LBA) permet d’orienter le diagnostic des PID. Il s’agit d’un acte non invasif, facile, rapide et peu onéreux d’exploration du poumon profond. Il fournit une image représentative des modifications inflammatoires et immunitaires observées au niveau des alvéoles en distinguant le type cellulaire prédominant dans le poumon profond. Il permet aussi de distinguer les alvéolites macrophagiques, à polynucléaires neutrophiles, à polynucléaires éosinophiles ainsi que les alvéolites lymphocytaires (4,9). Ces dernières font l’objet de notre travail de recherche. Les données de la littérature (10) témoignent de la nécessité du phénotypage dans toute alvéolite lymphocytaire afin d’orienter le diagnostic vers une pathologie impliquant l’immunité humorale ou cellulaire. Un marquage immunocytochimique ou par cytométrie en flux est donc nécessaire pour évaluer les sous-populations lymphocytaires dans le but d’éliminer ou d’ajouter des éléments d’enquête orientant vers un groupe restreint d’affections.
  13. 13. INTRODUCTION 2 RAPPEL THEORIQUE 1. Définition: Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) représentent un groupe hétérogène de pathologies pulmonaires diffuses dont la caractéristique histologique est l’atteinte de l’interstitium pulmonaire, c’est à dire des espaces entre les cellules alvéolaires et des membranes basales endothéliales, par de l’inflammation et de la fibrose en proportions variables ; néanmoins, d’autres structures histologiques peuvent être affectées comme les lumières alvéolaires, les bronchioles ou encore les vaisseaux (11). Malgré des différences notables concernant leur étiologie et leur évolution, les PID partagent certains aspects cliniques, radiologiques, fonctionnels et histopathologiques. Les PID sont ainsi subdivisées en PID de cause connue, les PID de cause inconnue mais bien individualisables et les PID de cause inconnue ou idiopathiques (11). 2. Rappel anatomique : D’une façon schématique, le poumon est constitué par une charpente conjonctive correspondant à l’interstitium pulmonaire et un ensemble de conduits aériens comprenant les différentes ramifications de l’arbre bronchique, les canaux alvéolaires et les alvéoles. A l’intérieur de cet ensemble, se ramifient les vaisseaux fonctionnels du poumon. Les vaisseaux lymphatiques principaux siègent en regard des pédicules broncho-vasculaires, des septa interlobulaires et dans les régions sous-pleurales (12). Weibel subdivise l’interstitium pulmonaire en trois secteurs (13):  Un secteur axial péribroncho-vasculaire.  Un secteur périphérique comprenant l’interstitium sous-pleural et les septa interlobulaires.  Un secteur intralobulaire en continuité avec les deux précédents. Le lobule pulmonaire secondaire constitue l’unité anatomique et physiologique de base du poumon. Il est de forme polyédrique et mesure environ 1 à 2,5 cm de long. La bronchiole aérant le lobule pulmonaire secondaire et l’artère homologue au centre du lobule, ont un diamètre d’environ 1 mm. Les septa conjonctifs interlobulaires au sein desquels cheminent les veines pulmonaires et les lymphatiques, constituent les bords. Le cortex du poumon,
  14. 14. INTRODUCTION 3 d’environ 3 à 4 cm d’épaisseur comporte une ou deux rangées de lobules pulmonaires secondaires. Il constitue la région périphérique du poumon. A ce niveau, les lobules sont relativement larges et ont une forme de cônes tronqués avec une base pleurale et un apex de direction centrale. Dans la zone centrale ou médullaire du poumon, les lobules pulmonaires secondaires sont plus petits et de forme polygonale ou hexagonale. Les trois secteurs interstitiels sont parfaitement représentés au niveau du lobule pulmonaire secondaire. Les septa interlobulaires appartiennent au secteur interstitiel périphérique de Weibel. Au centre du lobule pulmonaire secondaire, la branche artérielle pulmonaire et la bronchiole sont entourées par du tissu conjonctif appartenant au secteur axial de Weibel. Ce tissu conjonctif représente en fait la continuation de l’interstitium entourant les éléments broncho-vasculaires du hile et leurs branches de division plus distales jusqu’au centre du lobule pulmonaire secondaire et plus en aval. Le troisième secteur de Weibel siège au sein des septa alvéolaires. Il s’agit des fibres septales qui relient les systèmes axial et périphérique. Un squelette fibreux continu est ainsi constitué au sein du poumon (Figure 1) (14,15). Figure 1 : Présentation schématique de l’interstitium pulmonaire (D’après www.studyblue.com, 34)
  15. 15. INTRODUCTION 4 3. Principales étiologies : Les PID sont classées en PID de cause connue (pneumoconiose, lymphangite carcinomateuse, PHS, pneumopathies médicamenteuses, PID associées aux connectivites …), les PID de cause inconnue mais représentant des entités bien déterminées (sarcoïdose) et les PID idiopathiques. Ces-dernières font l’objet d’une classification multidisciplinaire par les Sociétés Américaine Thoracique et Européenne Respiratoire (ATS et ERS) qui ont publié en 2002 des définitions consensuelles des sous types de PID idiopathiques. Les PID idiopathiques regroupent par ordre de fréquence décroissante : La fibrose pulmonaire idiopathique (UIP), les pneumopathies interstitielles non spécifiques (NSIP), la pneumopathie organisé cryptogénique (COP), la pneumopathie interstitielle aigüe (AIP), la bronchiolite respiratoire avec pneumopathie interstitielle (RB-ILD), la pneumopathie interstitielle desquamative (DIP) et la pneumopathie interstitielle lymphoïde (LIP) (figure 2A) (16). Une révision de la classification de 2002 a été proposée par ATS et ERS en 2012. Les PID ont été ainsi divisées en PID de cause connue (connectivite, médicament, exposition…), les granulomatoses, les formes particulières et les PID idiopathiques. Ces-dernières ont également été subdivisées en pneumopathies interstitielles idiopathiques majeures, rares et inclassables. Parmi les pneumopathies rares, une nouvelle entité a été identifiée : la fibro- élastose pleuro-pulmonaire idiopathique (figure 2B) (17).
  16. 16. INTRODUCTION 5 Figure 2 : Classification des PID ; A : Classification de 2002 ; B : Classification de 2012 (D'après ATS et ERS ; 16, 17) Pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Collagénose(sclérodermie, PR..) Pneumoconiose (asbestose, silicose) PM Pneumopathies interstitielles idiopathiques UIP RB-ILD NSIP DIP COP LIP AIP Granulomatose Sarcoïdose Alvéolite allergique Histiocytose X ;LAM Pneumopathie à éosinophiles lipoprotéinose alvéolaire ALI(Acute Lung Injury) SDRA Pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Cause connue Connectivite, médicament, exposition ... Pneumopathies interstitielles idiopathiques Pneumopathies interstitielles idiopathiques majeures Chroniques fibrosantes: UIP, PINS Aiguës, subaiguës: POC, PIA Liées au tabac: DIP, RB-ILD Pneumopathies interstitielles idiopathiques rares Pneumopathie interstitielle lymphoïde idiopathique Fibroélastose pleuro-pulmonaire idiopathique Pneumopathies interstitielles idiopathiques inclassables Granulomatose Sarcoïdose Formes particulières HPCL, LAM, lipoprotéinose alvéolaire, PCIE… A B
  17. 17. INTRODUCTION 6 4. Epidémiologie : L’étude épidémiologique des PID repose sur plusieurs critères comme l’âge, le sexe, les expositions environnementales et le tabagisme. Peu d’études ont été publiées sur l’incidence, la prévalence et la mortalité des PID dans le monde en raison des problèmes de classification, de diversité des manifestations cliniques, des signes radiologiques et microscopiques rendant l`approche diagnostique laborieuse (18). Des registres ont été mis en place au Nouveau- Mexique, en Flandres, en Allemagne, en Italie, au Royaume-Uni, en Espagne et en Grèce (19-25). Selon Coultas (19), la prévalence globale des PID est estimée à 67-81/100 000 avec une incidence autour de 26-32/100 000 et l’âge moyen des patients est compris entre 51 et 69 ans. Une autre étude menée en France par Cottin (26), a rapporté une prévalence des PID de 30 cas/100 000 habitants avec 300 décès annuels. En France, il y a 12 à 15 000 nouveaux cas de PID/an. En Tunisie, nous disposons de peu de données épidémiologiques sur les PID. Une étude a été menée dans la plupart des services de pneumologie de la capitale de 2000 à 2005 et a répertorié 1707 cas de pneumopathies interstitielles diffuses représentant 7.2% des motifs d’hospitalisation. L’âge moyen des patients était de 50,9 ans avec un sex-ratio de 0,51. Selon cette étude, les cas asymptomatiques non diagnostiqués sont dix fois plus fréquents que les cas symptomatiques (27). 5. Physiopathologie : Les mécanismes physiopathologiques des PID demeurent méconnus. Plusieurs hypothèses pathogéniques ont été proposées par certains auteurs (28).  La fibrose pulmonaire idiopathique (UIP) : L’UIP demeure de cause inconnue. Elle résulterait de processus superposés de détérioration tissulaire, de phénomènes inflammatoires et de réparation. Une altération de la perméabilité de l’épithélium et des lames basales, alvéolaires et capillaires conduit à une infiltration inflammatoire interstitielle avec œdème et diffusion des cellules inflammatoires et mésenchymateuses. Les cellules inflammatoires sont recrutées à partir du sang circulant, libérant des cytokines qui agissent sur le recrutement et la prolifération des cellules mésenchymateuses (les fibroblastes) et leur synthèse de collagène. Cette exagération des mécanismes physiologiques de réparation tissulaire serait à l’origine de la fibrose pulmonaire idiopathique (Figure 3) (29-32).
  18. 18. INTRODUCTION 7 Figure 3 : Hypothèse du processus pathogénique de FPI (29,32)  La pneumopathie d’hypersensibilité (PHS) : Plusieurs antigènes sont impliqués dans le processus pathogénique (champignons, bactéries, protozoaires, insectes, produits chimiques de bas poids moléculaire…). La majorité des individus exposés à ces antigènes développent une tolérance immunitaire médiée par les cellules T régulatrices et l’antigène inhalé produit une augmentation du nombre des lymphocytes sans avoir de conséquences cliniques. La coexistence de facteurs génétiques et environnementaux provoque une réaction immunitaire exagérée ce qui induit un processus inflammatoire pulmonaire (Figure 4) (33). Trois formes de PHS sont distinguées:  Forme aiguë : Granulome interstitiel non caséeux avec cellules géantes.  Forme subaiguë : Granulome, bronchiolite avec ou sans pneumonie organisée, fibrose interstitielle.  Forme chronique : Inflammation interstitielle chronique, destructions alvéolaires, fibrose dense, emphysème.
  19. 19. INTRODUCTION 8 Figure 4 : Hypothèse du processus pathogénique de PHS (33) La formation du granulome inflammatoire est le résultat d’une réponse immunitaire Th1 secondaire à une stimulation antigénique avec production de nombreux médiateurs pro- inflammatoires qui interviennent dans le recrutement de plusieurs cellules : les lymphocytes, les macrophages, les monocytes et les cellules épithélioïdes qui vont former un granulome. Ce dernier involue dans la majorité des cas. Néanmoins, la présence d’une exposition répétée à un antigène avec une prédisposition génétique et des changements immunopathologiques dans le microenvironnement pulmonaire incitent le recrutement et l’activation des fibroblastes et l’accumulation de la matrice extra cellulaire induisant une évolution chronique vers une fibrose (Figure 5) (33).
  20. 20. INTRODUCTION 9 Figure 5 : La formation du granulome au cours de la PHS (33) 6. Démarche diagnostique : La démarche diagnostique dans les PID est le résultat d’une confrontation multidisciplinaire entre pneumologues, radiologues et pathologistes. En effet, le diagnostic des PID est porté selon un faisceau d’arguments cliniques, radiologiques et anatomopathologiques. Selon les nouvelles recommandations de l’ATS et de l’ERS, le LBA doit être réalisé dans toute PID confirmée radiologiquement (figure 6) (4).
  21. 21. INTRODUCTION 10 Figure 6 : Démarche diagnostique devant une PID (4) 6.1. Manifestations Cliniques : Les symptômes débutent le plus souvent de façon insidieuse avec une dyspnée d’effort d’installation progressive et une toux non productive. Ces symptômes ne sont pas typiques des PID et ne permettent pas d’orienter le diagnostic étiologique (2). Des signes extra pulmonaires en faveur d’une connectivite (sclérodermie, lupus érythémateux disséminé, polyarthrite rhumatoïde) peuvent être observés et doivent être pris en considération afin de guider le diagnostic des PID. 6.2. Aspects radiologiques : En cas de suspicion de PID, le bilan diagnostique comprend la radiographie du thorax et le scanner thoracique de haute résolution. 6.2.1. Radiographie standard du thorax : L’image radiographique permet de donner une vision globale de l’atteinte parenchymateuse, de préciser la topographie des lésions par rapport aux structures anatomiques normales, la présence ou non d’une atteinte pleurale ou médiastinale. Elle permet surtout de surveiller l’évolution des lésions dans le temps (34). Dans 90% des cas, les PID ont un aspect d’infiltration pulmonaire diffuse. Dans les 10% restant, l’atteinte parenchymateuse n’est pas détectable et la radiographie parait normale (34). 6.2.2. La tomodensitométrie haute résolution (TDM-HR) :
  22. 22. INTRODUCTION 11 La TDM-HR en coupes fines est l’examen de référence pour confirmer le diagnostic d’une PID. Elle permet l’exploration fine du parenchyme avec une description détaillée des lésions élémentaires et de leur distribution topographique, ainsi qu’une analyse du médiastin et de la plèvre à la recherche de lésions pleurales, d’adénomégalies hilaires et/ou médiastinales (35). L’atteinte interstitielle est caractérisée par des opacités à limites nettes non confluentes non systématisées sans bronchogramme aérien et comporte divers éléments. L’aspect réticulé est constitué d’opacités linéaires plus ou moins régulières qui correspondent à un épaississement des septa interlobulaires et/ou à l’interstitium des parois alvéolaires. L’aspect nodulaire est fait d’éléments de taille variable (micronodules, nodules ou masses) et peut s’associer aux opacités linéaires pour former un infiltrat réticulonodulaire diffus. Il peut exister des lésions kystiques avec des cavités aériques à paroi fine plus ou moins juxtaposées (Rayons du miel). L’étendue de ces lésions est variable selon les PID. Les principales caractéristiques des lésions scannographiques des PID sont regroupées dans le tableau 1 (16,35).
  23. 23. INTRODUCTION 12 Diagnostics Radiographie thoracique TDM-HR Topographie des lésions Fibrose Pulmonaire Idiopathique (FPI) Réticulation basale Rétraction pulmonaire Réticulations, rayons de miel (++), bronchectasies de traction, distorsion architecturale, verre dépoli (+/-) Périphérique, sous pleurale, basale symétrique Pneumopathie Interstitielle Non Spécifique (PINS) Verre dépoli Réticulations Verre dépoli ++, consolidation, opacités linéaires Irrégulières Périphérique, sous pleurale, basale, symétrique Pneumopathie Organisée Cryptogénique (COP) Consolidation « patchy » : Bilatérale Condensations alvéolaires migratrices Bronchogramme aérien Sous pleurale, Péri bronchique Pneumopathie Interstitielle Desquamative (DIP) Verre dépoli Verre dépoli, opacités linéaires Basale, Périphérique Bronchiolite Respiratoire avec Pneumopathie Interstitielle (RB-ILD) Épaississement parois bronchiques, Verre dépoli Épaississement parois bronchiques, verre dépoli Nodules centrolobulaires Diffus Pneumopathie Interstitielle Lymphoïde (LIP) Opacités réticulaires, Nodules Opacités réticulaires, nodules, verre dépoli, épaississement péribronchovasculaire et septal Diffus Tableau 1 : Aspects radiologiques des PID (16) 6.3. Apport du Lavage Broncho-Alvéolaire : 6.3.1. Définition du LBA : Le LBA est un outil diagnostique peu invasif qui permet d’explorer le poumon profond. Les informations qu’il fournit sont fiables sous couvert d’une technique rigoureuse tant au niveau de sa réalisation au cours de la fibroscopie bronchique que dans son analyse dans le
  24. 24. INTRODUCTION 13 laboratoire d’anatomie pathologique. Grâce à la reproductibilité de ses résultats, le LBA s’est imposé comme un outil fondamental du diagnostic positif des PID (4,36). Le LBA possède une excellente valeur diagnostique étiologique pour les pneumopathies infectieuses, les hémorragies intra-alvéolaires, les lipoprotéinoses alvéolaires, les pneumopathies chroniques à éosinophiles et accessoirement les tumeurs. Le plus souvent, il n’a qu’une valeur d’orientation et permet d’identifier la formule cellulaire: alvéolite lymphocytaire, à polynucléaires neutrophiles, à polynucléaires éosinophiles, mixte (4). 6.3.2. Intérêt du LBA : Le LBA permet tout d’abord une analyse de la cytologie normale alvéolaire aussi bien quantitative que qualitative. Il permet également la détection des cellules (inflammatoires, néoplasiques …) ou du matériel acellulaire (lipoprotéines) anormal et la mise en évidence de nombreux agents pathogènes. C’est un outil très pratique pour le suivi de l’évolution des processus pathologiques ou pour évaluer la réponse à un traitement (36). Certains auteurs (4) soulignent l’importance de corréler les données du LBA aux aspects radiologiques. Le LBA permet en effet, d’accéder facilement à une analyse plus fine des processus pathologiques mis en cause. Etant donné qu’il s’agit d’un acte non invasif, facile, rapide et peu onéreux, il est tout à fait justifié de l’entreprendre en présence de tout signe de PID avant d’envisager d’autres moyens diagnostiques plus invasifs tels que la biopsie Trans-pariétale ou la biopsie Trans-bronchique ou encore la biopsie chirurgicale. 6.3.3. Réalisation et interprétation du LBA : Le LBA est réalisé au cours de la fibroscopie soit sous anesthésie locale afin de prévenir la toux soit sous anesthésie générale d’un patient intubé. Du liquide isotonique stérile est instillé à travers le canal de travail directement dans une bronche obstruée par l’extrémité du fibroscope. Il n’y a pas de consensus établi sur la quantité exacte de liquide à instiller. On admet généralement des aliquots de 20-60 ml pour un volume total de 100-300 ml. Le retour du liquide est d’environ 40-70%, mais il peut être inférieur à ce volume dans les troubles ventilatoires obstructifs (37). En cas d’atteinte diffuse du parenchyme pulmonaire, le LBA est réalisé dans le lobe moyen ou la lingula. En effet, la corrélation entre les deux lobes est excellente et ces localisations antérieures permettent un bon rendement. En cas d’atteinte focale dans un lobe ou un segment
  25. 25. INTRODUCTION 14 pulmonaire, on s’appuie sur la documentation radiologique pour «laver» la zone d’intérêt (37). Le LBA est peu invasif et n’a pas de contre-indication absolue. Les complications les plus fréquentes sont une aggravation transitoire de l’hypoxémie due au liquide résiduel du LBA dans les alvéoles et plus rarement, un pneumothorax. Les facteurs de risque de survenue d’une complication sont : des infiltrats pulmonaires étendus, une PaO2< 8 kPa (< 60 mm Hg), une saturation en oxygène < 90%, un VEMS <1 litre, une thrombocytopénie <20 G/l et une hyperréactivité bronchique (37). Après la réception des écouvillons contenant le liquide à analyser, des études cytologiques et microbiologiques rigoureuses sont faites, des colorations spéciales sont réalisées à la recherche d’agents opportunistes, de sidérophages, de substance extracellulaire anormale ou de cellules tumorales. Le diagnostic est orienté selon le profil cellulaire objectivé. Il est recommandé dans certains profils de continuer l’analyse par un marquage immunocytochimique ou une acquisition par cytométrie en flux (Comme le profil lymphocytaire, ou le profil macrophagique s’il y a une suspicion clinique d’histiocytose X) (8,9). L’interprétation du LBA doit être minutieuse. Elle fournit d’une part, des éléments de certitude diagnostique devant la présence de cellules malignes, d’agents infectieux pathogènes, de sidérophages (indice de Golde > 100 signant une hémorragie alvéolaire), d’une substance amorphe intercellulaire en faveur d’une lipoprotéinose alvéolaire. D’autre part, cette interprétation fournit des éléments d’orientation étiologique devant une alvéolite (augmentation harmonieuse de la cellularité totale ou de l’une des populations cellulaires normalement présentes dans l’alvéole (macrophages, polynucléaires neutrophiles, lymphocytes) ou devant l’apparition de cellules normalement absentes (éosinophiles, mastocytes)) (8,9).  Orientation diagnostique du LBA : Les valeurs habituels du LBA chez un sujet adulte, sain, non-fumeur sont regroupées dans le tableau ci-dessous (Tableau 2).
  26. 26. INTRODUCTION 15 Tableau 2 : Valeurs habituelles du LBA (Sujet adulte, sain, non-fumeur) (8,9) Le LBA peut confirmer dans certains cas le diagnostic suspecté d’une hémorragie intra- alvéolaire diffuse devant des images d’érythrophagocytose (macrophages alvéolaires qui ont phagocyté des hématies et deviennent chargés en fer) ou devant le score de GOLDE >100. Le score de GOLDE est une évaluation qui tient compte de la charge des macrophages en fer estimée selon l’intensité de la coloration par le Perls. On effectue une numération-formule des macrophages de valeur 0 à 4 sur 200 éléments reconnus selon leur couleur (Tableau 3) (38).  Indice 0 : Négatifs  Indice1 : Faiblement bleus  Indice 2 : Modérément bleus (diffus) ou avec quelques grains (moins de 50% de la surface du cytoplasme)  Indice 3 : Granulations dans plus de 50 % du cytoplasme ou forte positivité diffuse  Indice 4 : Forte positivité et masquage du noyau Indice 0 1 2 3 4 % des sidérophages sur 200 macrophages a b c d e Score de GOLDE = (ax0) + (bx1) + (cx2) + (dx3) + (ex4) Le score de GOLDE varie de 0 à 400. Tableau 3 : Score de GOLDE La charge en fer est normale ou faible de 0 à 20, intermédiaire de 20 à 70, élevée à plus de 70 et une hémorragie alvéolaire occulte est diagnostiquée si le score est supérieur à 100.  Profil cytologique du LBA : Le profil cytologique du LBA varie en fonction de la pathologie suspectée et les différents profils observés sont regroupées dans le tableau ci-dessous (Tableau 4) (4). Richesse cellulaire 150 à 200 000 cellules/ml Macrophages 90 à 95 % Lymphocytes <20% Polynucléaires neutrophiles <5% Polynucléaires éosinophiles <1% Mastocytes <1%0
  27. 27. INTRODUCTION 16 Type cellulaire Anomalie Diagnostic suggéré Macrophages >90% Histiocytose X Lymphocytes >25% Sarcoïdose PINS PHS PM Collagénose Pneumopathie radique LIP Lymphome COP Bérylliose Pneumoconiose Pneumonie virale >50% PHS PINS Neutrophiles >3% Dommage alvéolaire diffus Pneumonie bactérienne, fongique Asbestose Collagénose FPI Bronchiolite oblitérante SDRA >50% Dommage alvéolaire diffus Pneumonie bactérienne Eosinophiles >1% Pneumonie à éosinophiles Maladie de Churg-Strauss Syndrome hyperéosinophilique ABPA >25% Pneumonie à éosinophiles Cellules épithéliales >5% Contamination Cellules bronchiques >5% Prélèvement inadéquat Cellules malignes Néoplasie Tableau 4 : Les principaux diagnostics suggérés selon le profil cellulaire observé au LBA (4) On va s’intéresser dans notre étude aux alvéolites lymphocytaires qui sont observées dans nombreuses affections (sarcoïdose, PHS, tuberculose, connectivites …). Il est recommandé devant toute alvéolite lymphocytaire de continuer l’analyse par un marquage immunocytochimique ou une acquisition par cytométrie en flux.
  28. 28. INTRODUCTION 17 6.3.4. Immunocytochimie : L’immunocytochimie est une technique qui permet la détection in situ d’un antigène (Ag) à l’aide d’anticorps de reconnaissance spécifique. Elle consiste à révéler sur un étalement ou une coupe cytologique, par réaction antigène-anticorps, la présence des récepteurs antigéniques cellulaires intranucléaires, membranaires ou cytoplasmiques (39,40). Le marqueur recherché ou l’antigène (Ag) peut être intracellulaire ou membranaire ou extracellulaire. Les anticorps utilisés sont soit polyclonaux, c’est à dire un mélange d’anticorps reconnaissant différents épitopes sur un antigène donné, soit monoclonaux ne reconnaissant qu’un seul type d’épitope sur un antigène donné (41). L’arrivé des anticorps monoclonaux, à partir des années 1980, a contribué significativement à l’essor de l’immunocytochimie même si, pour certains antigènes, les anticorps polyclonaux restent d’actualité (42). Figure 7 : Les différents types d’anticorps (D’après www.dako.com) La visualisation du complexe antigène-anticorps doit être réalisée in situ à l’aide d’un marqueur morphologique. Plusieurs méthodes sont possibles : radio-isotopiques, fluorescence, métallique, enzymatique (43). En anatomie pathologique, la méthode la plus appropriée pour révéler le complexe Ag/Ac sur étalements ou coupes cytologiques, est la mise en évidence d’une activité enzymatique. La plus communément utilisée est la peroxydase extraite de raifort (cruciféracée), car elle est disponible en grande quantité, stable, peu couteuse et détectable par plusieurs chromogènes et elle est couplée de façon stable à des protéines (figure 8) (43). La première technique immuno-peroxydasique a été décrite par Nakane et Pierce (44). Depuis, elle a fait l’objet de nombreux développements qui ont conduit à une augmentation de la sensibilité par rapport aux techniques plus précoces.
  29. 29. INTRODUCTION 18 En outre, La peroxydase peut être présente de façon endogène dans certains tissus biologiques et permet la décomposition de l’H2O2 et cette activité est présente dans toutes les hémoprotéines comme l’hémoglobine (les hématies), les cytochromes (les polynucléaires, les macrophages) et les catalases (foie/rein) ; elle peut donc donner un signal non spécifique lors de la révélation du complexe antigène-anticorps. Il est nécessaire alors de l’inhiber durant la technique immunocytochimique. L’inhibition de ces peroxydases endogènes se fait par une incubation des étalements dans le H2O2 avant le marquage immunocytochimique (43). Figure 8 : Mode d’action de peroxydase (41) Les chromogènes les plus utilisés en immunocytoperoxydase sont le 3-Amino-9-Ethyl- Carbazole (AEC) et la 3,3-Diaminobenzidine (DAB) (Tableau 5) (45,46). AEC DAB Produit de réaction rouge facilitant l’observation. Précipité marron. Soluble dans les alcools et les solvants organiques. Précipité insoluble. Les contre-colorants ne doivent pas contenir de l’alcool. Tout contre-colorant peut être utilisé. Le milieu de montage doit être aqueux. Tout milieu de montage utilisé. Peut perdre son intensité de coloration (diffusion dans le milieu de montage). Intensité de coloration pratiquement permanente. Tableau 5 : Caractéristiques des deux chromogène de la peroxydase (46) On distingue:  L’immunoperoxydase directe : Une seule étape et une seule espèce animale : l’anticorps primaire est directement couplé à la peroxydase (43) ; Ac primaire conjugué + antigène → marquage direct (Figure 9).
  30. 30. INTRODUCTION 19  L’immunoperoxydase indirecte : Deux étapes et deux espèces animales : l’anticorps primaire est détecté par un second anticorps couplé à la peroxydase (43); Ac secondaire conjugué + Ac primaire + antigène → marquage indirecte (Figure 9). Figure 9 : Les différentes méthodes de marquage immunocytochimiques (D’après www.dako.com) Il existe de nombreux systèmes d’amplifications utilisés en immunocytochimie, on distingue ainsi :  Le système PAP : Trois étapes et trois espèces animales : un second anticorps sert de liaison entre l’anticorps primaire et le complexe peroxydase-anti-peroxydase (Figure 10) (47). Figure 10 : Système PAP (D’après www.dako.com)
  31. 31. INTRODUCTION 20  Système Biotine/Streptavidine : Trois étapes et deux espèces animales : la caractéristique de ce système biotine (vitamine B1) streptavidine (avidine = protéine) est la haute affinité de la streptavidine pour la biotine. La streptavidine sert de pont entre le second anticorps biotinylé et plusieurs peroxydases biotinylées (43). Le principal avantage de ce système est l’amplification considérable du signal sans augmenter le bruit de fond (45). Il permet de plus une utilisation à de très faibles concentrations des réactifs et en particulier de l’anticorps primaire du fait de la forte interaction existant entre la biotine et la streptavidine (47). La biotinylation d’un anticorps n’altère pas ses propriétés de liaison à l’antigène. L’avidine est extraite du blanc d’œuf et possède 4 sites de liaison à haute affinité pour la biotine. La streptavidine est une protéine isolée à partir d’une bactérie Streptomyces avidini, elle a les mêmes propriétés de l’avidine (4 sites de liaison à haute affinité pour la biotine) (Figure 11) (47). Figure 11 : Système Biotine/Streptavidine (D’après www.dako.com)  Système d’amplification polymérique : L’emploi d’un marquage polymérique constitue un développement récent. Ce système emploie une nouvelle technologie de polymérisation contrôlée pour préparer des conjugués polymérique HRP-anticorps de liaison. Par conséquent, le problème du au marquage non spécifique susceptible de se produire avec les systèmes de détection biotine/streptavidine en raison de la présence de biotine endogène, ne se pose plus (Figure 12).
  32. 32. INTRODUCTION 21 Figure 12 : Système d’amplification polymérique (D’après www.dako.com)  Apport de l’immunocytochimie dans le diagnostic des PID : Un protocole immunocytochimique est une technique complexe composée de nombreuses étapes successives. Son résultat - le dépôt coloré obtenu -, est influencé par des événements préalables à l’acte immunocytochimique proprement dit, en particulier la fixation (48) et le temps de restauration antigénique (49). Ces caractéristiques expliquent combien, il est difficile d’assurer une reproductibilité parfaite du signal immunocytochimique (50). L’immunocytochimie a pour objet la mise en évidence d’antigène in situ, sur des étalements ou coupes cellulaires à l’aide d’anticorps marqués. L’immunocytochimie est maintenant utilisée en routine et a un grand apport pour le diagnostic en oncologie, en pneumopathologie et plus spécifiquement dans le diagnostic de certaines PID : pour aider à orienter le diagnostic devant un profil cellulaire lymphocytaire (marquage CD4/CD8) et dans certains cas pour confirmer un diagnostic suggéré (marquage CD1a en cas de suspicion d’une histiocytose X) ou pour mettre en évidence des agents infectieux (CMV…). Les résultats immunocytochimiques sont habituellement intégrés dans un ensemble de données cliniques, radiologiques et biologiques, pour permettre le diagnostic (49). Ainsi, le pathologiste écartera rarement une possibilité diagnostique sur la base d’un marqueur absent si les autres paramètres cliniques et radiologiques sont en faveur de ce diagnostic (49). L’absence d’un marqueur peut être due à une particularité dans la procédure technique.
  33. 33. INTRODUCTION 22 6.3.5. Cytométrie en flux : a. Définition : La cytométrie en flux est une technologie qui permet la mesure et l’analyse, qualitative et quantitative, de multiples paramètres à l’échelon cellulaire dans une population hétérogène en suspension dans un liquide (51,52). Elle consiste à analyser les signaux optiques ou physiques émis par une particule coupant le faisceau lumineux d’un laser. Les propriétés mesurées par le cytométre en flux incluent la taille relative de la cellule, sa granularité ou sa complexité interne relative et enfin son intensité relative de fluorescence (51,52). Ce procédé d’analyse individuelle (cellule par cellule) peut être mono- ou multi- paramétriques et peut s’effectuer à la vitesse de plusieurs milliers d’événements par seconde. Les résultats sont représentés sous la forme d’histogrammes (un paramètre) ou de cytogrammes (deux paramètres). L’apport majeur de la cytométrie est de pouvoir aborder les populations cellulaires dans leur grande diversité et complexité. b. Principe :  Les composants d’un cytométre : Le cytométre en flux est un appareil complexe qui possède trois grands systèmes: le système fluidique qui introduit et positionne les cellules à analyser, le système optique comprenant les lasers comme source de lumière et les filtres optiques qui séparent la lumière émise par la cellule et la dirigent vers les détecteurs et le système électronique qui va convertir les signaux optiques en signaux électroniques analysables par l’ordinateur (Figure 13) (53).
  34. 34. INTRODUCTION 23 Figure 13 : Les composants d’un cytométre (D’après www.selectscience.net)  la composante fluidique : Les cellules doivent être mises en suspension pour pouvoir être analysées. L’analyse par la cytométrie en flux est basée sur la focalisation hydrodynamique par le liquide de gaine, ce dernier s’écoule à une vitesse constante ce qui entraine et focalise un deuxième flux liquide contenant l’échantillon et ainsi aligne les cellules une à une. Ces cellules seront excitées par le laser et émettront de la lumière qui sera collectée par le système optique (Figure 14) (54,55). Figure 14 : Principe de centrage hydrodynamique (D’après www.abcam.com)
  35. 35. INTRODUCTION 24  Le système optique : Il est composé d’une ou plusieurs sources lumineuses, de détecteurs de type photodiode (Pour la diffusion de la lumière), de photomultiplicateurs et de filtres optiques qui permettent de quantifier les diverses fluorescences émises par chaque cellule (54). Le laser est la source lumineuse utilisée par le cytométre pour ces propriétés de puissance, de stabilité et de focalisation avec une longueur d’onde étroite, bien définie et spécifique. Il existe plusieurs types de lasers disponibles et les plus couramment utilisés sont des lasers à argon (bleus ; 488 nm), lasers à hélium-néon (rouges ; 633nm) et des lasers ultra-violet (355 nm). Le cytomètre en flux analyse les cellules en les faisant défiler à grande vitesse à travers un ou plusieurs lasers. Les signaux optiques émis par la cellule coupant le faisceau lumineux d’un laser sont mesurés par l’appareil et sont essentiellement relatifs : - Aux propriétés optiques intrinsèques des cellules qui correspondent aux phénomènes de diffusion lumineuse liés aux dimensions de la cellule et à leur structure interne. Le signal est capturé par deux photodiodes. La première est disposée dans le prolongement du laser (FSC : Forward Scatter) à faible angle. Le signal capté reflète approximativement la taille de la cellule. La seconde est placée latéralement à 90 ° (SSC : Side Scatter). Le signal capté reflète l’hétérogénéité des cellules (granularité du cytoplasme). - Aux propriétés optiques induites de fluorescence obtenues par des marquages spécifiques de structure ou de fonction cellulaire. En général, des anticorps monoclonaux couplés à des fluorochromes sont nécessaires pour ces mesures optiques. Le fluorochrome absorbe l’énergie du laser et réémet l’énergie absorbée par vibration et dissipation de chaleur, d’où une émission de photons ayant une longueur d’onde plus élevée. Les différents signaux optiques émis par la cellule doivent être focalisés, séparés, puis acheminés vers des systèmes de détection, photomultiplicateurs ou photodiodes. Ils sont pour cela, sélectionnés par différents circuits optiques, composés d’une alternance de miroirs et de filtres. Ces signaux sont ensuite stockés par un ordinateur (Figure 15) (54).
  36. 36. INTRODUCTION 25 Figure 15 : Principe de système optique (D’après www.abcam.com)  Analyse des données : Une fois les signaux optiques convertis de façon proportionnelle en signaux électroniques puis en chiffres, les données sont stockées dans l’ordinateur sous forme de fichier FCS (flow cytometry standard). Les données peuvent être représentées sous forme : - d’histogrammes mono-paramétriques où l’axe des abscisses représente l’intensité du signal analysé et l’axe des ordonnées le nombre de cellules. - d’histogrammes bi-paramétriques ou cytogrammes présentant deux signaux simultanément (54). c. Applications : La cytométrie en flux entame un champ d’application très large dans des disciplines très variées telles que l’hématologie, l’immunologie, la cancérologie et la génétique autant dans les domaines de la recherche scientifique que dans ceux de la recherche et l’application clinique. Elle est également utilisée dans des domaines d’étude autres que celui de la cellule animale. C’est le cas par exemple de la biologie végétale, de la microbiologie ou la biologie marine (56). La cytométrie en flux est de plus en plus utilisée pour le typage des leucémies, la numération de très nombreux sous-types cellulaires, par exemple pour le suivi du sida ou des traitements immunosuppresseurs et des greffes. De plus, les états d’activation, de maturation et de prolifération des cellules peuvent être mesurés. La haute précision et la large utilisation de la cytométrie a déjà permis de décrire de nouveaux sous-types cellulaires tels que les
  37. 37. INTRODUCTION 26 lymphocytes T gamma delta, muqueux, les cellules TNK, les lymphocytes régulateurs dont l’action est ciblée au sein de la réponse immune (56). L’association de l’immunofluorescence et de la cytométrie en flux est devenue un élément essentiel dans l’étude des systèmes biologiques, surtout dans la discrimination entre cellules d’une population hétérogène. En effet, l’utilisation des anticorps monoclonaux (AcM), dirigés contre des composants membranaires spécifiques permet de distinguer par exemple des sous- populations lymphocytaires. Ces dernières années, l’identification et la caractérisation des antigènes (Ag) de surface des lymphocytes ont progressé très rapidement. Cependant, il n’existe pas d’AcM pouvant reconnaître à lui seul une cellule particulière pourvue de certaines fonctions. Cette limitation a conduit les utilisateurs de la technique d’immunofluorescence à préférer les marquages multiples en utilisant des combinaisons d’AcM révélés par des fluorochromes différents. Il y a deux méthodes d’immunofluorescence : - les réactions directes où l’AcM est directement couplé à un fluorochrome (Figure 16A). - les réactions indirectes où l’AcM est révélé par un second réactif couplé au fluorochrome (Figure 16B) (56). Figure 16 : Méthodes d’immunofluorescence Par rapport aux investigations initiales réalisées au microscope, la cytométrie en flux apporte en plus la quantification à l’échelon cellulaire individuel du nombre de sites reconnus et la possibilité de trier ces cellules selon l’intensité de leur marquage en vue d’études fonctionnelles ultérieures. Enfin, elle peut se combiner à l’analyse d’autres paramètres (cycle cellulaire, Calcium) et donc nous informer sur l’état fonctionnel des cellules (56).
  38. 38. OBJECTIF 27 OBJECTIF Le but de notre travail est de comparer le profil en immunocytochimie et en cytométrie en flux des alvéolites lymphocytaires dans le lavage broncho-alvéolaire
  39. 39. PATIENTS ET METHODES 28 1. Patients : Nous rapportons une étude comparative entre l’immunocytochimie et la cytométrie en flux dans le cadre du phénotypage des alvéolites lymphocytaires. Pour ce faire, nous avons colligé 32 cas d’alvéolites lymphocytaires diagnostiquées et prises en charge au service d’Anatomie Pathologique de l’Hôpital Abderrahmen Mami de l’Ariana pour l’analyse cytologique du LBA et le marquage immunocytochimique et dans le département d’Hématologie (Unité de Cytométrie en Flux) de l’Institut Pasteur de Tunis pour le phénotypage par cytométrie en flux. 2. Méthodes : 2.1. Protocole d’analyse cytologique du lavage broncho-alvéolaire : Le LBA est reçu dans des flacons siliconés et numérotés. Le premier flacon est considéré comme un liquide bronchique et les autres sont considérés comme un liquide alvéolaire et constituent le véritable LBA. Après la réception des écouvillons contenant le liquide à explorer, on note l’aspect du liquide qui peut nous aider à suggérer un diagnostic précis (Par exemple : L’aspect hémorragique oriente vers une hémorragie alvéolaire, l’aspect laiteux ou gras oriente vers une lipoprotéinose). Il faut noter aussi s’il y a un dépôt au fond du flacon ou la présence de poussières, de pigments ou de petits grains de sable (micro-lithiase alvéolaire). Par la suite, on mesure le volume du LBA en versant la totalité du liquide dans une éprouvette graduée en plastique stérile sans filtration car la filtration altère les cellules, notamment les lymphocytes et des agrégats de cellules ou d’agent pathogènes peuvent être retenus dans le filtre et on note le volume en ml. Après avoir noté l’aspect et le volume du liquide, on fait une homogénéisation du LBA à l’aide du Vortex Mixer (de DRAGON Laboratory Instruments). On évalue ensuite la richesse cellulaire à l’aide de la cellule de Malassez (la richesse cellulaire est évaluée si le volume est supérieur à 30 ml). La cellule de Malassez est une lame en verre comprenant une plage centrale gravée et quadrillée (Figure 17) surmontée par deux rebords. Le volume compris entre la plaque gravée, la lamelle épaisse et se projetant dans les champs quadrillés est de 10-3 ml. Pour monter la cellule on fait glisser la lamelle épaisse sur les rebords humectés. On prélève un peu de liquide, après l’avoir bien remis en suspension par un geste d’agitation circulaire et on dépose une à deux gouttes de LBA entre lame et lamelle de façon à recouvrir la zone gravée en évitant d’inonder le tout. Par la suite, on compte les cellules déposées dans la zone
  40. 40. PATIENTS ET METHODES 29 quadrillée (toutes les cellules sont comptées sauf les hématies, les cellules bronchiques, les cellules bucco-pharyngées ou les débris). La surface de comptage de la cellule est gravée en 10 lignes et 10 colonnes verticales qui forment 100 cases. Une case sur deux est redivisée en 20 petits carrés. On compte les cellules sur toute la surface en suivant les colonnes au microscope. Pour ne pas compter deux fois une même cellule située sur un trait entre deux colonnes, il suffit de compter les cellules à gauche de la colonne en montant ou descendant. On compte les cellules sur la première ligne en haut et pas en bas. Figure 17 : Cellule de Malassez vue au microscope à faible grossissement 2.1.1. Cytocentrifugation et préparation des lames : On prépare environ cinq lames : trois pour les colorations standards (MGG, Perls, Papanicolaou) et deux pour le marquage immunocytochimique. a. Cytocentrifugation : Nous avons utilisé une cytocentrifugeuse de type SHANDON CYTOSPIN 4® avec des cyto- chambres à usage unique qui permettent la préparation de deux échantillons sur une seule lame. Ces chambres sont maintenues contre des lames Super Frost à l’aide de cytoclips métalliques. Au cours de la Cytocentrifugation, les cellules en suspension viennent se déposer sur une lame porte-objet et l’excès de fluide est absorbé par une carte filtre. Le volume mis dans les chambres à échantillon est lié essentiellement à la richesse cellulaire et le tableau ci-dessous récapitule le volume mis en fonction de la richesse cellulaire (Tableau 6).
  41. 41. PATIENTS ET METHODES 30 Tableau 6 : Volume mis selon la richesse cellulaire La durée et la vitesse de Cytocentrifugation est de 1200 tours/min pendant 10 minutes. b. Coloration : Après séchage à l’air pendant environ une à deux heures, trois colorations standards sont réalisées (tableau 7) (Annexe1). Richesse cellulaire Volume mis dans les chambres à échantillon <100 000 cellules/ml 4 à 5 gouttes 100 à 200 000 cellules/ml 3 à 4 gouttes 200 à 300 000 cellules/ml 2 à 3 gouttes 300 à 400 000 cellules/ml 1 à 2 gouttes 400 à 500 000 cellules/ml 1 goutte >500 000 cellules/ml Diluer avec du sérum physiologique (1 goutte de LBA + 1 goutte de sérum) Non déterminée 2 à 3 gouttes
  42. 42. PATIENTS ET METHODES 31 Tableau 7 : Les principales coloration du LBA c. Inclusion du culot dans la paraffine : Le liquide du LBA est centrifugé à 1500 tours/min pendant 3 minutes, après une fixation par l’AFA (Alcool-Formol-Acide acétique) pendant au minimum 3 heures. Ensuite, on glisse les culots dans une cassette à inclusion entre deux tissus mousses en regroupant les différents culots. Cette étape est suivie par un enrobage en paraffine. Les blocs sont ainsi préparés pour le marquage immunocytochimique sur cytoblocs (Annexe2). 2.1.2. Protocole de marquage immunocytochimique : Dans notre étude, deux procédures de marquage immunocytochimique ont été réalisées : Marquage sur des coupes incluses en paraffine (Cytoblocs) et marquage sur des étalements cytologiques frais (Annexe 3). Coloration Réactifs utilisés Résultats Intérêt MGG - kit RAL 555 : o Fix-RAL 555. o Eosine-RAL 555. o Bleu-RAL 555. NoyauxBleu/Violet. CytoplasmeRose/ Violet. HématiesRose pale Mettre en évidence les composants cellulaires en jouant sur l’action des ions acides/basiques Perls - Ferrocyanure de potassium. - Acide chloridrique à 2%. - Phloxine : Le rouge nucléaire, un contre colorant. Noyaux, cytoplasmeRose Hémosidérine (sels ferriques) Bleu turquoise Mettre en évidence les complexes insolubles contenant du fer (exemple : hémosidérine) Papanicolaou - Hématéine. - OG6 - EA50 NoyauxBleu/Violet Cytoplasme :  Eosinophiles Rose/Rouge /Orangé  Cynophiles Bleu verdâtre  Orangéophiles Orangé brillant OG6  permet de détecter la présence de la kératine. Diagnostic de la présence des cellules cancéreuses.
  43. 43. PATIENTS ET METHODES 32 a. Les étapes particulières aux coupes incluses en paraffine (Cytoblocs) : Les coupes sur les cytoblocs ont été réalisées à l’aide d’un microtome Sakura Cut SRM (épaisseur entre 3 et 4 microns) et sont montées sur des lames silanisées.  Déparaffinage : Les coupes montées sur des lames silanisées sont séchées à l’air libre puis portées à 56°C dans une étuve pendant 12 à 24 heures au point de fusion de la paraffine. Elles subissent ensuite les étapes suivantes :  Déparaffinage des sections dans 3 bains de toluène (5 minutes pour chaque bain).  Réhydratation dans 3 bains d’alcool éthylique de concentration décroissante 100%,70% et 50% (5 minutes chacun).  Lavage des lames à l’eau distillée.  Démasquage antigénique : Le démasquage antigénique vise à rompre les liaisons moléculaires créées par le fixateur et permet une accessibilité des sites antigéniques. Les lames ont été ainsi immergées dans un tampon citrate (pH=6) puis chauffées au four à micro-ondes X-BIOGENEX (2 cycles durant 5 minutes à 90°C et 10 minutes à 97°C). Après avoir été refroidies sur la paillasse à température ambiante pendant 20 minutes, les lames ont été rincées à l’eau distillée puis les coupes ont été délimitées avec un crayon hydrophobe (Novocastra Pen). b. Les étapes communes aux étalements et aux coupes incluses en paraffine (Cytoblocs) :  Blocage des peroxydases endogènes : Les peroxydases endogènes peuvent être présentes dans certains tissus biologiques et donner un signal non spécifique. Afin de réduire ce signal, les lames sont incubées avec le peroxyde d’hydrogène à 3% pendant 10 minutes et lavées dans le TBS ‘Tris Buffered Saline’ (3 bacs de 5 minutes chacun) (Annexe3).  Immunomarquage : Les lames sont placées dans une chambre humide où elles sont incubées avec l’anticorps primaire (tableau 9), dilué de façon optimale à température ambiante pendant une heure. L’humidité de la chambre est nécessaire pour éviter l’évaporation de la solution de l’anticorps (Annexe 3).
  44. 44. PATIENTS ET METHODES 33 Tableau 9 : Anticorps utilisés pour le marquage immunocytochimique Ensuite, un lavage dans 3 bains de tampon TBS (3x5minutes) est effectué. Par la suite, les lames sont incubées avec le Post Primary Block (10% de sérum animal dans une solution saline tamponnée de Tris, Leica) pendant 30 minutes afin d’accroitre la pénétration du polymère et un lavage dans 3 bains de tampon TBS (3x5 minutes) est effectué. Après, on incube avec le polymère peroxydase qui renferme l’anticorps secondaire (IgG-poly- HRP qui reconnait les immunoglobulines de souris et de lapin, Leica) pendant 30 minutes et un lavage dans 3 bains de tampon TBS (3x5 minutes) est effectué (Annexe3).  Révélation : La révélation a été réalisée avec le chromogène DAB (diaminobenzidine) préalablement préparé (Une goutte de ‘DAB Chromogen’ dans 1 ml de ‘DAB substrate Buffer’, Leica). Les lames ont été recouvertes puis rincées à l’eau après l’obtention d’une coloration brune satisfaisante (Annexe3).  Contre coloration et montage : La coloration de contraste a été réalisée avec l’hématéine de Mayer et les lames ont été par la suite rincées sous l’eau pendant 5 minutes. La déshydratation des lames a été effectuée dans 3 bains d’alcool éthylique de concentration croissante 50%, 70% et 100% pendant 5 minutes chacun et ont été montées avec un milieu de montage adapté au toluène/xylène (Annexe3). Anticorps Firme Clone Classe Ig Dilution Recommandée/utilisée Marquage Lapin anti- CD3 Invitrogen, camarillo, CA Polyclonal - 1 :50/1 :50 Cytoplasmique Les lymphocytes T Souris anti- CD4 Leica Biosystems Newcastle Ltd clone 4B12 IgG1, kappa 1 :100/1 :20 Cytoplasmique Les lymphocytes TCD4 Souris anti- CD8 Leica Biosystems Newcastle Ltd clone 1A5 IgG1 1 :20/1 :20 Cytoplasmique Les lymphocytes TCD8
  45. 45. PATIENTS ET METHODES 34 Figure 18 : Méthode immuno-enzymatique avec amplification du signal par un polymère (D’après www.leicabiosystems.com) 2.1.3 Lecture et interprétation des résultats : - L’interprétation est faite à l’aide d’un microscope optique ZEISS et la formule est évaluée à l’objectif x40 sur 200 à 400 éléments. On différencie sur un compteur électronique, macrophages, lymphocytes, polynucléaires neutrophiles et polynucléaires éosinophiles. La formule est exprimée en pourcentage (tableau 8) (Annexe1). Formule Pourcentage Macrophages 90 à 95% Lymphocytes <20% Polynucléaires neutrophiles <5% Polynucléaires éosinophiles <1% Tableau 8 : Formule du LBA Une description cytologique précise est faite en précisant le pourcentage des cellules bronchiques (>5%, le LBA est contaminé), la présence d’hématies, d’inclusions lipidiques, de cellules spumeuses, de corps ferrugineux ou pseudo-ferrugineux, la charge en fer des
  46. 46. PATIENTS ET METHODES 35 macrophages (taux de sidérophages et score de GOLDE) et la présence ou non de cellules tumorales. - Le rapport CD4/CD8 est calculé et interprété selon les valeurs suivantes :  Rapport CD4/CD8<1 : Rapport bas.  Rapport 1 < CD4/CD8 < 1.6 : Rapport sub-normal.  Rapport CD4/CD8> 1.6 : Rapport élevé 2.2 Protocole de marquage par cytométrie en flux : 2.2.1 Marquage des échantillons : Afin d’avoir centrifugé 100 µl du liquide de LBA à 1200 tours/min pendant 10 minutes, on ajoute au culot 100 à 200 µl du PBS (Phosphate Buffered Saline). Le liquide est ensuite transféré dans deux tubes à fond rond de 5 ml, un pour le contrôle et un tube 2 pour le marquage par les anticorps. Par la suite, le liquide est incubé avec les anticorps monoclonaux couplés à des fluorochromes : CD8-FITC, CD4-PE et CD3-PerCP-Cy5.5, pendant 20minutes à+4°C et à l’abri de la lumière. (Tous les anticorps sont de BD biosciences) (Tableau 10). Tous les fluorochromes utilisés pour cette étude ainsi que leurs longueurs d’ondes d’excitation et d’émission sont représentés dans la figure ci dissous (figure 19) (Annexe 4). Anticorps- fluorochromes Marqueurs Laser Longueur d’onde d’excitation Longueur d’onde d’émission CD8-FITC LT cytotoxiques Bleu 488 490 543 CD4-PE LT helper Bleu 888 565 578 CD3-PerCP-Cy5.5 LT Bleu 888 488 695 Tableau 10 : Les anticorps utilisés pour l’acquisition des données par cytométrie en flux.
  47. 47. PATIENTS ET METHODES 36 Figure 19 : les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission des différents fluorochromes utilisés dans le marquage par cytométrie en flux (D’après www.bdbioscinces.com) Les cellules marquées sont ensuite lavées avec 2 ml de PBS et centrifugées pendant 10 minutes à 1200 tours/min puis elles sont fixées en ajoutant 300 µl de fixateur 1x (3g de paraformaldéhyde dans 100 ml de PBS 1x, dilué). 2.2.2 Acquisition des données et analyse des échantillons : Les échantillons sont collectés sur un cytométre BD FACSCanto™ II (BD Biosciences).En premier, l’acquisition par l’instrument de tube échantillon appelé « contrôle » (‘tube 1’) suivi de tube marqué par chaque anticorps utilisé pour l’expérience. Les populations lymphocytaires à étudier sont identifiées par le cytogramme FSC et SSC selon leur taille et leur granularité relatives. Le logiciel d’analyse des données est utilisé afin de visualiser les sous populations lymphocytaire identifiées. Les chevauchements des spectres d’émission de certains fluorochromes utilisés induisent un signal non spécifique sur les autres détecteurs. Ces artefacts sont corrigés par traitement mathématique (compensations de fluorescence). Les résultats sont représentés sous forme d’un cytogramme présentant simultanément deux signaux.
  48. 48. PATIENTS ET METHODES 37 3 Etude statistique : Le coefficient de concordance kappa a été calculé afin d’évaluer la concordance des différentes techniques et interprété selon le tableau suivant. Accord Kappa Très bon >0.81 Bon 0.61-0.80 Moyen 0.41-0.60 Médiocre 0.21-0.40 Mauvais 0.0-0.20 Exécrable <0 Tableau 11 : Grille d’interprétation du Kappa
  49. 49. RESULTATS 38 1. Epidémiologie : Notre étude a été réalisée du 4/03/2014 au 02/06/2014. Au cours de cette période, 97 LBA ont été acheminés au laboratoire. Trente-deux LBA (soit 33%) présentaient un profil lymphocytaire et ont fait l’objet de notre étude. 2. Répartition selon le sexe : Notre série était constituée de 10 hommes (soit 31%) et 22 femmes (soit 69%). Le sex-ratio (H/F) est estimé à 0.44 (Figure 20). Figure 20 : La répartition selon le sexe 3. Répartition selon l’âge : L’âge moyen dans notre étude était de 46.5 ans avec des extrêmes allant de 6 ans à 68 ans. La médiane d’âge était de 52 ans. Quatre patients étaient âgés de moins de 30 ans (16%), 11 avaient moins de 60 ans (34%) et 9 patients avaient moins de 70 ans (28%) (Figure 21). Figure 21 : La répartition selon l’âge 0 2 4 6 8 10 0--9 10--19 30--39 40--49 50--59 60--69 Répartition selon l'âge Nombre des patients 69% 31% Répartition selon le sexe Femme Homme
  50. 50. RESULTATS 39 4. Répartition selon l’âge et le sexe : L’âge moyen des femmes était de 45 ans avec des extrêmes allant de 7 à 68. Pour les hommes, il était de 51 ans avec des extrêmes allant de 6 à 68 ans. 5. Le tabagisme : La notion de tabagisme a été mentionnée dans 2 cas de sexe masculin (soit 8%) (Figure 22). Figure 22 : Le tabagisme 6. Expositions professionnelles : Une exposition professionnelle a été rapportée dans 4 cas. Il s’agissait d’une exposition aux volailles chez une femme, à la silice chez un homme, à la poussière de laine chez une femme et au ciment chez un homme. 7. Les antécédents : 7.1. Les antécédents respiratoires : Des antécédents respiratoires étaient notés chez 8 malades. Il s’agissait de:  Un asthme (2 cas).  Une miliaire fébrile (1 cas).  Une sclérodermie avec localisation pulmonaire (1 cas).  Une pneumopathie d’hypersensibilité traitée (1 cas).  Une sarcoïdose traitée (3 cas). 0 50 100 Tabagiques Non tabagiques Tabagisme 8% 92%
  51. 51. RESULTATS 40 Figure 23 : Les antécédents respiratoires des patients 7.2. Les antécédents extra-respiratoires : Quatre patients ont présenté des antécédents extra respiratoires. Il s’agissait d’ :  Une sinusite (1 cas).  Une xérophtalmie avec polyarthralgie (1 cas).  Une hypertension artérielle associée à un diabète (1 cas).  Une coronoropathie (1 cas). 8. Les signes cliniques : La toux représentait le symptôme le plus fréquent dans notre série et a été rapportée dans 66% des cas. Quarante pourcent des patients ont présenté une dyspnée d’effort. La toux et la dyspnée d’effort étaient associées dans 4 cas. Les autres signes étaient représentés par les expectorations (2 cas), les douleurs thoraciques (1 cas) et la fièvre (2 cas) (Tableau 12). Signes cliniques Nombre des cas Pourcentage (%) Toux 10 66 Dyspnée d’effort 6 40 Douleurs thoraciques 1 6 Expectorations 2 13 Fièvre 2 13 Tableau 12 : Les signes cliniques des patients 75% 7% 3% 3% 3% 9% Les antécédents respiratoires Pas d'antécédents respiratoires Asthme Miliaire fébrile Sclérodermie (pulmonaire) PHS sarcoidose
  52. 52. RESULTATS 41 9. Les aspects radiologiques : La radiographie du thorax a été faite dans 18% des cas. Les anomalies observées étaient :  Des opacités médiastinales bilatérales (1cas).  Une condensation (1 cas).  Un syndrome interstitiel (2 cas).  Des infiltrations nodulaires et micronodulaires du champ pulmonaire gauche (1 cas). La tomodensitométrie thoracique en coupes fines a été réalisée dans 43% des cas et a montré :  Des adénopathies médiastinales (7 cas), parfois associées à des pseudonodules bilatéraux (1cas) et des nodules ou des micronodules (5 cas).  Une condensation alvéolaire entourée par des plages d’hyperdensité en verre dépoli réalisant un signe de Halo (1 cas).  Un épaississement des septa (1 cas).  Un aspect de PHS persistante avec probable majoration d’une bronchiolite constructive (1 cas). 10.Diagnostics radios-cliniques suspectés : Les données radio-cliniques avaient permis de suspecter les diagnostics de :  Sarcoïdose (9 cas).  PID sans préciser l’étiologie (3 cas).  PHS (2 cas).  Pneumoconiose (2 cas).  BOOP (1 cas) (Tableau 13). Diagnostic suspecté Nombre des cas Pourcentages (%) Sarcoïdose 9 53 PID 3 17 PHS 2 12 Pneumoconiose 2 12 BOOP 1 6 Tableau 13 : Diagnostic radio-clinique suspecté des patients Les caractéristiques cliniques de nos patients sont récapitulées dans le tableau 14.
  53. 53. RESULTATS 42 Tableau 14 : Caractéristiques cliniques de nos patients, * : non mentionné LBA N° Age Sexe Exposition professionnelle Antécédents Signes cliniques Radiographie standard TDM-HR Fibroscopie Diagnostic radio-clinique suspecté 1 * /F * * Toux sèche Dyspnée d’effort Opacités médiastinales bilatérales * * Sarcoïdose 2 19/F * * * * * * * 3 54/F * Sans ATCDs * * ADP médiastinales Normale Sarcoïdose 4 68/F * * * * * Normale PID 5 */H * * Toux chronique Dyspnée * Pseudonodules pulmonaires bilatéraux avec ADP médiastinales évoquant une sarcoïdose. * Sarcoïdose 6 41/F Exposition aux volailles RAS * * * Normale PHS 7 */F * * Toux sèche chronique * * Muqueuse légèrement inflammatoire * 8 36/F * * Dyspnée * Condensations parenchymateuses * Sarcoïdose 9 67/H * Sinusite coronarien * * * Normale PID 10 */H * Sclérodermie avec localisation pulmonaire * * * * PID 11 61/F * PID Hypoxémie * * * PID
  54. 54. RESULTATS 43 LBA N° Age Sexe Exposition professionnelle Antécédents Signes cliniques Radiographie standard TDM-HR Fibroscopie Diagnostic radio-clinique suspecté 12 53/F * Xérophtalmie sous larmes artificielles Polyarthralgie non étiquetées Toux sèche Dyspnée PID Epaississement des septa * * 13 61/F * HTA Diabète Tous sèche Dyspnée Syndrome interstitiel Aspect des PID ADP médiastinales * * 14 7/F * * * * - * * 15 30/F * * Toux sèche * ADP médiastinales Normale * 16 52/H Silice * * * PID avec des nodules et des masses pulmonaires * Pneumoconiose Maladie de système 17 36/F * Asthme persistant légère * * Micronodules diffuses au niveau du CP Aspect inflammatoire de la muqueuse bronchique * 18 */H * * * * ADP médiastinales bilatérales Aspect de fibrose associé LBA+ Biopsie étagée Sarcoïdose 19 */H * * * * * Normale Sarcoïdose 20 17/F * Pneumopathie hypoximiante bilatérales Hypoxémie * Condensation alvéolaire entourée par des plages d’hypodensité en verre dépoli réalisant un signe de Halo * *
  55. 55. RESULTATS 44 LBA N° Age Sexe Exposition professionnelle Antécédents Signes cliniques Radiographie standard TDM-HR Fibroscopie Diagnostic radio-clinique suspecté 21 6/H * Asthme * * * * * 22 59/F * * * * Nodules du foie PID+ ADP médiastinales * Sarcoïdose 23 61/F * Sarcoïdose Dyspnée * Nodules sous pleuraux de LM et LID Aspect hétérogène micronodulaire du foie et de la rate * Sarcoïdose 24 */F * Miliaire fébrile Toux sèche Fièvre * * * * 25 42/F * Pneumopathies bilatérales Toux Expectoration * * Aspect inflammatoire prédominant à droite * 26 61/H Ancien ouvrier dans une usine de Ciment RAS Douleurs thoraciques gauche Syndrome interstitiel Quelques nodules calcifiés * Aspect inflammatoire Pneumoconiose 27 61/F * PHS Reprise de la symptomatolo gie * Aspect de PHS persistante avec probable majoration de la bronchiolite constructive Aspect inflammatoire de la muqueuse de LM/LID/LIG PHS 28 40/F * * * * * * *
  56. 56. RESULTATS 45 LBA N° Age Sexe Exposition professionnelle Antécédents Signes cliniques Radiographie standard TDM-HR Fibroscopie Diagnostic radio-clinique suspecté 29 68/H * * Toux sèche Expectoration blanchâtre Infiltration micronodulaire et nodulaire du CP gauche * * * 30 66/F Poussière laine * * Syndrome interstitiel * * BOOP 31 51/H * Sarcoïdose Toux sèche chronique * ADP médiastinales Nodules parenchymateuses Normale LBA au niveau du LM Sarcoïdose 32 */F * * * * * * *
  57. 57. RESULTATS 46 11.Résultats du lavage broncho-alvéolaire : 11.1. Aspect du liquide : Le liquide de LBA était :  Opalescent dans 23 cas (72 %).  Clair dans 5 cas (16%).  Rosé dans 4 cas (12%) (Figure 24). Figure 24 : Aspect du liquide de LBA 11.2. Volume total récupéré : Le volume total récupéré était dans la limite de la normale compris entre 27 et 163. Un seul cas avait un volume inférieur à 30 ml. 11.3. Vitalité cellulaire : La vitalité cellulaire a été évaluée à l’aide du bleu de Trypan chez les 32 patients avec une moyenne de 58 % et des extrêmes allant de 2 à 90 % pour une normale de 86%. 11.4. Numération cellulaire : La numération cellulaire était :  Normale dans 6 cas (19%).  Diminué dans 4 cas (12%).  Elevée dans 22 cas (69%) (Figure 25). 72% 16% 12% Aspect du LBA Opalesent Clair Rosé 12% 19% 69% Cellularité Hypocellulaie Normocellulaire Hypercellulaire Figure 25 : Cellularité du LBA
  58. 58. RESULTATS 47 11.5. Formule cellulaire : Une formule lymphocytaire était observée dans tous les cas avec une moyenne de 45% et des extrêmes allant de 18 à 78% (Figure 26). Figure 26 : Formule du LBA 11.6. Immunocytochimie sur étalements : - Les résultats étaient interprétables dans 28 cas (87,5%) et non concluants dans 4 cas (12,5%). - Une lymphocytose à CD4 était notée dans 20 cas (71,4%) et une lymphocytose à CD8 était observée dans 8 cas (28,6%). - La moyenne des lymphocytes T CD3 positifs était de 79% avec des extrêmes allant de 38 à 94 %, celle des lymphocytes T CD4 positifs était de 45% avec des extrêmes allant de 14 à 80% et celle des lymphocytes T CD8 positifs était de 39% avec des extrêmes allant de 19 à 78% (Figure 27). Figure 27 : Immunocytochimie sur étalements 0 10 20 30 40 50 Macrophages Lymphocytes PNN PNE 45 % 45 % 8 % 2 % Formule du LBA 0 20 40 60 80 LT CD3+ LT CD4+ LT CD8+ 79 % 45 % 39 % Immunocytochimie sur étalements
  59. 59. RESULTATS 48 - Le rapport CD4/CD8 était :  Inférieur à 1 dans 8 cas (28%).  Compris entre 1 et 1,6 dans 10 cas (36%).  Supérieur à 1,6 dans 10 cas (36%) (Tableau 15). Tableau 15 : Rapport CD4/CD8 évalué par Immunocytochimie sur étalements 11.7. Immunocytochimie sur cytoblocs : - L’immunocytochimie sur cytoblocs a été réalisée chez 17 patients (53,1%). Les résultats étaient interprétables dans 10 cas (58,8%) et non concluants dans 7 cas (41,2%). - Une lymphocytose à CD4 a été notée dans 4 cas (40%) et une lymphocytose à CD8 était observée dans 6 cas (60%). - La moyenne des lymphocytes T CD3 positifs était de 53% avec des extrêmes allant de 7 à 81%, celle des lymphocytes T CD4 positifs était de 38% avec des extrêmes allant de 11 à 63% et celle des lymphocytes T CD8 positifs était de 44% avec des extrêmes allant de 17 à 71% (Figure28). Figure 28 : Immunocytochimie sur cytoblocs - Le rapport CD4/CD8 était :  Inférieur à 1 dans 6 cas (60%).  Compris entre 1 et 1,6 dans 2 cas (20%).  Supérieur à 1,6 dans 2 cas (20%) (Tableau 16). CD4/CD8 <1 1<CD4/CD8>1,6 CD4/CD8>1,6 28% 36% 36% 0 10 20 30 40 50 60 LT CD3+ LT CD4+ LT CD8+ 53 % 38 % 44 % Immunocytochimie sur cytoblocs
  60. 60. RESULTATS 49 CD4/CD8 <1 1<CD4/CD8<1.6 CD4/CD8>1,6 60% 20 20% Tableau 16 : Rapport CD4/CD8 évalué par Immunocytochimie sur cytoblocs 11.8. Cytométrie en flux : - Les résultats étaient interprétables dans 24 cas (75%) et non concluants dans 8 cas (25%). - Une lymphocytose à CD4 a été détectée dans 17 cas (70,8%) et à CD8 dans 7 cas (29,2%). - La moyenne des lymphocytes T CD3 positifs était de 60% avec des extrêmes allant de 0 à 91%, celle des lymphocytes T CD4 positifs était de 38% avec des extrêmes allant de 0 à 80% et celle des lymphocytes T CD8 positifs était de 22% avec des extrêmes de 2.7% à 44% (Figure 29). Figure 29 : Cytométrie en flux - Le rapport CD4/CD8 était :  Inférieur à 1 dans 7 cas (29%).  Compris entre 1 et 1,6 dans 3 cas (12%).  Supérieur à 1,6 dans 14 cas (59%) (Tableau 17). CD4/CD8 <1,6 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8≥1,6 29% 12% 59% Tableau 17 : Rapport CD4/CD8 évalué par Cytométrie en flux 0 10 20 30 40 50 60 LT CD3+ LT CD4+ LT CD8+ 60 % 38 % 22 % Cytométrie en flux
  61. 61. RESULTATS 50 11.9. Comparaison des résultats en immunocytochimie sur étalements et en immunocytochimie sur cytoblocs : - Les deux techniques ont été réalisées simultanément dans 17 cas avec des résultats interprétables dans 8 cas (47%). - Le rapport CD4/CD8 était :  Inférieur à 1 dans les deux techniques dans 2 cas (25%%).  Compris entre 1 et 1,6 dans les deux techniques dans un cas (12.5%)  Supérieur à 1,6 dans les deux techniques dans un cas (12,5%).  Discordant dans 4 cas (Tableau 18). Immunocytochimie sur étalements Total CD4/CD8<1 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8>1,6 Immunocytochimie sur cytoblocs CD4/CD8<1 2 2 2 6 1<CD4/CD8<1,6 0 1 0 1 CD4/CD8>1,6 0 0 1 1 Total 2 3 3 8 Tableau 18 : Rapport CD4/CD8 évalué par les deux techniques : Immunocytochimie sur étalements et Immunocytochimie sur cytoblocs Selon ces résultats, 4 cas étaient concordants (50%) et 4 cas étaient discordants (50%). Le coefficient de concordance kappa est estimé à 0.7 cadrant avec une bonne reproductibilité entre les deux techniques. 11.10.Comparaison des résultats en immunocytochimie sur étalements et en cytométrie en flux : - Dans notre série d’étude, 23 cas avaient des résultats interprétables avec les deux techniques (71,8%) et étaient donc comparables. - Le rapport CD4/CD8 était :  Inférieur à 1 dans les deux techniques dans 5 cas (21%).  Compris entre 1 et 1,6 dans les deux techniques dans 7 cas (30%)  Supérieur à 1,6 dans les deux techniques dans 2 cas (9%).  Discordants dans 9 cas (40%) (Tableau 19).
  62. 62. RESULTATS 51 Immunocytochimie sur étalements Total CD4/CD8<1 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8>1,6 Cytométrie en flux CD4/CD8<1 5 1 0 6 1<CD4/CD8<1,6 0 2 1 3 CD4/CD8>1,6 2 5 7 14 Total 7 8 8 23 Tableau 19 : Rapport CD4/CD8 évalué par les deux techniques : Immunocytochimie sur étalements et Cytométrie en flux Selon ces résultats, 14 cas étaient concordants (61%) et 9 cas étaient discordants (39%). Le coefficient de concordance kappa est estimé à 0.34 cadrant avec une reproductibilité médiocre. 11.11.Comparaison des résultats en immunocytochimie sur cytoblocs et en cytométrie en flux : - Les deux techniques ont été réalisées dans 17 cas et 5 cas uniquement avaient des résultats interprétables dans les deux techniques (29%). - Le rapport CD4/CD8 était :  Inférieur à 1 dans les deux techniques dans 2 cas (40%).  Supérieur à 1,6 dans les deux techniques dans 1 cas (20%).  Discordants dans 2 cas (Tableau 20). Immunocytochimie sur cytoblocs Total CD4/CD8<1 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8>1,6 Cytométrie en flux CD4/CD8<1 2 0 0 2 1<CD4/CD8<1,6 1 0 0 1 CD4/CD8>1,6 1 0 1 2 Total 4 0 1 5 Tableau 20 : Rapport CD4/CD8 évalué par les deux techniques : Immunocytochimie sur cytoblocs et Cytométrie en flux Le coefficient de concordance kappa est estimé à 0.3 cadrant avec une reproductibilité médiocre. Les résultats du LBA de notre étude sont récapitulés dans le tableau 21.
  63. 63. RESULTATS 52 Tableau 21: les résultats du LBA : * non exécuté ;- : Non concluant LBA N° Formule Immunocytochimie sur étalements Immunocytochimie sur cytoblocs Cytométrie en flux M (%) L (%) PNN (%) PNE (%) CD3 (%) CD4 (%) CD8 (%) CD4/CD8 CD3 (%) CD4 (%) CD8 (%) CD4/CD8 CD3 (%) CD4 (%) CD8 (%) CD4/CD8 1 33 66 1 0 * 31 46 0,7 81,5 36,5 67,5 0,5 82,2 19 43,7 0,4 2 57 24 18 1 * 57 33 1,7 32 40,5 17 2,4 39,6 36,8 12,6 2,9 3 55 30 15 0 * 40,5 37 1,1 * 43,5 30,5 1,4 - - - - 4 65 23 8 4 * 31 39,5 0,8 77 32 71 0,5 - - - - 5 55 39 6 0 - - - - 52,5 35,5 31 1,1 - - - - 6 17 78 3 2 60,5 55,5 33,5 1,7 - - - - 83,7 57,2 32,9 1,7 7 30 56 14 1 90 56,5 33,5 1,7 - - - - 68,7 62,4 16,4 3,8 8 57 40 3 0 - - - - - - - - - - - - 9 72 18 7 3 - - - - - - - - 21 8,7 11,5 0,8 10 58 24 18 0 - - - - 38 63 29 2,2 - - - - 11 47 28 24 1 63 35,5 30,5 1,2 - - - - 34,2 20 15,3 1,3 12 62 36 2 0 51,5 54,5 36,5 1,5 61 43.5 45.5 0.79 36,3 14 22,8 0,6 13 48 49 3 0 91 68,5 33,5 2,0 64 47 51 0.92 5,3 47,7 30,5 1,6 14 25 40 32 3 80,5 21 59 0,4 * * * * 58,7 37,2 13,7 2,7
  64. 64. RESULTATS 53 LBA N° Formule Immunocytochimie sur étalements Immunocytochimie sur cytoblocs Cytométrie en flux M (%) L (%) PNN (%) PNE (%) CD3 (%) CD4 (%) CD8 (%) CD4/CD8 CD3 (%) CD4 (%) CD8 (%) CD4/CD8 CD3 (%) CD4 (%) CD8 (%) CD4/CD8 15 60 38 2 0 90 44 36 1,2 * * * * 70,8 49,8 27,8 1,8 16 61 32 7 0 87 57 41,7 1,4 * * * * 81,7 61,2 21,8 2,8 17 74 23 3 0 84 47,5 40 1,2 * * * * 43 30,7 16 1,9 18 17 71 8 4 90 32 62 0,5 * * * * 79,2 36,3 41,6 0,9 19 64 33 2 1 74 46 34,5 1,3 * * * * 59,4 48,8 11 4,4 20 31 39 28 2 85 62 30 2,1 * * * * 75,6 70,6 2,7 26,1 21 41 49 1 9 38 14 33 0,4 * * * * 75,6 40,8 17,5 2,3 22 52 45 1 2 90 80 19 4,2 * * * * 89,9 80,3 11,4 7,0 23 68 24 8 0 77 46 32 1,4 64 27 41 0.65 - - - - 24 26 74 0 0 92 63,5 29 2,2 * * * * - - - - 25 18 76 0 6 44,5 20 52 0,4 - - - - 46,2 1,4 39,8 0,0 26 70 29 1 0 76 41 40 1,0 * * * * 23 12 9 1,3 27 13 67 15 5 94 69 34 2,0 * * * * - - - - 28 38 54 3 5 93 17 78 0,2 - - - - 64,2 13,6 43,6 0,3 29 58 33 8 1 71,5 34 30 1,1 * * * * 60,3 40,5 17,1 2,4 30 21 69 1 0 83 26 68 0,4 * * * * 82,5 36,2 39,4 0,9
  65. 65. RESULTATS 54 LBA N° Formule Immunocytochimie sur étalements Immunocytochimie sur cytoblocs Cytométrie en flux M (%) L (%) PNN (%) PNE (%) CD3 (%) CD4 (%) CD8 (%) CD4/CD8 CD3 (%) CD4 (%) CD8 (%) CD4/CD8 CD3 (%) CD4 (%) CD8 (%) CD4/CD8 31 34 63 3 0 91,5 69 26,5 2,6 7 11 45 0.24 62,1 50,4 11,3 4,5 32 36 60 4 0 89,5 54,5 28,5 1,9 * * * * 91,5 70,9 19,4 3,7
  66. 66. FIGURES 55 Colorations utilisées sur étalements Coloration Papanicolaou Coloration MGG Macrophages Lymphocytes Macrophages Lymphocytes
  67. 67. FIGURES 56 Immunocytochimie sur étalements Marquage membranaire des lymphocytes par l’anticorps anti CD3 Marquage membranaire des lymphocytes par l’anticorps anti CD4 Lymphocyte TCD3+ Lymphocyte TCD3- Lymphocyte TCD4- Lymphocyte TCD4+
  68. 68. FIGURES 57 Marquage membranaire des lymphocytes par l’anticorps anti CD8 Lymphocyte TCD8- Lymphocyte TCD8+
  69. 69. FIGURES 58 Immunocytochimie sur cytoblocs Marquage membranaire des lymphocytes par l’anticorps anti CD4 Marquage membranaire des lymphocytes par l’anticorps anti CD8 Lymphocyte TCD4- Lymphocyte TCD4+ Lymphocyte TCD8- Lymphocyte TCD8+
  70. 70. FIGURES 59 Cytométrie en flux Analyse lymphocytaire par cytométrie ne flux a) Distribution des lymphocytes selon leur taille et leur granularité relatives ; b) Sélection des sous populations lymphocytaires CD4+ou CD8+ ; c) Sélection des sous populations lymphocytaires CD3+CD8+ ; d) Sélection des sous populations lymphocytaires CD3+CD4+
  71. 71. FIGURES 60 Profils lymphocytaires observés Deux populations lymphocytaires CD4+ observées en cytométrie en flux
  72. 72. FIGURES 61 Quelques phénotypes rares observés dans l’analyse lymphocytaire par cytométrie en flux
  73. 73. DISCUSSION 62 DISCUSSION Les PID posent de réels problèmes diagnostiques vu l’absence de consensus quant à leur diagnostic et prise en charge. La nouvelle classification établie par l’ATS et l’ERS a mis l’accent sur la nécessité d’une collaboration multi-disciplinaire impliquant les cliniciens, les radiologues, les pathologistes et les biologistes (17). Les progrès dans le domaine de l’imagerie ont révolutionné l’approche diagnostique des PID. Selon certaines équipes (16, 34, 35), les données scannographiques permettent d’établir un diagnostic dans 60 à 80% des cas. Cependant, la place du LBA demeure importante selon les nouvelles recommandations de l’ATS et l’ERS, surtout dans les cas où l’imagerie parait peu concluante (4). Selon ces recommandations, 3 impératifs sont cités : Le site d’injection du liquide de LBA doit être choisi selon les données scannographiques récentes au lieu de choisir un site traditionnel (lobe moyen droit ou lingula) souvent peu informatif, le comptage cellulaire doit concerner toutes les populations cellulaires (les macrophages, les lymphocytes, les PNN et les PNE) et l’analyse des sous populations lymphocytaires dans le liquide du LBA ne peut être réalisée que si une alvéolite lymphocytaire est objectivée. Les alvéolites lymphocytaires sont définies par un afflux de lymphocytes dans les espaces aériens. Elles sont observées dans des PID de cause connue mais représentant des entités bien déterminées (pneumopathies infectieuses, PHS, pneumoconioses…), les PID de cause inconnue (la sarcoïdose…) et les PID idiopathiques (UIP, PINS, PHS, DIP…). L’identification d’un profil lymphocytaire dans le LBA peut donc orienter vers de nombreuses étiologies. Par ailleurs, le rapport CD4/CD8 est important et permet d’orienter le diagnostic vers une alvéolite à CD8 observée dans les pneumopathies infectieuses ou d’hypersensibilité (33) ou une alvéolite à CD4 observée dans la sarcoïdose. Le phénotypage lymphocytaire est donc une étape cruciale dans l’établissement du diagnostic. Deux techniques peuvent être utilisées : l’immunocytochimie ou la cytométrie en flux. La concordance entre ces deux techniques a fait l’objet de nombreuses publications avec des résultats variables. Pour la réalisation de ces deux techniques, un matériel de très bonne qualité avec une préservation cellulaire optimale sont indispensables. L’acheminement du LBA doit être fait 1 heure au maximum après le prélèvement du liquide et l’analyse cytologique doit être pratiquée le jour même. Pour la cytométrie en flux, la fixation des
  74. 74. DISCUSSION 63 cellules par le paraformaldéhyde doit être faite au maximum 24 heures après la réception des écouvillons contenant le liquide et le marquage immuno-cytochimique doit être pratiqué le jour suivant la réception du LBA (les lames doivent être séchées à l’air pendant au moins 3 à 4 heures avant le marquage). L’immunocytochimie dans notre étude est une technique immuno-enzymatique utilisant un procédé indirect peroxydase polymère avec une révélation par le chromogène DAB (couleur brunâtre). Cette technique a l'avantage de nécessiter peu de matériel et permet le blocage des peroxydases endogènes ainsi que l’étape de démasquage antigénique pour les coupes incluses en paraffine afin de réduire le signal non spécifique et d’augmenter le nombre d’épitopes antigéniques à la surface des cellules. La cytométrie qui requiert plus de matériel, permet une simplification de l'immunophénotypage des lymphocytes alvéolaires tout en augmentant la fiabilité des résultats. En effet, un fenêtrage sur la région lymphocytaire ainsi que l'étude des populations lymphocytaires doublement marquées par le CD3 et le CD4 permettent d'éliminer l'analyse des macrophages porteurs du récepteur CD4 et auto-fluorescents. Les limites techniques de l’immunocytochimie sur étalements : Dans notre série de 32 cas, les résultats étaient non interprétables dans 4 cas. Ce fait pourrait être expliqué par des problèmes d’acheminement et de conservation du liquide de lavage qui sont tributaires des services cliniques. D’autre part, l’étalement frais de liquide du LBA même après un séchage minimum de 3-4 heures n’est pas suffisant pour la fixation des cellules ce qui induit un marquage faible ou non concluant. Ce problème était à l’origine de 4 cas non concluants dans notre étude. Les limites techniques de l’immunocytochimie sur cytoblocs : Cette technique a été possible dans 17 cas. Les autres cas n’ont pas pu être étudiés vu l’absence du culot lors de l’inclusion en paraffine. Les résultats étaient non interprétables dans 7 cas. Ceci peut être lié à une fixation insuffisante des lames, un mauvais séchage ou à un démasquage insuffisant secondaire à un tampon de pH inapproprié. Le temps de fixation optimal doit être de moins de 6 heures (57) afin d’éviter la sur-fixation qui peut entrainer la dénaturation de certains antigènes et donc la diminution ou l’absence de marquage. D’autre part, le séchage des lames est une étape très importante pour l’adhésion des bandes de paraffine et il faut un temps de séchage d’au moins 12 heures à 37° C. Par ailleurs, L’anticorps anti-CD4 (de Leica Biosystems) est adapté à un tampon citrate de pH égal à 8,
  75. 75. DISCUSSION 64 alors que le tampon citrate utilisé dans notre travail est de pH égal à 6. Ceci pourrait donc être à l’origine de l’absence de marquage (dans les 7 cas non interprétables). Les limites techniques de la cytométrie en flux : Les données de la cytométrie en flux étaient non interprétables dans 8 cas. Ces résultats non interprétables peuvent être expliqués par l’hypo-cellularité des culots ou une faible viabilité. En effet, la cytométrie en flux nécessite une suspension hyper-cellulaire pour avoir un nuage des cellules représentatif et concluant. Selon Wenxin Ma et al, la cytométrie en flux ne peut pas distinguer les lymphocytes des autres cellules par le ‘Light Scattering’ quand le liquide est hypo-cellulaire. La cellularité nécessaire pour avoir une bonne acquisition est de l’ordre de centaines des milliers au minimum. Parmi les 8 cas non interprétables, 4 cas étaient hypo- cellulaires. D’autre part, la vitalité cellulaire est un élément crucial lors de l’immunophénotypage en cytométrie en flux. Dans notre série, elle était inférieure à la normale (environ 86%) dans 4 cas. Reproductibilité du profil des alvéolites lymphocytaires en immunocytochimie et en cytométrie en flux : Selon nos résultats, une bonne reproductibilité a été objectivée entre l’immunocytochimie sur étalements et sur cytoblocs dans l’analyse des sous-populations lymphocytaires CD3+, CD4+ et CD8+ (ƙ=0,7). Ces deux techniques sont pratiquées dans le même laboratoire avec les mêmes conditions d’acheminements et de conservation. Ceci peut expliquer les résultats observés. En revanche, la corrélation entre l’immunocytochimie (sur étalement et sur cytoblocs) et la cytométrie en flux était médiocre (ƙ=0,3). Ces résultats sont comparables à ceux rapportés par plusieurs auteurs. En effet, selon Thomas M, et al (58), le comptage lymphocytaire par immunocytochimie est fait sur un nombre bien limité de cellules (maximum de 400 éléments). Par ailleurs, la fiabilité des résultats dépend fortement de l’expérience de l’observateur. Ainsi, un signal non spécifique détecté sur les PNN peut donner lieu à une fausse interprétation. Selon Diederichsen AC et al, (59) et Pérez-Arellano JL et al, (60), la cytométrie en flux est plus apte à détecter des épitopes faiblement présents dans les cellules. L’immunocytochimie paraît donc avoir un grand intérêt dans la mise en évidence d’antigènes fortement exprimés au niveau cellulaire. Thalheim L et al, (61), ont rapporté que la cytométrie en flux était plus performante que l’immunocytochimie dans l’évaluation des populations lymphocytaires dans le liquide du LBA. Pour Wenxin Ma et al (62), la cytométrie

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