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Primaire                       Acides aminésFeuillet bêta   Hélice alpha                           Secondaire             ...
Fonctions des protéinesStructurale     Le collagène. C’est une protéine qui forme des fibres.                Celles-ci se ...
Fonctions des protéinesImmunitaire     Les anticorps                     Paratope                                         ...
Fonctions des protéinesCatalytique     Les enzymes. Ces protéines ont la                propriété de catalyser ou accélére...
Biosynthèse de protéines
Le code génétique universel
Production de protéines thérapeutiquesLa déficit de production de certaines protéinesou la production de certaines protéin...
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Production de protéines    recombinantes
Construction d’une molécule recombinante    Plasmide d’expression                                                       Gè...
Notre plasmide d’expression                  PqsD   6His          pET28   Ori                   Kan
Transformation de notre souche d’expression         E. Coli BL21
Étapes pour la production de notre                 protéine recombinante                                                  ...
Étapes pour la purification de notre               protéine recombinanteCulot : Cellules                    Lyse cellulair...
Chromatographie d’absorption ou d’affinité    Les chromatographies dadsorption est un méthode de séparation où la    moléc...
Étapes de la chromatographie d’affinité       1. Lavage de la colonne de nickel. Laver la colonne en passant 25ml de      ...
5. Lavage de la colonne: Laver la colonne avec une solution    d’imidazole 10mM pour éliminer les protéines non    spécifi...
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Électrophorèse de protéines en conditions dénaturantes ou SDS-PAGE  Lélectrophorèse a pour but de séparer des molécules ch...
Électrophorèse SDS-PAGE                         Fractions à analyser:                         Volume mort, fraction 10, 15...
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  1. 1. Qu’est-ce que c’est une protéine ? Des molécules toutes formées dun biologiques squelette carboné De faible masse Macromolécules moléculaire Protéines Acides polysaccharidesAcides gras sucres nucléotides Acides nucléiques aminés Amidon ADN, ARN Glycogène
  2. 2. Primaire Acides aminésFeuillet bêta Hélice alpha Secondaire Tertiaire Quaternaire
  3. 3. Fonctions des protéinesStructurale Le collagène. C’est une protéine qui forme des fibres. Celles-ci se trouvent dans tous les animaux. Elles sont secrétées par les cellules le tissu conjonctif comme les fibroblastes, ainsi que par d’autres types des cellules. Le collagène est le composant le plus abondante de la peau les tendons et les os. Le collagène représente le 25% de la masse totale de protéines chez les mammifères.
  4. 4. Fonctions des protéinesImmunitaire Les anticorps Paratope Groupe Groupe Groupe Groupe A B AB O Globules rouges Anticorps Anti-B Anti-A Aucun Anti-A Anti-B Antigènes A B A et B Aucun
  5. 5. Fonctions des protéinesCatalytique Les enzymes. Ces protéines ont la propriété de catalyser ou accélérer les réactions chimiques qui ont lieu dans les cellules et dans les milieux extracellulaires. Si les enzymes n’étaient pas présents, les réactions chimiques se feraient à une vitesse si faible que la vie ne serait pas possible.
  6. 6. Biosynthèse de protéines
  7. 7. Le code génétique universel
  8. 8. Production de protéines thérapeutiquesLa déficit de production de certaines protéinesou la production de certaines protéines nonfonctionnelles dans l’organisme amènefréquemment à des maladies qui peuvent être Cependant, de nombreuses protéinesgraves. humaines ayant une valeur pharmaceutique importante sontCes maladies peuvent parfois être traitées par obtenues difficilement à partir de leurladministration clinique de la protéine source naturelle.provenant de sources externes. La technologie de protéines recombinantes, apparue à la fin des années 70, offre une plateforme technique très puissante pour la production contrôlée de protéines dintérêt par des procédures relativement bon marché.
  9. 9. Recombinaison génétique Les protéines recombinantes sont des protéines produites par des cellules dont lADN a été modifié par recombinaison génétique.La recombinaison génétique est unéchange d‘information génétiqueentre deux génomes différents. Un gène codant une protéine dintérêt est introduit dans le génome de lespèce productrice.Les protéines recombinantes peuvent être purifiéeset utilisées à des fins thérapeutiques, industriellesou bien encore dans les activités de recherche.
  10. 10. Production de protéines recombinantes
  11. 11. Construction d’une molécule recombinante Plasmide d’expression Gène de PqsD Plasmide recombinant Gène de PqsD provenant de Pseudomonas aeruginosa
  12. 12. Notre plasmide d’expression PqsD 6His pET28 Ori Kan
  13. 13. Transformation de notre souche d’expression E. Coli BL21
  14. 14. Étapes pour la production de notre protéine recombinante Milieu Pré-culture Culture Centrifuger Culot : CellulesInoculer notre Inoculer 100 ml de milieu LB Collecter les cellules par Garder le culot cellulaire àbactérie (souche avec notre pré-culture de centrifugation à 7000 -20°C jusquau jour de lad’expression) dans 5 façon à obtenir une D0600 rpm/15min/4°C lyse.ml de milieu LB ou TSB initiale de 0,05.+ kan 30 µg/ml Laver le culot cellulaire avec Incuber à 37°C/240rpm 70ml de tampon de lavage.Incuber à 37°C/overnight/sous agitation Lors qu’une DO600 de 0,6 est Recollecter les cellules par atteinte, induire avec 1 mM centrifugation à 7000 d’IPTG final rpm/15min/4°C Incuber 2h de plus
  15. 15. Étapes pour la purification de notre protéine recombinanteCulot : Cellules Lyse cellulaire Séparation de fractions cellulaires Lyse: Resuspendre le culot cellulaire Séparation des fractions cellulaires: Fraction congelé à 20°C dans 6ml de tampon Centrifuger à 20000xg/30min/4°C Cytoplasmique Fraction (surnageant) de lyse Bugbuster®. pour décanter la fraction Membranaire membranaire. (culot) Vortexer pour détacher le culot des parois du tube en plastique. Diluer le surnageant obtenu avec 6 ml de tampon d’imidazole 10mM. Incuber sous agitation douce à Étant donné que notre protéine température pièce pendant 20 Filtrer avec un filtre de 0,2µm pour recombinante se trouve soluble minutes. éliminer les débris cellulaires en dans le cytoplasme, on purifiera suspension. donc notre protéine à partir de cette fraction.
  16. 16. Chromatographie d’absorption ou d’affinité Les chromatographies dadsorption est un méthode de séparation où la molécule dintérêt dun mélange complexe est isolée des autres constituants parce quelle se lie spécifiquement à la résine ou matrice sur laquelle on fait la chromatographie.Mélange Peu Beaucoupcomplexe d’affinité d’affinité Élimination de protéines non- Élution de la spécifiques protéine du mélange d’intérêt pure FPLC Fast protein liquid chromatography
  17. 17. Étapes de la chromatographie d’affinité 1. Lavage de la colonne de nickel. Laver la colonne en passant 25ml de l’eau distillée à débit de 5ml/miné. Cette étape permet d’éliminer l’éthanol qui est présente dans la colonne. 2. Équilibration de la colonne: Équilibrer la colonne en passant 25ml d’une solution d’imidazole 10mM à débit de 5ml/min. 3. Injecter l’échantillon contenant notre protéine à débit de 1ml/min.
  18. 18. 5. Lavage de la colonne: Laver la colonne avec une solution d’imidazole 10mM pour éliminer les protéines non spécifiques liées à la colonne. Débit 2ml/min pendant 7,5 minutes.6. Élution: Éluer notre protéine recombinante en faisant un gradient linéaire d’imidazole de 10mM à 250mM. Débit 2ml/min pendant 50 minutes. Imidazole
  19. 19. Imidazole 250mM Étape d’élution. Concentration croissante d’imidazole (Gradient)Étape d’injection et lavage. Concentration constante d’imidazole (10mM) Collecte le volume Fractions d’élution collectées de 2ml mort
  20. 20. Électrophorèse de protéines en conditions dénaturantes ou SDS-PAGE Lélectrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers dun gel (un polymère) sous leffet dun champ électrique.On fait bouillir un mélange de protéines en Ces charges se repoussent et déplient lesprésence : chaînes polypeptidiques.•dun agent réducteur : le β-mercaptoéthanol En conséquence :qui réduit les ponts disulfure. •les protéines sont dénaturées : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native•dun détergent anionique fort : le SDS quienveloppe les chaînes polypeptidiques des •les protéines nont plus de ponts disulfure :protéines de charges négatives. elles sont sous une forme monomérique
  21. 21. Électrophorèse SDS-PAGE Fractions à analyser: Volume mort, fraction 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, contrôle positif. Préparation des échantillons: Volume de fraction: 80µl Volume de loading buffer (5x) 20µl Volume final: 100µl Chauffer l’échantillon préparé à 95°C/5min. Déposer entre 60 à 80µl dans les puits. Direction de l’électrophorèse Migrer à 70 volts/over night Lorsque le gel aura migré complètement, colorer à l’argent Vérifier le présence d’une bande correspondant à notre protéine d’intérêt.

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