Manual de Prácticas Fitopatología-ESAVF

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOA
UNIDAD REGIONAL NORTE

ESCUELA SUPERIOR DE AGRICULTURA DEL VALLE DEL FUERTE

MANUAL DE PRÁCTICAS DEL LABORATORIO DE
FITOPATOLOGÍA

ELABORADO POR:

Ing. Jesús G. Loredo Vega
Ing. Jorge Daniel Mena Adriano

JUAN JOSÉ RÍOS, SIN. ENERO DE 2009

INTRODUCCIÓN................................................................................................................3
1.1 IMPORTANCIA DE LAS PRÁCTICAS........................................................................3
1.2 DEFINICIÓN DEL MARCO DE ACCIÓN DEL LABORATORIO................................4
1.3 MATERIAS QUE APOYA............................................................................................4
2. CONDICIONES DEL LABORATORIO..........................................................................5
2.1 INFRAESTRUCTURA..................................................................................................5
2.2 PERSONAL ADSCRITO..............................................................................................5
2.3 EQUIPO........................................................................................................................6
2.4 MATERIALES..............................................................................................................6
2.5 REACTIVOS.................................................................................................................6
2.6 MEDIDAS DE SEGURIDAD........................................................................................7
3. REGLAMENTO..............................................................................................................7
3.1 ORGANIZACIÓN.........................................................................................................7
3.2 DERECHOS Y OBLIGACIONES.................................................................................8
3.2.1 LABORATORISTAS.................................................................................................8
3.2.2 PROFESORES..........................................................................................................8
3.2.3 ESTUDIANTES.........................................................................................................9
3.2.4 TESISTAS.................................................................................................................9
3.2.5 PERSONAS EXTERNAS..........................................................................................9
3.3 PROGRAMACIÓN DE PRÁCTICAS.........................................................................10
3.4 SANCIONES..............................................................................................................10
4.- RELACIÓN DE PRÁCTICAS.....................................................................................11
4.1 Nematología VI semestre.........................................................................................11
4.1.1 PRÁCTICA 1. OBSERVACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMÁTODOS
FITOPARÁSITOS EN EL LABORATORIO.....................................................................11
4.1.2 PRÁCTICA 2. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DEL
SUELO (ECTOPARÁSITOS)...........................................................................................13
4.1.3 PRÁCTICA 3. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DE LA
RAÍZ (ENDOPARÁSITOS)..............................................................................................16
4.1.4 PRÁCTICA 4. MANIPULACIÓN DE NEMÁTODOS..............................................18
4.1.5 PRÁCTICA 5. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMÁTODOS..............20
4.1.6 PRÁCTICA 6. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE NEMÁTODOS
FITOPARÁSITOS............................................................................................................22
4.2 Bacteriología y virología, VII semestre..................................................................24
4.2.1 PRÁCTICA 1. ESTERILIZACIÓN DE EQUIPO DE LABORATORIO Y DE
MEDIOS DE CULTIVO....................................................................................................24
4.2.2 PRÁCTICA 2. ELABORACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.................................26
4.2.3 PRÁCTICA 3. MÉTODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS.......................28
4.2.4 PRÁCTICA 4. TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA DETERMINAR FORMA, TAMAÑO
Y AGRUPACIÓN CELULAR...........................................................................................31
4.2.5 PRÁCTICA 5. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD..................................................32
4.2.6 PRÁCTICA 6. REACCIÓN DE KOH......................................................................34
4.2.7 PRÁCTICA 7. TINCIÓN DE CÁPSULA.................................................................35
4.2.8 PRÁCTICA 8. OBSERVACIÓN DE SÍNTOMAS CAUSADOS POR
FITOBACTERIAS............................................................................................................37
4.3 Fitopatología General. IV semestre........................................................................40
4.3.1 PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN Y MANEJO DE MEDIOS DE CULTIVO..............40
4.3.2 PRÁCTICA 2. AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATÓGENOS A PARTIR DE
PLANTAS ENFERMAS...................................................................................................44

4.3.3. PRÁCTICA 3. ELABORACIÓN DE MONTAJES MICROSCOPICOS DE
HONGOS FITOPATÓGENOS.........................................................................................47
4.3.4 PRÁCTICA 4. SÍNTOMAS CAUSADOS POR HONGOS FITOPATÓGENOS.....51
4.3.5 PRÁCTICA 5. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD DE HONGOS
FITOPATÓGENOS..........................................................................................................53
4.3.6 PRÁCTICA 6. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE IMPORTANCIA AGRÍCOLA
DE LA CLASE PHYCOMYCETES..................................................................................56
DE LA CLASE DEUTEROMYCETES.............................................................................58
DE LA CLASE ASCOMYCETES....................................................................................60
DE LA CLASE BASIDIOMYCETES................................................................................62
4.3.10 PRÁCTICA 10 ELABORACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO..............................64
4.3.11 PRÁCTICA 11. MÉTODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS...................66
4.3.12 PRÁCTICA 12. TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA DETERMINAR FORMA,
TAMAÑO Y AGRUPACIÓN CELULAR..........................................................................69
4.3.13 PRÁCTICA 13. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD..............................................70
FITOPARÁSITOS EN EL LABORATORIO.....................................................................72
SUELO (ECTOPARÁSITOS)...........................................................................................73
RAÍZ (ENDOPARÁSITOS)..............................................................................................76
4.3.17 PRÁCTICA 17. MANIPULACIÓN DE NEMÁTODOS..........................................78
4.3.18 PRÁCTICA 18. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMÁTODOS..........80

INTRODUCCIÓN

1.1 IMPORTANCIA DE LAS PRÁCTICAS

La vinculación teoría-práctica es una necesidad ineludible en el proceso de enseñanza-
aprendizaje de cualquier rama de las ciencias biológicas, premisa que se reproduce
para el caso particular de las asignaturas que están estrechamente relacionadas con el
departamento de parasitología.

El presente manual se ha elaborado con fines didácticos y aplicaciones prácticas para
que los estudiantes que estén cursando las materias afines, tengan las herramientas
básicas para trabajar en el manejo de microorganismos, manejo de equipo y otros
materiales en el laboratorio de fitopatología. De tal manera que se incluyen los
procedimientos para el análisis de muestras de vegetales en la identificación y/o
detección de agentes fitopatógenos, también se incluyen los pasos a seguir en la
esterilización del material a utilizar por ejemplo cristalería y medios de cultivo, así como
el manejo del material vegetal para lograr aislar al agente causal, pruebas para evaluar
su patogenicidad e identificación, además se incluyen las diferentes fórmulas para la
elaboración de medios de cultivo para tal fin.

En el presente trabajo, siempre serán bien recibidas las críticas constructivas por parte
de colegas y estudiantes para mejorarlo y/o actualizarlo de manera constante.

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1.2 DEFINICIÓN DEL MARCO DE ACCIÓN DEL LABORATORIO

El Laboratorio de Fitopatología de la Escuela de Agricultura del Valle del Fuerte, es un
espacio donde se llevan a cabo distintas actividades como trabajos de investigación de
tesitas, prestadores del Servicio Social, se les brinda apoyo a investigadores que
imparten cursos de áreas afines con prácticas de laboratorio, se atiende a otras
instituciones educativas sobre el funcionamiento del mismo, señalando que su actividad
principal es atender las necesidades de enseñanza del plan de estudios de la
E.S.A.V.F., para que los alumnos puedan realizar experimentos prácticos necesarios
para comprobar los conocimientos teóricos que se les imparte en el aula y
proporcionarles las herramientas para realizar aplicaciones reales de los conocimientos
adquiridos.

En el Laboratorio de Fitopatología se imparten prácticas relacionadas con la
observación e identificación de microorganismos patógenos como: hongos, bacterias,
nematodos, virus, etc. También se observan e identifican microorganismos no
patógenos de cultivos que forman parte de la microflora del suelo.

1.3 MATERIAS QUE APOYA

Plan 2

• Bacteriología y Virología
• Conservación de Granos Almacenados
• Cultivos I
• Cultivos II
• Dinámica de Enfermedades
• Fitopatología Económica
• Fruticultura Especial
• Fruticultura General
• Horticultura General
• Micología
• Microbiología de Suelos
• Nematología
• Protección Vegetal

Plan 3

• Cultivos Básicos y Oleaginosas
• Fitopatología General

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2. CONDICIONES DEL LABORATORIO

2.1 INFRAESTRUCTURA

El laboratorio de fitopatología cuenta con la infraestructura necesaria y el equipamiento
suficiente para la observación e identificación de hongos, bacterias y nematodos
fitopatógenos, y para cubrir las necesidades del mismo.

AREA DE PRACTICAS PRINCIPAL
Cuenta con cinco mesas de trabajo con cubierta de acero inoxidable cada una y un total
de 45 sillas y 17 bancos de laboratorio, con un pintarrón, un televisor para presentación
de imágenes, un herbario fitopatológico, cajonera para el resguardo de muestras del
herbario, el laboratorio tiene una capacidad para 50 personas, un espacio apropiado
para la campana de flujo laminar, con capacidad para cinco personas. Señalando que
esta área cuenta con suministro de gas el cual se requiere para trabajos de muchas de
las prácticas.

ÁREA DE NEMATOLOGÍA
Cuenta con tres mesas de acero inoxidable, dos lavamanos, una columna de Collman,
centrifuga, una autoclave, archivero, vitrina para el resguardo de material, estante para
libros y documentos, dos escritorios y una computadora. Con capacidad para 30
personas.

ÁREA DE PREPARACIÓN DE PRÁCTICAS
Cuenta con una mesa para preparación de prácticas, una vitrina para el resguardo de
cristalería y microscopia, un lavamanos, una incubadora, una estufa Arnold, un
microboy, un congelador, una vitrina para resguardo de reactivos, tres vitrinas chicas y
un escritorio. Capacidad para 20 personas.

2.2 PERSONAL ADSCRITO

LABORATORISTA (Turno matutino) Ing. Jesús G. Loredo Vega.
Ingeniero agrónomo Parasitólogo egresado de la Escuela Superior de Agricultura del
Valle del Fuerte generación 2002-2007. Profesor adscrito a esta área cubriendo el turno
respectivo por el Ing. Hugo Beltrán Peña, quien se encuentra realizando un posgrado
en el Colegio de Posgraduados Campus Montecillo, en Texcoco estado de México.

LABORATORISTA (Turno vespertino) Ing. Julia E. Hernández Luna.

Ingeniero agrónomo Parasitólogo egresada de la Escuela Superior de Agricultura del
Valle del Fuerte, generación 1991-1996. Profesora adscrita a esta área cubriendo el
turno vespertino.

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2.3 EQUIPO
MICROPLATE READER FOTOCOLORIMETRO PARA ELISA
MODELO-STAT FAX 3200
SERIE 3200-2155
MARCA – AWARENESS TECHNOLOGY
08040952
51563 WESCO
52905 WESCO
52906 WESCO
52907 WESCO
72891 LEYCA
51559 WESCO
51562 WESCO
30123 ZEISS (1411J229923)
72890 LEYCA
141122970 ZEISS
MICROSCOPIOS DE DISECCION
8615243 SWIFT
52901 WESCO
52903 WESCO
52902 WESCO
51561 WESCO
52904 WESCO
MICROSCOPIO CON CAMARA DE VIDEO DIJI PLUS LABOMED

También se cuenta con el equipo necesario para el aislamiento y purificación de
microorganismos como campana de flujo laminar, microboy, y el equipo para la
esterilización de materiales usados en las distintas prácticas de laboratorio.

2.4 MATERIALES

El laboratorio de Fitopatología cuenta con el material suficiente para la realización de
las prácticas de las asignaturas afines, algunos ejemplos de estos son:

2 Campanas de secado (p/nematodos)
Vidrios de reloj
Tubos de ensayo
Matraces Erlen Meyer de varias medidas
Pipetas
Mecheros de alcohol
Cajas Petri
Vasos de precipitado
Probeta graduada

2.5 REACTIVOS

Los reactivos comúnmente usados en las prácticas del área de Fitopatología son:

6

Agar nutritivo
Alcohol
Lacto fenol claro
Lacto fenol azul
Agar bacteriológico
Agar papa dextrosa
Agar agar
Aceite de inmersión

2.6 MEDIDAS DE SEGURIDAD

El laboratorio de fitopatología de la E.S.A.V.F., cuenta con las siguientes medidas de
seguridad:
1 extintor
2 regaderas de emergencia
1 botiquín
Señalamientos de seguridad

3. REGLAMENTO

3.1 ORGANIZACIÓN

• La Escuela Superior de Agricultura del Valle del Fuerte dentro de su organización
académico-administrativa cuenta con laboratorios para la docencia y la
investigación. Estos son coordinados por el Coordinador de Prácticas y bajo su
cargo se encuentran los responsables de cada laboratorio; podrán nombrarse
becarios o brigadistas de servicio social como personal de apoyo.
• Para cada uno de los laboratorios pueden estar como responsables profesores
adscritos a la Institución; éstos desarrollarán actividades de docencia, investigación
y difusión afines a las funciones del laboratorio que se le haya encargado. A su vez,
los encargados deberán organizar sus actividades con el Coordinador de Prácticas.

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• Las tareas prioritarias de los laboratorios son la docencia e investigación; en el caso
de difusión, esta deberá estar coordinada entre el Departamento de Difusión y la
Coordinación de los Prácticas.

3.2 DERECHOS Y OBLIGACIONES

3.2.1 LABORATORISTAS
• Los Responsables de laboratorio tendrán a su cargo el resguardo del material,
equipo y reactivos; deberán mantener actualizados los inventarios correspondientes.
• Es obligación del laboratorista portar la bata y otros accesorios definidos para su
laboratorio.
• El Responsable de laboratorio deberá preparar con la debida oportunidad los
materiales, equipos y reactivos que sean necesarios para las actividades
programadas de los laboratorios, con excepción de aquellas actividades destinadas
exclusivamente para los tesistas.
• El Responsable de laboratorio deberá inspeccionar, limpiar y guardar
adecuadamente el equipo y materiales a su cuidado. De igual forma llevará el
control para la reposición oportuna de material y equipos dañados, destruidos o
faltantes.
• Los Responsables de laboratorio podrán permitir la entrada a los laboratorios sólo a
aquellos alumnos o profesores investigadores que presenten el programa de trabajo
de laboratorios autorizado por el Coordinador de Prácticas y el Coordinador
Académico.
• Los Responsables de Laboratorio deberán coordinar y supervisar las actividades del
los auxiliares de laboratorio (becarios y prestadores de Servicio Social) y otras
personas externas.

3.2.2 PROFESORES

• Es responsabilidad del profesor programar las prácticas y otras actividades que se
desarrollarán en el(los) laboratorio(s) que corresponde(n) a cada uno de los grupos
y/o tesistas que atiende, al inicio de cada semestre.
• Cada profesor deberá portar la bata y otros accesorios correspondientes cuando
realice actividades en el laboratorio.
• Es responsabilidad del profesor, dar las instrucciones y la orientación de la actividad
de laboratorio programada a los alumnos, tan clara y detalladamente como lo
requiera la seguridad de los participantes y el alcance de los objetivos de la misma.
• El profesor deberá estar presente en el laboratorio durante el desarrollo de las
actividades que haya programado.
• Las actividades de laboratorio para una asignatura determinada serán controladas y
evaluadas por el profesor a cargo.
• Los profesores que requieran para alguna actividad equipo especializado, deberán
solicitarlo al Coordinador de Laboratorios y a la Coordinación Académica, quienes
decidirán sobre su uso.

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3.2.3 ESTUDIANTES

• Los alumnos podrán entrar a los laboratorios exclusivamente dentro de la fecha y
hora programada para la actividad y con la presencia del profesor responsable de la
asignatura o del trabajo de investigación, salvo que exista un acuerdo entre el
profesor y el laboratorista.
• El alumno deberá realizar el trabajo de laboratorio con estricto apego a las
disposiciones previamente establecidas por el asesor, el profesor, y/o el
laboratorista responsable. Queda prohibido realizar cualquier otra actividad fuera del
trabajo indicado y la indisciplina.
• Es obligatorio para los alumnos:
3.2.3.1. Dejar su mochila en el sitio predestinado para ello.
3.2.3.2. Portar bata y ropa adecuada al ingresar a los laboratorios.
3.2.3.3. No fumar dentro de los laboratorios.
3.2.3.4. No introducir ni ingerir alimentos y/o bebidas en los laboratorios.
3.2.3.5. No utilizar celulares ni aparatos de sonido que perturben el desarrollo de la práctica.
• Los alumnos realizarán el manejo de los materiales, equipo y reactivos con el
cuidado y la responsabilidad necesarios para mantener su seguridad y la de los
demás, así como para la mejor conservación de los mismos.
• Los alumnos deberán entregar el material y equipo empleados en perfectas
condiciones, limpio y funcional. En el caso de deterioro o faltante, se obliga a
reponer el mismo en un plazo máximo de 15 días.
• Los alumnos deberán entregar su reporte de prácticas en el lapso de cinco días
hábiles al Responsable del Laboratorio.

3.2.4 TESISTAS

• Los tesistas podrán realizar sus trabajos de investigación y/o actividades
relacionadas en los laboratorios, siempre que tengan asignado un asesor y que se
hayan programado sus actividades al inicio del semestre.
• Los tesistas se obligan a preparar, utilizar adecuadamente, lavar, limpiar y guardar
el material que requieran en el desarrollo de sus actividades.
• Los tesistas podrán emplear el equipo especializado únicamente para estudios
previamente autorizados por el responsable del laboratorio y/o del coordinador de
laboratorios. Además el alumno será supervisado continuamente por el asesor y/o el
profesor del estudio en cuestión.

3.2.5 PERSONAS EXTERNAS

• En los laboratorios de la ESAVF podrán programarse actividades de docencia e
investigación, previa autorización del Coordinador Académico, para personas
externas a la institución tales como: tesistas, investigadores, profesores y
estudiantes de intercambio, prestadores de servicio social, practicantes, residentes y
visitas.

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• Las personas externas deberán ajustarse a la programación de sus actividades y
tendrán todas las obligaciones relativas al uso, conservación y resguardo de los
materiales utilizados.

3.3 PROGRAMACIÓN DE PRÁCTICAS

• El profesor responsable de cada materia realizará la programación de sus prácticas
al inicio de cada semestre ante el Coordinador de Prácticas. Para ello se tomarán en
cuenta alguno o más de los siguientes criterios:
• Horarios. Los horarios se definirán en función de las condiciones particulares de
cada laboratorio y a las necesidades propias de las prácticas a desarrollar.
• Número de estudiantes. Cada laboratorio determinará el número de estudiantes que
pueden realizar simultáneamente una práctica. Cuando el número de estudiantes de
un grupo exceda la capacidad de un laboratorio, se realizarán equipos de trabajo de
manera coordinada entre el profesor y el laboratorista.
• El Coordinador de Prácticas se reunirá con cada uno de los laboratorios para definir
la programación de prácticas a cubrir durante el semestre que inicia. Una vez
acordado el programa, dará seguimiento para asegurar el cumplimiento del mismo.
• Las prácticas externas y visitas a los laboratorios estarán sujetas a la disponibilidad
de espacios y horarios de cada laboratorio. Para ello se deberán solicitar a la
Dirección de la ESAVF al menos con una semana de anticipación.

3.4 SANCIONES

• El laboratorista que incumpla con sus obligaciones recibirá las sanciones
administrativas correspondientes por las autoridades de la ESAVF.
• El profesor que no programe las prácticas de su(s) materia(s) al inicio del semestre
sólo podrá acceder a este servicio en los espacios que el laboratorio tenga fuera de
la programación oficial.
• Cuando un profesor y/o su grupo falte injustificadamente a una práctica programada,
la práctica se dará por vista.
• El alumno, interno o externo, que no cumpla con alguna de sus obligaciones, no
tendrá derecho a uso del laboratorio por el tiempo que considere el responsable del
laboratorio.

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4.- RELACIÓN DE PRÁCTICAS

Plan 2

4.1 Nematología VI semestre

FITOPARÁSITOS EN EL LABORATORIO.

INTRODUCCIÓN
Los nemátodos son animales con una organización muy sencilla, que comprenden
especies parasitas de plantas (Fitoparasitas), también existen nemátodos saprófagos
(vida libre) que favorecen la descomposición de la materia orgánica, Omnívoros e
incluso Depredadores, sin olvidar que hay nemátodos parásitos de animales
(Zooparásitos), entre ellos los entomopatógenos que parasitan insectos y pueden
emplearse en la lucha biológica contra las plagas.

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Estos nemátodos los podemos encontrar en todos los lugares; el mar, agua dulce, suelo
y partes aéreas de las plantas; donde nos causan serios daños a las plantas cultivadas,
sin embargo a menudo pasan desapercibidos por los técnicos y agricultores o sus
daños son confundidos con otros factores; como la falta de fertilidad del suelo
(deficiencias de nutrientes), escaso contenido de humedad, etc. Esto se debe
fundamentalmente a su tamaño microscópico y a que viven en el suelo y/o el interior de
las raíces de las plantas.

OBJETIVOS: Que el alumno reconozca y aprenda a diferenciar los nemátodos
fitoparásitos de los de vida libre en el laboratorio.

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO
Microscopio de disección
Microscopio biológico

MATERIAL
Vidrios de reloj
Pipetas
Agua

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
Usando los nemátodos disponibles en el laboratorio, se coloca en un vidrio de reloj una
alícuota (2-5 mm) de la suspensión nemátodos-agua, enseguida se pasan al
microscopio de disección para ser observados e identificar los nematodos fitoparásitos
de los de vida libre. Y después se observan en el microscopio biológico.

INFORME DE RESULTADOS

BIBLIOGRAFÍA
CEPEDA, S. M. (1995). Prácticas de nematología agrícola. ED; Trillas. México. 109 pp.

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SUELO (ECTOPARÁSITOS)

INTRODUCCIÓN

Las muestras traídas del campo tienen que ser procesadas en el laboratorio para
obtener los nemátodos y observarlos con la ayuda del microscopio para su
identificación y conteo. Hay nematodos fitoparásitos que se alimentan de las raíces
como ectoparásitos, los que siempre estarán en el suelo; pero otros se introducen al
sistema radical (endoparásitos) del cual se alimentan e incluso algunos se mueven
hasta las partes áreas. El método de extracción será de acuerdo al tipo de nemátodos
mencionados anteriormente.

OBJETIVOS: Qué el alumno se adiestre en las diferentes técnicas para la extracción de
nemátodos del suelo (nemátodos de vida libre y fitoparásitos).

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO
Centrífuga
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MATERIAL
Muestras de suelo con nematodos
Embudos de 10-15 mm de diámetro
Tubos de goma
Pinzas de presión
Malla de alambre
Papel filtro
Etiquetas
Probeta
Cubeta de plástico
Tamiz de 100 mallas por pulgada cuadrada.

REACTIVOS
Kaolín
Sucrosa


PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
La muestra que se recogió en el campo se esparce sobre un pedazo de plástico, se
desmenuzan los terrones, se eliminan las piedras y separamos las raíces para
procesarlas posteriormente y extraer los nemátodos endoparásitos. Una vez mullido el
suelo, se procede a homogenizarlo con el fin de que las submuestras formen una
muestra compuesta, finalmente se distribuye en el plástico.

MÉTODO DEL EMBUDO DE BAERMANN: Primero se coloca un tubo de goma (8-10
cm. de largo) al cuello de un embudo de 10-15 mm. de diámetro, enseguida se lavan
ambos perfectamente y luego se coloca una pinza de presión en el tubo de goma para
cerrar el paso del agua. Después se procede a llenar con agua hasta 1 cm. bajo del
borde del embudo y se coloca el embudo en la gradilla. Enseguida se etiqueta con los
datos necesarios como: # de muestra, hospedero, fecha y lugar de colecta

Una vez que se ha hecho lo anterior, se procede a preparar una tela de alambre que de
antemano esté amoldada al embudo, sobre ella se coloca un papel facial (kleneex) y
luego la muestra de suelo (40-50 grs.), se envuelve la muestra y se humedece con una
piceta, se coloca la tela de alambre sobre el embudo cuidando que esta toque el agua
del embudo. Dejamos el embudo en reposo y a las 24 horas se sacan en un vaso de
precipitado unos 10 ml. de agua. En ellos van los nemátodos parásitos y saprofitos que
pasaron por el papel facial y la malla.

Si se desea, se pueden observar directamente los nemátodos al microscopio de
disección, esto se hace colocando unos 5 ml. de la suspensión en un vidrio de reloj,
luego se observan. En caso contrario o después de realizado lo anterior, se procede a
matarlos y fijarlos para su preservación por tiempo indefinido.
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MÉTODO COMBINADO (TAMIZ-EMBUDO DE BAERMANN): Del suelo distribuido en
el plástico, se toman muestras en diversos puntos agregándose a una probeta que
contiene 200 CC de agua hasta aforar a 300 CC. El contenido de la probeta se pasa a
una cubeta A, con 4-5 lts. de agua, en la cual se siguen desmenuzando los terrones
hasta que se disuelva bien el suelo. Se agita la solución y la dejamos reposar durante
15-30 segundos para que se sedimente el material pesado y los nemátodos
permanezcan flotando. El contenido de la cubeta A, se pasa a través de un tamiz de
100 mallas por pulgada cuadrada a una cubeta B, en la cual se agita y la dejamos
sedimentar para pasarlo por un tamiz de 325 (ó 500) y lo que queda en él se pasa al
embudo de Baermann.

MÉTODO DE FLOTACIÓN (TAMIZ-CENTRÍFUGA): Lo que queda en el tamiz de 325 ó
500 se pasa a un vaso de precipitado y se distribuyen los tubos de la centrifuga a los
que previamente se les agregó 0.5-1.0 g de kaolín, el cual se mezcla bien y se
centrifuga a 3000 rpm por 5 minutos, lo que permite la sedimentación de los nemátodos
junto con las partículas de suelo (favorecido por el kaolín). Después se decanta el
sobrenadante eliminando la materia orgánica suspendida.

El sobrenadante eliminado se sustituye por solución sucrosa (45 g. de solución sucrosa
o azúcar refinada en 100 CC. de agua destilada) y se mezcla con la muestra. Se
centrifuga a 3000 rpm durante 2 minutos y el sobrenadante se pasa por el tamiz de 325
ó 500 mallas donde los nemátodos quedan retenidos procediéndose inmediatamente a
lavarlos sumergiendo el tamiz en agua para eliminar el azúcar del cuerpo de los
nemátodos. Con la ayuda de una piceta se pasan a un vaso de precipitado, quedando
listo los nemátodos para hacer observaciones al microscopio y/o matarlos y fijarlos para
estudios posteriores de identificación y conteo.


BIBLIOGRAFÍA
PACHECO, A. J. (2000). Manual de prácticas de laboratorio de Nematología. Juan José
Ríos, Sin; México. 20 pp.

THORNE, G. (1961). Principles of nematology, MC. Graw-Hill book Co, New York,
Estados Unidos. 553 pp.

15

RAÍZ (ENDOPARÁSITOS)

INTRODUCCIÓN

Paralelamente al grupo de los nemátodos ectoparásitos (es decir, aquellos que se
alimentan externamente de la raíz y cuyo hábitat es el suelo), existe el grupo de los
endoparásitos que se han adaptado a vivir dentro de los tejidos vegetales y que ya no
dependen totalmente del ambiente del suelo, sino más bien de lo que ocurre en la
planta. Así pues, podemos encontrar nemátodos desde la raíz, tallos y hojas hasta en
las flores, frutos y semillas, y que constituyen un serio problema para la agricultura
porque son un grupo mucho más peligroso que el anterior. Para la extracción de estos
nemátodos, existen algunos métodos que por su sencillez y efectividad vale la pena
conocerlos.

OBJETIVOS: Que el alumno conozca y realice los métodos de extracción más sencillos
y prácticos que se conocen para extraer nemátodos endoparásitos.

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO

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Licuadora

MATERIAL
Raíces infectadas por nematodos
Navajas
Embudos
Tamiz 325 mallas por pulgada cuadrada
Agujas de disección

REACTIVOS
Kaolín
Sucrosa


OBSERVACIÓN DIRECTA: Se usa en raíces con agallamiento, se utilizan agujas de
disección para desmenuzar las agallas y extraer hembras, juveniles, machos y masas
de huevecillos de los nemátodos que causan agallas (Meloidogyne spp. y Nacobbus
spp.).

INCUBACIÓN: Las raíces previamente lavadas o el follaje son cortados en pequeñas
piezas y se colocan en un recipiente con agua limpia dejándose reposar por unas 24-48
horas para que los nemátodos salgan de los tejidos.

LICUADORA CENTRÍFUGA: Las raíces lavadas se licuan a alta velocidad durante un
minuto y el licuado se centrifuga de igual forma que en la flotación para nemátodos
ectoparásitos.

EMBUDO DE BAERMANN: Se procede de igual forma que lo descrito para
ectoparásitos, solo que aquí usamos en lugar de suelo, pequeñas piezas de raíces
previamente lavadas.

LICUADO-TAMIZADO: Lavar el material vegetal y cortar alrededor de 5 g. de raíces;
los trocitos de raíz se colocan en una licuadora en 100 ml. de agua y licuar durante un
minuto. El material licuado se pasa a través de un tamiz de 325 mallas, recogiendo el
material en un vaso de precipitado. Después observar al microscopio de disección.


BIBLIOGRAFÍA
GERARDO, A. M. (2002). Manual de prácticas de Micología. Juan José Ríos, Sin;
México. 35 pp.

17

4.1.4 PRÁCTICA 4. MANIPULACIÓN DE NEMÁTODOS

INTRODUCCIÓN

La manipulación de los nematodos previo a su identificación y conteo una vez que han
sido extraídos por las técnicas usadas en el laboratorio, es un proceso muy importante
porque lleva implícitos el matado, fijado y pesca de estos organismos.

OBJETIVOS: Que el alumno conozca las técnicas de manipulación más usadas para
realizar la identificación y conteo de nematodos en un análisis nematológico de una
muestra.

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO

MATERIAL
Vidrio de reloj
Lámpara de alcohol
Pipetas
Palillos de bambú
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Tubos de ensayo
Portaobjetos

REACTIVOS
Agua
Fijador FA. 4:10

MATADO: Existen varios métodos para realizar el matado de los nemátodos pero todos
ellos lo hacen tratando de evitar su distorsión. Hay 2 formas generales para realizar
esta operación, ellas son:

MATADO EN VIDRIO DE RELOJ: Se coloca en un vidrio de reloj una alícuota de la
suspensión nemátodos-agua y enseguida se expone durante 12 segundos a la flama de
una lámpara de alcohol. Después se observan al microscopio de disección para
verificar su muerte.

MATADO EN MASA: Se pone a calentar agua en un vaso de precipitado de 500 ml.,
cuando alcance una temperatura de 60 ºC se retira de la flama y se introduce durante
3-4 minutos el recipiente (tubo de ensayo) que contiene 10 cc. de agua con nemátodos.
También se puede matar dejando hervir el agua introduciendo el tubo de ensayo
durante un minuto.

FIJACIÓN: Una vez que los nemátodos han sido matados, se deja enfriar el agua con
nemátodos y se le agrega el fijador (FA. 4:10) en una porción de 1:1.

Fijador FA. 4:10

Formol al 40%.................... 10 CC.
Acido glacial acético............10 CC.
Agua destilada.....................10 CC.

Nota: Con este fijador los nemátodos rara vez se distorsionan, pero tienden a tornarse
café y la parte posterior del estilete de los Tylenchidos se vuelven transparentes
después de unos cuantos días.

PESCA DE NEMÁTODOS: Después de la extracción, matado y fijación de los
nemátodos, es necesario que sean trasladados a un portaobjetos con una gota de agua
para observarlos, estudiar sus características e identificación bajo el microscopio
biológico. El traslado se hace siempre de uno en uno con la ayuda de una varita de
bambú con la punta bien adelgazada. La técnica para pescar nematodos es la
siguiente:

1.- En el centro de un portaobjetos se deposita una gota de agua.
2.- Se coloca una alícuota de la suspensión agua-nemátodos matados y fijados en un
vidrio de reloj y se observan bajo el microscopio estereoscópico.

19

3.- Se localiza un nematodo en el fondo del vidrio de reloj y con la ayuda de la varita de
bambú se lleva al nematodo hacia la superficie lentamente y una vez en la superficie,
se saca rápidamente y se coloca en la gota de agua del portaobjetos.
4.- Nuevamente se busca otro nemátodos y se sigue el mismo procedimiento hasta
trasladar por lo menos 5 nemátodos al portaobjetos.
5.- Se coloca un cubreobjetos a la gota de agua con nemátodos. Enseguida se observa
al microscopio biológico.
6.- Se estudian las características de cada nematodo para su identificación y su
posterior cuantificación.


BIBLIOGRAFÍA
PACHECO, A. J. (2000). Manual de prácticas de laboratorio de Nematología. Juan José
Ríos, Sin; México. 20 pp.

THORNE, G. (1961). Principles of nematology, Mc. Graw-Hill book Co, New York,
Estados Unidos. 553 pp.

4.1.5 PRÁCTICA 5. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMÁTODOS

INTRODUCCIÓN

En nemátodos fijados muchos de los detalles internos del cuerpo, especialmente
gónadas, pueden ser obscurecidas por la apariencia granular del intestino. Los
especimenes pueden ser aclarados procesándolos a lactó fenol ó glicerina, los cuales
son medios de montaje apropiados. Además es muy importante con fines académicos o
de investigación al conservar preparaciones permanentes de nemátodos.

OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar preparaciones permanentes de
nemátodos para su conservación.

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO
Estufa Arnold

MATERIAL
Campana deshidratadora
Vidrio de reloj
Pelo de ángel
Portaobjetos
20

Cubreobjetos

REACTIVOS
Etanol 96%
Glicerina
Agua destilada
Lacto fenol
Cloruro de calcio

Transferir nemátodos del fijador a un vidrio de syracuse o de reloj que contenga 0.5 ml.
de la siguiente solución:

Solución I:
Etanol 96%.................... 20 partes
Glicerina........................ 1 parte
Agua destilada.............. 79 partes

Colocar el vidrio de reloj es una campana deshidratadora que contiene 1/10 de su
capacidad con etanol 96% y déjelo cuando menos durante 12 horas en una estufa a
35-40 ºC. Esto permite que se elimine casi toda el agua y deja a los nemátodos en una
mezcla de glicerina y etanol. Llene el vidrio de reloj con la solución II (5 partes de
glicerina y 95 partes de etanol 96%) y parcialmente cerrado, colóquelo durante 3 horas
en una estufa a 40 ºC para que se evapore lentamente el etanol hasta que los
nemátodos queden en glicerina pura.
Los nemátodos así deshidratados son transferidos a una gota de glicerina pura
(purificarla dejándola en un recipiente abierto en una campana deshidratadora que
contenga cloruro de calcio) en un portaobjetos, se colocan 2 tiras de pelo de ángel,
después se coloca un cubreobjeto y el borde de éste se sella con esmalte de uñas
transparentes.

Se colocan etiquetas adhesivas al portaobjeto con los siguientes datos:

1.- Nombre científico
2.- Localidad
3.- Hospedante
4.- No. de hembras y machos
5.- Colector
6.- Fecha


BIBLIOGRAFÍA

YEPEZ, T. G. (1972). Los nemátodos enemigos de la agricultura, Imprenta Universidad
de Caracas; Universidad Autónoma de Venezuela, Facultad de Agronomía. Venezuela.
220 pp.
21

4.1.6 PRÁCTICA 6. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE NEMÁTODOS
FITOPARÁSITOS

INTRODUCCIÓN

Los nemátodos fitoparásitos abarcan un gran número de géneros y especies de gran
importancia agrícola. El conocimiento de la sintomatología, morfología, biología y
control es de interés fundamental para el parasitólogo.

El control de los nemátodos fitoparásitos, se basa en una identificación correcta del
nematodo en cuestión, de ahí que sea importante conocer las características
morfológicas más importantes de los principales géneros de estos patógenos.

OBJETIVOS: Que el alumno conozca y diferencie las características morfológicas de
los principales géneros de nemátodos fitoparásitos de importancia agrícola.

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO

22

MATERIAL
Suelo con nemátodos
Montajes permanentes
Portaobjetos


1.- Elaborar montajes a partir de material vegetal enfermo o suelo procesado, los
montajes se harán siguiendo la metodología descrita anteriormente.

2.- Usando los montajes permanentes disponibles en el laboratorio, observar al
microscopio biológico los especimenes, con los objetivos 10x y 40x.

3.- Dibujar cada espécimen cuidadosamente, resaltando las características más
importantes: forma, tamaño, tipo de estilete, tipo de esófago, unión del bulbo basal con
el intestino, posición de la vulva, tipo de cola, características del sistema reproductor de
la hembra, etc.

4.- Se estudiarán los siguientes géneros:
-Meloidogyne
-Heterodera
-Globodera
-Punctodera
-Nacobbus
-Xiphinema


BIBLIOGRAFÍA
CEPEDA, S. M. (1995). Prácticas de nematología agrícola. ED; Trillas. México.

23

4.2 Bacteriología y virología, VII semestre.

4.2.1 PRÁCTICA 1. ESTERILIZACIÓN DE EQUIPO DE LABORATORIO Y DE
MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIÓN

El microbiólogo y el fitopatólogo necesitan frecuentemente trabajar con materiales y
equipos estériles, en el caso de medios de cultivo la esterilidad es obligada antes de
usarlos.

La esterilización es el proceso mediante el cual se obtienen sustancias o materiales
libres de organismos vivos. Los métodos de esterilización pueden ser químicos o
físicos. Entre los métodos físicos se encuentra el calor, las radiaciones y la filtración. El
método químico incluye el uso de gases o sustancias líquidas con propiedades
biocidas.

OBJETIVOS: Que el alumno comprenda el concepto de esterilización y aprenda a
utilizar los aparatos usados en el laboratorio para este fin.

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO
Autoclave
Estufa Arnold

MATERIAL
Medio de cultivo
Agua
Cajas Petri
Tubos de ensayo
Pipetas
Matraces
Morteros
Probetas

REACTIVOS
Medio de cultivo
Agua

24


ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

1). Revise que el agua se encuentre al nivel de la rejilla basal.
2). Introducir el material a utilizar.
3). Cierre el recipiente correctamente.
4). Abra la válvula de escape para que salga el aire seco y encienda la olla de presión.
5). Un minuto después de que empieza a salir el aire y vapor, cierre la válvula de
escape. El tiempo de esterilización se empieza a contar hasta que la aguja alcance 15
libras/pulgada cuadrada.
6). Mantenga el aparato de 15-20 libras durante el tiempo deseado, regulando la flama
del mechero.
7). Concluido el tiempo de esterilización, apague el aparato, espere a que baje a cero
presión antes de sacar con cuidado el material caliente.
ADVERTENCIA: nunca deje el aparato encendido sin vigilancia.

ESTERILIZACION CON CALOR SECO

1). Deposite el material seco y limpio en la estufa.
2). Cierre perfectamente y encienda el interruptor.
3). Ajuste el regulador a la temperatura deseada, cheque la temperatura con el
termómetro y cuente el tiempo de esterilización cuando se alcance la temperatura
requerida (100-180 oC).
4). Concluido el tiempo de exposición, apague el aparato.
ADVERTENCIA: no saque cristales muy calientes de la estufa, pues al contacto con el
aire frío o caliente se revientan.


BIBLIOGRAFÍA
Echando, E. 1971 Manual de Laboratorio para Fitopatología General, Herrera
Hermanos. Sucesores. 89 pp.

López, A. G. F. 1979. Manejo de hongos fitopatógenos.
Departamento de Parasitología Agrícola. UACH. 135 pp.

Diversos textos de microbiología: Bryan, Burdon. Pelckzar, etc.

25

4.2.2 PRÁCTICA 2. ELABORACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIÓN
Para el cultivo in Vitro de fitobacterias se requiere de la elaboración de un medio que
proporcione todos los requerimientos nutricionales que permitan su reproducción, los
cuales se les conoce como medios de cultivo.

Los medios de cultivo contienen cuatro componentes esenciales: fuentes de carbono y
nitrógeno, minerales y vitaminas.

Existe una gran variedad de de fuentes de carbono que se pueden emplear en los
medios de cultivo como son: alcoholes, pentosas, hexosas, disacáridos, trisacáridos,
polisacáridos, ácidos e hidroxiácidos ya sean solos o en combinación.

OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a elaborar medios de cultivo para el
aislamiento de bacterias fitopatógenas.

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO
Autoclave
Agitador magnético

MATERIAL
Agar Nutritivo
Agua destilada
Caseína hidrolizada
Peptona
Glucosa
Extracto de carne
Sacarosa


AGAR NUTRITIVO
Agar nutritivo 23 g
Agua destilada 1000 ml
Disolver el agar nutritivo en el agua, si desea puede dividir el líquido en dos matraces.
Esterilizar en autoclave a 115 lbs/pulgada cuadrada durante 15 minutos y vaciar en
cajas de Petri. Este medio generalmente se emplea para aislamientos de material
vegetal. Es un medio útil para el aislamiento de especies de Xanthomonas.

26

MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES (TTC)
Peptona 10 g
Caseína hidrolizada 1.0 g
Glucosa 5.0 g
Agar 12 g
Agua 1000 ml
Ajustar el ph a 7 y esterilizar en la forma normal, cuando el medio alcance una
temperatura de aproximadamente 45-50 0C adicionar solución acuosa de cloruro de
tetrazolio al 1.0% para dar una concentración final de 0.005%. Con este medio de
cultivo se pueden detectar las colonias virulentas y avirulentas de Ralstonia
solanacearum y P. s. p.v. phaseolicola. En el primer caso las colonias virulentas son
blancas, fluidas, con centro rojo y para la segunda bacteria las cepas virulentas forman
colonias rojas y las avirulentas son blancas.

MEDIO PARA LA PRODUCCION DE LEVANA
Extracto de carne 3g
Peptona 10 g
Sacarosa 50 g
Agar 20 g
Agua 1000 ml
Disuelva los ingredientes, esterilice en la forma convencional y vacíe en cajas
esterilizadas.

MEDIO DE GELATINA
Extracto de carne 3.0 g
Peptona 5.0 g
Gelatina 120.0 g
Agua 1000 ml
La gelatina se adiciona al agua y se deja hidratar durante 15 a 30 minutos y luego se
calienta para disolver la gelatina; posteriormente agregar y disolver los otros
constituyentes. Ajustar el ph a 7, vaciar a tubos y esterilizar a 120 0C durante 20
minutos.


BIBLIOGRAFÍA
Agrios, GN. 2007. Fitopatología. LIMUSA, México. 285-288 p.

Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriología “Bacterias fitopatógenas” INSTITUTO
DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados.

27

4.2.3 PRÁCTICA 3. MÉTODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS

INTRODUCCIÓN

El cultivo puro, es una condición artificial en el crecimiento de bacterias bajo
condiciones de laboratorio. Para determinar las características de una especie
bacteriana en particular, es imperativo que el organismo sea aislado y multiplicado en
laboratorio en cultivo puro. Existe una variedad de técnicas para el aislamiento y
desarrollo de bacterias como son: técnica de estría cruzada y la de vaciado en placa.

OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a realizar las técnicas para el
aislamiento y obtención de cultivos puros de bacterias fitopatógenas.

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO
Cámara de flujo laminar o microboy

MATERIAL
Medio de cultivo
Cajas Petri
Lámpara de alcohol
Asa bacteriológica
Material vegetal enfermo
Navajas o bisturí
Tubos de ensayo
Agua destilada estéril


Técnica de estría cruzada. Con el asa bacteriológica previamente flameada y enfriada,
se toma una gota de suspensión bacteriana del tubo de ensayo. Se procede a realizar
un estriado (4 o 5 “rayas”) en la caja de Petri. A partir de la ultima “raya” del estriado #
1, se comienza a rayar el estriado # 2, esto se repite 4 ó 5 veces cuidando de no tocar
mas que la ultima raya del estriado anterior. Todo esto se realiza en el microboy
previamente desinfectado y con la ayuda de una lámpara de alcohol. Al terminar se
sellan las cajas y se incuban a 28 grados centígrados Durante 24-48 hrs.

Técnica de vaciado en placa. Para lograr tener colonias separadas por esta técnica,
primeramente se debe hacer una suspensión (que se puede lograr al suspender el
material vegetal enfermo en agua esterilizada o en medio de cultivo líquido). De esta
suspensión se toma una gota ó 0.5 ml y se transfieren a otro tubo ó matraz con medio
de cultivo con agar líquido. Esta operación se repite 2 ó 3 veces más, teniendo cuidado
de agitar los tubos antes de hacer la transferencia. Inmediatamente después de cada
dilución, el contenido de cada uno de los tubos se traslada a una caja Petri estéril y
después del periodo de incubación se obtendrán colonias separadas.

28

AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN

Uno de los requisitos para considerar a una bacteria como el agente inductor de una
enfermedad, es aislarla y purificarla a partir del tejido enfermo. Para llevar a cabo esta
etapa existen diferentes metodologías y la elección de cualquiera de ellas dependerá
del tipo de síntoma, órgano afectado, grado de avance de la enfermedad y del material
y equipo disponibles. Entre las técnicas de aislamiento más comunes, se encuentran
las siguientes:

AISLAMIENTO DIRECTO
(Para muestras con marchites)

PROCEDIMIENTO

1. Con una navaja flameada y enfriada, haga un corte transversal al tallo que presente
flacidez incipiente, de preferencia cerca del nivel del suelo.
2. Haga una ligera presión y espere unos segundos para que de los haces vasculares
salga un exudado bacteriano.
3. Con el asa previamente flameada y enfriada, tome del exudado y transfiéralo a un
tubo con agua destilada estéril.
4. Agite el tubo para homogeneizar.
5. Con el asa flameada tome una gota de la suspensión y siembre una caja con medio
de cultivo por el método de estría cruzada.
6. Incube a 28 0C por 24-48 horas.

INMERSIÓN DEL TEJIDO EN AGUA ESTERIL
(Para muestras con manchas o tizones)

PROCEDIMIENTO

1. Al microscopio estereoscópico observe los tejidos afectados, para detectar la
presencia de exudados, escamas bacterianas, micelio u otras estructuras fungosas.
2. De la zona de avance de la enfermedad haga una preparación en fresco y observe
al microscopio compuesto.
3. Si en estas preparaciones observa únicamente células bacterianas, esto le indica
que el síntoma se puede deber a bacterias, por el contrario, si observa micelio, lo
más seguro es que el síntoma sea ocasionado por un hongo.
4. Seleccione tejido enfermo y lávelo con agua estéril.
5. Corte pequeños trocitos y desinféctelos con una solución de hipoclorito de sodio al
1% durante 1 a 2 minutos.
6. Decante el hipoclorito de sodio y lave 3 veces con agua esterilizada.
7. Una vez transcurridos los 5 ó 10 minutos, tome una gota de la suspensión con el
asa bacteriológica y siembre con estría cruzada una caja con medio de cultivo.
8. Después del periodo de incubación seleccione las colonias bacterianas que se
asemejen a las del agente causal, y siémbrelas una nueva caja con medio de cultivo
para obtener así, suficiente cultivo puro y continuar con las pruebas de
patogenicidad.

29

INMERSIÓN DEL TEJIDO EN AGUA ESTERIL
(Muestra con sobrecrecimiento)

PROCEDIMIENTO

1. Con un cepillo pequeño y cerdas suaves lave al chorro del agua la agalla o tejido
con fasciación y luego haga unas fracciones.
2. Coloque los cortes en un tubo con 3 ml de agua destilada estéril y manténgalos así
durante unos 10-20 minutos.
3. Pase 3 asadas de la suspensión anterior a otro tubo con 3 ml de agua estéril.
4. Siembre 2 cajas con medio de cultivo por estría cruzada.
5. Incube a 22-28 0C durante 2-4 días.
6. Seleccione las colonias bacterianas con características del posible patógeno y
transfiera a las otras cajas con medio de cultivo.


BIBLIOGRAFÍA
Rodríguez, M. M. 2001 Manual de prácticas de bacterias fitopatógenas.
DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA AGRICOLA. Universidad Autónoma de
Chapingo.

30

4.2.4 PRÁCTICA 4. TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA DETERMINAR FORMA, TAMAÑO
Y AGRUPACIÓN CELULAR

INTRODUCCIÓN

Como las células bacterianas son incoloras, se requiere del empleo de colorantes para
hacerlas más nítidas al microscopio, para lo cual se pueden emplear técnicas de
coloración simples o diferenciales.

Tinción simple. El azul de metileno de Loeffler es uno de los reactivos más valiosos
que se tienen para la tinción de bacterias. Es excelente para las bacterias del género
Curtobacterium donde puede demostrar el perlado y los gránulos. En los bacilos
esporulados (Bacillus), teñidos con este reactivo, las esporas aparecen como cuerpos
no teñidos dentro de células azules.
Tinción diferencial. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas es la “Tinción de
Gram.”, porque no solo permite determinar la forma y agrupación de las bacterias, sino
también es de considerable valor en la identificación y clasificación, al separar a las
bacterias en gram negativas y gram positivas.

OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a utilizar los reactivos para llevar a cabo las
distintas técnicas de coloración de bacterias.

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO

MATERIAL
Cultivo bacteriano
Asa bacteriológica
Agua alcohol
Azul de metileno
Portaobjetos
Lámpara de alcohol
Cristal violeta
Lugol
Safranina


BIBLIOGRAFÍA

31

4.2.5 PRÁCTICA 5. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD

INTRODUCCIÓN

Cuando una planta, supuestamente infectada por una bacteria, es traída al laboratorio,
se procede al aislamiento en medio artificial de cultivo según la técnica usual. No
obstante, los resultados del aislamiento precisan ser interpretados con cautela, pues: a)
las colonias desarrolladas en la caja de Petri pueden ser bacterias saprofitas, por lo que
la enfermedad puede no ser provocada por estas bacterias. b) aparecen en la caja,
colonias de bacterias patogénicas y saprofitas las cuales no se diferencian por su
aspecto. c) las colonias obtenidas, aunque sean de bacteria patogénica, se presentan
avirulentas o perdieron por alguna razón, la patogenicidad.

La demostración de la patogenicidad de una cepa bacteriana es un procedimiento
complicado que requiere mucho tiempo para que aparezcan los síntomas típicos de la
enfermedad en a planta homóloga. En la mayoría de las ocasiones no siempre se
dispone de este material, siendo más difícil, aún, cuando se tratan de árboles o plantas
que no se encuentran en la región.

Existen pruebas de patogenicidad como la reacción de hipersensibilidad, pudrición del
tubérculo de papa, inoculación a frutos verdes de peral o manzano las cuales se
describen a continuación.

OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar pruebas de patogenicidad de bacterias
fitopatógenas.

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO
Incubadora

MATERIAL
Agua estéril
Alcohol
Cajas de Petri
Papel filtro


PUDRICIÓN DEL TUBERCULO DE PAPA

Para bacterias aisladas de órganos con pudrición, la patogenicidad se puede valorar
con la prueba de pudrición del tubérculo de papa y los resultados se pueden observar a
las 24 horas de haberse realizado.

32

PROCEDIMIENTO

Un tubérculo de papa de preferencia de la variedad Alpha, se lava, se seca y se
desinfecta superficialmente, bañándolo con etanol al 70%, seguido de un flameado
(evite adicionar mucho alcohol porque al quemarse podrá dañar las capas externas del
tubérculo y se correrá el riesgo de contaminación por bacterias esporuladas como
Bacillus spp. De estos tubérculos se cortan rebanadas de 5mm de grosor y se colocan
en cajas de Petri con papel filtro (previamente esterilizado) se pueden acomodar dos
rebanadas por caja y una de ellas servirá de testigo.

A cada una de las rebanadas se les hace una insición superficial y solo en una de ellas
se pone crecimiento de la bacteria a probar. Finalmente se le adicionan unos 2-3 mm
de agua estéril solo para humedecer el papel y crear un ambiente húmedo, se incuban
a 28 0C durante 24-72 horas. A partir de las primeras 24 horas, se palpa el tejido de
cada una de las rebanadas y si la que ha sido inoculada, se siente blanda, indica que la
bacteria probada sintetiza enzimas pectolíticas y es muy probable que sea el agente
causal de la pudrición. Al igual que la prueba anterior, también sirve para diferenciar
especies y pato vares de Pseudomonas fluorescentes.


BIBLIOGRAFÍA
Agrios, GN. 2007. Fitopatología, LIMUSA. México. 35 p.

33

4.2.6 PRÁCTICA 6. REACCIÓN DE KOH

INTRODUCCIÓN

La determinación del Gram de las bacterias, también se puede realizar de una forma
más rápida y sencilla, empleando únicamente solución acuosa de KOH al 3%, la cual
resulta ser una prueba rápida y muy sencilla en la que no influye la edad del cultivo con
los resultados como sucede con la tinción de Gram y el procedimiento es como sigue:

OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a realizar la prueba de reacción de
KOH, para diferenciar a las bacterias gram negativas de las gram positivas.

MATERIAL REQUERIDO

MATERIAL
Asa bacteriológica
Cultivo bacteriano
Portaobjetos

REACTIVOS
Hidróxido de potasio

a) En un portaobjetos limpio coloque una gota de KOH.
b) Del cultivo bacteriano puro, tome una asada.
c) Mezcle el cultivo con el hidróxido durante unos segundos y levante lentamente el
asa.
d) Si se forma un hilo, la reacción se considera positiva y significa que la bacteria
pertenece al grupo de las gram negativas. Por el contrario si después de unos
minutos no se forma el hilo, la bacteria es un miembro de las Gram positivas.


BIBLIOGRAFÍA


34

4.2.7 PRÁCTICA 7. TINCIÓN DE CÁPSULA

INTRODUCCIÓN

La cápsula es una capa gelatinosa y mucoide cuyo espesor puede ser escaso o por el
contrario, importante, hasta el punto de duplicar el volumen de la bacteria. Este material
no solamente no existe en todas las bacterias, sino que en las especies capsuladas
puede no estar siempre presente. Su desarrollo se favorece cuando la bacteria se
cultiva en medios con alto contenido de carbohidratos o cuando se multiplica dentro del
hospedante.

OBJETIVOS: Que el alumno sea capaz de utilizar los reactivos para la coloración de la
cápsula bacteriana y mejorar su observación al microscopio.

MATERIALES REQUERIDOS

EQUIPO

MATERIAL
Portaobjetos
Lámpara de alcohol

REACTIVOS
Fuccina
Etanol
Mordente de Muir
Azul de metileno
Agua estéril


a) Se hace un frotis de la bacteria y se fija al aire.
b) La laminilla se cubre con fuccina fenicada fuerte y se calienta ligeramente durante 1
minuto.
c) El frotis se lava rápidamente con etanol, y después se lava perfectamente con agua.
d) Se cubre con el mordente de Muir durante 30 seg.
e) Lave con agua y posteriormente con etanol durante 30 segundos ó hasta que el frotis
tome un color rojo pálido.
f) Lave perfectamente con agua.
g) Tiña con azul de metileno de Loeffler durante 30 segundos.
h) Lave con agua y deje secar.
i) Observe al microscopio compuesto, las bacterias se tiñen de rojo y las capsulas de
azul.

35


BIBLIOGRAFÍA
DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados

Rodríguez, M. M. 2001 Manual de prácticas de bacterias fitopatógenas.
DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA AGRICOLA. Universidad Autónoma de
Chapingo.

36

4.2.8 PRÁCTICA 8. OBSERVACIÓN DE SÍNTOMAS CAUSADOS POR
FITOBACTERIAS

INTRODUCCIÓN

Las bacterias fitopatógenas ocasionan el desarrollo de casi tantos tipos de síntomas en
las plantas que infectan como los que producen los hongos. Producen manchas y
tizones foliares, pudriciones blandas de frutos, raíces y órganos almacenados,
marchitamientos, crecimientos excesivos, sarnas, cancros etc. Cualquiera de estos
tipos de síntomas puede ser producido por las bacterias patógenas de varios géneros y
cada género contiene algunos patógenos capaces de producir diferentes tipos de
enfermedades. Sin embargo, las especies de Agrobacterium, sólo producen
crecimientos excesivos o proliferación de los órganos. Por otra parte, los crecimientos
excesivos también pueden ser producidos por ciertas especies de Corynebacterium y
Pseudomonas. Asimismo, las dos especies fitopatógenas de Streptomyces, sólo
producen sarnas o lesiones en los órganos subterráneos de las plantas. Las especies
de Rhizobium inducen la formación de nódulos en las raíces de las leguminosas.

Los síntomas pueden indicar la existencia de una enfermedad, pero ellos no son en sí
la enfermedad, estos son utilizados como guías para diagnosticar la naturaleza o causa
de una enfermedad en particular. Entre las enfermedades bacterianas encontramos
variados tipos de síntomas, los cuales son divididos en cuatro categorías:

1. Cambios de color: Alteraciones presentes en los plastidios, vacuolas o cloroplastos
dando como consecuencia:
Clorosis: Retardamiento o disminución de la clorofila por anormalidades en los
cloroplastos.

Amarillamiento: Disminución de clorofila e incremento de carotenos y xantofilas.

Antocianocencia: coloración púrpura como resultado del incremento del pigmento
antocianina.

2. Desintegración de tejidos: Son ocasionados por la acción enzimático o toxinas que
producen los patógenos sobre la pared del hospedante y/o afectando el protoplasma
celular.

Pudrición: áreas muertas debido a la maceración de tejidos con presencia de
exudados bacterianos. Esta pudrición puede ser de consistencia seca o húmeda.

Cancro: Necrosis restringida en los tejidos corticales de tallos y raíz con crecimiento
secundario, usualmente delimitado por tejido sano.

Necrosis: Áreas donde las células sufren primeramente plasmólisis, colapso y la
muerte. En ocasiones éstas áreas presentan una coloración oscura o castaña debido a
la producción de melaninas.

37

Tizón: Desintegración rápida de los tejidos seguida por la muerte celular, esta puede
ser parcial o total del hospedante (producción de toxinas) también definida como
lesiones de crecimiento indeterminado.

Mancha: Necrosis localizada en cualquier parte de la planta.

3. Desarrollo anormal del crecimiento: Ocasionado por alteraciones en las sustancias
reguladoras del crecimiento ya sea aumentando o disminuyendo su concentración.

Agalla: desarrollo anormal donde las células dañadas sufren el fenómeno de
Hiperplasia (multiplicación excesiva de las células) o Hipertrofia (aumento de tamaño de
las células).

Fasciación: proliferación excesiva de brotes como consecuencia de la Hipoplasia (poca
división celular), presentándose la planta como arrosetada.

4. Daños al sistema vascular
Marchitez: Flacidez o pérdida de turgencia de la planta debido al taponamiento de los
vasos que conforman este sistema, ya sea por estructuras del patógeno, sustancias
que las bacterias producen o estructura del tejido vegetal.

OBJETIVOS: Que el alumno sea capaz de diferenciar la sintomatología de
enfermedades de importancia en plantas causadas por bacterias.

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO

MATERIAL
Agua destilada estéril
Portaobjetos
Navajas


a). Identificar los distintos tipos de síntomas ya señalados, usando para ello las
muestras de material vegetal enfermo que le proporcione el instructor.
b). Describir en forma sencilla al menos un tipo de síntoma característico de cada
enfermedad. En cada caso, indique el patógeno y el nombre común de la enfermedad.
Por ultimo señalar como diferenciar síntomas de enfermedades causadas por bacterias
y hongos y discutir que tan confiable resulta la identificación de las enfermedades en
base a la observación de síntomas.

38


BIBLIOGRAFÍA
Agrios, G. N. 2007. Fitopatología. LIMUSA Wiley, México. pp 540-541
Bauer, L. I. 1984. Fitopatología. LIMUSA. Colegio de Postgraduados.

39

Plan 3

4.3 Fitopatología General. IV semestre.

4.3.1 PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN Y MANEJO DE MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIÓN

Los medios de cultivo son mezclas de sustancias que se usan para el aislamiento y
desarrollo de hongos, bacterias y otros microorganismos. Cabe señalas que la mayoría
de los hongos fitopatógenos se pueden cultivar de manera relativamente sencilla en
medios adecuados. Sin embargo existen grupos de patógenos denominados parásitos
obligados cuyo cultivo aún no se a logrado a menos que se inoculen en plantas vivas.

Los medios de cultivo requieren de ciertas características mínimas para lograr
exitosamente el desarrollo de los hongos y entre los más importantes se encuentran:

1. El medio deberá contener elementos nutritivos tales como: fuentes de carbono,
nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, cobre y molibdeno. También pueden ser
necesarias algunas vitaminas y otras sustancias que se hallan presentes en los
materiales naturales o artificiales que componen los medios.
2. El medio no deberá deshidratarse fácilmente, por que se evita manejándolo en
recipientes adecuados que además permitan su manejo en condiciones estériles
es decir, evitando contaminaciones. El oxigeno es necesario en todos los casos
por lo que deberá permitirse la aireación. Ya sea en las cajas de Petri o en tubos
de cultivo.
3. La mayoría de los medios de cultivo para hongos requieren esterilización antes
de usarse, lo que generalmente se logra mediante calor húmedo usando
autoclave u olla Express.
4. La mayoría de los hongos crecen bien a temperatura de 20 a 32 oC, pero existe
mucha variación entre grupos o especies. La temperatura óptima para el
desarrollo de la enfermedad que causen puede servir como punto de referencia
para la temperatura de incubación del hongo en el medio de cultivo.
5. La mayoría de los hongos crecen bien a ph de 5 a 6, pero hay excepciones. La
temperatura y/o Ph óptimo para la esporulación puede ser distinto que para el
crecimiento del micelio. En ocasiones es conveniente agregar pequeñas
cantidades de ácido láctico para eliminar bacterias contaminantes en el medio,
pues estas generalmente no toleran la acidez, permitiendo el crecimiento
fungoso.
6. El crecimiento del micelio y sobre todo la esporulación de los hongos en el
medio, esta muy influido por la luz. Muchos hongos esporulan fácilmente sin
necesidad de luz artificial o aun en plena oscuridad, pero otros requieren
condiciones especiales de calidad y confiabilidad de luz. Este factor puede ser
clave cuando se requieren altas cantidades de esporas con fines de
investigación o para identificar alguna especie en particular.

El medio de cultivo sustituye parcialmente las propiedades nutricionales del
hospedante o sustrato natural del hongo por cultivar. La utilidad del medio es

40

proporcionar energía al microorganismo, para que desarrolle en la forma más
normal posible.

Por su composición nutritiva los medios de cultivo pueden ser:

1. Medios naturales. Están compuestos por materiales enteramente naturales,
tales como partes de plantas, malta, levadura etc.… se requieren en forma de
extractos o decocciones o simplemente esterilizando las partes vegetales con
calor u otro método. Aunque se usan poco, pueden ser superiores a otros
medios sobre todo en el caso de hongos de difícil esporulación. Por ejemplo se
pueden conseguir altas cantidades de esporas de Stemphylium, sembrando a
este hongo en tallos de cartamo esterilizados en autoclave.
2. Medios semisintéticos. Están compuestos parcialmente por materiales
naturales y sintéticos, el ejemplo mas común es el de papa dextrosa y agar, V8
agar, harina de maíz, agar etc.… son los más usados.
3. Medios sintéticos. Se conoce perfectamente su composición, ejemplo medio de
Komada o de Awuah y Lorbeer, para Fusarium oxisporum, por su consistencia
los medios de cultivo pueden ser:
a) Sólidos. Contienen agentes solidificantes principalmente el agar, proporción de
1 a 3%, el agar esta compuesto por una mezcla de carbohidratos complejos y se
obtiene a partir de algas.
b) Semisólidos. Aunque generalmente se usan poco en micología, estos se
obtienen bajando la concentración del agar o usando gelatina como agente
solidificante.
c) Líquidos. Se preparan sin agente solidificante. Se usan principalmente para
obtener altas concentraciones de esporas, ejemplo: papa- dextrosa.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

La preparación de medios de cultivo presenta distinto grado de complejidad, pero en
general se tarda una o dos horas para la elaboración de las más comunes. A
continuación se describe la forma de preparar el medio papa dextrosa agar, jugo V8
agar, agua agar, por ser los más comunes n la mayoría de los laboratorios de
fitopatología en el mundo.

OBJETIVOS

Aprender a elaborar los medios de cultivo.

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO
Autoclave
Olla Express

41

MATERIAL
Papas
Agua destilada
Matraces
Tubos de ensayo

REACTIVOS
Agar
Dextrosa
Carbonato de calcio
Jugo V8


a). Elaboración de papa dextrosa agar (PDA).

Crecen la mayoría de hongos y bacterias.
Papa partida 200 gr.
Dextrosa (glucosa) 13 gr.
Agar 18-16 gr.

1. Hierva las papas partidas en 500 ml de agua.
2. En otro recipiente disuelva el agar, calentando para ayudar a disolver.
3. Cuele el caldo de papa a través de la manta de cielo o algodón. Mezcle
ambos líquidos, agregue la dextrosa y homogenice.
4. Divida el líquido en recipientes adecuados (matraces o tubos). Tapar los
matraces con tapón de algodón. En caso de requerir el medio en tubos de
cultivo, se vacía a estos cuidadosamente, procurando no derramar medio
en la boca de los tubos. Los tubos también se tapan con algodón (al igual
que los matraces); en caso de ser tubos con tapa de rosca, esta deberá
quedar ligeramente floja durante la esterilización.
5. Esterilizar matraces y/o tubos en el autoclave u olla de presión de 15-20
libras/pulgada2 (± 120 oC durante 15-20 minutos) contados a partir del
momento en que se alcance la presión ya mencionada.
6. Abra la olla o autoclave hasta que la presión baje a cero. Deje enfriar el
medio al contacto con el aire, cuando este se encuentre tibio se vacía a
cajas de Petri en condiciones asépticas, es decir en la cámara de
transferencia o al manos desinfectando una mesa y auxiliándose de
mecheros de gas. Las corrientes de aire deberán evitarse al máximo. Los
tubos de ensayo se colocan en posición inclinada hasta que el medio
solidifique, apretando los tapones de rosca o algodón, según se trate.
7. En ocasiones se agregan 2 o 3 gotas de ácido láctico (antes de vaciar)
para prevenir el desarrollo de bacterias. en otros casos se agregan
pequeñas cantidades (50-200 ppm) de antibióticos tales como la
estreptomicina, penicilina, etc., también antes de vaciar, el cloranfenicol
tolera la esterilización en las condiciones antes señaladas. A ciertos
42

medios selectivos también se le pueden incorporar PCNB, Benomyl u
otros fungicidas pero en dosis bajas (mg /lt).

b). Elaboración de V8-agar.

Para Phycomycetes y otros
Jugo V8 200 ml
Carbonato de calcio 3 gr
Agar 16-18 gr

Agregue 200 ml de jugo V8 a 800 ml de agua tibia, agregue el carbonato de
calcio y el agar agitando la mezcla, caliente en baño Maria hasta disolver el
agar. Una vez que el agar este disuelto, lleve el volumen a 1000 ml con agua
destilada. Vacíe el medio en recipientes adecuados y esterilice en el
autoclave a 15 libras de presión durante 20 minutos.

c). Elaboración de agua-agar.

Phycomycetes y otros. No crecen bacterias.
Agar 16 gr.
Agua destilada hasta completar 1000 ml

Disuelva el agar en 800 ml de agua utilizando un baño Maria, una vez
disuelto, lleve el volumen con agua a 1000 ml, vacíe el medio en recipientes
apropiados y esterilice en el autoclave a 15 libras de presión.


BIBLIOGRAFÍA

Agrios, GN. 2007. Fitopatología. LIMUSA, México. 285-288 p.

López, A.G. 1979. Manejo de Hongos Fitopatógenos. Universidad Autónoma de
Chapingo, México.

43

4.3.2 PRÁCTICA 2. AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATÓGENOS A PARTIR DE
PLANTAS ENFERMAS

INTRODUCCIÓN: El aislamiento consiste en el proceso de separación de
microorganismos a partir de su sustrato natural (plantas) para hacerlas crecer en un
medio de cultivo artificial.

El aislamiento y cultivo persigue diversos fines, el más común en un laboratorio de
fitopatología es para diagnosticar la causa de una enfermedad desconocida, sin
embargo, puede tener objetivos didácticos o de investigación sobre taxonomía,
fisiología y genética microbiana. Es común también cuando se quiere tener cepas puras
en la evaluación de productos químicos in Vitro.

El cultivo de microorganismos tiene enormes ventajas que contribuyen al conocimiento
de la biología de estos. Sin embargo, hay que considerar que al cultivar un organismo:
a) pueden ocurrir mutaciones b) se puede perder parcial o totalmente su patogenicidad,
c) los hongos pueden o no formar cuerpos fructíferos en medios artificiales; estos
cuerpos pueden presentar variación, d) existen hongos que no se pueden cultivar
(parásitos obligados) y otros que requieren medios complejos para su desarrollo.

Las técnicas para aislar hongos son diversas y dependen del hongo a estudiar y de la
propia experiencia del investigador.

OBJETIVOS

Aprender a aislar y cultivar hongos fitopatógenos

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO
Cámara de flujo laminar
Olla Express
Autoclave
Microscopio estereoscopico

MATERIAL
Agua destilada
Pinzas
Navajas
Filtros de porcelana

REACTIVOS

Alcohol etílico
Hipoclorito de sodio
PDA

44


INDUCCIÓN AL DESARROLLO MICELAR

Se recomienda que el hongo crezca y esporule sobre medios de cultivo, recomendable
para hongos que crecen en el interior del hospedante y/o que esporulen poco en el
tejido, tales como hongos de la raíz. Este método es el más usado cuando se requiere
tener a un hongo en cultivo puro.

1. Lavar el material enfermo con agua corriente y secar.
2. Seleccionar al tejido vegetal afectado procurando que los trocitos queden de 0.3
a 0.5 cm de longitud.
3. Desinfectar los trocitos (ver anexos al final de la práctica).
4. Enjuagar los trocitos en 3 pasos de agua destilada estéril y secarlos
perfectamente, al secar bien, disminuyen las contaminaciones.
5. Pasar 4 a 5 secciones a una caja de Petri con PDA, selle la caja con cinta
parafilm e incube de 20 a 25 oC.

INDUCCIÓN A LA ESPORULACIÓN

Se recomienda para aislar hongos que esporulen abundantemente y que atacan las
partes aéreas de las plantas.

1. Colocar en una caja de Petri 1 o 2 hojas de papel kleenex y humedecerlo con
agua destilada estéril (cámara húmeda).
2. Pasar la sección del tejido infectado a la cámara húmeda.
3. Después de 24-72 hrs, observar con el microscopio estereoscopico, tomar las
esporas con agujas de disección y transferir a una caja de Petri con PDA.

PURIFICACIÓN DE CEPAS

Es raro que al hacer una siembra o aislamiento, se obtenga solo al hongo deseado,
normalmente también crecen microorganismos contaminantes de los cuales es
necesario apartar al organismo de interés. Este proceso se denomina purificación y
normal mente consiste en cortar puntas de micelio del borde de la colonia en
crecimiento, mediante aguja de disección flameada. Esta pequeña porción del hongo y
agar se deposita en otras cajas con medio de cultivo estéril y de esta forma se obtienen
cultivos puros.

Es aconsejable hacer aislamientos que la muestra sea fresca (pocas horas) y que se
siembre a partir del borde de lesiones en crecimiento activo, de lo contrario la
purificación se dificulta, en ocasiones es necesario utilizar medios selectivos con
antibióticos y fungicidas para purificar cepas (la experiencia es clave).

45

DESINFECCIÓN

Los tejidos enfermos contienen normalmente diversidad de organismos que invaden los
tejidos muertos por el patógeno. Estos contaminantes dificultan el aislamiento, por lo
que generalmente es necesaria una desinfección previa a la siembra.

Entre los desinfectantes más usuales se tienen a:

1. Hipoclorito de sodio. El desinfectante más usado es el blanqueador de uso
domestico (cloralex), basta mezclar una parte de esta sustancia en cinco partes
de agua destilada para obtener el producto deseado ya que el blanqueador viene
al 5-6%, es decir que normalmente se usa hipoclorito al 1-2%, el tiempo de
exposición varía de 30 a 90 segundos; el material viejo o muy contaminado se
puede tratar por 2 a 3 minutos siempre que no se elimine el patógeno.
2. Alcohol etílico. Se usa generalmente al 70% por periodos de 30 segundos, el
uso de alcohol al 95% es peligroso por su flameabilidad.


.

BIBLIOGRAFÍA

Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA, México. 285-290 p.

López, A.G.F. 1979. Manejo de Hongos Fitopatógenos. Universidad Autónoma de
Chapingo.

46

4.3.3. PRÁCTICA 3. ELABORACIÓN DE MONTAJES MICROSCOPICOS DE
HONGOS FITOPATÓGENOS

INTRODUCCIÓN

Por su tamaño microscópico, los hongos generalmente no pueden observarse a simple
vista, a excepción de hongos macroscópico que por su propio tamaño pueden ser
observados superficialmente sin aparatos, siempre y cuando no se requiera estudiar
detalles de las esporas, etc.

Para su observación al microscopio compuesto, los hongos requieren ser preparados y
montados en portaobjetos. En estudios preliminares o de rutina se hacen preparaciones
temporales desechables, pero si se desea preservar especimenes por largo tiempo es
necesario elaborar montajes permanentes, los que de hacerse correctamente duran
uno o varios años en buenas condiciones.

Para hacer un montaje de calidad, se requiere paciencia y experiencia, además de la
destreza individual, sin embargo, todo fitopatólogo debe intentar hacer buenas
preparaciones, ya que actividades prácticas tales como el diagnostico de enfermedades
dependen de alto grado de buenas preparaciones.

OBJETIVOS

Aprender a preparar montajes microscópicos de especimenes fungosos.

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO
Microscopio biológico compuesto

MATERIAL
Cepas de hongos
Montajes permanentes de hongos
Agua
Cinta adhesiva
Porta y cubre objetos
Navajas

REACTIVOS
Fenol ( cristales )
Acido láctico
Lactofenol azul y claro
Glicerina

47


MONTAJE CON AGUJA DE DISECCIÓN

Es útil para montar estructuras que desarrollan abundantemente en la superficie del
hospedante, o a partir de cepas que crecen en medio de cultivo. Es la técnica obligada
para hacer preparaciones a partir de raíces infectadas. El procedimiento consiste en:

1. Colocar una pequeña gota de agua u otro medio de montaje en el centro de un
portaobjetos.
2. con la punta de la aguja humedecida tome o roce ligeramente las esporas y/o
micelio que desee montar, evite tomar material excesivo ya que dificulta la
observación posterior. De ser necesario, puede auxiliarse del microscopio
estereoscopico para hacer mejor el trabajo.
3. Transferir el material a la gota del medio de montaje, coloque cuidadosamente
un cubreobjetos y observe con los objetivos 10x y 40x.
4. Para montajes temporales use agua o lactofenol, para preparaciones
permanentes use lactofenol y selle con esmalte para uñas.

MONTAJE MEDIANTE CINTA ADHESIVA

Es la técnica más rápida y fácil, sobre todo para personas inexpertas. Las
preparaciones son exclusivamente temporales. No usar para hacer montajes a partir de
raíces, especialmente si estas presentan suelo adherido. El método consiste en:

1. Colocar una gota de agua u otro medio de montaje en el centro de un
portaobjetos.
2. cortar un trozo de cinta, 1 o 2 cm más grande que la longitud del portaobjetos, no
use trozos de cinta más pequeños o más grandes.
3. Tomar la cinta por los extremos con dos de los dedos, deposite suavemente la
parte engomada sobre la superficie del hospedante o crecimiento del hongo en
medio de cultivo, evite presionar demasiado, pues tomara material en exceso y/o
también se pegaran setas u otras estructuras de la planta que dificultaran la
observación.
4. Tome la cinta con las dos manos y péguela sobre el portaobjetos, vigile que la
cinta pegue rápidamente en ambos extremos del cristal, pues de lo contrario
despegara fácilmente, observe al microscopio con los objetivos 10x y 40x.

Las mejores preparaciones no son aquellas que presentan mucho material, sino las
que contienen las estructuras típicas del hongo, más aun si se encuentran bien
separadas y arregladas en forma estética.

CORTES DE CUERPOS FRUCTÍFEROS

Cuando se quieran observar estructuras que se encuentran parcial o totalmente
inmersas en el hospedante y/o encerradas en cuerpos fructíferos, es necesario hacer
cortes transversales que permitan observar perfectamente la forma y ubicación interna
de las esporas, estos cortes se pueden hacer con aparatos especiales, pero
generalmente se efectúan de manera manual mediante el siguiente método:
48

1. Coloque el material enfermo bajo el microscopio de disección, separe una
porción superficial del tejido enfermo mediante un corte longitudinal procurando
no dañar los cuerpos fungosos, esto facilitara los cortes de los cuerpos ya que
solo manejaremos una pequeña porción de tejido, el tamaño de la muestra
puede variar, pero se aconseja dejar tiras de +/- 1 a 3 cm de largo por +/- 1 a 3
mm de ancho, con un grosor de +/- 0.5 a 2 mm; esto depende de muchos
factores tales como el tamaño de los cuerpos a cortar, consistencia del tejido
etc., la experiencia es básica.
2. Con una navaja de rasurar sin usar, separe el tejido adyacente que se encuentra
adelante y a los lados del cuerpo fructífero; este quedara delimitado y listo para
los cortes definitivos.
3. Coloque el dedo índice de la mano izquierda junto al cuerpo a cortar, cuide de no
presionar directamente al cuerpo, de tal forma que al recargar la navaja en el
dedo índice, este guíe y regule el espesor de los cortes, estos deben ser lo más
delgado posible (cortes transversales de un solo tajo).
4. Los cortes que van quedando adheridos o por un lado de la navaja, se toman
con una aguja de disección humedecida y se transfieren al portaobjetos, en el
que previamente se a depositado una gota de medio de montaje. Coloque al
portaobjetos y observe al microscopio.

MEDIOS DE MONTAJE

1. Agua destilada. Útil para montajes temporales, se puede agregar detergente en
bajas cantidades para reducir la formación de burbujas.
2. Lactofenol. Aunque existen otros medios, este es uno de los más usados por su
fácil preparación y alta eficiencia, además también funciona como solución
fijadora y restauradora de la turgencia del material.

PREPARACIÓN DEL LACTOFENOL

Fenol (cristales) 20 gr
Ácido láctico 20 ml
Glicerina 40 ml

Para obtener una mezcla rápida, calentar ligeramente el agua hasta disolver el fenol,
agregue enseguida la glicerina y el ácido láctico, se pueden agregar (opcional)
colorantes tales como el azul algodón u otros, para teñir las esporas y para que la
observación sea más agradable a la vista.

ABLANDAMIENTO DE TEJIDOS SECOS

Las tres técnicas descritas se pueden hacer con tejido fresco y seco. En el caso de
cortes de material seco o duro se puede reblandecer los trozos a cortar en una
solución de hidróxido de potasio (KOH) al 2%, esto facilita los cortes, el periodo de
exposición es variable, pero comúnmente basta de 3 a 5 minutos, la exposición
prolongada reblandece excesivamente los tejidos y/o desintegra las estructuras
fungosas.
49


BIBLIOGRAFÍA

Echando, E. 1971. Manual de Laboratorio para Fitopatología General, Herrera
Hermanos. 13-14 p.

Streeta, R.B. 1972 Tha Diagnosis of Plant diseases, Univ. Arizona Press.
López, A.G. 1979. Manejo de Hongos Fitopatógenos. UACH. 25-29 p.

50

4.3.4 PRÁCTICA 4. SÍNTOMAS CAUSADOS POR HONGOS FITOPATÓGENOS

INTRODUCCIÓN

De manera sencilla podemos decir que una enfermedad es toda alteración de la
fisiología o de la estructura normal de la planta, lo suficientemente prolongada para
producir síntomas visibles y ocasionar daños en la calidad y/o cantidad de la
producción. En consecuencia, los síntomas son manifestaciones visibles de tal
anormalidad, cada enfermedad fungosa es causada generalmente por un solo patógeno
y presenta síntomas que son característicos; si bien es cierto que algunas
enfermedades presentan síntomas idénticos, por lo que se requieren estudios de
laboratorio para diferenciarlas.

Por lo anterior, el conocimiento de los síntomas es indispensable para el diagnostico de
enfermedades, sobre todo a nivel de campo, las enfermedades fungosas pueden
agruparse en base a los síntomas principales, de la siguiente manera:

1. Enfermedades vasculares. Estos hongos atacan principalmente los vasos
conductores, el micelio, esporas y algunos productos de su metabolismo
taponean o destruyen los vasos, evitando el flujo de agua y nutrientes hacia la
parte superior de la planta, a consecuencia de lo anterior generalmente se
derivan tres tipos de síntomas:
a) Marchitamiento. El sistema conductor es bloqueado gradualmente y la planta
muestra flacidez que inicialmente se observa solo en horas calurosas, al paso
del tiempo la planta muere.
b) Amarillamiento. Puede o no presentarse con la marchitez, pero generalmente
se presenta al inicio de la enfermedad, cuando los tejidos están parcialmente
incluidos por el hongo. Se inhibe la síntesis de clorofila o esta se destruye por la
acción de toxinas fungosas.
c) Defoliación. La obstrucción del sistema vascular o el ataque directo al follaje
provocan desprendimiento de hojas.
2. Enfermedades de tipo necrótico. Algunos hongos invaden inicialmente los
tejidos parenquimatosos, si bien es cierto que con el tiempo también alcanzan
los vasos conductores, los síntomas más comunes de este tipo son:
a) Manchas foliares. Estos hongos parásitos destruyen la lámina foliar, ramas o
superficies de frutos, las manchas son de tamaño pequeño, es decir que solo
alcanzan un tamaño y forma determinada a pesar de que el ambiente sea
favorable, con frecuencia las lesiones están limitadas por las nervaduras
principales.
b) Tizones. El patógeno causa manchas necróticas extensivas en cualquier órgano
de la parte aérea de la planta, las lesiones crecen de forma relativamente
indefinida mientras existan condiciones ambientales favorables, los órganos
afectados presentan aspecto de quemaduras por fuego.
c) Pudriciones. Estos patógenos producen enzimas que destruyen la lámina media
de la pared celular y como resultado, las células pierden su integridad, se
plasmolizan y mueren. Las pudriciones pueden ser blandas o secas.
3. Enfermedades hiperplasicas. Algunos patógenos estimulan anormalmente las
células, induciendo su división excesiva (hiperplasia) o provocan su crecimiento

51

exagerado (hipertrofia), a simple vista se aprecian tumores o agallas en distintos
órganos de la planta.

OBJETIVOS

Reconocer distintos tipos de síntomas causados por hongos fitopatógenos.

MATERIALES REQUERIDO

EQUIPO
Microscopios de disección y biológico compuesto.

MATERIAL

Material vegetal enfermo.

REACTIVOS

Lactofenol claro.


1. Identifique los distintos tipos de síntomas ya señalados, usando para ello
las muestras de material vegetal enfermo que le proporcione su instructor.
2. Describa en forma sencilla al menos un tipo de síntomas típico
representativo de cada grupo, señalando: color, tamaño, forma, borde,
consistencia etc. En cada caso, indique el patógeno y el nombre común
de la enfermedad.
3. Haga un dibujo sencillo pero explícito de cada tipo de síntomas que
observe.

RESULTADO DE LA PRÁCTICA

Se consideran los dibujos y la descripción

BIBLIOGRAFÍA

Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA. México. 284 p.

González, L.C. Introducción a la Fitopatología IICSA.

Walker, J.C. Patología Vegetal. OMEGA. Barcelona, España.

52

4.3.5 PRÁCTICA 5. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD DE HONGOS
FITOPATÓGENOS

INTRODUCCIÓN.

Los hongos causan enfermedades mediante un proceso que indica cuando las esporas
(o micelio) que germina y el patógeno penetra a los tejidos sanos, al paso de días y
meses el patógeno invade los tejidos, produciendo sobre la superficie del hospedante
nuevas generaciones de esporas.

La identificación de enfermedades se basa en gran parte en el reconocimiento de
síntomas típicos de cada enfermedad, en caso de duda o de enfermedades poco
conocidas, es necesario un estudio de laboratorio para determinar la causa del
problema.

En laboratorio, el fitopatólogo analiza las plantas y en base al microorganismo
detectado a los síntomas y apoyándose en literatura especializada da un diagnostico
del problema, sin embargo estos diagnósticos con frecuencia tienen alto grado de
incertidumbre, ya que es raro encontrar a un solo microorganismo asociado a la
enfermedad en estudio, en ocasiones hay 2, 3, 4 o más organismos creciendo en los
tejidos enfermos. Aquí cabe la interrogante ¿ cuál de todos es el causante del problema
en estudio?.

El diagnostico rápido y preciso es indispensable para tomar medidas de control,
diagnósticos equivocados conducen a fallas en el control, que pueden conducir a
pérdidas totales, por lo anterior, el investigador tiene que probar experimentalmente en
ocasiones a todos los microorganismos asociados para establecer la causa de la
enfermedad.

Los ensayos que se utilizan para probar la capacidad de un organismo para causar una
enfermedad, se denominan “pruebas de patogenicidad”. Estas pruebas tienen que
satisfacer cuatro reglas o postulados fueron desarrollados por Roberto Koch en el siglo
pasado y señalan que:

1. El microorganismo debe estar asociado con la enfermedad, a su vez esta
no debe aparecer sin que el microorganismo este o haya estado presente.
2. El microorganismo debe aislarse en cultivo puro y deben establecerse sus
caracteres específicos (forma, tamaño, fisiología, etc.)
3. El microorganismo puro debe reproducir los síntomas de la enfermedad
cuando se inocule en plantas sanas de la misma variedad o tipo del cual
fue aislado, este proceso deberá efectuarse bajo ambiente favorable a la
enfermedad.
4. El microorganismo debe ser reaislado del hospedante inoculado y debe
mostrar las mismas características en cultivo, que el microorganismo
inoculado originalmente en plantas sanas.

En el caso de parásitos obligados, es necesario hacer adaptaciones que permiten
cumplir los postulados de Koch.

53

OBJETIVOS

Conocer la metodología para probar la patogenicidad de hongos fitopatogenos y cumplir
los postulados de Koch.

MATERIAL REQUERIDO

EQUIPO
Microboy.

MATERIAL
Frutos enfermos (de tomate )
Lámparas de alcohol.
Bolsas de plástico.
Papel absorbente

REACTIVOS
PDA infectado con hongo
Hipoclorito de sodio.


1. Colecte frutos de tomate enfermos por pudrición agria (Geotrichum candidum),
observe y describa los síntomas, observe al microscopio el cuerpo (micelio y
esporas) del hongo y haga dibujos detallados de estos.
2. Desinfecte frutos de tomate sumergiéndolos en hipoclorito de sodio al 2% por
dos minutos, los frutos deberán estar sanos y sin golpes, de preferencia maduros
y consistencia firme.
3. Provoque heridas de 0.5 a 1.0 cm de profundidad en los frutos desinfectados,
para ello utilice una aguja de disección esterilizada, a la flama de un mechero.
4. Coloque sobre las heridas un disco pequeño de PDA-hongo (micelio y esporas) o
gotas de agua estéril con esporas en suspensión de cultivos jóvenes y puros de
Geotrichum candidum. Tome otros frutos desinfectados e inocúlelos de la misma
forma, pero sin causar heridas previas, deje frutos con o sin heridas sin inocular,
como testigos.
5. Coloque los frutos inoculados y no inoculados por separado, en una bolsa o
recipiente que contenga papel absorbente humedecido con agua destilada estéril
(cámara húmeda).
6. Incube de 2 a 4 días a temperatura de 25 a 39 oC.
7. Al detectar síntomas de la enfermedad en los frutos inoculados, proceda a hacer
el reaislamiento de manera similar a como realizó el aislamiento, cheque las
características del hongo desarrollando en los frutos inoculados antes de hacer
el reaislamiento.
8. Compare las características morfológicas del hongo inoculado, compare también
los síntomas reproducidos artificialmente con los que presentaron los frutos
infectados naturalmente.
54


BIBLIOGRAFÍA

Agrios, G.N. 2007. Fitopatología, LIMUSA. México. 35 p.

González, L.C. 1981. Introducción a la Fitopatología. IICA. San José Costa Rica. 12-13
p.

Bauer, L.I. 1984. Fitopatología. LIMUSA. Colegio de Postgraduados.

55

Manual de Prácticas Fitopatología-ESAVF

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