Comparaison des Profils des Alvéolites Lymphocytaires en
Immunocytochimie et en Cytométrie en Flux dans le Lavage
Bronchio...
Plan
Introduction : les pneumopathies interstitielles diffuses
Objectif
Patients et méthodes
Résultats et discussion
Concl...
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Définition des PID
• Groupe hétérogène de pathologies
pulmonaires diffuse...
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Pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Pneumopathies interstitielles idiopathiques
NSIP
COP RB-ILD LIPUIP
AIP DIP
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Pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Pneumopathies interstitielles idiopathiques
ATS/ERS consensus ERS 2012
Les ...
Épidémiologie:
• En Tunisie:
2000-2005 : 1707  7.2% des motifs d’hospitalisation.
Âge moyen = 51 ans.
Sex-ratio = 0,51.
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Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Physiopathologies des
PID
• Mécanismes méconnus:
• Origine infectieuse
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Démarche diagnostique:
• Processus dynamique résultant
d’une concertation multi-disciplinaire
• Peut prendre du temps
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Démarche diagnostique:
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Endoscopie bronchique et Lavage Broncho-
Alvéolaire
Imagerie médicale
Radiographie standard du th...
Démarche diagnostique: Interrogatoire et ATCD
• L’interrogatoire joue un rôle clé:
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• Bilan immunologique:
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Démarche diagnostique: Examen Clinique, Bilan biologique et
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Imagerie médicale
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Outil diagnostique peu invasif d’exploration du
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• Détection :
Des cellules (inflammatoire, néoplasiques …)
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Réalisation et interprétation du LBA:
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Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
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Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
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• Détection in situ d’un antigène à l’aide d’anticorp...
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Systèmes d’amplification:
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Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Apport de l’immunocytochimie :
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Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Cytométrie en Flux
Analyse qualitative et quantitative de
multiples pa...
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Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Cytométrie en Flux
Champ d’application très large
Hématologie
Cancérol...
Comparaison du profil en immunocytochimie et en
Cytométrie en flux des alvéolites lymphocytaires dans
le lavage bronchiolo...
32 cas d’alvéolites lymphocytaires
Sex-ratio (H/F) = 0,44
Âge moyen = 46,5 [6-68]
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Les antécédents
respiratoires
Les antécédents respiratoires
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Patie...
Étude statistique
Marquage par
Cytométrie en flux
Marquage
immunocytochimique
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Analyse cytologique
du LBA
Patients et mé...
28
Richesse cellulaire Cellule de Malassez
Cellularité normale: 150-300 000 cellule/ml
Vitalité cellulaire
Bleu de Trypan
...
29
Cytocentrifugation
et préparation des
lames
Cytochambres maintenues contre des lames Super Frost par des cytoclips méta...
30
Coloration Trois colorations standards: MGG – Perls - Papanicolaou
MGG
Papanicolaou
Perls
31
Inclusion du culot
dans de la paraffine
Centrifugation 1500 tours/min ( 3 min)
Fixation AFA ( 3 heures)
Cassette à incl...
32
Marquage
immunocytochimique
Marquage sur des étalements cytologiques frais
Marquage sur des coupes incluses en paraffin...
33
Méthodes : Protocole de marquage immunocytochimique
Étapes particulières aux coupes incluses en paraffine ( Cytoblocs)
...
34
Blocage des peroxydases
endogènes
Incubation avec le H2O2à 3%
10 minutes
Lavage avec TBS
Trois bacs de 5 minutes chacun...
35
Méthodes : Protocole de marquage par Cytométrie en flux
Centrifugation
1200 tours/min
10 minutes
100-200 µl de PBS au c...
69%
12%
19%
Hype-rcelluleire Normo-cellulaire Hypo-cellulaire
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Opalesent Clair Rosé
Cellularité
Résultats et Di...
Macrophages Lymphocytes PNN PNE
45% 45%
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Macrophages Lymphocytes PNN PNE
Lymphocytaire: moyenne 45% [18-78]
Résultats...
Concluants Non concluants
87,5%
12,5%
Concluants Non concluants
Problèmes d’acheminements et de
conservation ?
Problèmes d...
Concluants Non concluants
58,8%
41,2%
Concluants Non concluants
Réalisée chez 17 patients (53,1%)
Autres cas  Absence du ...
Concluantes Non concluantes
75%
25%
Concluantes Non concluantes
Hypo-cellularité du liquide?
Faible vitalité?
Résultats et...
Comparaison entre Immunocytochimie sur étalements et en Immunocytochimie
sur cytoblocs
4 cas discordants sur 8 cas
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Immu...
Comparaison entre Immunocytochimie sur étalements et en
Cytométrie en flux
9 cas discordants sur 23 cas
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Immunocytochimi...
Comparaison entre Immunocytochimie sur cytoblocs et en Cytométrie
en flux
2 cas discordants sur 5 cas
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Immunocytochimie ...
• Mauvaise reproductibilité entre Immunocytochimie et Cytométrie en flux:
• Comparables à plusieurs études:
Comptage lymp...
Selon d’autres études
l’immunocytochimie énumère plus
de cellules que l’analyse par
cytométrie en flux même si le LBA est
...
un opérateur expérimenté
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Conclusions
• Deux techniques comparées non réalisées dans les
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Comparaison des Profils des Alvéolites
Lymphocytaires en Immunocytochimie et en
Cytométrie en Flux dans le Lavage Broncho-
Alvéolaire

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  • Madame la présidente,
    Mesdames et messieurs, les membres du Jury,
    Je tiens pour commencer à vous adresser mes sincères remerciements pour votre lecture, votre présence aujourd’hui et les remarques qui viendront enrichir ce travail que j’aurais plaisir à discuter avec vous.
    Et j’aimerais remercier aussi tous ceux qui m’ont fait l’amitié de venir aujourd’hui, chère famille et chers amis.
    Chers auditoires vous êtes les bienvenus.
    L’intitulé de notre projet est la comparaison des profils des alvéolites lymphocytaires en immunocytochimie et en Cytométrie en flux dans le lavage broncho-alvéolaire.
  • Au cours de cet exposé, on va introduire en premier lieu les pneumopathies interstitielles diffuses, ensuite, on va entamer l’objectif de notre travail tout en précisant les méthodes utilisées ainsi que l’échantillon étudiée. Par la suite, on va aborder les résultats et les discussions et on finit cette présentation par une conclusion.
  • Tout d’abord et afin d’appréhender ce sujet, il fallait mettre l’accent sur les PID qui représentent un groupe hétérogène de pathologie pulmonaire diffuses dont la caractéristique histologique est l’atteinte de l’Interstitium pulmonaire c’est-à-dire, les espaces entre les cellules alvéolaires et les membranes basales endothéliales par de l’inflammation et de la fibrose. Néanmoins, d’autres structures peuvent être affectées comme les lumières alvéolaires, les bronchioles, les vaisseaux.
  • Les PID sont ainsi classées en :
    PID de cause connue comme Collagénose, Pneumoconiose, PM
    Les PID de cause inconnue mais représentant des entités bien déterminées, également les granulomatoses tels que la sarcoïdose, l’alvéolite allergique, l’Histiocytose.
    Et d’autre part les PID idiopathiques qui font l’objet d’une classification multidisciplinaire par les sociétés américaine thoracique et européenne respiratoires en 2002 et ont regroupé 7 entités la plus fréquente est la fibrose pulmonaire idiopathique (UIP).
  • Par ailleurs, une révision de la classification de 2002 a été proposée en 2012 par l’ATS et l’ERS. Les PID idiopathiques ont désormais ainsi classé en PID idiopathiques majeures, rares et inclassables.
  • La prévalence des PID est estimé à 67-81/100 000 avec un incidence autour de 26-32/100 000/an et l’âge moyen est compris entre 51 et 69 ans.
    En Tunisie, on ne dispose pas réellement des registres épidémiologiques sur les PID. En outre, une étude a été menée dans la plupart des services de pneumologie de la capitale de 2000 à 2005 et a raporté que les PID représentent 7.2% des motifs d’hospitalisation avec un âge moyen de 50.9 ans et un sex-ratio de 0.51.
    Selon cette étude, les cas symptomatiques non diagnostiqués sont dix fois plus fréquents que les cas symptomatiques.
  • Ce qui s’avérait difficile concernant les PID est leurs mécanismes physiopathologiques qui demeurent méconnus.
    En effet plusieurs hypothèses pathogéniques ont été proposées et généralement, c’est la conséquence d’un processus inflammatoire impliquant des éléments structuraux pulmonaires.
    Certaines PID sont causées par des infections, mais la majorité est le résultat d’un mécanisme immunologique, environnemental ou toxique qui provoque des lésions de l’épithélium alvéolaire, et la présence d’une prédisposition génétique à une altération du processus de réparation incite à l’installation d’une pneumopathie interstitielle.
  • Malgré les différences notables concernant leurs étiologies et leur évolution, les PID partagent certains aspects cliniques, radiologiques, fonctionnels et histopathologiques rendant leur démarche diagnostique souvent laborieuse.
    En effet, c’est processus dynamique qui peut prendre du temps et qui peut être révisé à plusieurs stades. C’est le résultat d’une confrontation multidisciplinaire entre pneumologues, radiologues et pathologistes.
  • D’une manière générale, les étapes du démarche diagnostique des PID comprend en lieu l’interrogatoire et l’histoire du patient à la recherche d’une exposition professionnelle, des antécédents respiratoires et extra-respiratoires en faveur d’une connectivite et qui peuvent être observés et doivent prises en considération afin de mieux guider le diagnostic.
    En deuxième lieu, un examen clinique doit être réalisé avec une exploration respiratoire fonctionnelle qui objective un trouble ventilatoire obstructif et des examens biologiques sont demandés à la recherche par exemple d’un syndrome inflammatoire (CRP, VS, fibrinogène).
    L’étape qui suive est l’imagerie médicale qui comprend la radiographie standards du thorax qui donne une vision globale de l’atteinte parenchymateuse dans 90% des cas, et la TDM-HR en coupes fines qui est considérée comme l »examen de référence pour confirmer le diagnostic d’une PID. Elle permet une description détaillée des lésions élémentaires et de leur distribution topographiques.
    En dernier lieu, et selon les nouvelles recommandations de l’ATS et de l’ERS, devant toute PID confirmé radiologiquement, il est recommandé de continuer le diagnostic par un LBA au cours d’une endoscopie bronchique.
  • En effet, le LBA présente un Outil diagnostique peu invasif d’exploration du poumon profond. Les Informations qu’il fournit fiables sous couvert d’une technique rigoureuse tant au niveau de sa réalisation au cours de la Fibroscopie bronchique que dans son Analyse dans le laboratoire d’anatomie pathologique.
    Il convient tout d’abord de noter que le LBA permet une analyse de la cytologie alvéolaire normale.
    D’autre part il est important de corréler les données du LBA aux aspects radiologiques, il permet en effet d’accéder facilement à une analyse plus fine des processus pathologiques mis en cause.
  • A la lumière de ce critère, le LBA permet la Détection Des cellules (inflammatoire, néoplasiques …) ou Du matériel acellulaire anormal (lipoprotéines) ainsi que la Mise en évidence de nombreux agents pathogènes (Pneumocystis carinii …). C’est un outil très pratique pour le Suivi de l’évolution du processus pathologique ou pour Évaluer la réponse à un traitement.
    Donc, étant donné qu’il s’agit d’un Acte non invasif, rapide, peu onéreux, il est tout à fait justifié de l’Entreprendre devant tout signe de PID avant d’envisager d’autres moyens diagnostiques plus invasifs tels que Biopsie Trans-pariétale ou Trans-bronchique et la Biopsie chirurgicale qui représente beaucoup plus des complications …
  • En règle générale, le LBA est réalisé au cours d’une endoscopie bronchique où on instille un volume de 100 à 300 ml de sérum physiologique par des fractions. Cette technique ne présente pratiquement pas de contre-indication et les complications les plus fréquentes sont une aggravation de l’hypoxémie du au liquide résiduel du LBA dans les alvéoles et plus rarement un pneumothorax.
  • Par ailleurs l’analyse cytologique du LBA comprendra une description macroscopique et microscopique. Chez un sujet adulte, sain, non-fumeur, l’interprétation du LBA est comme suit : (tableau)
  • Pour conclure nos propos, nous tenons à souligner que le LBA possède une excellente valeur de certitude diagnostique pour Les pneumopathies infectieuses, Les hémorragies intra-alvéolaires par la coloration de PERLS, Les lipoprotéinoses alvéolaires, Les pneumopathies chroniques à éosinophiles et accessoirement Les tumeurs plus spécifiquement les adénocarcinomes.
    Et le plus souvent, il n’a qu’une valeur d’orientation diagnostique selon le profil cellulaire trouvé : Alvéolites à polynucléaires éosinophiles, à polynucléaires neutrophiles, macrophagiques et les Alvéolites lymphocytaires qui font l’objet de notre travail de recherche.
    Par ailleurs, il est recommandé de continuer l’analyse du LBA devant toute alvéolite lymphocytaire par un marquage CD3/CD4/CD8 soit en immunocytochimie soit en Cytométrie en flux.
  • Donc il convient tout d’abord de noter que l’immunocytochimie est une technique qui permet la détection in situ d’un antigène à l’aide d’un anticorps de reconnaissance spécifique.
    La visualisation du complexe immun doit être réalisée à l’aide d’un marqueur morphologique. Plusieurs méthodes sont possibles et la plus utilisée en anatomie pathologique est la mise en évidence d’une activité enzymatique, La plus communément utilisée est la peroxydase extraite de raifort (cruciféracée) car elle est disponible en grande quantité, peu couteuse, détectable par plusieurs chromogènes et couplée de façon stable à des protéines.
  • Il est intéressant donc de souligner que les peroxydases permettent la décomposition de l’eau oxygénée et cette activité peut être présente dans certains tissus biologiques et peut donc donner un signal non spécifique lors de la révélation du complexe immun. Il est nécessaire alors de l’inhiber par une incubation des étalements dans le H2O2 avant le marquage immunocytochimique.
    Revenons maintenant à la technique immuno-peroxydasique qui peut être soit directe où l’AC primaire est directement couplé à la peroxydase, soit indirecte où l’AC primaire est détecté par un second anticorps couplé à la peroxydase.
  • Et en vue d’augmenter la sensibilité des techniques immunocytochimiques, de nombreux systèmes de détection utilise cet enzyme couplées à des molécules amplificatrices apparaissent. Parmi ces systèmes d’amplification, on distingue le système d’amplification polymérique qui utilise des conjuguées polymériques HRP- anticorps de liaison. Les polymères sont composés d’un squelette de Dextran, molécule inerte sur lequel des anticorps secondaires et des marqueurs (les peroxydases) sont fixés
    Et par conséquent, plusieurs problèmes de marquage faible ou non spécifique ne se posent plus avec une amplification du signal d’où une augmentation de la sensibilité du technique immunocytochimique.
  • A la lumière de ce critère, l’immunocytochimie présente alors un grand apport pour le diagnostic dans des différents domaines tels qu’en oncologie, en pneumologie et plus particulièrement dans le diagnostic de certains PID soit pour confirmer un diagnostic suggéré per exemple le marquage anti CD1a en cas de suspicion d’une Histiocytose X, soit pour aider à orienter le diagnostic devant un profil cellulaire lymphocytaire par un marquage anti CD3/CD4/CD8.
  • La deuxième technique utilisée dans notre étude est la Cytométrie en flux qui représente une technologie permettant la mesure et l’analyse, qualitative et quantitative, de multiples paramètres à l’échelon cellulaire dans une population hétérogène en suspension dans un liquide. Elle consiste à analyser les signaux optiques ou physiques émis par une particule coupant le faisceau lumineux d’un laser
    En ce concerne leur Principe, la Cytométrie en flux est composée de 3 systèmes liés entre eux :
    le système fluidique : introduit et positionne les cellules à analyser,
    le système optique : les lasers comme source de lumière et les filtres optiques qui séparent la lumière émise par la cellule et la dirigent vers les détecteurs
    le système électronique : convertir les signaux optiques en signaux électroniques analysables par l’ordinateur
  • Donc d’une façon plus générale, cette technologie entame un champ d’application très larges dans des disciplines très variés telles que l’hématologie, la cancérologie et la génétique. Elle est de plus en plus utilisée dans le diagnostic et le suivi clinique de nombreuses pathologies comme le typage des leucémies suivi du sida ou des traitements immunosuppresseurs et plus particulièrement dans l’immunophénotypage des alvéolites lymphocytaires.
  • Ces points nous amène à l’objectif de notre travail qui est la Comparaison du profil en immunocytochimie et en Cytométrie en flux des alvéolites lymphocytaires dans le lavage broncho-alvéolaire.
  • Pour ce faire, on colligé 32 cas d’alvéolites lymphocytaires renfermant 22 femmes et 10 hommes avec un sex-ratio de l’ordre de 0.44 et un âge moyen de 46.5 ans et on a rapporté seulement 2 cas de sexe masculin tabagique
  • En général, on a rapporté que 75% de nos patients ne présentaient pas d’antécédents respiratoires et que le signe clinique le plus fréquent est la toux avec 66% ainsi que le diagnostic rx clinique le plus suspecté était la sarcoïdose avec 53%.
  • En ce qui concerne les méthodes, on a effectué en premier lieu une analyse cytologique du LBA suivie d’un marquage immunocytochimique et un immunophénotypage par Cytométrie en flux et on a calculé le coefficient de concordance kappa afin d’évaluer la reproductibilité des différents techniques.
  • En premier lieu, l’analyse cytologique du LBA comprend une étude macroscopique également l’aspect du liquide et le volume récupéré et une étude microscopique incluant :
    L’évaluation de la richesse ainsi que la vitalité cellulaire
  • suivie d’une centrifugation et préparation des lames
  • pour les trois colorations standards : le MGG pour évaluer la formule cellulaire, le Perls à la recherche d’une éventuelle hémorragie alvéolaire et le Papanicolaou à la recherche des cellules néoplasiques et on peut l’utiliser aussi pour évaluer la formule cellulaire.
  • L’étape qui suit est l’inclusion du culot dans de la paraffine et la préparation des Cytoblocs pour le marquage immunocytochimique
  • En deuxième lieu, la technique immunocytochimique renferme un marquage sur des Cytoblocs qui englobe des étapes particulières par rapport à la deuxième méthode qui utilise des étalements cytologiques frais.
  • En ce qui regarde les coupes sur Cytoblocs, un déparaffinage suivi d’un démasquage antigénique a été pratiqué avant d’attaquer les étapes de marquage immunocytochimiques.
    Dans le même ordre d’idée, les coupes sur Cytoblocs et les étalements frais ont été délimité par un crayon hydrophobe
  • par la suite elles ont subi les étapes suivantes :
    Une incubation avec le H2O2 pendant 10 minutes
    Un Marquage par les anticorps primaires anti CD3/CD4/CD8 pendant 1 heure
    Une incubation avec le post Primary block et le polymère peroxydase pendant 30 minutes chacun
    Après une révélation par le chromogène DAB a été effectué suivie d’une contre coloration et montage.
  • Ainsi, le protocole de marquage par Cytométrie en flux consiste à un marquage par des anticorps monoclonaux couplés à des fluorochromes ; CD8-FITC, CD4-PE et CD3-PerCP-Cy5.5 du liquide de LBA suivi d’une acquisition des données par un Cytométre BD FACSCANTO et une analyse des sous populations lymphocytaires trouvées.
  • On va attaquer par la suite la partie résultats et discussions
    Notre analyse cytologique du LBA a rapporté que :
    72% des cas ont un aspect opalescent du liquide du LBA avec un volume total récupéré entre 27 et 163 ml et une vitalité cellulaire de 58% ainsi qu’une Hypercellularité a été marquée dans 69% des cas.
  • Quant à la formule cellulaire, elle était lymphocytaire dans toute notre série d’étude avec une moyenne de 45%.
  • Le marquage immunocytochimique sur étalements était non concluant dans 12.5% des cas. Ce fait pourrait être expliqué par :
    Des problèmes d’acheminement et de conservation du liquide de lavage qui sont tributaires des services cliniques. D’autre part, l’étalement frais de liquide du LBA même après un séchage minimum de 3-4 heures n’est pas suffisant pour la fixation des cellules ce qui induit un marquage faible ou non concluant.
  • D’autre part, la technique immunocytochimique sur des Cytoblocs a été réalisée chez 17 patients en raison d’absence du culot lors de l’inclusion en paraffine pour le reste des cas, et elle était non concluante dans 41.2% des cas. Ceci pourrait être lié à  une fixation insuffisante des lames ou à un démasquage insuffisant secondaire à un tampon de pH inapproprié.
  • En ce qui concerne la Cytométrie en flux, elle était non concluante dans 25% des cas. Ces résultats non interprétables peuvent être expliqués par une faible viabilité cellulaire ou une hypo-Cellularité du liquide de LBA. Sur ce point, la Cytométrie en flux nécessite une suspension Hypercellulaire pour avoir un nuage des cellules représentatif et concluant.
  • Selon nos résultats, on a trouvé une bonne reproductibilité entre l’immunocytochimie sur étalement et sur Cytoblocs dans l’analyse des sous populations lymphocytaires CD3+, CD4+ et CD8+ avec un coefficient kappa de 0.7 , cette résultat peut être expliquée par le fait que ces deux techniques ont été pratiqué dans le même laboratoire avec les mêmes conditions d’acheminements et de conservations.
  • En revanche, la corrélation entre l’immunocytochimie (sur Cytoblocs et sur étalements) et la Cytométrie en flux était médiocre avec un coefficient kappa de 0.3, ces résultats sont comparables à ceux rapporté par plusieurs auteurs qui ont expliqué cette reproductibilité médiocre par le fait que l’analyse immunocytochimique est fait sur un nombre bien limité des cellules et que la fiabilité des résultats dépend éventuellement de l’expérience de l’observateur, d’autre part ils ont approuvé que la Cytométrie en flux est plus apte à détecter des épitopes faiblement présents dans les cellules, c’est pourquoi l’immunocytochimie parait avoir un grand intérêt dans la mise en évidence d’antigènes fortement exprimés au niveau cellulaire.
  • A l’opposé de ce qui précède, certains auteurs trouvent que l’immunocytochimie est plus sensible dans la numération cellulaire du LBA même avec une hypocellularité. Selon eux « La Cytométrie en flux ne peut être aussi sensible que l’œil humain avec un microscope dans la détection d’une cellule légèrement colorée ».
    Dans un autre ordre d’idées, certaines études ont rapporté une bonne reproductibilité entre ces deux techniques et pourtant ils ont préféré la Cytométrie en flux par rapport à l’immunocytochimie vue qu’elle nécessite beaucoup moins du temps.
  • Avant de conclure cette présentation, on va soulever les points qui nous apparaissent comme des limites de notre travail et qui s’exposent selon nous le plus à la critique. En effet, pour notre part la reproductibilité médiocre entre les deux techniques peuvent être expliqué par le fait que ces deux procédures ont étaient pratiqués dans deux laboratoires différentes avec des différents conditions d’acheminement et de conservation. D’autre part, la discordance des résultats dans certains cas peut être expliquée en corrélant ces résultats avec les données cliniques afin d’étudier la justesse des deux techniques ainsi que leur fiabilité.
  • Madame la présidente, mesdames et messieurs les membres de jury, je vous remercie de votre écoute attentive. Comme je tiens également à remercier les personnes présentes dans la salle pour leur participation. Je serai ravie de répondre à vos questions et à différentes suggestions que vous voudrez bien m’adresser.
  • Présentation mémoire Master de Recherche en Biologie Fonctionnelle Parcours: Physiologie Appliquée et Physiopathologies

    1. 1. Comparaison des Profils des Alvéolites Lymphocytaires en Immunocytochimie et en Cytométrie en Flux dans le Lavage Bronchiolo-Alvéolaire 1 FACULTE DES SCIENCES DE TUNIS DEPARTEMENT DE BIOLOGIE HÔPITALABDERRAHMEN MAMI DE L’ARIANA LABORATOIRE D’ANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUE INSTITUT PASTEUR DE TUNIS LABORATOIRE D’HÉMATOLOGIE RÉPUBLIQUE TUNISIENNE, MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE DE TUNIS EL MANAR Réalisé et présenté par: Rihem KASMI Soutenue devant: Président de Jury: Pr. MARRAKCHI Raja Examinateur : Pr. MEZNI Faouzi Encadreurs: Dr. MLIKA Mouna Dr. SAFRA Inès
    2. 2. Plan Introduction : les pneumopathies interstitielles diffuses Objectif Patients et méthodes Résultats et discussion Conclusions et perspectives 2
    3. 3. Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Définition des PID • Groupe hétérogène de pathologies pulmonaires diffuses. • Caractéristiques histologiques: Atteinte de l’interstitium pulmonaire Espaces entre les cellules alvéolaires et les membranes basales endothéliales par de l’inflammation et de la fibrose • Autres structures: les lumières alvéolaires les bronchioles les vaisseaux 3
    4. 4. 4 Pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Pneumopathies interstitielles idiopathiques NSIP COP RB-ILD LIPUIP AIP DIP ATS/ERS consensus ERS 2002 Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Cause connue Connectivite, médicament, exposition Cause inconnue, entités bien déterminées Granulomatose Sarcoïdose l’alvéolite allergique l’histiocytose X
    5. 5. 5 Pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Pneumopathies interstitielles idiopathiques ATS/ERS consensus ERS 2012 Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Formes particulières HPCL, LAM, lipoprotéinose alvéolaire, PCIE Granulomatose Sarcoïdose Cause connue Connectivite, médicament, exposition Pneumopathies interstitielles idiopathiques inclassables Pneumopathies interstitielles idiopathiques rares Pneumopathies interstitielles idiopathiques majeures
    6. 6. Épidémiologie: • En Tunisie: 2000-2005 : 1707  7.2% des motifs d’hospitalisation. Âge moyen = 51 ans. Sex-ratio = 0,51. 6 Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Prévalence 67-81/100 000 Incidence 26-32/100 000/an Âge moyen 51-69 ans Coultas et al. Am J Respir Crit Care Med 1994 Cas asymptomatiques non diagnostiqués Cas symptomatiques=10X Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
    7. 7. 7 Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Physiopathologies des PID • Mécanismes méconnus: • Origine infectieuse • Origine immunologique • Origine environnementale • Origine toxique. Facteurs génétiques Facteurs environnementales Poussières, fumées Agression Infections Tabagisme Radiation Facteurs immunologiques Autres maladies Lésions de l’épithélium alvéolaire Pneumopathie interstitielle Guérison Activation du processus de réparationPrédisposition génétique à une altération du processus de réparation 7
    8. 8. Démarche diagnostique: • Processus dynamique résultant d’une concertation multi-disciplinaire • Peut prendre du temps • Peut être révisé à tout moment lors du suivi 8 Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Démarche diagnostique Radiologues PathologistesPneumologues
    9. 9. Démarche diagnostique: 9 Endoscopie bronchique et Lavage Broncho- Alvéolaire Imagerie médicale Radiographie standard du thorax TDM-HR Examen clinique Explorations respiratoires Examens biologiques Interrogatoire Histoire du patient Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
    10. 10. Démarche diagnostique: Interrogatoire et ATCD • L’interrogatoire joue un rôle clé: • Recherche de signes d’orientation • Recherche d’une éventuelle exposition • Recherche d’ATCD à valeur dianostique Interrogatoire Histoire du patient 10
    11. 11. • Bilan immunologique: systématiquement en cas: Atteinte extra-respiratoire Une maladie systémique était suspectée Selon Cottin: recherche Anticorps anti-nucléaires Anticorps anti-peptides cycliques citrulinés Facteur rhumatoide. Recherche de précipitines justifiée si notion d’exposition à des antigènes organiques ou suspicion de PHS à l’interrogatoire • Examen clinique: • selon les dernières recommandations de la Société Française de Pneumologie, râles crépitants secs et bilatéraux reproduisant le bruit du « velcro » constants et précoces • Hippocratisme digital présent dans près de 50% des cas. Démarche diagnostique: Examen Clinique, Bilan biologique et explorations respiratoires Examen clinique Examens biologiques Explorations respiratoires Explorations respiratoires Gazométrie arterielle Hypocapnie au repos: plus fréquente et plus précoce. Test de marche de 6 minutes Selon Cottin, moyen fiable pour évaluer la fonction respiratoire au cours de l’exercice. Exploration fonctionnelle respiratoire Selon les recommandations de la Société Française de Pneumologie: il faut évaluer la CVF et la TLco chez tout patient présentant une PID au moment du diagnostic à la recherche d’un trouble ventilatoire restrictif et d’une diminution de la Tlco, souvent seules anomalies détectées lors du diagnostic précoce de PID. 11
    12. 12. Démarche diagnostique: Examen Clinique, Bilan biologique et explorations respiratoires Imagerie médicale Radiographie standard du thorax TDM-HR Radiographie du thorax Selon Brauner: 90%: diagnostic positif  Images pulmonaires anormales diffuses dont l’évolution est supérieure à 3 mois. 10% des cas infra-radiographiques: le diagnostic positif de PID repose sur la TDM + LBA + EFR. Diagnostic correct avec haute probabilité que dans 25% des cas Tomodensitométrie thoracique • Place importante à toutes les étapes de prise en charge. • Elle permet: • Diagnostic positif et étiologique des PID • Surveillance évolutive et pronostique. • Éviter le recours aux méthodes invasives de diagnostic de PID, telles que la biopsie, et d’éviter de ce fait le risque non négligeable de complications. • Certaines études ont mis en évidence un apport contributif de la TDM dans le choix du site de lavage en l’orientant vers les zones à priori les plus lésées. 12
    13. 13. Le lavage broncho-alvéolaire Outil diagnostique peu invasif d’exploration du poumon profond. Informations fiables sous couvert d’une technique rigoureuse: Endoscopie bronchique. Analyse dans le laboratoire d’anatomie pathologique. Analyse de la cytologie alvéolaire normale Corrélation avec les données radiologiques 13 Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Endoscopie bronchique et Lavage Bronchiolo-Alvéolaire
    14. 14. • Détection : Des cellules (inflammatoire, néoplasiques …) Du matériel acellulaire anormal (lipoprotéines) • Mise en évidence de nombreux agents pathogènes (Pneumocystis carinii …) • Suivi de l’évolution du processus pathologique • Évaluation la réponse à un traitement 14 Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Acte non invasif, rapide, peu onéreux Entreprendre devant tout signe de PID avant d’envisager d’autres moyens diagnostiques plus invasifs Biopsie Trans-pariétale ou Trans- bronchique Biopsie chirurgicale Le lavage broncho-alvéolaire
    15. 15. Réalisation et interprétation du LBA: 15 • Endoscopie bronchique • Instillation du liquide isotonique stérile par fraction (40-50 ml). Récupération du liquide dans des aliquots  LBA • Pas de contre-indication. • Complications: Douleurs thoraciques dues au liquide résiduel du LBA dans les alvéoles. Pneumothorax. Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Le lavage broncho-alvéolaire
    16. 16. 16 Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Analyse du LBA chez un sujet adulte, sain et non- fumeur
    17. 17. 17 Orientation diagnostique selon le profil cellulaire trouvéCertitude diagnostique Les pneumopathies infectieuses Les hémorragies intra-alvéolaires Les lipoprotéinoses alvéolaires Les pneumopathies chroniques à éosinophiles Les tumeurs Alvéolites à polynucléaires neutrophiles Alvéolites macrophagiques Alvéolites lymphocytaires Alvéolites à polynucléaires éosinophiles Immunocytochimie Cytométrie en flux Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Lavage Broncho-Alvéolaire
    18. 18. 18 Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Immunocytochimie • Détection in situ d’un antigène à l’aide d’anticorps spécifiques • Visualisation du complexe immun à l’aide d’un marqueur morphologique: • Plusieurs méthodes possibles Mise en évidence d’une activité enzymatique. la peroxydase extraite de raifort (cruciféracée)  disponible en grande quantité  peu couteuse  détectable par plusieurs chromogènes  couplée de façon stable à des protéines
    19. 19. 19 Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Peroxydase: Décomposition de l’H2O2 Présente de façon endogène dans certains tissus biologiques Signal non spécifique Technique immuno-peroxydasique Immunocytochimie
    20. 20. 20 Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Systèmes d’amplification: Système d’amplification polymérique: Conjugués polymériques-HRP anticorps de liaison Immunocytochimie
    21. 21. 21 Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Apport de l’immunocytochimie : Diagnostic en: Oncologie, Pneumopathies diagnostic des PID Immunocytochimie Confirmation d’un diagnostic suggéré CD1a  Histiocytose X Orientation du diagnostic devant un profil cellulaire lymphocytaire Marquage anti CD3/CD4/CD8
    22. 22. 22 Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Cytométrie en Flux Analyse qualitative et quantitative de multiples paramètres à l’échelon cellulaire dans une population hétérogène en suspension dans un liquide. Analyse des signaux optiques ou physiques émis par une particule coupant le faisceau lumineux d’un laser.
    23. 23. 23 Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) Cytométrie en Flux Champ d’application très large Hématologie Cancérologie Génétique Diagnostic et suivi clinique Typage des leucémies Suivi du SIDA Traitements immunosuppresseurs Immunophénotypage des alvéolites lymphocytaires
    24. 24. Comparaison du profil en immunocytochimie et en Cytométrie en flux des alvéolites lymphocytaires dans le lavage bronchiolo-alvéolaire. 24 Objectif
    25. 25. 32 cas d’alvéolites lymphocytaires Sex-ratio (H/F) = 0,44 Âge moyen = 46,5 [6-68] Tabagisme : 2 cas de sexe masculin 25 22 femmes 10 hommes Patients et méthodes Patients
    26. 26. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 7% 3% 3% 3% 9% 75% Les antécédents respiratoires Les antécédents respiratoires 26 Patients et méthodes 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 66% 40% 6% 13% 13% Signes cliniques Signes cliniques 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 53% 17% 12% 12% 6% Diagnostics radio- cliniques suspectés Diagnostics radio-cliniques suspectés Patients
    27. 27. Étude statistique Marquage par Cytométrie en flux Marquage immunocytochimique 27 Analyse cytologique du LBA Patients et méthodes Méthodes
    28. 28. 28 Richesse cellulaire Cellule de Malassez Cellularité normale: 150-300 000 cellule/ml Vitalité cellulaire Bleu de Trypan Vitalité cellulaire normale : ± 86%
    29. 29. 29 Cytocentrifugation et préparation des lames Cytochambres maintenues contre des lames Super Frost par des cytoclips métalliques Volume mis selon la richesse cellulaire Cytocentrifugeuse SHANDON CYTOSPIN4 Cytocentrifugation 650 tours/min ( 10 min)
    30. 30. 30 Coloration Trois colorations standards: MGG – Perls - Papanicolaou MGG Papanicolaou Perls
    31. 31. 31 Inclusion du culot dans de la paraffine Centrifugation 1500 tours/min ( 3 min) Fixation AFA ( 3 heures) Cassette à inclusion Enrobage en paraffine
    32. 32. 32 Marquage immunocytochimique Marquage sur des étalements cytologiques frais Marquage sur des coupes incluses en paraffines ( Cytoblocs) Marquage immunocytochimique sur des étalements frais ( Anticorps anti CD4) Marquage immunocytochimique sur des Cytoblocs ( Anticorps anti CD4)
    33. 33. 33 Méthodes : Protocole de marquage immunocytochimique Étapes particulières aux coupes incluses en paraffine ( Cytoblocs) Déparaffinage • 3 bains toluène ( 5 min chacun) • Réhydratation: 3 bains d’alcool 100°, 70°, 50° ( 5 min chacun) • Lavage à l’eau distillée Démasquage antigénique • Tampon citrate (pH=6)- Four à Micro-ondes – Deux cycles : 5’ - 90°/10’ - 97° • Rinçage à l’eau Rompre les liaisons moléculaires crées par le fixateur Accessibilité des sites antigéniques Délimitation des coupes – Crayon hydrophobe
    34. 34. 34 Blocage des peroxydases endogènes Incubation avec le H2O2à 3% 10 minutes Lavage avec TBS Trois bacs de 5 minutes chacun Incubation avec Post Primary Block 30 minutes Incubation avec Polymère Peroxydase (anticorps secondaire) 30 minutes Immunomarquage Anticorps primaires : anti CD3- CD4-CD8 Chambre humide Température ambiante 1 heure Révélation avec le Chromogène DAB  coloration brune Rinçage à l’eau Lavage avec TBS Trois bacs de 5 minutes chacun Lavage avec TBS Trois bacs de 5 minutes chacun Lavage avec TBS Trois bacs de 5 minutes chacun Contre coloration Hématéine de Mayer Montage Étapes communes aux étalements et aux coupes incluses en paraffine ( Cytoblocs) Méthodes : Protocole de marquage immunocytochimique
    35. 35. 35 Méthodes : Protocole de marquage par Cytométrie en flux Centrifugation 1200 tours/min 10 minutes 100-200 µl de PBS au culot CD8-FITC, CD4-PE et CD3-PerCP-Cy5.5 20 minutes +4° à l’abri de la lumière Lavage 2 ml PBS Centrifugation 1200 tours/min 10 minutes Fixation 300 µl de fixateur 1X ( 3g de para- formaldéhyde dans 100 ml de PBS 1X, dilué) Acquisition des données et analyse des échantillons Contrôle 100 µl LBA Contrôle Marquage Contrôle Marquage Marquage
    36. 36. 69% 12% 19% Hype-rcelluleire Normo-cellulaire Hypo-cellulaire 72% 16% 12% Opalesent Clair Rosé Cellularité Résultats et Discussions Résultats du LBA Aspect du LBA Opalescent Hypercellulaire Volume total récupéré Entre 27 et 163 ml Vitalité cellulaire 58% 36
    37. 37. Macrophages Lymphocytes PNN PNE 45% 45% 8% 2% Macrophages Lymphocytes PNN PNE Lymphocytaire: moyenne 45% [18-78] Résultats et Discussions Formule cellulaire 37
    38. 38. Concluants Non concluants 87,5% 12,5% Concluants Non concluants Problèmes d’acheminements et de conservation ? Problèmes de fixation ? Résultats et Discussions Immunocytochimie sur étalements 38
    39. 39. Concluants Non concluants 58,8% 41,2% Concluants Non concluants Réalisée chez 17 patients (53,1%) Autres cas  Absence du culot lors de l’inclusion en paraffine Fixation insuffisante des lames? Mauvais séchage? Démasquage insuffisant secondaire à Tampon de pH inapproprié? Résultats et Discussions Immunocytochimie sur cytoblocs 39
    40. 40. Concluantes Non concluantes 75% 25% Concluantes Non concluantes Hypo-cellularité du liquide? Faible vitalité? Résultats et Discussions Cytométrie en flux 40
    41. 41. Comparaison entre Immunocytochimie sur étalements et en Immunocytochimie sur cytoblocs 4 cas discordants sur 8 cas 41 Immunocytochimie sur étalements Total CD4/CD8<1 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8>1,6 Immunocytochimie sur cytoblocs CD4/CD8<1 2 2 2 6 1<CD4/CD8<1,6 0 1 0 1 CD4/CD8>1,6 0 0 1 1 Total 2 3 3 8 Coefficient de concordance kappa = 0,7 Bonne concordance entre les deux techniques Même Laboratoire Mêmes conditions d’acheminement et de conservation Résultats et Discussions
    42. 42. Comparaison entre Immunocytochimie sur étalements et en Cytométrie en flux 9 cas discordants sur 23 cas 42 Immunocytochimie sur étalements Total CD4/CD8<1 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8>1,6 Cytométrie en flux CD4/CD8<1 5 1 0 6 1<CD4/CD8<1,6 0 2 1 3 CD4/CD8>1,6 2 5 7 14 Total 7 8 8 23 Coefficient de concordance kappa = 0,34 Reproductibilité médiocre entre les deux techniques Résultats et Discussions
    43. 43. Comparaison entre Immunocytochimie sur cytoblocs et en Cytométrie en flux 2 cas discordants sur 5 cas 43 Immunocytochimie sur cytoblocs Total CD4/CD8<1 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8>1,6 Cytométrie en flux CD4/CD8<1 2 0 0 2 1<CD4/CD8<1,6 1 0 0 1 CD4/CD8>1,6 1 0 1 2 Total 4 0 1 5 Coefficient de concordance kappa = 0,3 Reproductibilité médiocre entre les deux techniques Résultats et Discussions
    44. 44. • Mauvaise reproductibilité entre Immunocytochimie et Cytométrie en flux: • Comparables à plusieurs études: Comptage lymphocytaire par immunocytochimie fait sur un nombre bien limité de cellules (maximum de 400 éléments). Fiabilité des résultats dépend fortement de l’expérience de l’observateur. Signal non spécifique détecté sur les PNN peut donner lieu à une fausse interprétation Cytométrie en flux plus apte à détecter des épitopes faiblement présents dans les cellules. 44 Résultats et Discussions
    45. 45. Selon d’autres études l’immunocytochimie énumère plus de cellules que l’analyse par cytométrie en flux même si le LBA est hypo-cellulaire. « La cytométrie en flux ne peut être aussi sensible que l’œil humain avec un microscope dans la détection d’une cellule légèrement colorée ». 45 Résultats et Discussions Autres études Bonne reproductibilité entre ces deux techniques. Pourtant, les auteurs ont préféré la cytométrie en flux par rapport à l’immunocytochimie vu qu’elle nécessite beaucoup moins de temps (4 heures pour l’immunocytochimie vs. 40 min pour la cytométrie en flux dans notre étude).
    46. 46. un opérateur expérimenté Conclusion et Perspectives Conclusions • Deux techniques comparées non réalisées dans les mêmes conditions expérimentales • Cas discordants non corrélés aux diagnostics cliniques retenus Perspectives • Réaliser les 2 techniques dans notre laboratoire • Consulter les dossiers médicaux pour les cas discordants afin d’évaluer la justesse des résultats 46 un matériel de très bonne qualité avec une préservation cellulaire optimale Fiabilité dépend de plusieurs facteurs
    47. 47. 47 Merci pour votre attention

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