5. • Mejoras económicas en el cultivo de peces
– incremento en la tasa de crecimiento
– incremento en la porción comestible
– mejores tasas de conversión alimenticia
– utilización de dietas de bajo costo (carbohidratos)
– resistencia al frío y a la congelación
– resistencia alas enfermedades
– mayor fecundidad
– control de la reproducción
– menor agresión
• Diseño de peces para el mercado
– apariencia externa: peces para alimentación ó peces ornamentales
– sabor, textura
– composición de ácidos grasos
• Peces como bioreactores
– producción de compuestos de importancia médica
• Investigación básica, desarrollo, crecimiento y reproducción
Aleström & de la Fuente, 1999
10. VENTAJAS DE LA TRANSFERENCIA DE
GENES EN LOS PECES
ALTA FECUNDIDAD
GAMETOS FACILMENTE DISPONIBLES
(DESOVES DE MILES DE HUEVOS)
MAYOR NUMERO DE INDIVIDUOS
TRANSGENICOS PRODUCIDOS
FERTILIZACION E INCUBACION
EXTERNA
SE EVITAN LOS PROBLEMAS DE
FERTILIZACION IN VITRO Y
REIMPLANTACION
LA FERTILIZACION SE PUEDE RETRASAR
POR UN PERIODO DE TIEMPO
CONSIDERABLE DESPUES DE LA COLECTA
DE HUEVOS
(DIAS EN EL CASO DE SALMONES) SIN
VARIACIONES APRECIABLES EN SU
VIABILIDAD
11. GRAN TAMAÑO
FACILITA EL MANEJO,
ROBUSTOS Y GRANDES
(DE 1 A 7 mm DE DIAMETRO)
FRECUENCIAS DE
INTEGRACION
IGUALES O MAYORES
A LAS REGISTRADAS
PARA RATONES (10 –
70 %)
ACCION DE
SECUENCIAS
REGULADORAS
SIMILARES A LAS
DE LOS
VERTEBRADOS
SUPERIORES
12. Danio rerio Oryzias latipes
• Tiempo generacional corto
• Facilidad y costo de mantenimiento
• Rápido desarrollo
• Transparencia de los embriones
CEBRA MEDAKA
13.
14. GENES REPORTEROS
d-cristalino de pollo
CAT
PARTICULARMENTE UTIL
EXPRESION PUEDE SER DETECTADA A NIVELES
EXTREMADAMENTE BAJOS
LA ACTIVIDAD ES MAS FACIL DE DETECTAR Y
CUANTIFICAR QUE LA SECUENCIA DE DNA
b-GALACTOSIDASA
TEST COLORIMETRICO ALTAMENTE
ESPECIFICO
Luciferasa
Sacrificio
19. • Promotor de la queratina krt8 (solo visible bajo luz fluorescente) y
un promotor específico de las células musculares mylz2 (visible sin
necesidad de luz fluorescente)
• Mezclaron líneas de diferentes colores
• Y utilizaron promotores con expresión gradual
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26. VENTAJAS
Observación en vivo de la expresión de los
transgenes
Se pueden utilizar los mismos embriones a
diferentes etapas para obtener un patrón dinámico
de expresión
27.
28. Kaede
Aislada del coral
Trachyphylia
geoffroyi
Fotoconversión
irreversible de
verde a rojo bajo
luz ultravioleta o
violeta
37. yeast transcription factor
specific areas of the fish tissue
progeny of this cross
Lasting
transcriptional activation
Heberlein et al.,2004
GAL4 DNA-binding motif
(upstream activating sequence - UAS)
Stable transgenic line 1
ACTIVATOR
Stable transgenic line 2
EFFECTOR
Tissue-specific expression Lasting activation
Promoter
Drives the GOI
KalTA4
Kal
TA4
Kal
TA4
42. 1983 EN RESPUESTA A LOS PROBLEMAS ENFRENTADOS
POR LA INDUSTRIA ACUICOLA CANADIENSE
43. DOS MANERAS POTENCIALES EN LA
QUE LA TECNOLOGIA DE
TRANSGENICOS PODRIA SER USADA
PARA RESOLVER EL PROBLEMA
1) PRODUCIR SALMONES RESISTENTES AL
FRÍO
2) ELEVAR LAS TASAS DE CRECIMIENTO,
PARA EVITAR LA NECESIDAD DE
CULTIVARLOS EN INVIERNO
44. GH
Regulación del
metabolismo de
nitrógeno, lípidos,
carbohidratos y
minerales
Estimula el apetito
Mejora la FCR
Promueve la
mobilización de
lípidos
Promueve la
retención de
nitrógeno
Promueve la
incorporación de
aminoácidos en
los tejidos
Promueve el
desarrollo y
maduracióndel
intestino
Mejora la
capacidad
digestiva
45. DOS GENES OFRECEN EXPECTATIVAS DE
GRAN VALOR PARA LA ACUACULTURA
GH y AFP
LA TRANFERENCIA DE ESTOS GENES EN ADICION A SU
INCORPORACION, HERENCIA Y PERSISTENCIA EN LOS
HUESPEDES REQUIERE ADEMAS DE:
EXPRESION
DEL
TRANSGEN EN
LOS TEJIDOS
APROPIADOS
NIVEL DE
EXPRESION
SUFICIENTE
PARA MEDIAR
UNA ACCION
FISIOLOGICA
CAPACIDAD DE
MANIPULAR
LOS NIVELES
DE EXPRESION
IN VIVO
47. • Los transgenes de GH se
incorporan en prácticamente
todos los tejidos
• Ausencia de expresión de GH
en la pituitaria de algunas
especies (regulación negativa)
- Niveles plasmáticos de IGFs
son muy bajos
- Altos niveles de mRNA de
los IGFs en los hepatocitos y
el músculo
– Acción autócrina o parácrina
Funcionamiento diferente del
sistema endócrino de los peces transgénicos (GH)
48. • El apetito en los peces transgénicos no esta
directamente influenciado por los IGFs
• Se han observado niveles bajos de Grehlina
y del neuropeptido Y (moléculas
orexigénicas) en peces transgénicos, a
pesar de mostrar una gran motivación por
alimentarse
• Los niveles de CCK (hormona
anorexigénica) cerebrales no fluctúan
estacionalmente, como sucede con los
peces no transgénicos
• Continúan alimentándose aún en invierno,
contrariamente a los no transgénicos
APETITO
73. • No hay riesgo de virus o priones
• Se producen de 5 a 27 mg de
proteina recombinante por g de
músculo
• Comparable con lo que se produce
en leche (10mg/g)
• Factor de coagulación VII
• Vacuna contra Hepatitis B
• gLH en huevos de trucha
• IGF1 y 2 en huevos de cebra
74. 1. Promotor de vtg y CYP1
• Sensibles a distintos disruptores ambientales
estrogénicos (estradiol, dietilstibestrol, bisfenol-
A etc.)
2. Promotor de proteinas de shock calórico
(hsp25) sensible a metales pesados
3. Diferentes construcciones sensibles a
agentes oxidantes
79. • Tilapias transgénicas que producen insulina
humanizada en sus corpúsculos de
Brockmann
• Encapsulamiento de los corpúsculos para evitar
rechazo
• Éxito en el transplante a ratones diabéticos
• Se restauraron los niveles de glucosa adecuados
Wright & Pohajdak, 2000
82. • Modelos para
estudios sobre
cancer
• Mismos
mecanismos
básicos de
regulación
genética en
carcinogénesis
• Expresión de
oncogenes
Langenau et al., 2003, Chen, 2007
84. • Expresión de proteinas de IHNV, VHSV
• Inmunidad por expresión de péptidos anti-
bacterianos
• Imunizados antes de que haya madurado su sistema
inmunológico
• Cecropina-B (promotor de CMV), péptidos catiónicos de
Hyalophora cecropia en bagre y medaka
• Propiedades bacteriolíticas y anti-virales
• Gen de la lactoferrina (promotor de b-actina) en carpa
• Lisozima de pollo con mayor actividad bacteriolítica
(promotor de keratina) en cebra y platija
Hew et al., 1995; Hepell & Davis, 2000; Dunham et al., 2002, Sarmasik et al, 2002; Lorenzen & LaPatra, 2005; Yazawa et al., 2006
93. GEN DE TROYA
Efectos antagónícos en dos componentes adaptativos propician el
descenso de la población Pew, 2003
94. • MACHOS DE MEDAKA TRANSGENICOS (GH)
4 VECES MAYOR PROBABILIDAD DE REPRODUCIRSE
30% MAS SUCEPTIBLES A MORIR QUE SUS SIBLINGS
NO TRANSGENICOS
• MODELO
60 TRANSGENICOS MEZCLADOS EN UNA POBLACION
DE 60,000 NO TRANSGENICOS
40 GENERACIONES CON PREVALENCIA DE
TRANSGENICOS CON MAYOR ÉXITO REPRODUCTIVO
PRODUCCION CONTINUA DE CRIAS QUE MUEREN
PRECOZMENTE
• EXTINCION DE LA POBLACION
2004
96. 1. Alimento abundante y sin predación mayor número de transgénicos
2. Alimento abundante y predación
3. Alimento escaso sin predación
4. Alimento escaso y predación
97. • ¿Purga?
• ¿Expansión?
• ¿Gen de
Troya?
Las truchas arco iris transgénicas son 37 más grandes al alcanzar la
madurez sexual y tienen una menor viabilidad juvenil
98. • ¿Ingestión sin riesgos?
• Equivalencia sustancial
• No hay estudios de largo plazo
• Ecosistemas naturales
• Medidas de contención
• Construcciones que podrían representar un riesgo
• GH, recombinasas, resistencia a enfermedades
• Especies nativas (endémicas)
• Especies con potencial invasor
• Técnologías emergentes
• Análisis de riesgo
99. • El nivel de contención requerido para un
transgen en particular dependerá del
riesgo potencial que pueda causar en la
naturaleza (Devlin et al., 2006)
• NRC (2004) recomendó el uso simultaneo
de múltiples estrategias de contención
100. Además de escapes masivos, 2% de los salmones cultivados escapan
Se estiman 2 millones de escapes de salmones al año en el Atlántico Norte
(Norwegian Directorate of Fisheries 2009)
Wong and Van Eenennaam, 2008
102. • Se diseña para inducir
el 100% de mortalidad
– Cambios de
temperatura
– pH
– Tratamiento con cloro,
bromuro, ozono
• Tratamiento de
efluentes y
restauración
103. NUEVOS ORGANISMOS PARA LOS CUALES:
NO EXISTE INFORMACION RELEVANTE EN CUANTO A SU
COMPORTAMIENTO EN EL AMBIENTE NATURAL
TAMPOCO EXISTE NINGUNA BASE TEORICA APROPIADA
PARA SU PREDICCION
SE HAN PROPUESTO RESTRICCIONES QUE
IMPLICAN LA UTILIZACION DE ORGANISMOS
INFERTILES
105. METODOS DE ESTERILIZACION
COMUNES
METODOS
REDUCCION DE LA
FERTILIDAD
EFICACIDAD
TRIPLOIDIA HEMBRAS SI
IMPORTANTE
POSIBILIDAD DE
PRODUCCION DE NO
ESTERILES,
SUCEPTIBLES A
ENFERMEDADES
TRIPLOIDIA MACHOS NO
TRATAMIENTO
CON
ANDROGENOS
SI Posibilidad de NO
estériles significativa
PRODUCCION
DE HIBRIDOS
SI
?
106. • A escala comercial raramente se alcanza el 100%
• Varían según
– la especie,
– la variedad,
– el método,
– la calidad de los gametos
– y el sexo
• Aunque se retarda el crecimeinto ovárico, se han
reportado casos de ovocitos maduros
• Variabilidad en el crecimiento, disminución de la
resistencia las enfermedades y el stress
107. PRINCIPAL FUNCION
ESTIMULACION DE LA SINTESIS Y LIBERACION DE
GONADOTROPINAS
LIBERACION
DE LAS TERMINACIONES NERVIOSAS A LA PITUITARIA POR
MEDIO DE UN SISTEMA PORTA PRIMITIVO
ESTRUCTURA
PRIMARIA
108. Uzbekova et al., 2000; Maclean et al., 2003; Hu et al., 2007; Xu et al., 2011
109. De dos a tres formas en el cerebro de los peces
Uno especie- específico GnRH1,
GnRH2 (alias chicken GnRH-II ó cGnRH-II),
GnRH3 (alias GnRH de salmón or sGnRH)
En los que tienen tres el GnRH1 es el que se libera a la
pituitaria
En los peces cebra solo hay 2 (GnRH2 y GnRH3)
El GnRH3 se libera a la pituitaria
En las truchas hay dos genes para el GnRH3, GNRH3A y
GNRH3B, localizados en diferentes cromosomas pero
codifican para lel mismo péptido
110. Se debe conocer cual es el predominante para su
correcta inactivación
Están relacionados con los niveles de GH y juegan un
importante papel en el desarrollo
En los cebra el knockeo del GnRH2 ó GnRH3, ó ambos
resultan en embriones con defectos en el cerebro, ojos o
corazón
111. • No inhiben por completo la expresión
genética
– Son eficaces contra especies relativamente raras
de RNAm
• Vida media del RNA muy corta
• Con la incompatibilidad de unas cuantas
bases (1 a 4) no se alcanzan los resultados
esperados
• Efectos colaterales tóxicos no específicos
• Reemplazo continuo de mRNAs por nuevas
transcripciones
112. Verdadero
efecto de
interferencia ya
que se knockean
varios genes
aparte del GOI
– Anormalidades
fenotípicas en
varios estudios
Oates et al., 2000; Zhao et al., 2001
113. • Análogos de DNA que
actúan
– bloqueando la traducción
evitando que se unan las sub-
unidades ribosómicas
– alteran el splicing del pre-
mRNA generando transcritos
aberrantes que dan lugar a genes
no funcionales
• Tienen sitios de
reconocimiento para los
ribosomas y utilizan
fosforodiamidato
– Mayor afinidad por el RNA que el
mismo RNA
• No los degradan las
RNAsas
Heasman, 2002
114. Chen et al., 2004
Un anillo morfolino sustituye a la ribosa o
desoxiribosa
115.
116. Wong & Van Eenennaam, 2008
Activador transcripcional
responsivo a la tetraciclina
117. Hu et al., 2010
Nitroreductase
metronidazole
cytotoxin
zona pellucida
atrophy of gonads
119. Richardson & Lehman, 2010
gradient of stromal-derived factor 1a (Sdf1a)
provides the directional cue that guides the
migration of the primordial germ cells (PGCs)
to the gonadal tissue
120. Inducción de la expresión ubicuita de
Sdf1a en embriones de Danio rerio y
disrupción del patrón normal de migración
de las PGCs
Wong & Collodi, 2013
CONTROL
121. Zhang et al., 2014
(Tol2-CMV-GFP-pA-CMV-gal4-pA-Tol2) (Tol2-CMV-RFP-pA-5 3 UAS-as/dnd-pA-Tol2)
transcription of
antisense dnd
disrupted the
migration of PGCs,
led to their
apoptosis
dead end
122. • Con niveles variables de fertilidad, la presión
de selección favorecería a los peces fértiles
(Muir and Howard, 2004)
• Debido a que en las operaciones acuícolas
se manejan números muy elevados de
animales, aún eventos raros de reversión a
la fertilidad serían probables (Wong & Van
Eenennaam , 2008)
123.
124. • Los individuos crecen tan rápido como su
fisiología se los permite a pesar de las posibles
ventajas de ser grande
• Al llevarlos más allá de su crecimiento hay
repercusiones somáticas
• Un de las razones es que el crecimiento cuesta:
– Reducción en la velocidad de natación
– Habilidad disminuida para hipo-osmoregular
– Alteraciones hormonales (IGFs, Insulina)
– Envejecimiento precoz (desgaste de los telómeros)
– Menor cantidad de esperma
Farrel et al, 1997;Devlin, et al., 2000; DeLiang etal., 2007; Li et al., 200; Pauliny et al., 2015
125. • Malformación vertebral
• Malformación craneal
• Acromegalia
• Prognatismo
• Sobre crecimiento de los
opérculos
• Diferencia de color
• Alteración en el tamaño y
forma de las aletas
• Eritrocitos más pequeños,
menos hemoglobina, más
colesterol y triglicéridos
• Menor crecimiento
• Poca discriminación de presas
• Mayor habilidad reproductiva*
Devlin et al., 1995; Nam et al., 2002; Sundström et al., 2004; Li et al, 2009; Darek et al., 2011; Fitzpatrick et al., 2011; Noh et al, 2012
• Menor frecuencia
reproductiva, menor
fidelidad en los nidos,
menor fertilización
• Menor supervivencia
ante predación
• Menor viabilidad
• Disminución de la
resistencia a
enfermedades*
• Alteraciones en
diferentes órganos
(intestino, branquias,
músculo, hígado)
• Menor tendencia a
formar cardúmenes
144. • Gen introducido
• Especie transformada y características
• Estrategia de contención
• Movilidad de la especies (e.g. especies migradoras)
• Habilidad para volverse feral
• Aptitud relativa de la especie
• Ecosistema receptor
• Interacciones genotipo-ambiente
• Estabilidad de la comunidad receptora
Van Eenennaam & Olin, 2006
145. • Viabilidad juvenil
• Viabilidad en la etapa adulta
• Edad a la madurez sexual
• Fecundidad femenina
• Fertilidad masculina
• Éxito reproductivo
Muir and Howard 2001
net fitness methodology
146. • Medio ambiente natural
• Incertidumbre
• Experimentos en acuarios no proveen datos definitivos
para AR
• Tres aproximaciones
1. Cámaras de comportamiento, túneles de nado,
instalaciones para reto de enfermedades
• Características fisiológicas y comportamentales individuales
2. Sistemas semi-naturales
• Microcosmos, mesocosmos (alimentación, predación, nado,
efectos metabólicos y energéticos)
3. Liberación en la naturaleza de animales equivalentes
• Variedades con crecimiento rápido o con implantes de GH
147. • Los salmones transgénicos no afectan a
las poblaciones no-transgénicas cuando
hay alta disponibilidad de alimento (7.5%
de su biomasa)
• Ante la escases de alimento dominaban
los transgénicos
• Les ganaban el alimento a los no-transgénicos
• Mostraban un fuerte componente agonístico y
canibalístico hacia los no-transgénicos
• Aún así mayor mortalidad de transgénicos
• Diferencias fenotípicas entre organismos
silvestres y cultivados
Devlin et al., 2004
149. • Reducción de nado afectaría la susceptibilidad a
ser predado
• ¿En que grado?
• Interacciones sinérgicas y antagónicas
derivadas de los efectos pleiotrópicos del
transgen
Mayor apetito y rápido desarrollo Mayor susceptibilidad a la predación
y menor supervivencia
vs
150. EFECTO DE GH SOBRE VARIEDADES
SELECCIONADAS
Devlin et al., 2001
153. MARCADORES GENETICOS
INCLUYEN SECUENCIAS GENETICAS
COMPLETAMENTE INACTIVASYTRIVIALES
ESTAS SECUENCIAS SON COMPLETAMENTEARTIFICIALESY
CONSISTEN DE HOMOPOLIMEROS DE DNA
ESTOS PECES AL SER LIBERADOSY AUNQUE SE
LLEGARAN A REPRODUCIR, SU PROGENIETAMBIEN
LLEVARIA EL MARCADOR GENETICO,
ESPECIALMENTE SI LOSTRANSGENICOS FUERAN
HOMOZIGOTICOS PARA EL MARCADOR
154.
155.
156.
157. EL CASO DE GloFish
(Yorktown Technologies, Austin, TX)
• FDA determina no regular los Glofish en base a que
los cebra no presentan riesgo para la alimentación y
porque los cebra no transgénicos no han ejercido
impactos sobre el ambiente
• No se permitieron en California
• Se prohibió su venta, posesión e importación
• Yorktown Technologies solicita una excepción
• Los científicos del Departamento de Caza y Pesca
recomiendan aprobar una excepción
• Fue denegada por la Comisión de Caza y Pesca por
inquietudes éticas
• La Comisión vota posteriormente y decide aprobar la
excepción
• La ley estatal de California requiere de un estudio
completo de impacto ambiental
• Yorktown Technologies decide no seguir adelante
debido al costo e incertidumbre del procedimiento de
impacto ambiental
158.
159.
160. Salmón AquadvantageTM
• Triploide
• Dos debilidades:
• 1.-La dificultad para
verificar
consistentemente la
triploidía en grandes
poblaciones
• 2.- Interferencia
reproductiva con
poblaciones
silvestres y
competencia
NRC, 2004