1. MÓDULO III
ELECTRICIDAD Y
ELECTROFORESIS
II

2. Repasemos:
µ = v / E = q / kf
Entonces, la movilidad electroforética depende de:
• carga de la partícula (pH)
•fuerza iónica del medio
•tamaño (radio) y forma de la partícula
• viscosidad del medio
•temperatura

3. Discutamos los resultados obtenidos en el
T.P.
µ =v / E
µ = d . L / t . Vab
¿Qué ocurre con la movilidad electroforética
si...
• se modifica la caída de potencial aplicada?
• se modifica la longitud del soporte?
• se modifica el tiempo de corrida?

4. Discutamos los resultados obtenidos en el
T.P.
¿Qué ocurrió con la movilidad electroforética a
altos valores de diferencia de potencial?
d EFECTO JOULE
Q/tpo = k.V.i
V

5. Variación de la resistencia del soporte
durante la corrida
• Papel
R 1
• Acetato de celulosa
2
tiempo de corrida

6. Voltaje constante vs Intensidad constante
Voltaje constante
V = R.i = constante
Q/t = k.V. i = k.R.i2
Al transcurrir la corrida:
R↓ → i ↑ → ↑ Q/t → evaporación de
solvente → ↑ Fuerza iónica → ↓ µ
Refrigerar

7. Voltaje constante vs Intensidad constante
Intensidad constante
i = R/V = constante
Q/t = k.V. i = k.R.i2
Al transcurrir la corrida:
R↓ → V ↓ → ↓ Q/t
pero como V ↓ :
µ =d.L /t.V
↓ d → debo ↑ t → ↑ difusión → ↓ resolución

8. Equilibrio de disociación o ionización
de un ácido débil en solución acuosa
HA H+ + A-
[H+] [A-]
Constante de
disociación KA=
[HA]

9. Ecuación de Henderson Hasselbach
[H+] [A-]
KA=
[HA]
Tomando el log negativo de ambos
miembros y sustituyendo - log [H+] por pH
y - log Ka por pKA y ordenando:
[A-]
pH = pKA + log
[HA]

10. Entonces...
- -
COOH COO COO
+ +
H3N – C – H H3N – C – H H2N – C – H
R R R
pH ácido Punto isoiónico alcalino
Forma iónica Catión Ión anfótero Anión
Migración Hacia el cátodo Nula Hacia el ánodo
Distancia Negativa Nula Positiva

11. Variación de la movilidad electroforética
con el pH del medio
- -
COOH COO COO
+ +
H3N – C – H H3N – C – H H2N – C – H
R R R
pH < pI pH = pI pH > pI

12. Movilidad electroforética en función del pH
25
electroforética 20
15
pI
Movilidad
10
5
0
-5 0 5 10 15
-10
-15
-20
-25
pH
curva corregida por efecto electroendosmótico
curva experimental
Testigo neutro

13. Se dispone de un aminoácido que posee los
siguientes grupos ionizables:
COOH pKa = 2.0
H2N – C – H pKa = 10.0
R (NH2) pKa = 12.0
a) Esquematice las estructuras predominantes a
pH: 2, 5, 7, 8, 10, 12, 14.
b) Calcule carga neta exacta a cada pH.
c) Estime el pI aproximado a partir de los pKa.

14. Se desea determinar el pI de una proteína. Los datos experimentales
obtenidos en las distintas corridas son:
pH intensidad tiempo distancia distancia
(mA) (minutos) recorrida por recorrida por
la proteína el dextrano
(cm) (cm)
2.0 4.0 20 - 7.0 0.0
4.0 4.0 25 - 4.0 0.0
6.0 7.0 40 - 1.0 - 0.5
8.0 3.0 25 2.0 - 1.0
10.0 3.0 30 5.0 - 2.0
Longitud de cada tira = 20.0 cm. Resistencia de cada tira = 105 Ω.
a) Determine el campo eléctrico aplicado en cada corrida.
b) Calcule las movilidades de la proteína a cada pH.
c) Calcule pI de la proteína.

15. Ejemplos de sustancias con movilidad
electroforética: aminoácidos
Neutros

16. Ejemplos de sustancias con movilidad
electroforética: aminoácidos
Neutros

17. Ejemplos de sustancias con movilidad
electroforética: aminoácidos
Ácidos

18. Ejemplos de sustancias con movilidad
electroforética: aminoácidos
Básicos

19. Ejemplos de sustancias con movilidad
electroforética: polipéptidos y proteínas
Son polímeros de aminoácidos unidos
por uniones peptídicas
Polipéptidos: 10 -100 aminoácidos
Proteínas: más de 100 aminoácidos

20. Ejemplos de sustancias con movilidad
electroforética: ácidos nucleicos (ADN y ARN)

21. Según su objetivo, la electroforesis puede
ser:
• Analítica: • Preparativa:
ANÁLISIS AISLAMIENTO
de las bandas de las distintas
obtenidas fracciones (utiliza
(utiliza poca mayor cantidad
muestra) de muestra)

22. La electroforesis puede realizarse en
forma:
• Vertical • Unidireccional
• Horizontal • Bidireccional

23. Tipos de electroforesis de uso más frecuente en
la actualidad
• Electroforesis en medio soporte:
- convencional
- SDS-PAGE: densidad de carga uniforme
⇒ separación de proteínas por pesos
moleculares
- isoelectronfoque: gradiente de pH ⇒ alta
resolución
• Electroforesis capilar

24. Al realizar una electroforesis debe tenerse en
cuenta la selección de:
1) Objetivo de la electroforesis: tipo de
electroforesis.
2) Soporte y buffer de corrida.
3) Modo y lugar de siembra de la muestra.

25. Al realizar una electroforesis debe tenerse en
cuenta la selección de:
4) Condiciones de corrida: voltaje (bajo,
mediano o alto) e intensidad. Si se trabaja con
voltajes medianos y altos debe refrigerarse la
corrida para evitar el efecto Joule.
Puede trabajarse a voltaje o intensidad
constante.
5) Tiempo de corrida

26. Al realizar una electroforesis debe tenerse en
cuenta la selección de:
6) Revelado:
•colorantes
•inmunofijación
•enzimático
•transferencia a una membrana de
nitrocelulosa y posterior revelado
(inmunoblot) : Westernblot (proteínas),
Southernblot (ADN), Northenblot (ARN)

27. ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS
LIBRE EN SOPORTES CAPILAR
1937 CROMATOGRAFÍA
2004
Tiselius Avance Tecnológico
AUMENTO EN RESOLUCION Y SENSIBILIDAD

28. Electroforesis en acetato de
a
celulosa
Proteinograma de suero

29. SDS-PAGE

30. Isoelectroenfoque (IEF)

31. Electroforesis
bidimensional

32. Electroforesis Capilar

33. Electroforesis Capilar

34. Páginas a consultar:
1)http://www.rit.edu/~pac8612/electro/Electro
_Sim.html
2)http://micro.magnet.fsu.edu/electromag/java
/electrophoresis/
3)http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-
misc/anim/elfo/electrof2.html

35. FIN