1. Qu’est-ce que c’est une protéine ?
Des molécules toutes formées d'un
biologiques squelette carboné
De faible masse Macromolécules
moléculaire
Protéines Acides polysaccharides
Acides gras sucres nucléotides Acides
nucléiques
aminés
Amidon
ADN, ARN Glycogène

4. Primaire
Acides aminés
Feuillet bêta Hélice alpha
Secondaire
Tertiaire
Quaternaire

5. Fonctions des protéines
Structurale Le collagène. C’est une protéine qui forme des fibres.
Celles-ci se trouvent dans tous les animaux. Elles sont
secrétées par les cellules le tissu conjonctif comme les
fibroblastes, ainsi que par d’autres types des cellules. Le
collagène est le composant le plus abondante de la peau
les tendons et les os. Le collagène représente le 25% de
la masse totale de protéines chez les mammifères.

6. Fonctions des protéines
Immunitaire Les anticorps
Paratope
Groupe Groupe Groupe Groupe
A B AB O
Globules
rouges
Anticorps
Anti-B Anti-A Aucun Anti-A Anti-B
Antigènes
A B A et B Aucun

7. Fonctions des protéines
Catalytique Les enzymes. Ces protéines ont la
propriété de catalyser ou accélérer
les réactions chimiques qui ont lieu
dans les cellules et dans les milieux
extracellulaires. Si les enzymes
n’étaient pas présents, les réactions
chimiques se feraient à une vitesse
si faible que la vie ne serait pas
possible.

8. Biosynthèse de protéines

9. Le code génétique universel

10. Production de protéines thérapeutiques
La déficit de production de certaines protéines
ou la production de certaines protéines non
fonctionnelles dans l’organisme amène
fréquemment à des maladies qui peuvent être Cependant, de nombreuses protéines
graves. humaines ayant une valeur
pharmaceutique importante sont
Ces maladies peuvent parfois être traitées par obtenues difficilement à partir de leur
l'administration clinique de la protéine source naturelle.
provenant de sources externes.
La technologie de protéines
recombinantes, apparue à la fin des
années 70, offre une plateforme
technique très puissante pour la
production contrôlée de protéines
d'intérêt par des procédures
relativement bon marché.

11. Recombinaison génétique
Les protéines recombinantes sont des
protéines produites par des cellules dont l'ADN
a été modifié par recombinaison génétique.
La recombinaison génétique est un
échange d‘information génétique
entre deux génomes différents.
Un gène codant une
protéine d'intérêt est
introduit dans le génome
de l'espèce productrice.
Les protéines recombinantes peuvent être purifiées
et utilisées à des fins thérapeutiques, industrielles
ou bien encore dans les activités de recherche.

12. Production de protéines
recombinantes

13. Construction d’une molécule recombinante
Plasmide d’expression
Gène de PqsD
Plasmide recombinant
Gène de PqsD provenant de
Pseudomonas aeruginosa

14. Notre plasmide d’expression
PqsD
6His
pET28
Ori Kan

15. Transformation de notre souche d’expression
E. Coli BL21

16. Étapes pour la production de notre
protéine recombinante
Milieu
Pré-culture Culture Centrifuger
Culot : Cellules
Inoculer notre Inoculer 100 ml de milieu LB Collecter les cellules par Garder le culot cellulaire à
bactérie (souche avec notre pré-culture de centrifugation à 7000 -20°C jusqu'au jour de la
d’expression) dans 5 façon à obtenir une D0600 rpm/15min/4°C lyse.
ml de milieu LB ou TSB initiale de 0,05.
+ kan 30 µg/ml Laver le culot cellulaire avec
Incuber à 37°C/240rpm 70ml de tampon de lavage.
Incuber à 37°C/over
night/sous agitation Lors qu’une DO600 de 0,6 est Recollecter les cellules par
atteinte, induire avec 1 mM centrifugation à 7000
d’IPTG final rpm/15min/4°C
Incuber 2h de plus

17. Étapes pour la purification de notre
protéine recombinante
Culot : Cellules Lyse cellulaire Séparation de
fractions cellulaires
Lyse: Resuspendre le culot cellulaire Séparation des fractions cellulaires: Fraction
congelé à 20°C dans 6ml de tampon Centrifuger à 20000xg/30min/4°C Cytoplasmique
Fraction (surnageant)
de lyse Bugbuster®. pour décanter la fraction Membranaire
membranaire. (culot)
Vortexer pour détacher le culot des
parois du tube en plastique. Diluer le surnageant obtenu avec 6
ml de tampon d’imidazole 10mM.
Incuber sous agitation douce à Étant donné que notre protéine
température pièce pendant 20 Filtrer avec un filtre de 0,2µm pour recombinante se trouve soluble
minutes. éliminer les débris cellulaires en dans le cytoplasme, on purifiera
suspension. donc notre protéine à partir de
cette fraction.

18. Chromatographie d’absorption ou d’affinité
Les chromatographies d'adsorption est un méthode de séparation où la
molécule d'intérêt d'un mélange complexe est isolée des autres constituants
parce qu'elle se lie spécifiquement à la résine ou matrice sur laquelle on fait la
chromatographie.
Mélange Peu Beaucoup
complexe d’affinité d’affinité
Élimination
de protéines
non- Élution de la
spécifiques protéine
du mélange d’intérêt
pure
FPLC Fast protein liquid
chromatography

19. Étapes de la chromatographie d’affinité
1. Lavage de la colonne de nickel. Laver la colonne en passant 25ml de
l’eau distillée à débit de 5ml/miné. Cette étape permet d’éliminer
l’éthanol qui est présente dans la colonne.
2. Équilibration de la colonne: Équilibrer la colonne en passant 25ml d’une
solution d’imidazole 10mM à débit de 5ml/min.
3. Injecter l’échantillon contenant notre protéine à débit de 1ml/min.

20. 5. Lavage de la colonne: Laver la colonne avec une solution
d’imidazole 10mM pour éliminer les protéines non
spécifiques liées à la colonne. Débit 2ml/min pendant
7,5 minutes.
6. Élution: Éluer notre protéine recombinante en faisant un
gradient linéaire d’imidazole de 10mM à 250mM. Débit
2ml/min pendant 50 minutes.
Imidazole

21. Imidazole
250mM
Étape d’élution.
Concentration croissante
d’imidazole (Gradient)
Étape d’injection et lavage.
Concentration constante
d’imidazole (10mM)
Collecte le volume Fractions d’élution collectées de 2ml
mort

22. Électrophorèse de protéines en conditions dénaturantes ou SDS-PAGE
L'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers d'un gel (un polymère)
sous l'effet d'un champ électrique.
On fait bouillir un mélange de protéines en Ces charges se repoussent et déplient les
présence : chaînes polypeptidiques.
•d'un agent réducteur : le β-mercaptoéthanol En conséquence :
qui réduit les ponts disulfure. •les protéines sont dénaturées : elles ont perdu
leur structure tridimensionnelle native
•d'un détergent anionique fort : le SDS qui
enveloppe les chaînes polypeptidiques des •les protéines n'ont plus de ponts disulfure :
protéines de charges négatives. elles sont sous une forme monomérique

24. Électrophorèse SDS-PAGE
Fractions à analyser:
Volume mort, fraction 10, 15, 20, 25, 30,
35, 40, 45, 50, contrôle positif.
Préparation des échantillons:
Volume de fraction: 80µl
Volume de loading buffer (5x) 20µl
Volume final: 100µl
Chauffer l’échantillon préparé à
95°C/5min.
Déposer entre 60 à 80µl dans les puits.
Direction de
l’électrophorèse Migrer à 70 volts/over night
Lorsque le gel aura migré complètement,
colorer à l’argent
Vérifier le présence d’une bande
correspondant à notre protéine d’intérêt.