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1. INTRODUCCIÓN
2. TÉCNICAS
3. DESARROLLOS
4. BIOSEGURIDAD
a. POSIBLES IMPACTOS
b. ANÁLISIS DE RIESGO
Mouse
Metallothionein
Promoter
N-terminal exon
Intron
Activation
by Cd2+
Rat growth
Hormone
gene
Palmiter et al., 1982
• Mejoras económicas en el cultivo de peces
– incremento en la tasa de crecimiento
– incremento en la porción comestible
– mejores tasas de conversión alimenticia
– utilización de dietas de bajo costo (carbohidratos)
– resistencia al frío y a la congelación
– resistencia alas enfermedades
– mayor fecundidad
– control de la reproducción
– menor agresión
• Diseño de peces para el mercado
– apariencia externa: peces para alimentación ó peces ornamentales
– sabor, textura
– composición de ácidos grasos
• Peces como bioreactores
– producción de compuestos de importancia médica
• Investigación básica, desarrollo, crecimiento y reproducción
Aleström & de la Fuente, 1999
Coss Pacheco y
Rebordino González, 2015
VENTAJAS DE LA TRANSFERENCIA DE
GENES EN LOS PECES
 ALTA FECUNDIDAD
 GAMETOS FACILMENTE DISPONIBLES
(DESOVES DE MILES DE HUEVOS)
 MAYOR NUMERO DE INDIVIDUOS
TRANSGENICOS PRODUCIDOS
 FERTILIZACION E INCUBACION
EXTERNA
 SE EVITAN LOS PROBLEMAS DE
FERTILIZACION IN VITRO Y
REIMPLANTACION
 LA FERTILIZACION SE PUEDE RETRASAR
POR UN PERIODO DE TIEMPO
CONSIDERABLE DESPUES DE LA COLECTA
DE HUEVOS
 (DIAS EN EL CASO DE SALMONES) SIN
VARIACIONES APRECIABLES EN SU
VIABILIDAD
GRAN TAMAÑO
FACILITA EL MANEJO,
ROBUSTOS Y GRANDES
(DE 1 A 7 mm DE DIAMETRO)
FRECUENCIAS DE
INTEGRACION
IGUALES O MAYORES
A LAS REGISTRADAS
PARA RATONES (10 –
70 %)
ACCION DE
SECUENCIAS
REGULADORAS
SIMILARES A LAS
DE LOS
VERTEBRADOS
SUPERIORES
Danio rerio Oryzias latipes
• Tiempo generacional corto
• Facilidad y costo de mantenimiento
• Rápido desarrollo
• Transparencia de los embriones
CEBRA MEDAKA
GENES REPORTEROS
d-cristalino de pollo
CAT
PARTICULARMENTE UTIL
EXPRESION PUEDE SER DETECTADA A NIVELES
EXTREMADAMENTE BAJOS
LA ACTIVIDAD ES MAS FACIL DE DETECTAR Y
CUANTIFICAR QUE LA SECUENCIA DE DNA
b-GALACTOSIDASA
TEST COLORIMETRICO ALTAMENTE
ESPECIFICO
Luciferasa
Sacrificio
Tamiya et al., 1990
Amsterdam et al., 1995
• Promotor de la queratina krt8 (solo visible bajo luz fluorescente) y
un promotor específico de las células musculares mylz2 (visible sin
necesidad de luz fluorescente)
• Mezclaron líneas de diferentes colores
• Y utilizaron promotores con expresión gradual
VENTAJAS
 Observación en vivo de la expresión de los
transgenes
 Se pueden utilizar los mismos embriones a
diferentes etapas para obtener un patrón dinámico
de expresión
Kaede
 Aislada del coral
Trachyphylia
geoffroyi
 Fotoconversión
irreversible de
verde a rojo bajo
luz ultravioleta o
violeta
• Metalotioenína
• Proteinas de shock calórico
Adam et al., 2000
• Estudios de migración celular
• Proyección axonal
Halloran et al., 2000
 MICROINYECCION
 INFECCION RETROVIRAL
 TRANSPOSONES
 TRANFERENCIA BALISTICA
 ELECTROPORACION
 PIGGYBACKING
 LIPOFECCION
The Sleeping Beauty (SB)
transposon system
terminal inverted repeats terminal inverted repeats
(N-Nitroso-N-ethylurea)
Targeting-Induced Local Lesions In Genomes Transcription Activator-Like Effector Nucleases
Murphey & Zon, 2002
yeast transcription factor
specific areas of the fish tissue
progeny of this cross
Lasting
transcriptional activation
Heberlein et al.,2004
GAL4 DNA-binding motif
(upstream activating sequence - UAS)
Stable transgenic line 1
ACTIVATOR
Stable transgenic line 2
EFFECTOR
Tissue-specific expression Lasting activation
Promoter
Drives the GOI
KalTA4
Kal
TA4
Kal
TA4
Wong & Van Eenennaam, 2008
Yoshikawa et al.,2008
Heat induced Cre
Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats
(CRISPR)-associated Cas9
Nucleasas dirigidas por RNA
1983 EN RESPUESTA A LOS PROBLEMAS ENFRENTADOS
POR LA INDUSTRIA ACUICOLA CANADIENSE
DOS MANERAS POTENCIALES EN LA
QUE LA TECNOLOGIA DE
TRANSGENICOS PODRIA SER USADA
PARA RESOLVER EL PROBLEMA
1) PRODUCIR SALMONES RESISTENTES AL
FRÍO
2) ELEVAR LAS TASAS DE CRECIMIENTO,
PARA EVITAR LA NECESIDAD DE
CULTIVARLOS EN INVIERNO
GH
Regulación del
metabolismo de
nitrógeno, lípidos,
carbohidratos y
minerales
Estimula el apetito
Mejora la FCR
Promueve la
mobilización de
lípidos
Promueve la
retención de
nitrógeno
Promueve la
incorporación de
aminoácidos en
los tejidos
Promueve el
desarrollo y
maduracióndel
intestino
Mejora la
capacidad
digestiva
DOS GENES OFRECEN EXPECTATIVAS DE
GRAN VALOR PARA LA ACUACULTURA
GH y AFP
LA TRANFERENCIA DE ESTOS GENES EN ADICION A SU
INCORPORACION, HERENCIA Y PERSISTENCIA EN LOS
HUESPEDES REQUIERE ADEMAS DE:
EXPRESION
DEL
TRANSGEN EN
LOS TEJIDOS
APROPIADOS
NIVEL DE
EXPRESION
SUFICIENTE
PARA MEDIAR
UNA ACCION
FISIOLOGICA
CAPACIDAD DE
MANIPULAR
LOS NIVELES
DE EXPRESION
IN VIVO
Environment
Somatic Growth
GONADAL STEROIDS CORTISOL IGF INSULIN
GTH TSH ACTH GH CATECHOLAMINES
GnRH TRH CRF GHRH
T4
T3
SRIF
GH
• Los transgenes de GH se
incorporan en prácticamente
todos los tejidos
• Ausencia de expresión de GH
en la pituitaria de algunas
especies (regulación negativa)
- Niveles plasmáticos de IGFs
son muy bajos
- Altos niveles de mRNA de
los IGFs en los hepatocitos y
el músculo
– Acción autócrina o parácrina
Funcionamiento diferente del
sistema endócrino de los peces transgénicos (GH)
• El apetito en los peces transgénicos no esta
directamente influenciado por los IGFs
• Se han observado niveles bajos de Grehlina
y del neuropeptido Y (moléculas
orexigénicas) en peces transgénicos, a
pesar de mostrar una gran motivación por
alimentarse
• Los niveles de CCK (hormona
anorexigénica) cerebrales no fluctúan
estacionalmente, como sucede con los
peces no transgénicos
• Continúan alimentándose aún en invierno,
contrariamente a los no transgénicos
APETITO
Fletcher et al., 1999
Lee et al. (2009)
Devlin et al., 2007
Pitkänen et al., 1999
Rahman and McLean, 1999
Abass & Dunham, 2015)
Misgurnus mizolepis
(Cypriniformes, Cobitidae)
Promotor β-
actina ligado a
GH
Crecimiento
>35 veces
(Nam et al. 2001)
Notothenioid and Channicthyid fish
Antifreeze
n= 4 to 88
m.w.= 2,600 to 56,000 Da
Freezing Avoidance in Frigid Marine Environment
Saffron cod
E. gracilis
Polar cod
B. saida
Greenland cod
G. ogac
Atlantic cod
G. morhua
AAT-AAT-PAT-AAT-PAT-AAT-AAT-etc
disac disac disac disac
disac disac
disac
AAT-AAT-PAT-AAT-PAR-AAT-AAT-etc
disac disac disac
disac disac
disac
Antarctic notothenioid :
Northern cod :
The other half of the story:
AFGP in Northern Gadids (Cods)
Antifreeze
Peptides
(4 types)
• Type I: 3-4 kDa
• Type II: ~14 kDa
• Type III: 7 kDa
14 kDa
• Type IV: ~15 kDa
(Chan et al, 2010)
Pitx1 gene
• No hay riesgo de virus o priones
• Se producen de 5 a 27 mg de
proteina recombinante por g de
músculo
• Comparable con lo que se produce
en leche (10mg/g)
• Factor de coagulación VII
• Vacuna contra Hepatitis B
• gLH en huevos de trucha
• IGF1 y 2 en huevos de cebra
1. Promotor de vtg y CYP1
• Sensibles a distintos disruptores ambientales
estrogénicos (estradiol, dietilstibestrol, bisfenol-
A etc.)
2. Promotor de proteinas de shock calórico
(hsp25) sensible a metales pesados
3. Diferentes construcciones sensibles a
agentes oxidantes
Fang & Miller, 2012
Radicales libres
O2
Peroxidación
de
lípidos
• Tilapias transgénicas que producen insulina
humanizada en sus corpúsculos de
Brockmann
• Encapsulamiento de los corpúsculos para evitar
rechazo
• Éxito en el transplante a ratones diabéticos
• Se restauraron los niveles de glucosa adecuados
Wright & Pohajdak, 2000
White et al., 2013
Induction of liver tumors in TO(Myc) fish.
Li Z et al. Dis. Model. Mech. 2013;6:414-423
©2013 by The Company of Biologists Limited
• Modelos para
estudios sobre
cancer
• Mismos
mecanismos
básicos de
regulación
genética en
carcinogénesis
• Expresión de
oncogenes
Langenau et al., 2003, Chen, 2007
ANGIOGÉNESIS
Cross et al. 2003
RESPUESTA ANTI-INFLAMATORIA
LIU et al. 2003
• Expresión de proteinas de IHNV, VHSV
• Inmunidad por expresión de péptidos anti-
bacterianos
• Imunizados antes de que haya madurado su sistema
inmunológico
• Cecropina-B (promotor de CMV), péptidos catiónicos de
Hyalophora cecropia en bagre y medaka
• Propiedades bacteriolíticas y anti-virales
• Gen de la lactoferrina (promotor de b-actina) en carpa
• Lisozima de pollo con mayor actividad bacteriolítica
(promotor de keratina) en cebra y platija
Hew et al., 1995; Hepell & Davis, 2000; Dunham et al., 2002, Sarmasik et al, 2002; Lorenzen & LaPatra, 2005; Yazawa et al., 2006
CARPAS SIN HIJAS
• Metabolismo de Carbohidratos
• Trucha: transportador de glucosa, Hexokinasa
• Metabolismo de Lípidos
• Cebra: D5 Y D6-desaturasa
• Metabolismo de Fosforo
• Medaka: fitasa
• Metabolismo Vitamina C
• Trucha: L-gulono-gamma-lactona oxidasa
Krasnov et al., 1998; Hostetler and Muir 2004; Heather et al., 2005 Alimuddin et al., 2005, 2007;
POSITIVO
NEUTRO
NEGATIVO
CORTO PLAZO LARGO PLAZO
IMPACTO
MODIFICACION
DE HABITATS
PREFERENCIALES
MODIFICACION
DE AREAS DE
REPARTICION
COMPETENCIA
INTRA-E-INTER-
ESPECIFICA
COLONIZACION DE NUEVOS MEDIOS
TOLERANCIA A
FACTORES FISICOS
DEL MEDIO
PURGA
GMO tiene una menor adaptación – el más seguro
Pew, 2003
EXPANSION
GMO tiene igual o mayor adaptación
Pew, 2003
GEN DE TROYA
Efectos antagónícos en dos componentes adaptativos propician el
descenso de la población Pew, 2003
• MACHOS DE MEDAKA TRANSGENICOS (GH)
 4 VECES MAYOR PROBABILIDAD DE REPRODUCIRSE
 30% MAS SUCEPTIBLES A MORIR QUE SUS SIBLINGS
NO TRANSGENICOS
• MODELO
 60 TRANSGENICOS MEZCLADOS EN UNA POBLACION
DE 60,000 NO TRANSGENICOS
 40 GENERACIONES CON PREVALENCIA DE
TRANSGENICOS CON MAYOR ÉXITO REPRODUCTIVO
 PRODUCCION CONTINUA DE CRIAS QUE MUEREN
PRECOZMENTE
• EXTINCION DE LA POBLACION
2004
wild-type medaka
transgenic medaka
top view
side views
Pennington et al., 2010
1. Alimento abundante y sin predación mayor número de transgénicos
2. Alimento abundante y predación
3. Alimento escaso sin predación
4. Alimento escaso y predación
• ¿Purga?
• ¿Expansión?
• ¿Gen de
Troya?
Las truchas arco iris transgénicas son 37 más grandes al alcanzar la
madurez sexual y tienen una menor viabilidad juvenil
• ¿Ingestión sin riesgos?
• Equivalencia sustancial
• No hay estudios de largo plazo
• Ecosistemas naturales
• Medidas de contención
• Construcciones que podrían representar un riesgo
• GH, recombinasas, resistencia a enfermedades
• Especies nativas (endémicas)
• Especies con potencial invasor
• Técnologías emergentes
• Análisis de riesgo
• El nivel de contención requerido para un
transgen en particular dependerá del
riesgo potencial que pueda causar en la
naturaleza (Devlin et al., 2006)
• NRC (2004) recomendó el uso simultaneo
de múltiples estrategias de contención
Además de escapes masivos, 2% de los salmones cultivados escapan
Se estiman 2 millones de escapes de salmones al año en el Atlántico Norte
(Norwegian Directorate of Fisheries 2009)
Wong and Van Eenennaam, 2008
$
$$ $
• Se diseña para inducir
el 100% de mortalidad
– Cambios de
temperatura
– pH
– Tratamiento con cloro,
bromuro, ozono
• Tratamiento de
efluentes y
restauración
 NUEVOS ORGANISMOS PARA LOS CUALES:
 NO EXISTE INFORMACION RELEVANTE EN CUANTO A SU
COMPORTAMIENTO EN EL AMBIENTE NATURAL
 TAMPOCO EXISTE NINGUNA BASE TEORICA APROPIADA
PARA SU PREDICCION
 SE HAN PROPUESTO RESTRICCIONES QUE
IMPLICAN LA UTILIZACION DE ORGANISMOS
INFERTILES
Weber & Lee, 2014
METODOS DE ESTERILIZACION
COMUNES
METODOS
REDUCCION DE LA
FERTILIDAD
EFICACIDAD
TRIPLOIDIA HEMBRAS SI
IMPORTANTE
POSIBILIDAD DE
PRODUCCION DE NO
ESTERILES,
SUCEPTIBLES A
ENFERMEDADES
TRIPLOIDIA MACHOS NO
TRATAMIENTO
CON
ANDROGENOS
SI Posibilidad de NO
estériles significativa
PRODUCCION
DE HIBRIDOS
SI
?
• A escala comercial raramente se alcanza el 100%
• Varían según
– la especie,
– la variedad,
– el método,
– la calidad de los gametos
– y el sexo
• Aunque se retarda el crecimeinto ovárico, se han
reportado casos de ovocitos maduros
• Variabilidad en el crecimiento, disminución de la
resistencia las enfermedades y el stress
 PRINCIPAL FUNCION
 ESTIMULACION DE LA SINTESIS Y LIBERACION DE
GONADOTROPINAS
 LIBERACION
 DE LAS TERMINACIONES NERVIOSAS A LA PITUITARIA POR
MEDIO DE UN SISTEMA PORTA PRIMITIVO
 ESTRUCTURA
PRIMARIA
Uzbekova et al., 2000; Maclean et al., 2003; Hu et al., 2007; Xu et al., 2011
De dos a tres formas en el cerebro de los peces
Uno especie- específico GnRH1,
GnRH2 (alias chicken GnRH-II ó cGnRH-II),
GnRH3 (alias GnRH de salmón or sGnRH)
En los que tienen tres el GnRH1 es el que se libera a la
pituitaria
En los peces cebra solo hay 2 (GnRH2 y GnRH3)
El GnRH3 se libera a la pituitaria
En las truchas hay dos genes para el GnRH3, GNRH3A y
GNRH3B, localizados en diferentes cromosomas pero
codifican para lel mismo péptido
Se debe conocer cual es el predominante para su
correcta inactivación
Están relacionados con los niveles de GH y juegan un
importante papel en el desarrollo
En los cebra el knockeo del GnRH2 ó GnRH3, ó ambos
resultan en embriones con defectos en el cerebro, ojos o
corazón
• No inhiben por completo la expresión
genética
– Son eficaces contra especies relativamente raras
de RNAm
• Vida media del RNA muy corta
• Con la incompatibilidad de unas cuantas
bases (1 a 4) no se alcanzan los resultados
esperados
• Efectos colaterales tóxicos no específicos
• Reemplazo continuo de mRNAs por nuevas
transcripciones
Verdadero
efecto de
interferencia ya
que se knockean
varios genes
aparte del GOI
– Anormalidades
fenotípicas en
varios estudios
Oates et al., 2000; Zhao et al., 2001
• Análogos de DNA que
actúan
– bloqueando la traducción
evitando que se unan las sub-
unidades ribosómicas
– alteran el splicing del pre-
mRNA generando transcritos
aberrantes que dan lugar a genes
no funcionales
• Tienen sitios de
reconocimiento para los
ribosomas y utilizan
fosforodiamidato
– Mayor afinidad por el RNA que el
mismo RNA
• No los degradan las
RNAsas
Heasman, 2002
Chen et al., 2004
Un anillo morfolino sustituye a la ribosa o
desoxiribosa
Wong & Van Eenennaam, 2008
Activador transcripcional
responsivo a la tetraciclina
Hu et al., 2010
Nitroreductase
metronidazole
cytotoxin
zona pellucida
atrophy of gonads
Xiong et al., 2013
Richardson & Lehman, 2010
gradient of stromal-derived factor 1a (Sdf1a)
provides the directional cue that guides the
migration of the primordial germ cells (PGCs)
to the gonadal tissue
Inducción de la expresión ubicuita de
Sdf1a en embriones de Danio rerio y
disrupción del patrón normal de migración
de las PGCs
Wong & Collodi, 2013
CONTROL
Zhang et al., 2014
(Tol2-CMV-GFP-pA-CMV-gal4-pA-Tol2) (Tol2-CMV-RFP-pA-5 3 UAS-as/dnd-pA-Tol2)
transcription of
antisense dnd
disrupted the
migration of PGCs,
led to their
apoptosis
dead end
• Con niveles variables de fertilidad, la presión
de selección favorecería a los peces fértiles
(Muir and Howard, 2004)
• Debido a que en las operaciones acuícolas
se manejan números muy elevados de
animales, aún eventos raros de reversión a
la fertilidad serían probables (Wong & Van
Eenennaam , 2008)
• Los individuos crecen tan rápido como su
fisiología se los permite a pesar de las posibles
ventajas de ser grande
• Al llevarlos más allá de su crecimiento hay
repercusiones somáticas
• Un de las razones es que el crecimiento cuesta:
– Reducción en la velocidad de natación
– Habilidad disminuida para hipo-osmoregular
– Alteraciones hormonales (IGFs, Insulina)
– Envejecimiento precoz (desgaste de los telómeros)
– Menor cantidad de esperma
Farrel et al, 1997;Devlin, et al., 2000; DeLiang etal., 2007; Li et al., 200; Pauliny et al., 2015
• Malformación vertebral
• Malformación craneal
• Acromegalia
• Prognatismo
• Sobre crecimiento de los
opérculos
• Diferencia de color
• Alteración en el tamaño y
forma de las aletas
• Eritrocitos más pequeños,
menos hemoglobina, más
colesterol y triglicéridos
• Menor crecimiento
• Poca discriminación de presas
• Mayor habilidad reproductiva*
Devlin et al., 1995; Nam et al., 2002; Sundström et al., 2004; Li et al, 2009; Darek et al., 2011; Fitzpatrick et al., 2011; Noh et al, 2012
• Menor frecuencia
reproductiva, menor
fidelidad en los nidos,
menor fertilización
• Menor supervivencia
ante predación
• Menor viabilidad
• Disminución de la
resistencia a
enfermedades*
• Alteraciones en
diferentes órganos
(intestino, branquias,
músculo, hígado)
• Menor tendencia a
formar cardúmenes
Hong et al., 2011
CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
Yazawa 2012
small body sizes and
short generation times
Yoshizaki et al 2012
• Gen introducido
• Especie transformada y características
• Estrategia de contención
• Movilidad de la especies (e.g. especies migradoras)
• Habilidad para volverse feral
• Aptitud relativa de la especie
• Ecosistema receptor
• Interacciones genotipo-ambiente
• Estabilidad de la comunidad receptora
Van Eenennaam & Olin, 2006
• Viabilidad juvenil
• Viabilidad en la etapa adulta
• Edad a la madurez sexual
• Fecundidad femenina
• Fertilidad masculina
• Éxito reproductivo
Muir and Howard 2001
net fitness methodology
• Medio ambiente natural
• Incertidumbre
• Experimentos en acuarios no proveen datos definitivos
para AR
• Tres aproximaciones
1. Cámaras de comportamiento, túneles de nado,
instalaciones para reto de enfermedades
• Características fisiológicas y comportamentales individuales
2. Sistemas semi-naturales
• Microcosmos, mesocosmos (alimentación, predación, nado,
efectos metabólicos y energéticos)
3. Liberación en la naturaleza de animales equivalentes
• Variedades con crecimiento rápido o con implantes de GH
• Los salmones transgénicos no afectan a
las poblaciones no-transgénicas cuando
hay alta disponibilidad de alimento (7.5%
de su biomasa)
• Ante la escases de alimento dominaban
los transgénicos
• Les ganaban el alimento a los no-transgénicos
• Mostraban un fuerte componente agonístico y
canibalístico hacia los no-transgénicos
• Aún así mayor mortalidad de transgénicos
• Diferencias fenotípicas entre organismos
silvestres y cultivados
Devlin et al., 2004
Devlin et al., 2006
• Reducción de nado afectaría la susceptibilidad a
ser predado
• ¿En que grado?
• Interacciones sinérgicas y antagónicas
derivadas de los efectos pleiotrópicos del
transgen
Mayor apetito y rápido desarrollo Mayor susceptibilidad a la predación
y menor supervivencia
vs
EFECTO DE GH SOBRE VARIEDADES
SELECCIONADAS
Devlin et al., 2001
Sundström et al., 2014
 MARCADORES GENETICOS
 INCLUYEN SECUENCIAS GENETICAS
COMPLETAMENTE INACTIVASYTRIVIALES
ESTAS SECUENCIAS SON COMPLETAMENTEARTIFICIALESY
CONSISTEN DE HOMOPOLIMEROS DE DNA
 ESTOS PECES AL SER LIBERADOSY AUNQUE SE
LLEGARAN A REPRODUCIR, SU PROGENIETAMBIEN
LLEVARIA EL MARCADOR GENETICO,
ESPECIALMENTE SI LOSTRANSGENICOS FUERAN
HOMOZIGOTICOS PARA EL MARCADOR
EL CASO DE GloFish
(Yorktown Technologies, Austin, TX)
• FDA determina no regular los Glofish en base a que
los cebra no presentan riesgo para la alimentación y
porque los cebra no transgénicos no han ejercido
impactos sobre el ambiente
• No se permitieron en California
• Se prohibió su venta, posesión e importación
• Yorktown Technologies solicita una excepción
• Los científicos del Departamento de Caza y Pesca
recomiendan aprobar una excepción
• Fue denegada por la Comisión de Caza y Pesca por
inquietudes éticas
• La Comisión vota posteriormente y decide aprobar la
excepción
• La ley estatal de California requiere de un estudio
completo de impacto ambiental
• Yorktown Technologies decide no seguir adelante
debido al costo e incertidumbre del procedimiento de
impacto ambiental
Salmón AquadvantageTM
• Triploide
• Dos debilidades:
• 1.-La dificultad para
verificar
consistentemente la
triploidía en grandes
poblaciones
• 2.- Interferencia
reproductiva con
poblaciones
silvestres y
competencia
NRC, 2004
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  • 1.
  • 2. 1. INTRODUCCIÓN 2. TÉCNICAS 3. DESARROLLOS 4. BIOSEGURIDAD a. POSIBLES IMPACTOS b. ANÁLISIS DE RIESGO
  • 4.
  • 5. • Mejoras económicas en el cultivo de peces – incremento en la tasa de crecimiento – incremento en la porción comestible – mejores tasas de conversión alimenticia – utilización de dietas de bajo costo (carbohidratos) – resistencia al frío y a la congelación – resistencia alas enfermedades – mayor fecundidad – control de la reproducción – menor agresión • Diseño de peces para el mercado – apariencia externa: peces para alimentación ó peces ornamentales – sabor, textura – composición de ácidos grasos • Peces como bioreactores – producción de compuestos de importancia médica • Investigación básica, desarrollo, crecimiento y reproducción Aleström & de la Fuente, 1999
  • 6. Coss Pacheco y Rebordino González, 2015
  • 7.
  • 8.
  • 9.
  • 10. VENTAJAS DE LA TRANSFERENCIA DE GENES EN LOS PECES  ALTA FECUNDIDAD  GAMETOS FACILMENTE DISPONIBLES (DESOVES DE MILES DE HUEVOS)  MAYOR NUMERO DE INDIVIDUOS TRANSGENICOS PRODUCIDOS  FERTILIZACION E INCUBACION EXTERNA  SE EVITAN LOS PROBLEMAS DE FERTILIZACION IN VITRO Y REIMPLANTACION  LA FERTILIZACION SE PUEDE RETRASAR POR UN PERIODO DE TIEMPO CONSIDERABLE DESPUES DE LA COLECTA DE HUEVOS  (DIAS EN EL CASO DE SALMONES) SIN VARIACIONES APRECIABLES EN SU VIABILIDAD
  • 11. GRAN TAMAÑO FACILITA EL MANEJO, ROBUSTOS Y GRANDES (DE 1 A 7 mm DE DIAMETRO) FRECUENCIAS DE INTEGRACION IGUALES O MAYORES A LAS REGISTRADAS PARA RATONES (10 – 70 %) ACCION DE SECUENCIAS REGULADORAS SIMILARES A LAS DE LOS VERTEBRADOS SUPERIORES
  • 12. Danio rerio Oryzias latipes • Tiempo generacional corto • Facilidad y costo de mantenimiento • Rápido desarrollo • Transparencia de los embriones CEBRA MEDAKA
  • 13.
  • 14. GENES REPORTEROS d-cristalino de pollo CAT PARTICULARMENTE UTIL EXPRESION PUEDE SER DETECTADA A NIVELES EXTREMADAMENTE BAJOS LA ACTIVIDAD ES MAS FACIL DE DETECTAR Y CUANTIFICAR QUE LA SECUENCIA DE DNA b-GALACTOSIDASA TEST COLORIMETRICO ALTAMENTE ESPECIFICO Luciferasa Sacrificio
  • 17.
  • 18.
  • 19. • Promotor de la queratina krt8 (solo visible bajo luz fluorescente) y un promotor específico de las células musculares mylz2 (visible sin necesidad de luz fluorescente) • Mezclaron líneas de diferentes colores • Y utilizaron promotores con expresión gradual
  • 20.
  • 21.
  • 22.
  • 23.
  • 24.
  • 25.
  • 26. VENTAJAS  Observación en vivo de la expresión de los transgenes  Se pueden utilizar los mismos embriones a diferentes etapas para obtener un patrón dinámico de expresión
  • 27.
  • 28. Kaede  Aislada del coral Trachyphylia geoffroyi  Fotoconversión irreversible de verde a rojo bajo luz ultravioleta o violeta
  • 29. • Metalotioenína • Proteinas de shock calórico Adam et al., 2000
  • 30. • Estudios de migración celular • Proyección axonal Halloran et al., 2000
  • 31.  MICROINYECCION  INFECCION RETROVIRAL  TRANSPOSONES  TRANFERENCIA BALISTICA  ELECTROPORACION  PIGGYBACKING  LIPOFECCION
  • 32. The Sleeping Beauty (SB) transposon system terminal inverted repeats terminal inverted repeats
  • 33.
  • 34.
  • 35. (N-Nitroso-N-ethylurea) Targeting-Induced Local Lesions In Genomes Transcription Activator-Like Effector Nucleases
  • 37. yeast transcription factor specific areas of the fish tissue progeny of this cross Lasting transcriptional activation Heberlein et al.,2004 GAL4 DNA-binding motif (upstream activating sequence - UAS) Stable transgenic line 1 ACTIVATOR Stable transgenic line 2 EFFECTOR Tissue-specific expression Lasting activation Promoter Drives the GOI KalTA4 Kal TA4 Kal TA4
  • 38. Wong & Van Eenennaam, 2008
  • 40. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated Cas9 Nucleasas dirigidas por RNA
  • 41.
  • 42. 1983 EN RESPUESTA A LOS PROBLEMAS ENFRENTADOS POR LA INDUSTRIA ACUICOLA CANADIENSE
  • 43. DOS MANERAS POTENCIALES EN LA QUE LA TECNOLOGIA DE TRANSGENICOS PODRIA SER USADA PARA RESOLVER EL PROBLEMA 1) PRODUCIR SALMONES RESISTENTES AL FRÍO 2) ELEVAR LAS TASAS DE CRECIMIENTO, PARA EVITAR LA NECESIDAD DE CULTIVARLOS EN INVIERNO
  • 44. GH Regulación del metabolismo de nitrógeno, lípidos, carbohidratos y minerales Estimula el apetito Mejora la FCR Promueve la mobilización de lípidos Promueve la retención de nitrógeno Promueve la incorporación de aminoácidos en los tejidos Promueve el desarrollo y maduracióndel intestino Mejora la capacidad digestiva
  • 45. DOS GENES OFRECEN EXPECTATIVAS DE GRAN VALOR PARA LA ACUACULTURA GH y AFP LA TRANFERENCIA DE ESTOS GENES EN ADICION A SU INCORPORACION, HERENCIA Y PERSISTENCIA EN LOS HUESPEDES REQUIERE ADEMAS DE: EXPRESION DEL TRANSGEN EN LOS TEJIDOS APROPIADOS NIVEL DE EXPRESION SUFICIENTE PARA MEDIAR UNA ACCION FISIOLOGICA CAPACIDAD DE MANIPULAR LOS NIVELES DE EXPRESION IN VIVO
  • 46. Environment Somatic Growth GONADAL STEROIDS CORTISOL IGF INSULIN GTH TSH ACTH GH CATECHOLAMINES GnRH TRH CRF GHRH T4 T3 SRIF GH
  • 47. • Los transgenes de GH se incorporan en prácticamente todos los tejidos • Ausencia de expresión de GH en la pituitaria de algunas especies (regulación negativa) - Niveles plasmáticos de IGFs son muy bajos - Altos niveles de mRNA de los IGFs en los hepatocitos y el músculo – Acción autócrina o parácrina Funcionamiento diferente del sistema endócrino de los peces transgénicos (GH)
  • 48. • El apetito en los peces transgénicos no esta directamente influenciado por los IGFs • Se han observado niveles bajos de Grehlina y del neuropeptido Y (moléculas orexigénicas) en peces transgénicos, a pesar de mostrar una gran motivación por alimentarse • Los niveles de CCK (hormona anorexigénica) cerebrales no fluctúan estacionalmente, como sucede con los peces no transgénicos • Continúan alimentándose aún en invierno, contrariamente a los no transgénicos APETITO
  • 49.
  • 51.
  • 52. Lee et al. (2009)
  • 57. Misgurnus mizolepis (Cypriniformes, Cobitidae) Promotor β- actina ligado a GH Crecimiento >35 veces (Nam et al. 2001)
  • 58.
  • 59. Notothenioid and Channicthyid fish Antifreeze
  • 60. n= 4 to 88 m.w.= 2,600 to 56,000 Da
  • 61.
  • 62.
  • 63. Freezing Avoidance in Frigid Marine Environment
  • 64.
  • 65.
  • 66.
  • 67. Saffron cod E. gracilis Polar cod B. saida Greenland cod G. ogac Atlantic cod G. morhua AAT-AAT-PAT-AAT-PAT-AAT-AAT-etc disac disac disac disac disac disac disac AAT-AAT-PAT-AAT-PAR-AAT-AAT-etc disac disac disac disac disac disac Antarctic notothenioid : Northern cod : The other half of the story: AFGP in Northern Gadids (Cods)
  • 68.
  • 69. Antifreeze Peptides (4 types) • Type I: 3-4 kDa • Type II: ~14 kDa • Type III: 7 kDa 14 kDa • Type IV: ~15 kDa
  • 70.
  • 71.
  • 72. (Chan et al, 2010) Pitx1 gene
  • 73. • No hay riesgo de virus o priones • Se producen de 5 a 27 mg de proteina recombinante por g de músculo • Comparable con lo que se produce en leche (10mg/g) • Factor de coagulación VII • Vacuna contra Hepatitis B • gLH en huevos de trucha • IGF1 y 2 en huevos de cebra
  • 74. 1. Promotor de vtg y CYP1 • Sensibles a distintos disruptores ambientales estrogénicos (estradiol, dietilstibestrol, bisfenol- A etc.) 2. Promotor de proteinas de shock calórico (hsp25) sensible a metales pesados 3. Diferentes construcciones sensibles a agentes oxidantes
  • 75.
  • 76.
  • 77.
  • 78. Fang & Miller, 2012 Radicales libres O2 Peroxidación de lípidos
  • 79. • Tilapias transgénicas que producen insulina humanizada en sus corpúsculos de Brockmann • Encapsulamiento de los corpúsculos para evitar rechazo • Éxito en el transplante a ratones diabéticos • Se restauraron los niveles de glucosa adecuados Wright & Pohajdak, 2000
  • 81. Induction of liver tumors in TO(Myc) fish. Li Z et al. Dis. Model. Mech. 2013;6:414-423 ©2013 by The Company of Biologists Limited
  • 82. • Modelos para estudios sobre cancer • Mismos mecanismos básicos de regulación genética en carcinogénesis • Expresión de oncogenes Langenau et al., 2003, Chen, 2007
  • 83. ANGIOGÉNESIS Cross et al. 2003 RESPUESTA ANTI-INFLAMATORIA LIU et al. 2003
  • 84. • Expresión de proteinas de IHNV, VHSV • Inmunidad por expresión de péptidos anti- bacterianos • Imunizados antes de que haya madurado su sistema inmunológico • Cecropina-B (promotor de CMV), péptidos catiónicos de Hyalophora cecropia en bagre y medaka • Propiedades bacteriolíticas y anti-virales • Gen de la lactoferrina (promotor de b-actina) en carpa • Lisozima de pollo con mayor actividad bacteriolítica (promotor de keratina) en cebra y platija Hew et al., 1995; Hepell & Davis, 2000; Dunham et al., 2002, Sarmasik et al, 2002; Lorenzen & LaPatra, 2005; Yazawa et al., 2006
  • 86. • Metabolismo de Carbohidratos • Trucha: transportador de glucosa, Hexokinasa • Metabolismo de Lípidos • Cebra: D5 Y D6-desaturasa • Metabolismo de Fosforo • Medaka: fitasa • Metabolismo Vitamina C • Trucha: L-gulono-gamma-lactona oxidasa Krasnov et al., 1998; Hostetler and Muir 2004; Heather et al., 2005 Alimuddin et al., 2005, 2007;
  • 87.
  • 89. MODIFICACION DE HABITATS PREFERENCIALES MODIFICACION DE AREAS DE REPARTICION COMPETENCIA INTRA-E-INTER- ESPECIFICA COLONIZACION DE NUEVOS MEDIOS TOLERANCIA A FACTORES FISICOS DEL MEDIO
  • 90.
  • 91. PURGA GMO tiene una menor adaptación – el más seguro Pew, 2003
  • 92. EXPANSION GMO tiene igual o mayor adaptación Pew, 2003
  • 93. GEN DE TROYA Efectos antagónícos en dos componentes adaptativos propician el descenso de la población Pew, 2003
  • 94. • MACHOS DE MEDAKA TRANSGENICOS (GH)  4 VECES MAYOR PROBABILIDAD DE REPRODUCIRSE  30% MAS SUCEPTIBLES A MORIR QUE SUS SIBLINGS NO TRANSGENICOS • MODELO  60 TRANSGENICOS MEZCLADOS EN UNA POBLACION DE 60,000 NO TRANSGENICOS  40 GENERACIONES CON PREVALENCIA DE TRANSGENICOS CON MAYOR ÉXITO REPRODUCTIVO  PRODUCCION CONTINUA DE CRIAS QUE MUEREN PRECOZMENTE • EXTINCION DE LA POBLACION 2004
  • 95. wild-type medaka transgenic medaka top view side views Pennington et al., 2010
  • 96. 1. Alimento abundante y sin predación mayor número de transgénicos 2. Alimento abundante y predación 3. Alimento escaso sin predación 4. Alimento escaso y predación
  • 97. • ¿Purga? • ¿Expansión? • ¿Gen de Troya? Las truchas arco iris transgénicas son 37 más grandes al alcanzar la madurez sexual y tienen una menor viabilidad juvenil
  • 98. • ¿Ingestión sin riesgos? • Equivalencia sustancial • No hay estudios de largo plazo • Ecosistemas naturales • Medidas de contención • Construcciones que podrían representar un riesgo • GH, recombinasas, resistencia a enfermedades • Especies nativas (endémicas) • Especies con potencial invasor • Técnologías emergentes • Análisis de riesgo
  • 99. • El nivel de contención requerido para un transgen en particular dependerá del riesgo potencial que pueda causar en la naturaleza (Devlin et al., 2006) • NRC (2004) recomendó el uso simultaneo de múltiples estrategias de contención
  • 100. Además de escapes masivos, 2% de los salmones cultivados escapan Se estiman 2 millones de escapes de salmones al año en el Atlántico Norte (Norwegian Directorate of Fisheries 2009) Wong and Van Eenennaam, 2008
  • 101. $ $$ $
  • 102. • Se diseña para inducir el 100% de mortalidad – Cambios de temperatura – pH – Tratamiento con cloro, bromuro, ozono • Tratamiento de efluentes y restauración
  • 103.  NUEVOS ORGANISMOS PARA LOS CUALES:  NO EXISTE INFORMACION RELEVANTE EN CUANTO A SU COMPORTAMIENTO EN EL AMBIENTE NATURAL  TAMPOCO EXISTE NINGUNA BASE TEORICA APROPIADA PARA SU PREDICCION  SE HAN PROPUESTO RESTRICCIONES QUE IMPLICAN LA UTILIZACION DE ORGANISMOS INFERTILES
  • 104. Weber & Lee, 2014
  • 105. METODOS DE ESTERILIZACION COMUNES METODOS REDUCCION DE LA FERTILIDAD EFICACIDAD TRIPLOIDIA HEMBRAS SI IMPORTANTE POSIBILIDAD DE PRODUCCION DE NO ESTERILES, SUCEPTIBLES A ENFERMEDADES TRIPLOIDIA MACHOS NO TRATAMIENTO CON ANDROGENOS SI Posibilidad de NO estériles significativa PRODUCCION DE HIBRIDOS SI ?
  • 106. • A escala comercial raramente se alcanza el 100% • Varían según – la especie, – la variedad, – el método, – la calidad de los gametos – y el sexo • Aunque se retarda el crecimeinto ovárico, se han reportado casos de ovocitos maduros • Variabilidad en el crecimiento, disminución de la resistencia las enfermedades y el stress
  • 107.  PRINCIPAL FUNCION  ESTIMULACION DE LA SINTESIS Y LIBERACION DE GONADOTROPINAS  LIBERACION  DE LAS TERMINACIONES NERVIOSAS A LA PITUITARIA POR MEDIO DE UN SISTEMA PORTA PRIMITIVO  ESTRUCTURA PRIMARIA
  • 108. Uzbekova et al., 2000; Maclean et al., 2003; Hu et al., 2007; Xu et al., 2011
  • 109. De dos a tres formas en el cerebro de los peces Uno especie- específico GnRH1, GnRH2 (alias chicken GnRH-II ó cGnRH-II), GnRH3 (alias GnRH de salmón or sGnRH) En los que tienen tres el GnRH1 es el que se libera a la pituitaria En los peces cebra solo hay 2 (GnRH2 y GnRH3) El GnRH3 se libera a la pituitaria En las truchas hay dos genes para el GnRH3, GNRH3A y GNRH3B, localizados en diferentes cromosomas pero codifican para lel mismo péptido
  • 110. Se debe conocer cual es el predominante para su correcta inactivación Están relacionados con los niveles de GH y juegan un importante papel en el desarrollo En los cebra el knockeo del GnRH2 ó GnRH3, ó ambos resultan en embriones con defectos en el cerebro, ojos o corazón
  • 111. • No inhiben por completo la expresión genética – Son eficaces contra especies relativamente raras de RNAm • Vida media del RNA muy corta • Con la incompatibilidad de unas cuantas bases (1 a 4) no se alcanzan los resultados esperados • Efectos colaterales tóxicos no específicos • Reemplazo continuo de mRNAs por nuevas transcripciones
  • 112. Verdadero efecto de interferencia ya que se knockean varios genes aparte del GOI – Anormalidades fenotípicas en varios estudios Oates et al., 2000; Zhao et al., 2001
  • 113. • Análogos de DNA que actúan – bloqueando la traducción evitando que se unan las sub- unidades ribosómicas – alteran el splicing del pre- mRNA generando transcritos aberrantes que dan lugar a genes no funcionales • Tienen sitios de reconocimiento para los ribosomas y utilizan fosforodiamidato – Mayor afinidad por el RNA que el mismo RNA • No los degradan las RNAsas Heasman, 2002
  • 114. Chen et al., 2004 Un anillo morfolino sustituye a la ribosa o desoxiribosa
  • 115.
  • 116. Wong & Van Eenennaam, 2008 Activador transcripcional responsivo a la tetraciclina
  • 117. Hu et al., 2010 Nitroreductase metronidazole cytotoxin zona pellucida atrophy of gonads
  • 118. Xiong et al., 2013
  • 119. Richardson & Lehman, 2010 gradient of stromal-derived factor 1a (Sdf1a) provides the directional cue that guides the migration of the primordial germ cells (PGCs) to the gonadal tissue
  • 120. Inducción de la expresión ubicuita de Sdf1a en embriones de Danio rerio y disrupción del patrón normal de migración de las PGCs Wong & Collodi, 2013 CONTROL
  • 121. Zhang et al., 2014 (Tol2-CMV-GFP-pA-CMV-gal4-pA-Tol2) (Tol2-CMV-RFP-pA-5 3 UAS-as/dnd-pA-Tol2) transcription of antisense dnd disrupted the migration of PGCs, led to their apoptosis dead end
  • 122. • Con niveles variables de fertilidad, la presión de selección favorecería a los peces fértiles (Muir and Howard, 2004) • Debido a que en las operaciones acuícolas se manejan números muy elevados de animales, aún eventos raros de reversión a la fertilidad serían probables (Wong & Van Eenennaam , 2008)
  • 123.
  • 124. • Los individuos crecen tan rápido como su fisiología se los permite a pesar de las posibles ventajas de ser grande • Al llevarlos más allá de su crecimiento hay repercusiones somáticas • Un de las razones es que el crecimiento cuesta: – Reducción en la velocidad de natación – Habilidad disminuida para hipo-osmoregular – Alteraciones hormonales (IGFs, Insulina) – Envejecimiento precoz (desgaste de los telómeros) – Menor cantidad de esperma Farrel et al, 1997;Devlin, et al., 2000; DeLiang etal., 2007; Li et al., 200; Pauliny et al., 2015
  • 125. • Malformación vertebral • Malformación craneal • Acromegalia • Prognatismo • Sobre crecimiento de los opérculos • Diferencia de color • Alteración en el tamaño y forma de las aletas • Eritrocitos más pequeños, menos hemoglobina, más colesterol y triglicéridos • Menor crecimiento • Poca discriminación de presas • Mayor habilidad reproductiva* Devlin et al., 1995; Nam et al., 2002; Sundström et al., 2004; Li et al, 2009; Darek et al., 2011; Fitzpatrick et al., 2011; Noh et al, 2012 • Menor frecuencia reproductiva, menor fidelidad en los nidos, menor fertilización • Menor supervivencia ante predación • Menor viabilidad • Disminución de la resistencia a enfermedades* • Alteraciones en diferentes órganos (intestino, branquias, músculo, hígado) • Menor tendencia a formar cardúmenes
  • 126.
  • 127.
  • 128.
  • 129.
  • 130.
  • 131.
  • 132.
  • 133.
  • 134.
  • 135.
  • 136.
  • 137. Hong et al., 2011 CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
  • 138.
  • 139.
  • 140.
  • 141. Yazawa 2012 small body sizes and short generation times
  • 143.
  • 144. • Gen introducido • Especie transformada y características • Estrategia de contención • Movilidad de la especies (e.g. especies migradoras) • Habilidad para volverse feral • Aptitud relativa de la especie • Ecosistema receptor • Interacciones genotipo-ambiente • Estabilidad de la comunidad receptora Van Eenennaam & Olin, 2006
  • 145. • Viabilidad juvenil • Viabilidad en la etapa adulta • Edad a la madurez sexual • Fecundidad femenina • Fertilidad masculina • Éxito reproductivo Muir and Howard 2001 net fitness methodology
  • 146. • Medio ambiente natural • Incertidumbre • Experimentos en acuarios no proveen datos definitivos para AR • Tres aproximaciones 1. Cámaras de comportamiento, túneles de nado, instalaciones para reto de enfermedades • Características fisiológicas y comportamentales individuales 2. Sistemas semi-naturales • Microcosmos, mesocosmos (alimentación, predación, nado, efectos metabólicos y energéticos) 3. Liberación en la naturaleza de animales equivalentes • Variedades con crecimiento rápido o con implantes de GH
  • 147. • Los salmones transgénicos no afectan a las poblaciones no-transgénicas cuando hay alta disponibilidad de alimento (7.5% de su biomasa) • Ante la escases de alimento dominaban los transgénicos • Les ganaban el alimento a los no-transgénicos • Mostraban un fuerte componente agonístico y canibalístico hacia los no-transgénicos • Aún así mayor mortalidad de transgénicos • Diferencias fenotípicas entre organismos silvestres y cultivados Devlin et al., 2004
  • 148. Devlin et al., 2006
  • 149. • Reducción de nado afectaría la susceptibilidad a ser predado • ¿En que grado? • Interacciones sinérgicas y antagónicas derivadas de los efectos pleiotrópicos del transgen Mayor apetito y rápido desarrollo Mayor susceptibilidad a la predación y menor supervivencia vs
  • 150. EFECTO DE GH SOBRE VARIEDADES SELECCIONADAS Devlin et al., 2001
  • 151.
  • 153.  MARCADORES GENETICOS  INCLUYEN SECUENCIAS GENETICAS COMPLETAMENTE INACTIVASYTRIVIALES ESTAS SECUENCIAS SON COMPLETAMENTEARTIFICIALESY CONSISTEN DE HOMOPOLIMEROS DE DNA  ESTOS PECES AL SER LIBERADOSY AUNQUE SE LLEGARAN A REPRODUCIR, SU PROGENIETAMBIEN LLEVARIA EL MARCADOR GENETICO, ESPECIALMENTE SI LOSTRANSGENICOS FUERAN HOMOZIGOTICOS PARA EL MARCADOR
  • 154.
  • 155.
  • 156.
  • 157. EL CASO DE GloFish (Yorktown Technologies, Austin, TX) • FDA determina no regular los Glofish en base a que los cebra no presentan riesgo para la alimentación y porque los cebra no transgénicos no han ejercido impactos sobre el ambiente • No se permitieron en California • Se prohibió su venta, posesión e importación • Yorktown Technologies solicita una excepción • Los científicos del Departamento de Caza y Pesca recomiendan aprobar una excepción • Fue denegada por la Comisión de Caza y Pesca por inquietudes éticas • La Comisión vota posteriormente y decide aprobar la excepción • La ley estatal de California requiere de un estudio completo de impacto ambiental • Yorktown Technologies decide no seguir adelante debido al costo e incertidumbre del procedimiento de impacto ambiental
  • 158.
  • 159.
  • 160. Salmón AquadvantageTM • Triploide • Dos debilidades: • 1.-La dificultad para verificar consistentemente la triploidía en grandes poblaciones • 2.- Interferencia reproductiva con poblaciones silvestres y competencia NRC, 2004