Relatório final do projeto estágio da Licenciatura em Bioquímica

1. I
UNIVERSIDADE DO PORTO
FACULDADE DE CIÊNCIAS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS DE ABEL SALAZAR
Relatório de Estágio da Licenciatura em Bioquímica
Preparação de nanobioconjugados de nanoestrelas de ouro e tirosi-nase
para o desenvolvimento de sensores.
Rui Pedro Fernandes Ribeiro
2013

2. Preparação de nanobioconjugados de nanoestrelas de ouro e tirosi-nase
II
para o desenvolvimento de sensores.
REQUIMTE, Departamento de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Uni-versidade
do Porto, 4169-007 Porto, Portugal
Orientadora
Professora Doutora Eulália Pereira
Co-orientadora
Mestre Leonor Soares
Porto, 2013

3. III
Agradecimentos
À Professora Doutora Eulália Pereira, minha orientadora, gostaria de agradecer a
oportunidade de estagiar no seu grupo de investigação, a confiança e motivação depositada
em mim, bem como os conhecimentos transmitidos e a sua enorme disponibilidade.
A todos os elementos do grupo de investigação agradeço pelo companheirismo e ex-celente
ambiente de trabalho, em especial à Mestre Leonor Soares, minha co-orientadora, e
ao Doutor Pedro Quaresma, pela amizade, simpatia e paciência e pelo constante apoio na
elaboração deste projeto. Quero agradecer-lhes por tudo o que aprendi durante estes largos
meses: as técnicas, as dicas e os conselhos sábios que levo comigo e me ajudarão na minha
carreira científica, mas também os grandes momentos de descontração que se misturaram
com o trabalho.
Aos meus amigos, por toda amizade que aqui é impossível descrever, em especial, à
minha grande amiga Francisca Dias que nos últimos quatro anos me ajudou a descobrir o
verdadeiro gosto pela ciência, pois quando se tem espírito científico não há limites para o
conhecimento.
Aos meus pais deixo aqui o meu sentido agradecimento, e quero dizer-lhes que des-cobri
que tenho mais deles em mim do que imaginava: ao meu pai, com quem partilho a
mesma boa disposição e curiosidade pelo mundo que nos rodeia e à minha mãe, de quem
herdei o espírito de sacrifício, resistência e perfecionismo. Obrigado pelo apoio e força in-condicionais
que me motivam todos os dias a ser mais e melhor.
À minha restante família agradeço por me ter acompanhado todos os dias da minha
vida, em especial à minha prima Ana a quem mais uma vez agradeço por me ter dado mui-to
mais do que me apercebi, e à minha avó Eduarda que, nos últimos dozes anos tem sido
um pilar essencial na minha vida.
A todos vocês, obrigado por terem entrado na minha vida, me terem inspirado e ilu-minado
com a vossa presença!

4. IV
Abreviaturas
A
AuNPs nanopartículas de ouro
AuNSs nanoestrelas de outro
Ala alanina
Asn asparagina
C
CALNN pentapéptido de carga neutra (Cis- Ala-Leu-Asn-Asn)
Cis cisteína
D
D.L.S. Dispersão dinâmica de luz (Dynamic light scattering)
ou espetroscopia de correlação fotónica
L
Leu leucina
M
M concentração molar
11-MUA ácido 11-mercaptoundecanóico
N
NPs nanopartículas
P
PVP polivinilpirrolidona
S
seeds núcleos de crescimento

5. V
T
T.E.M. Microscopia de transmissão eletrónica
tips pontas das nanoestrelas
TYR tirosinase
U
UV/vis Ultravioleta/visível
λ comprimento de onda

6. VI
ÍNDICE
1
Introdução
1
1.1
Nanotecnologia
1
1.2
Nanopartículas
de
Ouro
2
1.2.1
Características
e
propriedades
2
1.2.2
Técnicas
de
síntese
2
1.3
Interação
nanopartícula-­‐proteina
4
1.4
Técnicas
de
caracterização
e
análise
de
nanopartículas
e
da
interação
destas
com
péptidos
e
proteínas
7
1.4.1
Espetrofotometria
UV/Vis
7
1.4.2
Medidas
de
dispersão
dinâmica
de
luz
(D.L.S.)
7
1.4.3
Medidas
de
potencial
zeta
(Potencial
ζ)
8
1.4.4
Microscopia
eletrónica
de
transmissão
(T.E.M.)
9
2
Objetivos
10
3
Materiais
e
Métodos
11
3.1
Reagentes
e
Solventes
11
3.2
Instrumentação
12
3.3
Procedimentos
laboratoriais
13
3.3.1
Síntese
de
núcleos
de
crescimento
(seeds)
de
ouro
13
3.3.2
Funcionalização
de
AuNPs
com
PVP
14
3.3.3
Síntese
de
AuNSs
15
3.3.4
Centrifugação
das
AuNSs
16
3.3.5
Determinação
da
concentração
e
da
área
superficial
das
AuNSs
16
3.3.6
Funcionalização
de
AuNSs
com
o
péptido
CALNN
e
MUA
17
3.3.7
Formação
dos
bionanoconjugados
com
tirosinase
17
3.3.8
Caracterização
das
nanopartículas
18
3.3.9
Estudo
da
estabilidade
coloidal
das
AuNSs
19
4
Resultados
20
4.1
Síntese
e
funcionalização
de
AuNPs
esféricas
pelo
método
da
redução
do
citrato
20
4.2
Funcionalização
das
esferas
com
o
PVP
21

7. 4.3
Síntese
de
núcleos
de
crescimento
de
ouro
22
4.4
Síntese
de
AuNSs
23
4.5
Estudo
da
estabilidade
coloidal
das
AuNSs
27
4.6
Funcionalização
das
AuNSs
27
4.7
Formação
de
bionanoconjugados
de
tirosinase
31
5
Considerações
finais
33
6
Referências
Bibliográficas
34
VII

8. VIII
Índice de Figuras
Figura 1-1 Ilustração representativa da escala nano [3]. 1
Figura 1-2 Representação gráfica da concentração atómica em função do tempo
ilustrando os fenómenos de nucleação e crescimento (adaptado de Xia et al. [9]). 3
Figura 1-3 Representação do mecanismo proposto para a reação entre DMF-PVP e
HAuCl4 (adaptado de Kedia et al. [15]). 4
Figura 1-4 Coroa de proteínas na NP. A ligação da proteína à partícula pode levar a uma
série de consequências, nomeadamente alterações conformacionais, que podem levar a
mudanças na atividade biológica, fibrilação, ou estabilização de determinada conformação.
(adaptado de Yang et al. [16]). 5
Figura 1-5 Fórmula de estrutura dos agentes de revestimento utilizados: PVP, 11-MUA e
CALNN. 6
Figura 1-6 Estrutura cristalográfica da tirosinase de Agaricus bisporus (PDB-2Y9W). 7
Figura 1-7 Representação do potencial elétrico em função da distância da superfície de
AuNPs (adaptado de Wikipédia [22]). 8
Figura 4-2 A- espetro de extinção de solução das seeds, em etanol, após sofrerem as
respetivas centrifugações; B - espetro de extinção das AuNSs, em etanol, sintetizadas com
as seeds diferenciais. 22
Figura 4-3 Representação esquemática da uma AuNS de 4 tips no plano 횷 e 2 tips no
plano 횺, e espetro de extinção de AuNSs com diferentes números de tips. 24
Figura 4-4 Espetro de extinção das amostras do stock de 120 mL de AuNSs em DMF,
etanol e água. 25
Figura 4-5 Imagens de T.E.M. e análise estatística do diâmetro médio das soluções de
AuNSs sintetizadas a partir de seeds com 18 nm de diâmetro. A - 7 mL de AuNSs de rácio
9; B - 7 mL de AuNSs de rácio 11; C - 7 mL de AuNSs de rácio 15; D - 120 mL de AuNSs
de rácio 15. 26
Figura 4-6 Espetros de extinção da solução stock de 120 mL de AuNSs após a variação
com o pH (A) e com a força iónica (B). Imagens de T.E.M. de AuNs sem adição de NaCl
(C), com 0,5M de NaCl (D) e 3M de NaCl (E). 28
Figura 4-7 A – espetro de extinção de aliquotas de 1,5 mL de AuNSs funcionalizadas
com CALNN e 11-MUA antes e após a diminuição do pH; B – espetro de extinção da
solução stock de 120 mL de AuNSs funcionalizadas antes e após a diminuição do pH;
distribuição do potencial z das AuNSs funcionalizadas com o CALNN logo após a

9. funcionalização (C e D) e 6 dias depois (E e F), com o 11-MUA (G e H) e da
funcionalização de 10 mL de AuNSs com CALNN (I e J). 29
Figura 4-8 Representação gráfica do potencial z e do diâmetro médio das partículas em
função da quantidade de enzima adicionada. 32
Figura 4-9 Espetro de extinção das AuNSs em função da quantidade de enzima
adicionada. 32
IX

10. X
Índice de Tabelas
Tabela 3-I Características dos rotores utilizados. 12
Tabela 4-I Comparação do dimâmetro médio das AuNPs antes e após a funcionalização
com PVP obtidos por três técnicas diferentes. 20
Tabela 4-II Descrição das centrifugações diferenciais das AuNPs. 23
Tabela 4-III Comparação do diâmetro calculado com o obtido por T.E.M das AuNSs
sintetizadas com diferentes rácios. 24
Tabela 4-IV Concentração do stock de 120 mL AuNSs antes e após as centrifugações. 25
Tabela 4-V Medições de Potencial z das AuNSs antes e após a funcionalização. 30
Tabela 4-VI Resultados do potencial z e de D.L.S. de soluções de AuNSs com diferentes
concentrações de enzima. 31

11. XI
Resumo
A combinação de nanomateriais inorgânicos com produtos biológicos permite a cria-ção
de nanomateriais biologicamente ativos com potenciais aplicações na indústria, medi-cina
e até mesmo a nível ambiental, já que a produção destes materiais fundamenta-se hoje
em dia no conceito de Química Verde, que pode ser definida como o uso de metodologias
que visam a redução de reagentes ou produção de produtos que possam ser nocivos ao ho-mem
ou ao ambiente.
O trabalho desenvolvido neste projeto teve como objetivo a preparação de bioconju-gados
com possível aplicação no desenvolvimento de biossensores e em biorremediação.
Este relatório descreve a síntese e funcionalização de núcleos de crescimento e de na-noestrelas
de ouro e utilização destas para a preparação e estudo de bionanoconjugados
com tirosinase.
Os núcleos de crescimento são nanoesferas de ouro sintetizadas pelo método da redu-ção
do citrato e funcionalizadas com PVP. Estes núcleos de crescimento são posteriormen-te
utilizados na síntese de nanoestrelas de ouro.
Para tornar a superfície das nanoestrelas biocompatível com materiais biológicos co-mo
proteínas, estas foram funcionalizadas com o péptido tiolado CALNN, e outro agente
de revestimento também tiolado, 11-MUA, servindo este último apenas como controlo.
Após a funcionalização das nanoestrelas estas são mais aptas à adsorção de biomolé-culas
à superfície, podendo ser utilizadas como biossensores, catalisadores de reações bio-lógias
ou como transportadores de fármacos. Para a formação destes bionanoconjugados
foi utilizada a enzima tirosinase que realiza duas reações de catálise distintas.
Ao longo de todo o trabalho experimental, foram utilizadas diversas técnicas de carac-terização
de nanopartículas como a espetrofotometria UV/vis, a microscopia de transmis-são
eletrónica e medidas de dispersão dinâmica de luz e de potencial zeta.

12. 1
1 Introdução
1.1 Nanotecnologia
Define-se nanociência como o estudo das propriedades da matéria numa escala entre
1 e 100 nm (Figura 1-1) e nanotecnologia como a manipulação de materiais a essa escala, de
forma a produzir materiais que sejam úteis para o desenvolvimento humano. A nanotecno-logia
é um campo bastante multidisciplinar abrangendo áreas como a engenharia de mate-riais,
eletrónica e mecânica, bem como a biologia, física e química.
Uma nova área de estudos que tem sido intensamente explorada pelos cientistas é a
nanomedicina, ou seja a aplicação da nanotecnologia, nanomateriais e nanodispositivos
para o diagnóstico e terapêutica de doenças. Por exemplo, muitos cientistas tentam desen-volver
nanobiossensores, que quando inseridos no corpo humano podem continuadamente
monitorizar níveis de glucose no sangue [1], transportadores de fármacos baseados em na-nopartículas,
ou utilizar as próprias nanopartículas para terapia termal contra o cancro [2].
Portanto, a expansão do conhecimento em nanociência e nanotecnologias é de crucial
importância para o próprio conhecimento científico, mas também para o desenvolvimento
de uma melhor sociedade e qualidade de vida.
Figura 1-1 Ilustração representativa da escala nano [3].

13. 2
1.2 Nanopartículas de Ouro
1.2.1 Características e propriedades
As soluções coloidais de AuNPs possuem geralmente cores intensas, que variam de
acordo com o tamanho e a morfologia das partículas. Por sua vez, o tamanho e a morfolo-gia
das partículas depende do processo de síntese, podendo-se obter partículas isotrópicas
(esferas) ou anisotrópicas (estrelas, triângulos, cubos,etc).
O controlo destes dois parâmetros durante a síntese de NPs, representa hoje em dia
um dos maiores desafios que a nanoquímica enfrenta, uma vez que estes têm uma grande
influência nas propriedades óticas das partículas.
Na origem física de tais propriedades encontra-se o fenómeno de ressonância plas-mónica
de superfície (SPR). Este fenómeno ocorre quando a radiação eletromagnética inte-rage
com os eletrões presentes na banda de condução do metal, promovendo a sua oscila-ção
e induzindo a formação de dipolos na nanopartícula. Assim, metais que possuem
eletrões de condução livres, ou seja, eletrões das orbitais d, como é o caso dos metais no-bres
(ouro e prata), apresentam uma absorção forte na zona do visível do espetro de extin-ção.[
4, 5]
As soluções coloidais de AuNPs isotrópicas (esféricas) com diâmetros de 5-20 nm
apresentam no espetro UV/vis uma única banda plasmónica típica a 520 nm.[6] As nano-partículas
anisotrópicas apresentam normalmente mais do que uma banda plasmónica, por
exemplo, as nanoestrelas de Au (AuNSs), devido á sua anisotropia intrínseca, exibem duas
bandas de absorção. A ressonância plasmónica de AuNSs resulta da hibridação da excita-ção
colectiva dos eletrões do núcleo da partícula e cada ponta (tip) individual da partícula.
Nos espetros experimentais observam-se então duas bandas distintas, uma compreendida
entre os 700 e 800 nm e uma mais fraca compreendida entre os 500 e 600 nm.[7]
1.2.2 Técnicas de síntese
A síntese de nanoestruturas é baseada em duas abordagens: “bottom-up” (de baixo
para cima) e “top-down” (de cima para baixo). Na abordagem “bottom-up” a produção de
nanoestruturas ocorre através da deposição espontânea e ordenada (self-assembly) de áto-mo
a átomo ou molécula a molécula formando estruturas bem definidas. Na abordagem
“top-down” as nanoestruturas são produzidas a partir de uma estrutura macroscópica que
vai sendo desbastada, isto é transformada, até se obter o tamanho e forma desejados.[8]

14. A abordagem utilizada na síntese química de AuNPs é a “bottom-up”, na qual um sal
do metal pretendido, que serve como percursor, é decomposto ou reduzido para gerar áto-mos
metálicos (átomos com numero de oxidação zero) que são a base de construção da
3
partícula.
Embora o processo de nucleação ainda não seja completamente conhecido, o modelo
mais aceite é o modelo de LaMer, proposto nos anos 50, Figura 1-2. Este modelo propõe que
a concentração dos átomos disponíveis para a nucleação aumenta à medida que o percursor
metálico é decomposto ou reduzido e, assim que a concentração dos átomos atinge a con-centração
de nucleação mínima os átomos começam a agregar em pequenos núcleos que
vão crescendo de forma acelerada até se esgotar o percursor. [9-11]
De forma a controlar o tamanho e a morfologia das partículas, recorre-se frequente-mente
a agentes de revestimento que se ligam à superfície das partículas estabilizando-as e
evitando assim a seu crescimento e a agregação.
Figura 1-2 Representação gráfica da concentração atómica em função do tempo ilustrando os fenómenos de
nucleação e crescimento (adaptado de Xia et al. [9]).
1.2.2.1 Síntese de AuNPs esféricas
A síntese de AuNPs esféricas foi efetuada segundo o método da redução do citrato,
inicialmente descrito por Turkevich et al. [12], no qual uma solução do sal ácido tetraclo-roáurico
(III) (percursor metálico) em solução aquosa e de citrato de sódio (agente redutor
e agente de revestimento) é levada à ebulição, sendo o sal de ouro reduzido a ouro metálico
(Au0). Como o citrato de sódio é adicionado em excesso, à medida que este reduz o sal de

15. ouro e fica na sua forma ionizada, vai sendo adsorvido à superfície da AuNP tornando-a
negativa, o que previne a agregação das partículas, devido às repulsões eletrostáticas.
4
1.2.2.2 Síntese de AuNSs
A síntese de AuNSs foi efetuada segundo o método descrito por Liz-Marzán [13, 14],
que envolve a adição de AuNPs de 15 nm revestidas com PVP (seeds) a uma solução de
sal ácido tetracloroáurico (III) (percursor metálico) em DMF (agente redutor) na presença
de concentrações de PVP elevadas. Foi proposto um mecanismo de redução do sal de ouro
que se apresenta na Figura 1-3 e que se baseia na formação de um composto de coordenação
instável PVP − DMF! − AuCl! !
.[15]
Figura 1-3 Representação do mecanismo proposto para a reação entre DMF-PVP e HAuCl4 (adaptado de
Kedia et al. [15]).
1.3 Interação nanopartícula-proteina
A interação entre nanopartículas e proteínas constitui, atualmente, um desafio da na-notecnologia,
uma vez que estes nanobioconjugados têm comportamentos complexos que
diferem dos comportamentos das proteínas e das partículas não conjugadas. A adsorção da
proteína à superfície da partícula pode ocorrer por interações de van der Waals, pontes de
hidrogénio, interações eletrostáticas, interações hidrofóficas e emparelhamento

16. π−π. Dependendo do tipo de ligação, quando há adsorção de proteína à superfície da nano-partículas
forma-se uma primeira camada de adsorpção, denominada “hard corona” que
pode ser mais ou menos densa, e eventualmente uma camada adicional, mais fracamente
adsorvida, denominada "soft corona" (Figura 1-4). [16]
A interação direta NP-proteína pode alterar a estrutura e conformação da proteína ad-sorvida
perdendo a sua função biológica e podendo-se tornar tóxica.[17] Uma estratégia
para preservar a estrutura e conformação da proteína, é a utilização de agentes de revesti-mento,
p.ex. péptidos, pré-adsorvidos à nanopartículas, tornando a superfície mais bio-compatível.[
5
16]
Figura 1-4 Coroa de proteínas na NP. A ligação da proteína à partícula pode levar a uma série de conse-quências,
nomeadamente alterações conformacionais, que podem levar a mudanças na atividade biológica,
fibrilação, ou estabilização de determinada conformação. (adaptado de Yang et al. [16]).
Os agentes de revestimento utilizados, são em regra, moléculas bifuncionais, em que
uma das extremidades da molécula tem a função de ligação à partícula, normalmente ex-tremidades
tioladas (-SH) ou aminadas (-NH2), e a outra extremidade tem a função de re-conhecimento
molecular para outras moléculas específicas. Estes agentes de revestimento
podem ser biomoléculas como péptidos, proteínas ou ácidos nucleicos, conferindo às partí-culas
as suas propriedades biológicas
No presente trabalho foram utilizados como agentes de revestimento o polímero po-livinilpirrolidona
(PVP), o ácido 11-mercaptoundecanóico (11-MUA), que é um hidrocar-boneto
linear bifuncional com um grupo tiol numa extremidade e um grupo carboxílico na

17. outra, e um péptido, o CALNN que tem um grupo tiol no resíduo de cisteína da posição N-terminal
e que ficará com o terminal carboxilato dirigido para o exterior (Figura 1-5).
Para a formação de bionanoconjugados foi utilizada a enzima tirosinase (Figura 1-6)
que faz parte de uma família de metaloproteínas de cobre encontradas em fungos, plantas e
mamíferos, que catalisam duas reações distintas: a o-hidroxilação de monofenóis e a oxi-dação-
6
redução de o-difenóis a o-quinonas. [18]
Figura 1-5 Fórmula de estrutura1 dos agentes de revestimento utilizados: PVP, 11-MUA e CALNN.
1 Ilustrações produzidas recorrendo ao software ChemBioDraw da PerkinElmer Inc.

18. 7
Figura 1-6 Estrutura cristalográfica da tirosinase de Agaricus bisporus (PDB-2Y9W).
1.4 Técnicas de caracterização e análise de nanopartículas e da intera-ção
destas com péptidos e proteínas
1.4.1 Espetrofotometria UV/Vis
A espetrofotometria UV/vis é uma técnica que é utilizada para determinar de um
modo quantitativo a concentração de substâncias em solução que absorvem radiação quan-do
são expostas à luz na gama do visível e ultravioleta, segundo a lei de Lambert-Beer,
equação 1, que relaciona matematicamente a absorvância, A, com a concentração, c, onde
ε representa o coeficiente de extinção molar e 푙 o percurso ótico, isto é, a distância que a
luz atravessa na amostra.
퐴 = 휀. 푐. 푙 (1)
Ao longo de todo o trabalho experimental, as soluções coloidais de nanopartículas
foram sendo caracterizadas por esta técnica, não só para determinação da concentração das
partículas, mas também para verificar a formação de nanopartículas formadas durante das
sínteses e verificação da estabilidade coloidal.
1.4.2 Medidas de dispersão dinâmica de luz (D.L.S.)
A técnica de dispersão dinâmica de luz (D.L.S.) é uma técnica, que permite medir o
raio hidrodinâmico de nanopartículas em solução. Nesta técnica a solução de nanopartícu-las
é iluminada por um laser monocromático e a sua intensidade de dispersão é detetada
por um dispositivo detetor de fotões com um ângulo de dispersão fixo ou variável. Devido

19. ao movimento Browniano das partículas a intensidade de dispersão é dependente do tempo
quando observada numa escala temporal de microsegundos. Estas flutuações são medidas
usando um método de autocorrelação em que cada intensidade de dispersão num dado
momento é comparada com a intensidade de dispersão noutro dado momento, um processo
que se vai repetindo ao longo do tempo.
Tais flutuações são relacionadas com o tamanho das partículas pela equação de Sto-kes-
Einstein, equação 2, onde d(H) é o raio hidrodinâmico, D o coeficiente de difusão
translacional, k a constante de Boltzman, T a temperatura absoluta e η a viscosidade. [19,
20]
8
푑 퐻 = !"
!!"# (2)
1.4.3 Medidas de potencial zeta (Potencial ζ)
Numa solução iónica, as nanopartículas com carga tem à sua superfície uma camada
de iões de carga oposta fortemente ligada, formando uma camada denominada camada de
Stern, Figura 1-7. Devido ao movimento Browniano ou a força aplicadas, as partículas mo-vem-
se, e com elas há deslocamento de iões. Estes iões que se movem com as partículas
formam uma camada difusa que se distingue dos restantes iões em solução. O potencial
eletrostático entre estas camadas de iões que se movem com as partículas e os restantes
iões em solução é chamado de potencial ζ, Figura 1-7.[21]
Figura 1-7 Representação do potencial elétrico em função da distância da superfície de AuNPs (adaptado de
Wikipédia [22]).

20. A medição de potencial ζ é feita aplicando um campo elétrico á solução coloidal e
medindo a molilidade eletroforética das partículas por D.L.S.. A determinação baseia-se na
aplicação da equação de Henry (equação 3), onde UE é a mobilidade eletroforética, ε a
constante dielétrica, η a viscosidade do solvente, ζ o potencial zeta e f(kR) a função de
Henry.[21]
9
푈! = !!"
!! 푓(푘푅) (3)
São consideradas partículas fortemente catiónicas, partículas com um potencial ζ su-perior
a +30 mV, neutras partículas entre -10 mV e +10 mV, e partículas fortemente anió-nicas
(ouro coloidal) abaixo dos -30 mV.
A medição do potencial ζ pode variar entre medições pois é sensível ao pH, tempera-tura,
força iónica e agente de revestimento. [21]
1.4.4 Microscopia eletrónica de transmissão (T.E.M.)
Na microscopia eletrónica transmissão um feixe de eletrões altamente energético in-cide
numa amostra de espessura fina interagindo e passando através dela. Forma-se uma
imagem quando o feixe transmitido é enviado através de lentes que ampliam e focam a
imagem, que é depois reproduzida num ecrã fluorescente. Esta é uma técnica que permite
analisar a estrutura e composição de materiais de origem não biológica (como nanopartícu-las)
ou biológica.

21. 10
2 Objetivos
O trabalho desenvolvido teve como objetivo principal a preparação de nanopartículas
de ouro com formas anisométricas (estrelas) para preparação de bioconjugados com tirosi-nase,
com possível aplicação no desenvolvimento biossensores e em biorremediação.
Mais especificamente pretendeu-se sintetizar nanopartículas metálicas como suspen-sões
coloidais, com posterior funcionalização das mesmas com agentes adequados, adap-tando
métodos publicados ou métodos já desenvolvidos neste grupo de investigação, e
também, estudar a adsorção da tirosinase às nanopartículas funcionalizadas, utilizando me-dições
de potencial ζ.

22. 11
3 Materiais e Métodos
3.1 Reagentes e Solventes
Todo o material de vidro utilizado no decorrer do trabalho experimental foi pré-lavado
com Aqua Régia, uma mistura de ácido clorídrico com ácido nítrico concentrado,
numa proporção de 3:1. Ao longo do trabalho experimental, foi utilizada, para a produção
de soluções e enxaguamento de material, água ultra pura Milli-Q2 (18,2 MΩ.cm). Também
foi utilizado, ao longo de todo o trabalho experimental, etanol (CH3CH2OH) absoluto
(99,5%) da Panreac, previamente filtrado por um filtro para seringa com membrana de po-li(
difluorovinidileno) (PVDF) com uma porosidade de 0,2 μm.
As soluções utilizadas na síntese de AuNPs foram preparadas utilizando ácido te-tracloroáurico
(III) (HAuCl4, solução a 30% (p:p) em HCl, 99,99% puro, Sigma-Aldrich).
Na síntese de AuNPs pelo método da redução do citrato, utilizou-se citrato de sódio di-hidratado
(Na3Cit) da Merck (p.a.). Na síntese de AuNSs pelo método de Liz-Marzán, uti-lizou-
se N,N-dimetilformamida (HCON(CH3)2) da Merck.
No processo de funcionalização de AuNPs e na síntese de AuNSs foi utilizado poli-vinilpirrolidona
(PVP) (10000 MM) da Sigma-Aldrich.
Para a funcionalização das AuNSs foram utilizados dois agentes de revestimento, o
ácido 11-mercaptoundecanóico (11-MUA) (grau de pureza de 95%) da Sigma-Aldrich, e
um péptido, o CALNN (ASLO
Laboratory
ApS,
Dinamarca).
Para o estudo da estabilidade coloidal das nanopartículas utilizou-se ácido clorídico
(HCl) da Sigma-Aldrich, hidróxido de sódio (NaOH) da Pronolab (p.a.) e cloreto de potás-sio
(KCl) da Merck (p.a.).
A enzima, utilizada na adsorção às AuNSs foi a tirosinase (TYR) de cogumelo da Si-gma-
Aldrich. A enzima foi mantida em tampão fosfato, 100 mM, isento de cloretos (Cl-)
pH 6,5 a 3 °C.
2 Purificada no Laboratório de Química-Física desta Faculdade

23. 12
3.2 Instrumentação
Na pesagem dos compostos utilizou-se uma balança analítica Kern ABS 120- 4
(±2x10-5 g) e uma balança semi-analítica Kern EMB 600-2 (± 1x10-2 g).
Na medição dos espetros de UV/vis recorreu-se a um espetrofotómetro UV/Vis de
feixe simples Vary Cary 50 Bio, utilizando uma célula de quartzo da Starna com um passo
ótico de 1 cm, no intervalo de 200-1000 nm de comprimento de onda.
As centrifugações das amostras, quando necessário, foram realizadas numa centrífu-ga
SIGMA 2-16K, utilizando dois rotores, um para tubos de falcon e outro para tubos ep-pendorff,
ver Tabela 3-I.
Tabela 3-I Características dos rotores utilizados.
Rotor 19776H (SIGMA) Rotor 12154H (SIGMA)
Raiomáx 9,3 cm 8,2 cm
Raiomin 3,1 cm 5,0 cm
Ângulo 25º 45º
RPMmáx 14000 rpm/min 26000 rpm/min
RFCmáx 20379 g 61973 g
Sempre que foi necessário realizar centrifugações iguais mas em rotores diferentes
ou equipamentos diferentes, analisou-se o tempo de centrifugação requerido para sedimen-tar
o mesmo material, quando a amostra é submetida a uma dada frequência de
rotação.[23] Assim sendo, o cálculo do tempo de sedimentação de uma partícula é calcula-do
integrando a equação 4,
휈! = !"
!" (4)
onde t define a velocidade terminal e r é uma coordenada medida sobre a trajetória da par-tícula
ao longo do eixo do tubo. Sabendo que a aceleração radial pode ser calculada por ω2r
e considerando partículas esféricas, obtemos a equação 5, através da qual podemos deter-minar,
por comparação o novo tempo requerido.[23]

24. 13
푡 = !
! 휂 !
!!(!!!!)!! 푙푛 !"#$!á!
!"#$!"#
(5)
A medição de potencial ζ, da polidispersão e/ou formação de agregados e do tama-nho
das partículas, foi realizada através do equipamento Zeta Sizer ZS da Malvern Intru-mentsTM,
com um laser de 4 mW de He-Ne (633 nm) com um ângulo de dispersão fixo de
173º. A medição de potencial ζ ou de tamanho hidrodinâmico de cada amostra corresponde
à média de três medições consecutivas com um intervalo de 5 segundos, limitando a volta-gem
do equipamento a 50 mV.
As imagens de microscopia eletrónica (T.E.M.) foram obtidas num microscópio HI-TACHI
H-81003. A análise das imagens obtidas foi realizada através do ImageJ4 e R5.
Para os estudos de estabilidade coloidal das AuNSs foi utilizado o espetrofotómetro
já referido e um potenciómetro Crison pH-meter BASIC 20+ com um elétrodo combinado
de vidro Crison (5208).
3.3 Procedimentos laboratoriais
3.3.1 Síntese de núcleos de crescimento (seeds) de ouro
A síntese de AuNPs (esféricas) foi efetuada segundo o método da redução do citra-to.[
12] Para tal, mediu-se 125 mL de água Milli-Q para um balão de três tubuladuras, à
qual se adicionou 86,4 μL da solução stock de HAuCl4 (1,445 M), e uma barra magnética
para agitação. Colocou-se o balão mergulhado num banho de parafina e procedeu-se à
montagem do dispositivo de refluxo. Ligou-se a placa de aquecimento a aproximadamente
130 °C e esperou-se que a solução entrasse em ebulição. Após a solução se encontrar em
ebulição adicionou-se rapidamente, uma solução aquosa de citrato de sódio (12,5 mL de
H2O + 0,142 g de citrato de sódio). No momento da adição, a mistura das duas soluções
adquiriu uma cor negra passando depois para uma cor vermelha. Deixou-se reagir durante
15 minutos e deixou-se arrefecer à temperatura ambiente.
3 Propriedade do Departamento de Engenharia dos Materiais do Instituto Superior Técnico de Lisboa.
4 Software de Análise e tratamento de imagem (http://rsbweb.nih.gov/ij).
5 Software de estatística computacional e gráfica (http://www.r-project.org).

25. 14
3.3.2 Funcionalização de AuNPs com PVP
A funcionalização de AuNPs foi feita segundo o método de Liz-Marzán [13], no qual
se adiciona uma quantidade de PVP de aproximadamente 60 moléculas do polímero por
nm2 de área superficial de partícula.
Deste modo, calculou-se a área superficial total das nanopartículas de ouro da solu-ção
coloidal. Para tal, foi necessário calcular a área superficial e o volume de cada partícu-la,
bem como a concentração de partículas.
Para calcular a área superficial e o volume de cada partícula recorreu-se às equações
6 e 7. O raio utilizado nestas equações foi calculado através do diâmetro médio das partí-culas.
Este diâmetro foi, por sua vez, obtido atendendo à razão entre a absorvância da ban-da
plasmónica e a absorvância a 450 nm das partículas, equação 8.[24]
퐴!"#!$% = 4휋푟! (6)
푉!"#!$% = !
! 휋푟! (7)
푑 = 푒
!"#!"#
!"#!"!!"
!!,!"#$
!,!!!" (8)
A concentração de AuNPs foi calculada pela razão entre a quantidade total de Au da
solução (que corresponde à quantidade de Au inicial) e a quantidade de Au que existe em
cada partícula, equação 9, onde 퐴푢 ! é calculada pela equação 10. O cálculo de 푛!"/!" é
feito pela equação 11, onde 푉!" é o volume da partícula (equação 7), 휌!" corresponde à
massa específica de Au e 푀푀!" corresponde à massa molar de Au.
퐴푢푁푃푠 = !" !×!!"#"!"#$
!!"/!"
(9)
퐴푢 ! = !"#!""!"×!,!×!"!!!
!,! (10)
푛!"/!" = !!"×!!"
!!!"
(11)

26. Sabendo então a concentração total de AuNPs e a área superficial de cada partícula, a
multiplicação deste dois valores representa a área superficial total de ouro da solução. Nes-te
ponto, calculou-se a quantidade de PVP necessária para a funcionalização das partículas
(60 moléculas de PVP por nm2), equação 12.
15
푛!"! = !!"!#$ !" !"#$%×!!"!×!"!"#é!"#$% !" !"!
!,!""×!"!" ×푀푀!"! (12)
Tendo, então, sido calculada a quantidade de PVP a adicionar à solução coloidal de
AuNPs, procedeu-se à dissolução da quantidade referida de PVP em 5 mL de H2O e adici-onou-
se, gota a gota, a solução preparada à solução coloidal de AuNPs em agitação vigo-rosa.
Após duas horas em agitação vigorosa, deixou-se a funcionalização decorrer durante
a noite em agitação moderada.
3.3.3 Síntese de AuNSs
A síntese de AuNSs foi feita segundo o método de síntese de Liz-Marzán. [13, 14]
Centrifugaram-se diferencialmente AuNPs preparadas como foi descrito na secção
anterior, ressuspendendo o sedimento em 3 mL de etanol absoluto filtrado, de modo a ob-ter
diferentes soluções de AuNPs homogéneas, cada uma com tamanhos médios de partícu-las
diferentes.
Dissolveu-se 1,5 g de PVP em 15 mL de DMF, com ultra-sons. De seguida, em agi-tação
vigorosa, adicionaram-se 82 μL de solução de HAuCl4 50 mM, e esperaram-se 2 a 3
minutos antes de se adicionarem as AuNPs preparadas anteriormente. Após a adição destes
núcleos de crescimento (seeds) deixou-se o sistema em agitação vigorosa até não ocorre-rem
mais mudanças de cor. Deixou-se reagir durante a noite, sem agitação e ao abrigo da
luz.
Caracterizou-se a solução coloidal de AuNSs espetrofotometricamente, tendo-se
usado para a obtenção da linha de base uma solução de DMF/PVP idêntica à da síntese.
A quantidade de seeds adicionada depende do tamanho das estrelas que quisermos
obter, dado que quanto menor o rácio 퐻퐴푢퐶푙! 퐴푢 !""#!, menor será o tamanho das es-trelas.
O volume de solução de seeds adicionado foi calculado pela equação 13, onde
퐻퐴푢퐶푙! !"#$% é calculada tendo em conta o volume de solução de HAuCl4 (50 mM) adi-cionado
e o volume de DMF e 퐴푢 !""#! é calculada segundo a equação 10.

27. 16
푉!""#! =
!á!"#
!"#$%! !"#$%
×!!"#
!" !""#!
(13)
3.3.4 Centrifugação das AuNSs
Foram realizadas duas séries de centrifugações das AuNSs, ambas a 10000 rpm du-rante
20 minutos (a 20 °C) no rotor 19776H. Sempre que foi necessário a utilização de um
equipamento diferente, recorreu-se à equação 5 para calcular o novo tempo requerido.
O sobrenadante da amostra centrifugada, foi desprezado e o sedimento foi ressus-pendido
em etanol absoluto filtrado, na primeira série, e em água Milli-Q na segunda série.
3.3.5 Determinação da concentração e da área superficial das AuNSs
Foi necessário fazer uma estimativa da concentração e da área superficial das AuNSs
para o seu processo de funcionalização. Para tal foi necessário assumir duas premissas:
1. A reação de síntese de AuNSs é completa, isto é, não se formam novas par-tículas,
nem as partículas existentes são destruídas. Assim o número de es-trelas
na solução será igual ao numero de seeds adicionado.
2. O ouro adicionado para a formação das pontas das estrelas (tips) é comple-tamente
reduzido e distribui-se igualmente por todas as partículas.
Deste modo, a concentração de AuNSs em DMF, é igual à concentração de seeds que
são adicionadas durante a síntese. Dado que durante as centrifugações há perda de material,
utilizou-se este pressuposto para calcular o coeficiente de extinção molar a 400 nm das
AuNSs obtidas directamente da síntese e determinou-se a concentração das soluções de
AuNSs após centrifugação medição de absorvância a 400 nm.
Partindo da segunda premissa calculou-se a quantidade de ouro que se deposita em
cada partícula para a formação das tips, dividindo as moles de ouro adicionadas pelas mo-les
de seeds.
Sabendo a quantidade de ouro que cada AuNS tem, dividiu-se essa quantidade pela
quantidade de ouro total existente na solução, que se obtém atendendo à absorvância a 400
nm, ver equação 8. Estes cálculos foram repetidos a cada centrifugação.
Para calcular a área superficial das estrelas assumiu-se, hipoteticamente, que o cres-cimento
é esférico. Este cálculo dá-nos uma aproximação de uma área entre o núcleo da
partícula e a área superficial real da partícula.

28. ! é o
Assim, recorreu-se à equação 14 [6] para calcular o raio da partícula, onde 푟!"#$
! é o volume da seed, 푚!" é a massa de ouro adicionada para o
17
volume da partícula, 푟!""#
crescimento das tips, 휌!" é a massa específica do outro e 푛!""#! é a quantidade de seeds
adicionadas. Tendo a aproximação do raio da partícula, através da equação 4, obtemos uma
aproximação da sua área superficial.
! = 푟!""#
푟!!"#
! + 3
4
!!"
!!!"!!""#!
(14)
3.3.6 Funcionalização de AuNSs com o péptido CALNN e MUA
As estrelas foram funcionalizadas com 4 a 6 moléculas de agente de revestimento
por nm2 de área superficial. Após o cálculo da quantidade necessária de agente de revesti-mento
para funcionalizar a solução coloidal de AuNSs, prepararam-se as respetivas solu-ções
dos agentes de revestimento: o CALNN e 11-MUA.
As soluções de CALNN foram preparadas através de diluições de uma solução stock
com uma concentração de 4,68 mM. As soluções de 11-MUA foram também preparadas
através de diluições de uma solução previamente preparada com uma concentração de 10
mM.
Adicionaram-se diferentes volumes das soluções de CALNN e 11-MUA, às partícu-las
e deixaram-se reagir durante a noite. As soluções coloidais de AuNSs resultantes foram
caracterizadas espetrocfotometricamente, e foram feitas medições de potencial ζ. As dife-rentes
concentrações de agentes de revestimento que se adicionaram às partículas encon-tram-
se na secção de resultados.
3.3.7 Formação dos bionanoconjugados com tirosinase
A formação de bionanoconjugados ocorre pela adsorção da enzima à superfície da
partícula após esta ser previamente funcionalizada com péptido. Neste projeto a enzima
que foi utilizada foi a tirosinase (TYR).
Os estudos de adsorção da enzima às partículas foram feitos realizando uma isotér-mica
de Langmuir, na qual se avalia a o ponto de saturação de ligação da enzima à partícu-la.
Foram adicionadas às partículas diferentes concentrações de enzimas acima e abaixo de
uma valor de referência.

29. Esse valor de referência foi estimado dividindo a maior área seccional da enzima pe-la
área superficial da partícula, ou seja, calculando a quantidade máxima de enzima que se
conseguiria adsorver à superfície da partícula.
Preparou-se, então, uma solução de TYR em tampão fosfato (isento de cloreto) a par-tir
da diluição de uma solução stock com uma concentração de 20,8 μM.
Adicionaram-se diferentes volumes da solução de TYR às partículas, deixaram-se
incubar durante a noite à temperatura ambiente. As soluções coloidais resultantes foram
caracterizadas espetrofotometricamente e foram feitas medições de potencial ζ e tamanho
hidrodinâmico. Os detalhes dos volumes e da concentração das soluções estão especifica-dos
18
na secção de resultados.
3.3.8 Caracterização das nanopartículas
3.3.8.1 Espetrofotometria de UV/Vis
Os ensaios foram realizados em células de quartzo, numa gama de comprimento de
onda entre os 200 nm e os 1000 nm.
3.3.8.2 Medições de potencial ζ
Transferiu-se lentamente para uma célula apropriada para medições ζ (poliestireno
com eléctrodos metálicos, Malvern) 0,7 mL de AuNPs, de forma a garantir que a amostra
não contivesse bolhas de ar e que os elétrodos estivessem completamente imersos. Colo-cou-
se a célula no compartimento do Zeta Sizer Nano ZS, e ajustou-se, para cada medição,
a voltagem (fixada a 50 mV), o número de medições e a temperatura.
3.3.8.3 Medições de tamanho hidrodinâmico
Transferiu-se para uma célula descartável apropriada para medições de tamanho hi-drodinâmico
(plástico, Malvern) 1 mL de AuNPs. Colocou-se a célula no compartimento
do Zeta Sizer Nano ZS, e ajustou-se, para cada medição, o número de medições e a tempe-ratura.

30. 19
3.3.8.4 Microscopia Eletrónica (T.E.M.)
Na preparação de amostras para T.E.M. depositou-se cerca de 10 μL de AuNPs nu-ma
rede de cobre revestida com carbono/”formvar” de 200 mesh de TAAB, deixando-se
secar ao ar, à temperatura ambiente, tendo sempre o cuidado de proteger a amostra de
quaisquer contaminantes. A observação das amostras no microscópio eletrónico ficou ao
cuidado do Doutor Pedro Quaresma.
3.3.9 Estudo da estabilidade coloidal das AuNSs
Foram feitos estudos de estabilidade coloidal para as AuNSs em função da variação
do pH e da variação da concentração iónica, esta última através da variação da concentra-ção
de cloreto de sódio (NaCl).
Para os estudos da estabilidade em função da variação do pH, prepararam-se várias
alíquotas de 2 mL de AuNSs e adicionaram-se diferentes volumes de HCl e NaOH, sob
agitação magnética, de forma a obter uma gama de pH compreendida entre 3 e 10. Três
minutos após o pH da solução estabilizar, esta foi caracterizada espetrofotometricamente.
Para os estudos da estabilidade em função da variação da concentração de cloreto de
sódio, prepararam-se várias alíquotas de 2 mL de AuNSs , adicionou-se solução de NaCl
para obter diferentes concentrações deste sal e, três minutos após a adição, as soluções fo-ram
caracterizadas espetrofotometricamente. Os detalhes das concentrações de sal adicio-nadas
encontram-se na secção de resultados.

31. 4 Resultados
4.1 Síntese e funcionalização de AuNPs esféricas pelo método da redu-ção
20
do citrato
Foi utilizado o método de Turkevich [12], o método mais simples e vulgar, para sin-tetizar
AuNPs com baixa dispersão de tamanho. Este método consiste na redução do sal de
Au+3 a Au0 (ouro metálico) pelo citrato de sódio, usando água como solvente.
Através da análise espetrofotométrica da amostra da solução de AuNPs que foi sinte-tizada,
Figura 4-1, observamos uma banda plasmónica bem definida a 520 nm, tal como se-ria
de esperar.[6] Além disso, pudemos também verificar que a banda plasmónica é bastan-te
estreita, o que é indicativo que a solução contém uma dispersão de tamanhos bastante
reduzida, isto é, é homogénea e bem estabilizada pelo agente de revestimento.
Estimou-se um diâmetro das AuNPs de 14,3 nm pelo método de Haiss [24], a partir
da razão 퐴!"#!" 퐴!"#, ver secção 3.3.2,. A concentração das partículas estimada, tal co-mo
está descrito na mesma secção, foi de 6,2 x 10-9 M.
Pelas imagens de T.E.M da solução, Figura 4-1, verificou-se que as partículas exibem
uma forma esférica e, através do tratamento estatístico das imagens, obteve-se um valor do
diâmetro médio das partículas de 13,7 ± 1,5 nm, que está de acordo com o calculado a par-tir
da razão 퐴!"#!" 퐴!"#.
As medições de D.L.S., indicaram que o raio hidrodinâmico das AuNPs é de 16,0 ±
3,6 nm com um potencial ζ de -45 ± 19 mV, um valor concordante com o apresentado na
literatura.[25]
Na Tabela 4-I apresentam-se os resultados da caracterização das AuNPs obtidas
diretamente da síntese e após funcionalização com PVP.
Tabela 4-I Comparação do dimâmetro médio das AuNPs antes e após a funcionalização com PVP obtidos
por três técnicas diferentes.
퐴!"#!" 퐴!"# T.E.M D.L.S.
AuNPs 14,3 nm 13,7 ± 1,5 nm 16,0 ± 3,6 nm
AuNPs + PVP 19,1 nm - 18,7 ± 1,4 nm

32. Figura 4-1 A - espetro de extinção da solução de AuNPs sintetizada pelo método da redução do citrato antes e após a
funcionalização com o PVP; B- espetro de extinção das seeds, em etanol, após 1 a 4 centrifugações, normalizado ao
máximo de absorção; C - imagem obtida por T.E.M. da solução de AuNPs antes da funcionalização com PVP e respetiva
análise estatística do tamanho das partículas.
21
4.2 Funcionalização das esferas com o PVP
Após a funcionalização das partículas com PVP, a análise espetrofotométrica revelou
uma pequena diminuição na absorvância, Figura 4-1. Esta diferença está certamente relacio-nada
com a mudança do agente de revestimento, de citrato para PVP, que provoca uma al-teração
do índice de refração. O diâmetro das partículas medido por D.L.S. foi de 18,7 ±
1,4 nm, ver Tabela 4-I. Este aumento do diâmetro da partícula é expectável, já que o PVP é
um polímero de grandes dimensões, relativamente ao citrato. No que diz respeito ao
potencial ζ obteve-se um valor de –37,2 ± 13 mV. Este valor é significativamente menor
do que o obtido para as partículas revestidas com citrato, o que está de acordo com o facto
do agente de revestimento ser neutro.

33. 22
4.3 Síntese de núcleos de crescimento de ouro
Apesar da solução de AuNPs ser bastante homogénea, existem em solução partículas
de diferentes tamanhos, que variam aproximadamente entre os 15 e 20 nm. Para se obte-rem
suspensões de partículas mais homogéneas, foram realizadas séries de centrifugações
diferenciais, com o mesmo tempo de rotação, mas com crescentes forças centrípetas, tal
como está descrito na Tabela 4-II. Os espetros das solução obtidas destas centrifugações en-contram-
se na Figura 4-2. Apresentam-se também, na Tabela 4-II os resultados corresponden-tes
à caracterização de cada uma das soluções coloidais obtidas na centrifugação diferenci-al.
Apresentam-se também os tamanhos pelo método de Haiss [24]. Embora este método
não seja diretamente aplicável a partículas revestidas com PVP, dado que foi desenvolvido
para partículas revestidas de citrato, verificou-se apenas pequenas alterações no espetro das
partículas originais após mudança do agente de revestimento, pelo que é legítimo utilizar a
mesma metodologia para estimar o tamanho das partículas revestidas com PVP, embora
seja de esperar que estes diâmetros estejam afetados de um maior erro.
Figura 4-2 A- espetro de extinção de solução das seeds, em etanol, após sofrerem as respetivas
centrifugações; B - espetro de extinção das AuNSs, em etanol, sintetizadas com as seeds diferenciais.

34. Centrifugação 1 2 3 4
RPM 5000 7000 10000 12000
Tempo / min 20 20 20 20
Banda Plasmónica 526,0 524,0 522,9 524,0
Diâmetro médio / nm 19,3 18,9 17,9 15,9
23
Tabela 4-II Descrição das centrifugações diferenciais das AuNPs.
4.4 Síntese de AuNSs
Foram sintetizadas amostras de 7 mL de AuNSs com um rácio 퐻퐴푢퐶푙! 퐴푢 !""#!
de 9, ver secção 3.3.3, com as AuNPs de diferentes tamanhos obtidas através das
centrifugações diferenciais, descritas na subsecção anterior.
O espetro de UV/vis das amostras de AuNSs representados na Figura 4-2, apresentam
duas bandas típicas de AuNSs: uma próxima dos 550 nm, que corresponde à banda de
absorção do núcleo da partícula, e outra compreendida entre 650 e 700 nm que
corresponde à banda de absorção das tips.
Verificou-se também que as AuNSs sintetizadas com seeds de tamanhos diferentes
apresentam a banda correspondente ao núcleo a comprimentos de onda semelhantes, mas
desvios significativos da banda correspondente às tips.
Rodríguez-Oliveros et al. [2] relacionaram o comprimento de onda da banda
plasmónica com o número de tips das estrelas, Figura 4-3, concluindo que a banda
plasmónica sofre um desvio para comprimentos de onda maiores com o aumento do
número e razão de aspeto das tips. Comparando os seus resultados e a observação do
espetro obtido, Figura 4-2 e das imagens de T.E.M., Figura 4-5, podemos inferir que as
AuNSs sintetizadas tem 5 a 6 tips no plano Π.
Como a amostra sintetizada com as seeds da centrigugação 3, seeds com um
diâmetro aproximado a 18 nm, foi a que apresentou uma melhor separação entre a banda
do núcleo e a banda das tips, a continuação do trabalho experiemental foi baseado na
reprodução dessas seeds.
O passo seguinte foi, com as seeds da centrifugação 3, sintetizar amostras de AuNSs
com rácios 퐻퐴푢퐶푙! 퐴푢 !""#! de 11 e 15 e compará-las com a amostra de rácio 9. A
caracterização espetrofotométrica e de T.E.M. destas amostras encontra-se na Figura 4-2 e 4-
5 respetivamente.

35. Figura 4-3 Representação esquemática da uma AuNS de 4 tips no plano 횷 e 2 tips no plano 횺, e espetro de
electromagnetic field distribution on the surface of the nanostars at the LSPRs, from which the
absorption cross section is worked out, as needed to determine the steady-state temperature of
a metallic NP.
2. LSPRs of gold nanostars
Let us consider a NS whose geometrical shape is described as a deformable parametric surface
called Supershape [20], which depends on certain parameters that basically modify the sphere
formula in spherical coordinates. Particularly, we fix a configuration of parameters that allow
us to change the number of tips in a star-like volume, preserving its shape. In order not to
introduce too much complexity in the system under study, we only vary the number of tips in
the plane ! (see Fig. 1(a)) from n = 1 to n = 6. In the perpendicular plane ", the symmetry
of the number of star tips is kept constant in such a way that two opposing tips, one pointing
upwards and the other one downwards. We will refer to the nanostar with n tips in the plane !
as Sn. Such star-like shapes indeed closely resemble those of fabricated colloidal NSs [13].
AuNSs Calculado T.E.M
Rácio 9 38,8 nm 36,1 ± 6,05 nm
Rácio 11 41,2 nm 39,7 ± 5,30 nm
Rácio 15 45,3 nm 47,6 ± 9,09 nm
In Fig. 1(b) the absorption cross section is plotted for NSs made of gold described by the
dielectric constant reported in reference [21]. The incident field is a plane wave impinging
from the bottom, its plane of incidence being the plane ", Fig. 1(a). NSs have arms 40 nm long,
and increasing number of tips. The LSPRs for Au-NSs are red-shifted when the number of tips
in the plane ! increases from S1 to S6: #LSP (nm)=521, 548, 560, 587, 628, 688, respectively. In
Fig. 2(a-f) we have plotted the norm of the surface electric field (SF) of the NSs in logarithmic
scale. As a general result, the SF is accumulated on the vertex of the NSs, thereby providing
large field enhancements, about |E|2 ! 104. Incidentally, these values make nanostars suitable
for SERS applications [11, 13]. Essentially, such SF patterns results from the dipolar character
on the plane ! of the corresponding lowest-energy LSPR. In addition, SF enhancements at the
LSPR grow for increasing number of tips from S1 to S6, in agreement also with the absorption
cross section in Fig. 1(b), that shows the same trend from S1 to S6; except for S2, which has
an absorption cross section and SF slightly larger than expected, presumably due to its 2-tip
symmetry along the polarization axis, specially suited to match the dipolar LSPR pattern. In
this regard, the NS asymmetry on the plane " along the polarization axis reduces its quality as
dipole-like resonant cavity.
3. Temperature profile of optically heated gold nanostars
From the point of view of the applicability for thermal therapy, such large absorption cross
sections make Au NSs good candidates to be used as heat sources.
24
Fig. 1. (a) Schematic representation of a 4-fold nanostar, with two relevant symmetry
planes: the plane extinção ! where de AuNSs the number com of diferentes tips is varied números and the de polarization tips.
plane ". (b)
Absorption cross sections for Au nanostars with different number of tips from S1 to S6,
along with that for the equivalent Au nanosphere.
Pelas imagens de T.E.M. observou-se que as diferentes suspensões tem uma boa
dispersão de tamanho e que o diâmetro médio das partículas corresponde ao calculado
através da equação 11 descrita na secção 3.3.5, Tabela 4-III.
Tabela 4-III Comparação do diâmetro calculado com o obtido por T.E.M das AuNSs sintetizadas com
diferentes rácios.
Comparando estas amostras, selecionaram-se as AuNSs de rácio 15, dado que apre-sentam
uma maior separação entre a banda do núcleo e a banda das tips (Figura 4‑2-B),
para continuar o trabalho experimental. Deste modo, procedeu-se à síntese de um stock de
AuNSs. Após a síntese de 120 mL de AuNSs de rácio 15, voltou-se a caracterizar a solu-ção
coloidal espetrofotometricamente e por T.E.M., Figura 4‑4 e 4-5-D respetivamente.
O diâmetro médio esperado para as particulas foi de 45,3 nm, um tamanho que não
difere muito do tamanho obtido por análise de imagens de T.E.M. que foi de 50,2 ± 8,5 nm.
A funcionalização das AuNSs em solução aquosa implica a lavagem do DMF, ver
secção 3.3.4. Após cada lavagem, caracterizou-se espetrofotometricamente a solução para
determinar a sua concentração de partículas, ver secção 3.3.5.
86' 5HFHLYHG6HSUHYLVHG'HFDFFHSWHG'HFSXEOLVKHG'HF
(C) 2012 OSA 2 January 2012 / Vol. 20, No. 1 / OPTICS EXPRESS 623

36. Pela observação do espetro da Figura 4‑4, calculou-se que houve uma perda de partí-culas,
cerca de 14%, durante a lavagem de DMF para etanol, e uma perca de cerca de 16 %
durante a lavagem de etanol para água. Observa-se pela figura que para diferentes solven-tes
há desvios da banda plasmónica, facto que se poderá dever ao diferentes índice de re-fração
para cada solvente. As concentrações das soluções após cada lavagem, apresentam-se
25
na Tabela 4-IV.
Tabela 4-IV Concentração do stock de 120 mL AuNSs antes e após as centrifugações.
1ª centrifugação 2ª centrifugação
Solvente DMF Etanol H2O milli-Q
[AuNP’s] / nM 8,33x10-2 7,15x10-2 6,97x10-2
AuNSs (DMF)
AuNSs (Etanol)
AuNSs (Água)
395 400 405 410
0.25
0.245
0.24
0.235
400 500 600 700 800 900 1000
(nm)
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Abs
Figura 4-4 Espetro de extinção das amostras do stock de 120 mL de AuNSs em DMF, etanol e água.

37. Figura 4-5 Imagens de T.E.M. e análise estatística do diâmetro médio das soluções de AuNSs sintetizadas a
partir de seeds com 18 nm de diâmetro. A - 7 mL de AuNSs de rácio 9; B - 7 mL de AuNSs de rácio 11; C -
7 mL de AuNSs de rácio 15; D - 120 mL de AuNSs de rácio 15.
26

38. 27
4.5 Estudo da estabilidade coloidal das AuNSs
O propósito do estudo da estabilidade coloidal de AuNSs foi de perceber quais os li-mites
de pH e concentração de NaCl aos quais as AuNSs são estáveis em solução. Por ou-tro
lado, as partículas funcionalizadas são mais sensíveis a variações de pH e de força ióni-ca,
e portanto a alteração destes parâmetros, na gama em que as partículas sem funcionali-zação
são estáveis, permite de uma forma qualitativa avaliar se a funcionalização ocorreu.
No estudo do efeito do pH na solução de AuNSs, para uma gama de pH entre 3 e 10
verificou-se por espetrofotometria de UV/vis, Figura 4-6-A, que as alterações da banda
plasmónica não são significativas, podendo-se inferir que dentro desta gama de pH as
AuNSs são muito estáveis. As pequenas diferenças no deslocamentos das bandas poderá
ser efeito da alteração do índice de refração, à medida que se altera o pH da solução.
No estudo do efeito da variação da concentração iónica seria de esperar que, com o
aumento da concentração de NaCl, o estado de agregação aumentasse, mas tal não foi veri-ficado.
Pela observação dos espetros, Figura 4-6-B, deparamo-nos com resultados anómalos.
Estudos simultâneos feitos pela Mestre Leonor Soares indicam que o aumento da concen-tração
de NaCl promove uma destruição das tips das AuNSs. As imagens T.E.M., realiza-das
pela própria, revelam partículas com formas mais arredondadas à medida que se adici-ona
sal às AuNSs.
4.6 Funcionalização das AuNSs
De forma a averiguar se as AuNSs são passíveis de serem funcionalizadas com agen-tes
de revestimento tiolados, foram conduzidos testes nos quais se funcionalizaram AuNSs
com dois agentes de revestimento diferentes: o péptico CALNN e o polímero 11-MUA.
Sabendo de antemão a concentração, volume e área superficial das partículas, e adi-cionando
cerca de 6 ligandos por nm2 de área superficial, a concentração de agente de re-vestimento
numa amostra de 1,5 mL de partículas é 4,0 nM, ver secção 3.3.6.
O potencial ζ das amostras antes, após e 6 dias depois da funcionalização com os
agentes de revestimento encontram-se na Tabela 4-V e na Figura 4-7, onde também se encon-tra
o espetro UV/vis das amostras.

39. Figura 4-6 Espetros de extinção da solução stock de 120 mL de AuNSs após a variação com o pH (A) e com
a força iónica (B). Imagens de T.E.M.6 de AuNs sem adição de NaCl (C), com 0,5M de NaCl (D) e 3M de
NaCl (E).
28
6 Imagens T.E.M. cedidas gentilmente pela Mestre Leonor Soares.

40. Figura 4-7 A – espetro de extinção de aliquotas de 1,5 mL de AuNSs funcionalizadas com CALNN e 11-
MUA antes e após a diminuição do pH; B – espetro de extinção da solução stock de 120 mL de AuNSs
funcionalizadas antes e após a diminuição do pH; distribuição do potencial ζ das AuNSs funcionalizadas com
o CALNN logo após a funcionalização (C e D) e 6 dias depois (E e F), com o 11-MUA (G e H) e da
funcionalização de 10 mL de AuNSs com CALNN (I e J).
29

41. 30
Tabela 4-V Medições de Potencial ζ das AuNSs antes e após a funcionalização.
Para além de se verificar que houve funcionalização através da alteração do potencial
ζ, já que este sofreu um aumento, diminuiu-se o pH das amostras e caracterizaram-se espe-trofotometricamente.
Ao diminuir o pH ocorre uma protonação do agente de revestimento
que leva à agregação das partículas, Figura 4-7(A). A agregação de AuNSs é visível no espe-tro
UV/Vis quando há um aumento da absorvância a comprimentos de onda superiores ao
comprimento de onda da banda correspondente às tips, um fenómeno que é devido ao aco-plamento
das plasmónicas de superfície. Assim, pudemos confirmar que houve funcionali-zação.
A fase que se seguiu no trabalho experimental, foi a reprodução da funcionalização
das AuNSs numa escala maior, isto é, procedeu-se à funcionalização de 10 mL de AuNSs.
A caracterização espetrofotométrica e de potencial ζ encontra-se na Figura 4-7(I-J) e na Tabe-la
4-V. Relativamente ao potencial ζ verificou-se que este se alterou (aumentou), mas rela-tivamente
ao espetro de absorção após a dimimuição do pH não se verifica grandes altera-ções,
apenas um pequeno desvio. Estes resultados não invalidam que ocorra funcionaliza-ção,
mas poderão querer dizer que o processo de agregação não segue uma padrão linear à
medida que se aumenta a escala de funcionalização, ou que durante o processo de funcio-nalização
a homogeneidade do péptido na solução de AuNSs seja menor a uma escala
maior.
CALNN 1 CALNN 2 MUA 1 MUA 2
Potencial ζ inicial / mV - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0
Potencial ζ após / mV - 33,03 ± 24,9 - 19,87 ± 29,6 - 9,00 ± 10 - 10,93 ± 10,7
Potencial ζ (6 dias) / mV - 15,67 ± 12,2 - 21,97 ± 21,8 - -
Potencial ζ 10 mL / mV - 33,47 ± 26,8 - 29,13 ± 30,4 - -

42. 31
4.7 Formação de bionanoconjugados de tirosinase
Para a formação dos bionanoconjugados com tirosinase, calculou-se, como descrito
na secção 3.3.7, uma aproximação do valor máximo de enzima que se liga a cada partícula:
194 unidades enzimáticas por AuNSs, ou seja, aproximadamente 1,6 ng de enzima por ml
de solução de AuNSs. Como também está descrito nessa mesma secção, foram preparadas
várias alíquotas de AuNSs em que se adicionaram concentrações de enzima acima e abaixo
do valor calculado, Tabela 4-VI. Os resultados das medições de potencial ζ e de D.L.S. en-contram-
se também descritos na Tabela 4-VI e no gráfico da Figura 4-8. A caracterização es-petrofotométrica
também foi realizada, e os seus resultados encontra-se na Figura 4-9.
Os resultados obtidos não foram os resultados esperados. Esperava-se que o potenci-al
ζ fosse aumentando com o aumento da concentração de enzima até atingir um ponto de
saturação de ligação à partícula.
Relativamente às medições de D.L.S., os resultados também não foram os esperados,
já que era esperado um aumento do raio hidrodinâmico da partícula à medida que mais en-zima
se liga à partícula. Destes resultados pode-se presumir que há ocorrência de alguma
agregação, pois a amostra 1, sem adição de enzima, revela um diâmetro médio aproxima-damente
o dobro do diâmetro médio das AuNSs.
No que diz respeito ao resultados espetrofotométricos, embora revelem ligeiras alte-rações,
sem ocorrer agregação das partículas, estes parecer ser também inconclusivos.
Tabela 4-VI Resultados do potencial ζ e de D.L.S. de soluções de AuNSs com diferentes concentrações de
enzima.
1 2 3 4 5 6 7 8
AuNPs / mL 1 1 1 1 1 1 1 1
VTYR / μL 0 13 33 44 65 131 327 600
Vtampão / μL 400 400 400 400 400 400 400 400
푉!!!/ μL 600 587 567 556 535 469 273 0
overnight
Potencial ζ / mV
- 21,3 ±
25
- 12 ±
14,9
- 10,2 ±
19,6
- 14,6 ±
20,3
- 15,5 ±
17,5
- 15,8 ±
16,9
- 15,7 ±
21,8
- 18,6 ±
21,2
Diâmetro / nm
86,3 ±
0,51
37, 1 ±
0,51
67,5 ±
0,51
37,5 ±
0,51
34,2 ±
0,58
81,91 ±
0,47
66,2 ±
0,60
88,6 ±
0,44

43. 0 100 200 300 400 500 600
TYR (μL)
0
-5
-10
-15
-20
-25
Potencial % (mV)
100
80
60
40
20
Figura 4-8 Representação gráfica do potencial ζ e do diâmetro médio das partículas em função da quantida-de
de enzima adicionada.
32
0.4
0.3
0.2
0.1
Figura 4-9 Espetro de extinção das AuNSs em função da quantidade de enzima adicionada.
Diâmetro médio (nm)
Potencial %
D.L.S.
300 400 500 600 700 800 900 1000
(nm)
0
Abs
0
1
2
3
4
5
6
7

44. 33
5 Considerações finais
Os métodos de síntese de AuNPs e de AuNS já se encontram muito bem optimizados,
contudo, ao longo da realização do trabalho experimental, verificou-se que a centrifugação
diferencial de AuNPs com PVP permite obter soluções de seeds mais homogéneas relati-vamente
ao tamanho. Isto torna-se muito relevante durante a síntese de AuNSs, pois permi-te
um maior controlo do tamanho e forma final das AuNSs, bem como uma maior reprodu-tibilidade.
No que se refere à estabilidade coloidal das AuNSs verificou-se que estas são muito
estáveis numa gama de pH entre 3 e 10, o que permite de uma forma rápida validar a fun-cionalização
das partículas através da agregação destas quando se diminui o pH.
A uma pequena escala (alíquotas de 1,5 mL) verifica-se que as AuNSs são passíveis
de serem funcionalizadas, mas tal não se verificou quando se aumentou a escala para 10
mL. Para se ter a certeza de que a funcionalização ocorreu seria imprescindível a utilização
de outras técnicas mais sensíveis como a espetroscopia fotoeletrónica de raios-X (XPS).
Já relativamente aos estudos de estabilidade coloidal de AuNSs com a variação da
força iónica é necessário realizar estudos mais profundos para perceber a forma como o sal
(NaCl) destrói as tips.
Quanto à formação de bionanoconjugados, os resultados revelaram-se inconclusivos,
sendo necessário estudos mais aprofundados para perceber se ocorre realmente adsorção da
enzima à superfície das partículas e como é que estes bionanoconjugados se comportam.
Assim, em estudos futuros, seria interessante repetir a preparação dos bionanoconjugados a
concentrações menores de tampão fosfato e com concentrações menor de enzima, pois é
presumível que à gama de concentrações utilizadas a enzima já se encontre no seu ponto de
saturação de ligação à partícula.

45. 34
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