1. ALMA MATER STUDIORUM – UNIVERSITA' DI BOLOGNA
LEOPOLD-FRANZENS UNIVERSITÄT INNSBRUCK
Facoltà di Farmacia
Corso di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
Phytochemical characterization of
the ethyl acetate soluble fraction of
wood extract of
Cotinus coggygria
Relatore: Dr.ssa Ester Speroni
Co-Relatore: Univ. Prof. Dr. Hermann Stuppner
Presentata da: Valentina Masi
Matricola: 0000254734

2. Cotinus coggygria
Anacardiaceae, chiamato
anche Sommacco selvatico,
Scotano, Albero della nebbia
Morfologia: Arbusto caducifoglio, globoso, alto
0,3-4 m, con odore resinoso; radici molto
robuste e capaci di insinuarsi profondamente tra
rocce; rami prostrato-ascendenti, sottili; rametti
dell'anno dapprima verdi-lucidi, poi rossastri-
bruni; corteccia scabra, sottilmente screpolata,
color terra con macchie chiare; legno verde
chiaro con midollo scuro e con odore di
trementina al taglio; gemme subsessili, piccole,
appuntite, scure.
Foglie semplici alterne, ovali-ellittiche o
subrotonde, ottuse, glabre, a margine intero, con
picciolo, glauche ed opache su ambedue le
pagine, colore virante al giallo-arancio fno al
rosso-carminio.
Fiori giallo-verdastri in pannocchie lasse ed
irregolari terminali (10-20 cm), molto piccoli, su
peduncoli gracili e piumosi (ad antesi conclusa)
per peli rosei, in gran parte sterili.
Frutti drupacei secchi, a forma di cuore (o di
pera), rugosi, radi, di 3-4 mm.

3. Distribuzione
Ampia distribuzione nelle zone più
meridionali del Mediterraneo,
penisola balcanica e nelle regioni del
Centro e del Sud-Ovest asiatico.
In Italia cresce spontaneamente nel
centro-nord (eccetto Val d'Aosta), con
esclusione di tutto il meridione e le
isole.
Preferenza per zone asciutte e
calcaree, fno ad un'altitudine di 900
m.
Spesso coltivato nei giardini per
l'e fetto decorativo di foglie e
infruttescenze.

4. Importanza e utilizzo
Foglie, inforescenze, frutti e tronco rientrano per secoli
nelle preparazioni della medicina tradizionale (in particolare
bulgara e cinese) per la cura di:
Ferite dalla guarigione difcile
Lesioni dei tessuti delle mucose
Alterazioni del sistema epatobiliare
Ulcera gastrica e duodenale
Diarrea
Infammazioni
Paradontite
Emorroidi
Estratto attivo contro:
Infezioni da E. coli, Staphylococcus aureus and S. cerevisiae
Cancro

5. Proflo Fitochimico
Classi fcazione dei
metaboliti secondari
presenti nel legno del
Cotinus c. fno ad ora
conosciuti:
Flavonoidi e derivati
Flavoni
Isofavoni
Auroni
Calconi
Acido gallico e
derivati

6. Proflo Fitochimico
Flavonoidi e derivati
• Eriodictiolo
• 7,3',4'-triidrossi-diidrofavone
• Fisetina
• 5,7,4'-triidrossi-diidrofavone
• Quercetina
• 3,7,3',4'-tetraidrossi-diidrofavone
• Buteina
• 3,5,7,3',4'-pentaidrossi-diidrofavone
• Disulfuretina {2,2'-[1,2-bis(3,4-
• Isoliquiritigenina (4,2',4'-triidrossicalcone)
diidrossifenil)-1, 2-etanedilidene]bis-[6-
• Fisetina (3,7,3',4'-tetraidrossifavone) idrossi-3(2H)-benzofuranone]}
• C-3/C-3'' dimero della butina (3',4',7- • Sulfuretina (6,3',4'-triidrossiaurone)
triidrossifavanone) • Sulfureina
• Catechina
• Fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina
Acido gallico e derivati
• Epifsetinidol-(4β→8)-(+)-catechina
• Fustina
• Acido gallico
• Diidroquercetagetina
• Metil gallato
• Butina
• Penta- galloil glucosio

7. Attività antinfammatoria
Legno del fusto di Cotinus coggygria

8. Attività antinfammatoria
Legno del fusto di Cotinus coggygria
↓
Estratto metanolico

9. Attività antinfammatoria
Legno del fusto di Cotinus coggygria
↓
Estratto metanolico
↓
Frazione di etilacetato

10. Attività antinfammatoria
Legno del fusto di Cotinus coggygria
↓
Estratto metanolico
↓
Frazione di etilacetato
↓
Saggio per via orale dell'edema di zampa di ratto

11. Attività antinfammatoria
Legno del fusto di Cotinus coggygria
↓
Estratto metanolico
↓
Frazione di etilacetato
↓
Saggio per via orale dell'edema di zampa di ratto
↓
Inibizione dell'edema del 34 - 57 %

12. Attività antinfammatoria
Legno del fusto di Cotinus coggygria
↓
Estratto metanolico
↓
Frazione di etilacetato
↓
Saggio per via orale dell'edema di zampa di ratto
↓
Inibizione dell'edema del 34 - 57 %
Ethyl acetate fraction
0.75
CTRL; n=18
difference volume [mL]
100 mg/kg; n=3
0.50 200 mg/kg; n=3
0.25
0.00
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
time [h]

13. Attività antinfammatoria
Sulfuretina e Fustina (sostanze pure)

14. Attività antinfammatoria
Sulfuretina e Fustina (sostanze pure)
↓
Saggio per via orale dell'edema di zampa di ratto

15. Attività antinfammatoria
Sulfuretina e Fustina (sostanze pure)
↓
Saggio per via orale dell'edema di zampa di ratto
↓
Inibizione dell'edema non signifcativa (16 – 23 %)
Pure substances
0.75
CTRL; n=18
Sulfuretin 200 mg/kg; n=3
difference volume [mL]
0.50 Fustin 100 mg/kg; n=3
0.25
0.00
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
time [h]

16. Scopo dello studio
Sviluppare l'indagine ftochimica sulla frazione di
etilacetato per identifcare i composti responsabili
dell'attività farmacologica

17. Scopo dello studio
Sviluppare l'indagine ftochimica sulla frazione di
etilacetato per identifcare i composti responsabili
dell'attività farmacologica
Identifcazione
Isolamento e
delucidazione strutturale

18. Scopo dello studio
Sviluppare l'indagine ftochimica sulla frazione di
etilacetato per identifcare i composti responsabili
dell'attività farmacologica
Identifcazione
Isolamento e Confronto con
delucidazione strutturale composti di riferimento

19. Isolamento

20. Composti isolati
D4 – D9 – D11
(Sephadex con MeOH puro → HSCCC)
Fustina Sulfuretina-6-O-β-D-glucoside (Sulfureina)
Eriodictiol-7-O-β-D-glucoside

21. Composti isolati
D4 – D9 – D11

22. Composti isolati
F5 - S9
(F5: Sephadex MeOH puro → Sephadex MeOH/H₂O → HSCCC;
S9: Sephadex MeOH puro → Sephadex MeOH puro → LOBAR)
1,2,3,6-tetragalloil-O-β-D-glucosio

23. Composti isolati
I2
(Sephadex con MeOH puro → HSCCC → Sephadex con MeOH puro)
Fraction Combined tubes Yield (mg)
I1 1-20 28.20
I2 21-27 11.09
I3 Washing 24.30
Basso rendimento
Campione contentente troppe impurità
↓
Struttura assegnata tramite confronto di spettri UV e MS
↓
Trigalloil-O-β-D-glucosio

24. Composti isolati
N4
(Sephadex con MeOH puro → HSCCC → Sephadex con MeOH puro)
Fraction Combined tubes Yield (mg)
N1 1-13 3.42
N2 14-18 7.16
N3 19-20 7.41
N4 21-28 78.88
N5 29-44 36.95
N6 Washing 4.59
Basso rendimento
Campione contenente troppe impurità
↓
Analisi NMR non praticabile

25. Composti isolati
P2
(Sephadex con MeOH puro → HSCCC → 2 Sephadex simultanee con MeOH puro →
2 Sephadex consecutive con MeOH puro)
Sulfuretina-6-O-β-D-glucoside-6’’-gallato (= sulfureina-6’’-gallato)

26. Composti isolati
Q11
(Sephadex con MeOH puro → HSCCC → LOBAR)
Pentagalloil-O-β-D-glucosio

27. Confronto con composti di
riferimento
O OH Acido gallico
-MS, -Spectral Bkgrnd, 3.7min #124
8000
168.8
6000
4000
2000 296.9 1416.7
437.8
246.8 499.7 542.9 610.9 793.9
HO OH 1031.5
0
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
OH
mAU
500
400
Norm.
300
1200
3.795
200
1000
100
0 800
5 10 15 20 25 30 35 40 45 min
mAU
3.718
600
500
400 400
300
200
200
100 0
0
200 250 300 350 400 450 500 550 nm
5 10 15 20 25 30 35 40 45 min

28. Confronto con composti di
riferimento
(+/-) catechina x10 4 -MS, -Spectral Bkgrnd, 6.1min #202
2 288.9
1
182.8
136.8 356.9 402.9442.5 504.8 579.8 649.1 792.8 1475.4
0
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
x10 4 +MS, -Spectral Bkgrnd, 6.0min #201
6 291.1
4
2 475.3
139.2
233.6 407.3 541.9 619.1 665.9
0
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
mAU
500
400
300
Norm.
200 1000
6.548
100
800
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 min
mAU
600
6.480
60
50
400
40
30
200
20
10 0
0
200 250 300 350 400 450 500 550 nm
5 10 15 20 25 30 35 40 45 min

29. Confronto con composti di
riferimento
O O Metilestere dell'acido gallico
CH3
x10 5 -MS, -Spectral Bkgrnd, 6.5min #216
2 182.8
1
296.8 366.8
0
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
HO OH
x10 5 +MS, -Spectral Bkgrnd, 6.5min #217
185.1
1.5
OH 1.0
0.5
153.1 475.3
534.6
0.0
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
mAU
500
mAU
400
1200
300
1000
200
6.824
100
800
0
mAU
5 10 15 20 25 30 35 40 45 min 600
6.659
500
400 400
300
200
200
0
100
200 250 300 350 400 450 500 550 nm
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 min

30. Confronto con composti di
riferimento
Fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina
x105 -MS, -Spectral Bkgrnd, 9.2min #308
0.75 561.1
0.50
0.25
302.9
0.00
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
x10 5 +MS, -Spectral Bkgrnd, 9.3min #309
2 563.1
1 411.1
273.0
633.0
0
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
mA U
500
400
300
mAU
1400
10.035
200
100 1200
0 1000
5 10 15 20 25 30 35 40 45 min
9.973
mA U
50 800
40 600
30 400
20 200
10
0
0 200 250 300 350 400 450 500 550 nm
5 10 15 20 25 30 35 40 45 min

31. Confronto con composti di
riferimento
Epifsetinidol-(4β→8)-(+)-catechina
x10 5 -MS, -Spectral Bkgrnd, 10.9min #362
1.5 561.1
1.0
0.5
634.9
0.0
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
x105 +MS, -Spectral Bkgrnd, 10.8min #361
4
563.2
3
2
1 411.1
273.2 467.0
0
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
mAU
500
400
mA U
300
11.561
200
800
100
0 600
5 10 15 20 25 30 35 40 45 min
11.465
mAU
80 400
70
60
200
50
40
30 0
20
200 250 300 350 400 450 500 550 nm
10
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 min

32. Confronto con composti di
riferimento
Sulfuretina
x10 5 -MS, -Spectral Bkgrnd, 32.2min #1072
0.75 268.9
0.50
0.25
336.7 382.8 538.8
0.00
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
x10 5 +MS, -Spectral Bkgrnd, 32.2min #1071
271.0
2
1
562.9
0
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
mAU
500
400
300
mAU
200
32.274
700
100
600
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 min
500
32.251
mAU
175 400
150 300
125
200
100
100
75
50 0
25 200 250 300 350 400 450 500 550 nm
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 min

33. Overview
1- acido gallico; 2- (+/-)catechina; 3- metilestere dell'acido gallico; 4- fisetinidol-(4α→8)-(+)-
catechina; 5- epifisetinidol-(4β→8)-(+)-catechina; 6-fustina; 7- eriodictiol-7-O-β-D-glucoside; 8-
1,2,3,6-tetragalloil-O-β-D-glucosio; 9- sulfuretina-6-O-β-D-glucoside (sulfureina); 10- pentagalloil-
O-β-D-glucosio; 11-sulfuretina-6-O-β-D-glucoside-6’’-gallato (sulfureina-6’’-gallato);12- sulfuretina

34. Metodi
Vacuum-liquid Chromatography
Thin Layer Chromatography (TLC)
Sephadex column chromatography
High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
Preparative LOBAR® system
Mass spectrometry
Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)
High Speed Counter Current Chromatography (HSCCC)

35. HSCCC
Spirale elicoidale in materiale inerte
Rotazione planetaria ed eccentrica
Zone di miscelazione e zone di deposito
che avanzano ad altissima velocità
↓
Eliminazione supporti solidi
↓
Recupero di campione vicino al 100%

36. Discussione
Attività plausibile dei composti isolati
Fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina Procianidine dimeriche
Inibitori del legame NF-kB al DNA
Epifsetinidol-(4β→8)-(+)-catechina

37. Discussione
Esteri dell'acido gallico
O OH
HO OH
OH
Inibitori dell'attivazione di NF-kB indotta da citochine
Riduttori dell'espressione delle molecole di adesione endotelio-leucociti nelle cellule in coltura

38. Discussione
Eriodictiol-7-O-β-D-glucoside
Inibitore della produzione di ossido nitrico (NO) e prostaglandina E 2 (COX-2)
Inibitore della crescita di promastigoti di Leishmania Braziliensis e
di epimastigoti di Tripanosoma Cruzi

39. Discussione
Sulfuretina-6-O-β-D-glucoside (sulfureina)
Attività anti-allergica tramite inibizione della produzione di istamina

40. Conclusione
Isolamento, purifcazione e identifcazione della maggior parte dei costituenti
della frazione di etilacetato di Cotinus coggygria
Primo passo nella razionalizzazione del
potenziale antinfammatorio delle preparazioni
di Cotinus coggygria

41. Grazie per l'attenzione