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Cursos de Formación de la UAT (2012)

  Plataforma de Genómica / Plataforma de Diagnóstico Molecular




     “Tecnologías de alto rendimiento en
                 genómica”

2ª Parte: Tecnologías de ultrasecuenciación y de enriquecimiento de
                             secuencia.
Programa del curso


   De Sanger hacia NGS

   454 de Roche
       Cómo funciona
       Flujo de trabajo de la tecnología

   Comparación con otros Sistemas NGS

   Aplicaciones de las tecnologías de ultrasecuenciación.
        Estudio de quasiespecies virales mediante análisis de amplicones.
        Secuenciación de genomas “de novo”.
        Metagenómica
        RNAseq
        Aplicaciones de los arrays de captura de secuencia:
                Análisis de exomas
                Estudio de mutaciones en leucemia mediante arrays de
                  captura de secuencia.

   Análisis de datos de ultrasecuenciación (UEB)
Cualquier DNA puede ser secuenciado




                 S. cervisiae                   Barley
M Tuberculosis                  C. elegans                   Arabidopsis




                                               Tomato

 Maccaca                            HIV                       Potato
                 Neanderthal




                                              James Watson
  Honeybee                             H5N1                   Grape wine
                       Mammut
Genomas Secuenciados


Nature Reviews Genetics 9, 303-313, 2008


Over the past years the
genomes of some of the most
impotant model organisms have
been sequenced:




Figure 2. Vertebrate genomic sequence data. Phylogenetic tree
representing species for which genomic sequence data are currently
available Green indicates that BAC (bacterial artificial chromosome)-based
sequence is available in targeted regions of the genome 11, 15. Yellow
represents 2X whole-genome shotgun assemblies17, and blue represents
full-shotgun or near-complete genomic sequence assemblies.
Cronología de la Secuenciación
                                           phi X 174
                                       Primer genoma de
                                         DNA completo
                                          secuenciado
                                       11 genes en 5386                                              Secuenciaci
                                         bases (cadena                                               ón Genoma
                                            sencilla)                                                  Watson
                      “Chain-terminator
                                                                                                      mediante
                          method”
                                                                                                     454/ROCHE
                        Sanger et al.
                                                                                                     Nature 452,
                        Método usado
                                                                                                     872-876 (17 1000
                   durante los proximos 30
                                                                                                     April 2008). Genomes
 Francis Crick               años                                                                                  Project
                                          ABI          El NIH  Finalización Lanzamie
  and James             “ DNA         comercializa   empieza     Proyecto
   Watson                                                                    nto de    Lanzamient
                    sequencing by         el 1ª    secuenciació Genoma                                 Lanzamiento GS FLX-
  describen el                                                             GS20 (454   o de
                      chemical       secuenciador         n     Humano                            GS FLX de SOLID Titanium
                                                                               Life    SOLEXA (ROCHE)                    GS FLX+
  modelo de la      degradation ”     automático,      a gran   (13 años) Science)                        (ABI)
                                                                                       (Illumina)                 (ROCHE)ROCHE)
doble hélice del      Maxam y           ABI 370.     escala de
     DNA.
      195 70
                       Gilbert
                         197            198
                                                     diversos
                                                     199
                                                    microorgs.   200       20            20     200 200 200 Helicos
      3   ´s             7              7            0           3         05            06     7   8   9  BioSciences

                                                                                                                         20
                                                                                                                         10


                                                                                                   2012
1ª Generación
                                                                                                  Secuenciación
 Método manual de Secuenciación Sanger                                            Método automático de Secuenciación
        Nucleótidos Modificados                                                                 Sanger
                                                                                   Nucleótidos Modificados Marcados
     dTTP              Polimerasa                                          dTTP      Polimerasa
            dGTP                                                                  dGTP
     dATP          +   Secuencia molde:3´…GCCAGTCGGATGCATATGTCTGAGTC…5´
                       Primer:         5´…CGGT                             dATP          +
                                                                                     Secuencia molde: 3´..GCCAGTCGGATGCATATGTCTGAGTC..5´
                                                                                                      5´…CGGT
            dCTP                                                                dCTP Primer:
                       (Marcaje radioactivo en el Primer o en uno
                       de los 4 dNTPs en cada tubo)
                                                                                  ddGTP        ddATP   ddTTP    ddCTP
     ddGTP ddATP ddTTP ddCTP
                                                   Grupo            Base
                                                   fosfato


                                                                                             CGGTCAGCCTAC
                                                                                             CGGTCAGCCTA
                                                             H                               CGGTCAGCCT
                                                                                             CGGTCAGCC
3´                                           CGGTCAGCCTACGTATACAGACTCAG                      CGGTCAGC
                                             CGGTCAGCCTACGTATACAGACTCA                       CGGTCAG
                                             CGGTCAGCCTACGTATACAGACTC
                                             CGGTCAGCCTACGTATACAGACT
                                             CGGTCAGCCTACGTATACAGAC                          Electroforesis
                                             CGGTCAGCCTACGTATACAGA
                                             CGGTCAGCCTACGTATACAG                            (1 Secuencia/Capilar)
                                             CGGTCAGCCTACGTATACA
                                             CGGTCAGCCTACGTATAC
                                             CGGTCAGCCTACGTATA
                                             CGGTCAGCCTACGTAT
                                             CGGTCAGCCTACGTA
                                             CGGTCAGCCTACGT
                                             CGGTCAGCCTACG
                                                                                                                     GCCTAC
                                             CGGTCAGCCTAC
                                             CGGTCAGCCTA
                                             CGGTCAGCCT
                                             CGGTCAGCC
                                             CGGTCAGC
                                             CGGTCAG
                                             CGGTCA
                                             CGGTC
                                             CGGT
                                             CGG
5´                                           CG
                                             C
1ª Generación Secuenciación


Estrategia de Secuenciación a
         gran escala
  Secuenciación   de fragmentos
largos de DNA.

 El DNA se fragmenta en trozos al
azar y se clonan en una biblioteca
bacteriana.

 El ADN de los clones bacterianos
individuales    se     secuencian
mediante Secuenciación Sanger
automática.

 La secuencia se      ensamblan
observando    las        regiones
solapantes.

 Los Gaps se pueden rellenar
mediante paseos de cebadores.
1ª Generación Secuenciación



              Primer borrador
                  Genoma
                                                 3.000 millones de
                  Humano
                                              dólares para secuenciar
                                                 3.000 nts (1$/nt)




Sanger sequencing:
- Long reads (500-1000 bp)
- Low throughput (192 reactions/run)
2ª Generación Secuenciación


Los Instrumentos de secuenciación de 2ª generación son
  capaces de generar cientos de miles de reacciones de
secuencias en paralelo en un día como los generados por
   varios cientos de secuenciadores con capilares tipo
     Sanger, a un coste por base leída más barato.
                                    2004        2006-2009

      Coste                       0.01$/bp      0.0001$/bp

      Capacidad/Instrumento/día   1.000.000   ˃ 5.000.000.000
2ª Generación Secuenciación




 ROCHE
              GS FLX 454        GS FLX+ 454          GS Junior 454




 Illumina

                Solexa        HiSeq 2000      HiSeq 1000       HiScanSQ       Genome            MiSeq
                                                                              Analyzer
                                                                                 IIx




   Life
Technology

             SOLiD™ 3System   SOLiD™ 4 System     5500               5500xl       Ion Torrent
                                                  System             System       System
Sanger vs 2ª Generación Secuenciación


  1. Fragmentación de DNA                          1. Fragmentación de DNA




2.Clonaje en Vectores; Transformación Bacterias; 2. Ligación de adaptadores in vitro y
  crecimiento y aislamiento vector DNA              amplificación clonal




  3. Ciclo Secuenciación                          3. Secuenciación masiva en paralelo
      Secuencia:
      Primer:


      Polimerasa
      dNTPs
      ddNTPs marcados



                                                   4. Procesamiento imagen
 4. Procesamiento imagen
                             CTATGCTCG
       Electroforesis
       (1
       Secuencia/Capilar)
Programa del curso


   De Sanger hacia NGS

   454 de Roche
       Cómo funciona
       Flujo de trabajo de la tecnología

   Comparación con otros Sistemas NGS

   Aplicaciones de las tecnologías de ultrasecuenciación.
        Estudio de quasiespecies virales mediante análisis de amplicones.
        Secuenciación de genomas “de novo”.
        Metagenómica
        RNAseq
        Aplicaciones de los arrays de captura de secuencia:
                Análisis de exomas
                Estudio de mutaciones en leucemia mediante arrays de
                  captura de secuencia.

   Análisis de datos de ultrasecuenciación (UEB)
GS 454 de ROCHE




GS FLX +   GS Junior
GS 454 de ROCHE: Como funciona


                  Formato de Placa

 1ª Generación                       2ª Generación
    3100 ABI                           GS ROCHE




96p-Plates     384p-Plates   PicoTiterPlate    PicoTiterPlate
                             FLX+ (70x70mm)        Junior
GS 454 de ROCHE: Como funciona

¿Cúantas muestras se pueden secuenciar por
                  run?
  GS FLX+                                                  Junior 454
                                           Gaskets




                                                                             70.000-100.000


N= (GxC)/Mbp por región PTP
    N= num de muestras que puedo secuenciar en
   un run
    G= tamaño de lo que quiero secuenciar
    C= Coverage (C= N * L / G)                             Multiplexar (MIDS; Tamaño
 Multiplexar (MIDS; Tamaño amplicón; Primer)               amplicón; Primer)
GS FLX/Junior 454 Workflow

gDNA, DNA plasmídico, RNA

          1.Calidad & Cantidad
           Material de partida


          2. Construcción Librería



          3. Amplificación mediante emPCR




           4. Secuenciación


 Datos Obtenidos
1. Calidad & Cantidad Material de partida

1.1 Calidad mediante Chips Bioanalyzer; gel agarosa




    gDNA, DNA plasmídico, RNA

1.2 Cuantificación mediante Picogreen (gDNA, amplicones) o Ribogreen (RNA)
                                    y = 34,577x - 61,596
                                         R2 = 0,9994
                        20000

                        15000
         Fluorescence




                        10000                 .

                         5000

                            0
                                0     200         400           600
                                    Lam bda DNA (ng/m L)                 Fluorímetro FLx800
GS FLX/Junior 454 Workflow

gDNA, DNA plasmídico, RNA

         1.Calidad & Cantidad
          Material de partida


          2. Construcción Librería



         3. Amplificación mediante emPCR




          4. Secuenciación


Datos Obtenidos
2. Construcción Librería



                                                                                       Librería Shotgun
                                                                                       Librería Pair-End
                                        Fragmentación                                  Librería cDNA
                                        Selección Tamaño
                                        Ligación
                                        Adaptadores


                                                                                      Librería Amplicones
  gDNA, DNA
  plasmídico                          PCR con Fusion Primers
  RNA


 Adaptador A (44 bases):                     Adaptador B (44 bases)                      Fusion
                                                                                         Primers
  Primer                                          Primer                               Adaptador A Target
                             4                                               4
Amplificación Primer                            Amplificación Primer
                        nucleótidos
            Secuenciación                                               nucleótidos
                                                            Secuenciación
                          “Key”         Biotina                           “Key”
                                                                                          Adaptador B Target
2. Construcción Librería: Fragmentación gDNA

Librerías
Shotgun
                                 Rotura utilizando nitrógeno a alta presión
NEBULIZACIÓN

                                                 Nebulize



                                       DNA genómico      Fragmentos de DNA
                                                           de doble cadena
              2.1 bar (30psi)


Librerías Pair-End
                                  Fuerzas de rotura hidrodinámicas
HYDROSHEAR                                                           gDNA
                                              Orificio
                                                                     fragmentado

                                gDNA
2. Construcción Librería: Fragmentación RNA

Librerías
cDNA
RNA

                             Rando       First Strand
                               m          Synthesis
                            Primers

         Solución de
      Fragmentación de                                      Second Strand
                                                              Synthesis
            RNA




                                       Fragmentos de cDNA
                                         de doble cadena
2. Construcción Librería: Selección fragmentos

gDNA Nebulizado:
                                               AMPure beads
    DNA 7500 Lab Chip           SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization)
                                                                                DNA 7500 LabChip




                                                                                   300pb-1000pb
         50pb-1000pb




gDNA fragmentado con Hydroshear:                                               RNA Pico 6000 LabChip



                            Electroelución

                                                                                      500pb-600 nt

                        Tamaño medio de 500-600 nt (dep. del contenido en GC)
                             Menos del 10% ≤ 300 nt, no adaptor dimers
                                  Conc >0.2 ng/μl (Ribogreen ®)
2. Construcción Librería

Inmobilización Fragmentos y aislamiento de la Librería:



   AB
                                Melt Solution
   BA
   BB
   AA




  4 tipos de productos resultan de la ligación

  Los productos con Biotina (AB, BA, BB) se unen a bolas magnéticas que
 llevan estreptavidina. Los products AA son lavados y eliminados.

  Mediante Melt Solution (NaOH0.1N) las cadenas no biotiniladas de cada
 fragmento de dsDNA son aisladas. Ambas cadenas de los fragmentos BB
 quedarán unidas a las bolas.

 Sólo se aislan cadenas de DNA sencilla AB constituyendo la librería.
2. Construcción Librería: Q&Q Librería




Molecules/μl =




  Num de Avogadro es 6.022x1023 (moléculas/mole)

  328.3x109 (gramos/mole) es peso molecular medio de nts.

  Perfil típico de una librería ssDNA (Agilent 2100 RNA Pico 6000
 LabChip): Tamaño medio de 500-800 bp

  Cuantificación mediante Ribogreen

  Dilución de trabajo para emPCR
GS FLX/Junior 454 Workflow

gDNA, DNA plasmídico, RNA

         1.Calidad & Cantidad
          Material de partida


          2. Construcción Librería



         3. Amplificación mediante emPCR




          4. Secuenciación


Datos Obtenidos
3. Amplificación mediante emPCR

Reacción de emPCR:


                     High-speed
                       shaker




                          -1 starting effective fragment per microreactor
                          - ~106 microreactors per ml
                          - All processed in parallel                       (Amplificación clonal)
3. Amplificación mediante emPCR

Recuperación de beads después de la emPCR:




                                 Rotura y Recuperación             Contaje     65%, 85% óptimo

                                                                                            DNA-beads/ml
                                                                        % Recuperación=                    x100
                                                                                            Input beads



  Enrequecimiento de beads con DNA:



          Melt



                                                                                   5-20% óptimo
                   Unión de Primer       Adición de bolas   Melt
                                                                                           DNA-beads/ml
  dsDNA          marcado con Biotina a   magnéticas con                                                    x100
                                                                      % Enrequecimiento=
                 bolas de captura con     estreptavidina                                   Input beads
                        ssDNA
emPCR Titulación sólo para GS FLX

Antes de la emPCR:


                                 ¿Cuántas copias de librería por
                                 Beads de captura son óptimas?




  1. Procesar 4 tubos emulsiones
    Tubo   Moléculas de Librería por   Vol Librería
            Bead de Captura (cpb)        Diluida
      1               2                   1.2 µl
      2               4                   2.4 µl
      3               8                   4.8 µl
      4               16                  9.6 µl

    2. Recuperación y enrequecimiento de cada tubo
    3. Contaje de las beads enriquecidas
    4. Escoger el ratio copia/bead con aproximadamente un 8% de
    enrequecimiento
GS FLX/Junior 454 Workflow
gDNA, DNA plasmídico, RNA

         1.Calidad & Cantidad
          Material de partida


         2. Construcción Librería



         3. Amplificación mediante emPCR




          4. Secuenciación


Datos Obtenidos
4. Secuenciación

                                            Gaskets
Metal coated PTP reduces crosstalk
29 μm well diameter (20/bead)
3,400,000 wells per PTP
4. Secuenciación

Secuenciación mediante síntesis
Química basada en la pirosecuenciación


                                                           Polimerasa añade
                                                          nucleótidos (dATP)
                                                           Se libera pirofosfato (PPi)
                                                           Sulfurilasa crea ATP a
                                                          partir del PPi
                Sulfurylase                               Luciferasa hidroliza ATP
                 Luciferase                  Luciferina   y usa luciferina para
                                                          producir luz.
                              Light + oxyluciferin
4. Secuenciación


Flujo de Reactivos
 Nucleotides are flowed sequentially across
the PTPone at a time (200 cycles à 4 bases)

 Pyrophosphate signal generation upon
complimentary nucleotide incorporation —dark
otherwise

 The CCD camera is generating a image after
every flow

 The signal strength is proportional to the
number of nucleotides incorporated
4. Secuenciación

Flowgama y Base calling:
4. Secuenciación:Ejemplo
Especificaciones Sistemas GS FLX & GS Junior


                                   GS Junior System
GS FLX+ System
El futuro de la secuenciación 454
Programa del curso


   De Sanger hacia NGS

   454 de Roche
       Cómo funciona
       Flujo de trabajo de la tecnología

   Comparación con otros Sistemas NGS

   Aplicaciones de las tecnologías de ultrasecuenciación.
        Estudio de quasiespecies virales mediante análisis de amplicones.
        Secuenciación de genomas “de novo”.
        Metagenómica
        RNAseq
        Aplicaciones de los arrays de captura de secuencia:
                Análisis de exomas
                Estudio de mutaciones en leucemia mediante arrays de
                  captura de secuencia.

   Análisis de datos de ultrasecuenciación (UEB)
Comparación con otros Sistemas NGS




          2ª NGS                                            3ª NGS



    ABI                                        Illumina
    ROCHE




       Illumina          ABI                      Roche        3ª NGS


Cuadro resumen de las posibles combinaciones de estrategias en las diferentes
plataformas de NGS
Comparación Plataformas NGS




     GS FLX 454                    HiSeq 2000-Illumina             ABI SOLID 5500xl

                                  Chemistry based on            Chemistry based on
    Chemistry based on
    pirosequencing                  reversible terminators         sequencing by ligation

                                   Sample amplified by           Sample amplified by
   Sample amplified by                                            emulsion PCR
                                    solidphase amplification
    emulsion PCR
                                   Read length 2x100 bp          Read length 50-100 bp
   Read length 250-500 bp
                                   3 billions reads per run      100-500 million reads per run
   >1 million reads per run
                                   600 Gb of sequence            50-100 Gb of sequence
   400-600 Mb of sequence
                                   2-11 days run                 4-8 days run
   ~10 hours run
Comparación Plataformas secuenciación




EQUIPO                             ROCHE GS FLX                  ILLUMINA HISEQ   ABI 5500XL
                                       454                            2000          SOLID
Coste del equipo                   450.000 $                 690.000 $            251.000 $

Coste de los reactivos             6.200 $                   23.470 $             10.503 $
por run*
Coste por Mb                       12 $                      0,07 $               0,04 $

Fuente: http://www.molecularecologist.com/next-gen-fieldguide/
Comparación Plataformas secuenciación
Comparación Plataformas secuenciación
                         Aplicaciones
Comparación Plataformas secuenciación




Next Generation Genomics: World Map of High-throughput
Sequencers
Ejemplos de Genomas humanos secuenciados




 Nature Reviews Genetics 11, 31-46 (January 2010)
Comparación Plataformas secuenciación




   1ª Generación       2ª Generación
3ª Generación Secuenciación
         SCIENCE Vol 323 2 JANUARY 2009

Real-Time DNA Sequencing from
Single Polymerase Molecules
John Eid,* Adrian Fehr,* Jeremy Gray,* Khai Luong,* John Lyle,* Geoff Otto,*
Paul Peluso,* David Rank,* Primo Baybayan, Brad Bettman, Arkadiusz Bibillo,
Keith Bjornson, Bidhan Chaudhuri, Frederick Christians, Ronald Cicero,
Sonya Clark, Ravindra Dalal, Alex deWinter, John Dixon, Mathieu Foquet,
Alfred Gaertner, Paul Hardenbol, Cheryl Heiner, Kevin Hester, David Holden,
Gregory Kearns, Xiangxu Kong, Ronald Kuse, Yves Lacroix, Steven Lin, Paul
Lundquist, Congcong Ma, Patrick Marks, Mark Maxham, Devon Murphy, Insil
Park, Thang Pham, Michael Phillips, Joy Roy, Robert Sebra, Gene Shen, Jon
Sorenson, Austin Tomaney, Kevin Travers, Mark Trulson, John Vieceli, Jeffrey
Wegener, Dawn Wu, Alicia Yang, Denis Zaccarin, Peter Zhao, Frank Zhong,
Jonas Korlach, Stephen Turner.




                                                                               Press Release

                                                       Pacific Biosciences Announces Early Access
                                                       Customers for Its Single Molecule Real Time
                                                       System
                                                     Eleven Leading Companies Support Launch of Third-generation DNA Sequencing

                                                        MENLO PARK, Calif., Feb 23, 2010 Pacific Biosciences, a private
                                                        company developing a disruptive technology platform for real-
                                                        time detection of biological events at single molecule resolution,
                                                        today announced the 10 institutions that have purchased its
                                                        Single Molecule Real Time (SMRT(TM)) DNA sequencing system
      http://www.pacificbiosciences.com                 as part of the company's early access program in North America.
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       Flujo de trabajo de la tecnología

   Comparación con otros Sistemas NGS

   Aplicaciones de las tecnologías de ultrasecuenciación.
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                Análisis de exomas
                Estudio de mutaciones en leucemia mediante arrays de
                  captura de secuencia.

   Análisis de datos de ultrasecuenciación (UEB)
PAUTAS PARA EL DISEÑO EXPERIMENTAL DE UN ESTUDIO DE
                                                             ULTRASECUENCIACIÓN




Pautes para el Diseño experimental de un estudio
              de ultrasecuenciación
UCTS WORKFLOW
                             Researcher


Statistics and Bioinformatics             UCTS
             (UEB)


         EXPERIMENTAL DESIGN    QUALITY SAMPLES COLLECTION




     RESULTS CHECKING    EXPERIMENTS SAMPLE PROCESSING



             DATA ANALYSIS
                                        SEQUENCING


                        UEB           UCTS
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                  captura de secuencia.

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Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Tecnologías de Ultrasecuenciación y de Enriquecimiento de Secuencia

  • 1. Cursos de Formación de la UAT (2012) Plataforma de Genómica / Plataforma de Diagnóstico Molecular “Tecnologías de alto rendimiento en genómica” 2ª Parte: Tecnologías de ultrasecuenciación y de enriquecimiento de secuencia.
  • 2. Programa del curso  De Sanger hacia NGS  454 de Roche  Cómo funciona  Flujo de trabajo de la tecnología  Comparación con otros Sistemas NGS  Aplicaciones de las tecnologías de ultrasecuenciación.  Estudio de quasiespecies virales mediante análisis de amplicones.  Secuenciación de genomas “de novo”.  Metagenómica  RNAseq  Aplicaciones de los arrays de captura de secuencia:  Análisis de exomas  Estudio de mutaciones en leucemia mediante arrays de captura de secuencia.  Análisis de datos de ultrasecuenciación (UEB)
  • 3. Cualquier DNA puede ser secuenciado S. cervisiae Barley M Tuberculosis C. elegans Arabidopsis Tomato Maccaca HIV Potato Neanderthal James Watson Honeybee H5N1 Grape wine Mammut
  • 4. Genomas Secuenciados Nature Reviews Genetics 9, 303-313, 2008 Over the past years the genomes of some of the most impotant model organisms have been sequenced: Figure 2. Vertebrate genomic sequence data. Phylogenetic tree representing species for which genomic sequence data are currently available Green indicates that BAC (bacterial artificial chromosome)-based sequence is available in targeted regions of the genome 11, 15. Yellow represents 2X whole-genome shotgun assemblies17, and blue represents full-shotgun or near-complete genomic sequence assemblies.
  • 5. Cronología de la Secuenciación phi X 174 Primer genoma de DNA completo secuenciado 11 genes en 5386 Secuenciaci bases (cadena ón Genoma sencilla) Watson “Chain-terminator mediante method” 454/ROCHE Sanger et al. Nature 452, Método usado 872-876 (17 1000 durante los proximos 30 April 2008). Genomes Francis Crick años Project ABI El NIH Finalización Lanzamie and James “ DNA comercializa empieza Proyecto Watson nto de Lanzamient sequencing by el 1ª secuenciació Genoma Lanzamiento GS FLX- describen el GS20 (454 o de chemical secuenciador n Humano GS FLX de SOLID Titanium Life SOLEXA (ROCHE) GS FLX+ modelo de la degradation ” automático, a gran (13 años) Science) (ABI) (Illumina) (ROCHE)ROCHE) doble hélice del Maxam y ABI 370. escala de DNA. 195 70 Gilbert 197 198 diversos 199 microorgs. 200 20 20 200 200 200 Helicos 3 ´s 7 7 0 3 05 06 7 8 9 BioSciences 20 10 2012
  • 6. 1ª Generación Secuenciación Método manual de Secuenciación Sanger Método automático de Secuenciación Nucleótidos Modificados Sanger Nucleótidos Modificados Marcados dTTP Polimerasa dTTP Polimerasa dGTP dGTP dATP + Secuencia molde:3´…GCCAGTCGGATGCATATGTCTGAGTC…5´ Primer: 5´…CGGT dATP + Secuencia molde: 3´..GCCAGTCGGATGCATATGTCTGAGTC..5´ 5´…CGGT dCTP dCTP Primer: (Marcaje radioactivo en el Primer o en uno de los 4 dNTPs en cada tubo) ddGTP ddATP ddTTP ddCTP ddGTP ddATP ddTTP ddCTP Grupo Base fosfato CGGTCAGCCTAC CGGTCAGCCTA H CGGTCAGCCT CGGTCAGCC 3´ CGGTCAGCCTACGTATACAGACTCAG CGGTCAGC CGGTCAGCCTACGTATACAGACTCA CGGTCAG CGGTCAGCCTACGTATACAGACTC CGGTCAGCCTACGTATACAGACT CGGTCAGCCTACGTATACAGAC Electroforesis CGGTCAGCCTACGTATACAGA CGGTCAGCCTACGTATACAG (1 Secuencia/Capilar) CGGTCAGCCTACGTATACA CGGTCAGCCTACGTATAC CGGTCAGCCTACGTATA CGGTCAGCCTACGTAT CGGTCAGCCTACGTA CGGTCAGCCTACGT CGGTCAGCCTACG GCCTAC CGGTCAGCCTAC CGGTCAGCCTA CGGTCAGCCT CGGTCAGCC CGGTCAGC CGGTCAG CGGTCA CGGTC CGGT CGG 5´ CG C
  • 7. 1ª Generación Secuenciación Estrategia de Secuenciación a gran escala  Secuenciación de fragmentos largos de DNA.  El DNA se fragmenta en trozos al azar y se clonan en una biblioteca bacteriana.  El ADN de los clones bacterianos individuales se secuencian mediante Secuenciación Sanger automática.  La secuencia se ensamblan observando las regiones solapantes.  Los Gaps se pueden rellenar mediante paseos de cebadores.
  • 8. 1ª Generación Secuenciación Primer borrador Genoma 3.000 millones de Humano dólares para secuenciar 3.000 nts (1$/nt) Sanger sequencing: - Long reads (500-1000 bp) - Low throughput (192 reactions/run)
  • 9. 2ª Generación Secuenciación Los Instrumentos de secuenciación de 2ª generación son capaces de generar cientos de miles de reacciones de secuencias en paralelo en un día como los generados por varios cientos de secuenciadores con capilares tipo Sanger, a un coste por base leída más barato. 2004 2006-2009 Coste 0.01$/bp 0.0001$/bp Capacidad/Instrumento/día 1.000.000 ˃ 5.000.000.000
  • 10. 2ª Generación Secuenciación ROCHE GS FLX 454 GS FLX+ 454 GS Junior 454 Illumina Solexa HiSeq 2000 HiSeq 1000 HiScanSQ Genome MiSeq Analyzer IIx Life Technology SOLiD™ 3System SOLiD™ 4 System 5500 5500xl Ion Torrent System System System
  • 11. Sanger vs 2ª Generación Secuenciación 1. Fragmentación de DNA 1. Fragmentación de DNA 2.Clonaje en Vectores; Transformación Bacterias; 2. Ligación de adaptadores in vitro y crecimiento y aislamiento vector DNA amplificación clonal 3. Ciclo Secuenciación 3. Secuenciación masiva en paralelo Secuencia: Primer: Polimerasa dNTPs ddNTPs marcados 4. Procesamiento imagen 4. Procesamiento imagen CTATGCTCG Electroforesis (1 Secuencia/Capilar)
  • 12. Programa del curso  De Sanger hacia NGS  454 de Roche  Cómo funciona  Flujo de trabajo de la tecnología  Comparación con otros Sistemas NGS  Aplicaciones de las tecnologías de ultrasecuenciación.  Estudio de quasiespecies virales mediante análisis de amplicones.  Secuenciación de genomas “de novo”.  Metagenómica  RNAseq  Aplicaciones de los arrays de captura de secuencia:  Análisis de exomas  Estudio de mutaciones en leucemia mediante arrays de captura de secuencia.  Análisis de datos de ultrasecuenciación (UEB)
  • 13. GS 454 de ROCHE GS FLX + GS Junior
  • 14. GS 454 de ROCHE: Como funciona Formato de Placa 1ª Generación 2ª Generación 3100 ABI GS ROCHE 96p-Plates 384p-Plates PicoTiterPlate PicoTiterPlate FLX+ (70x70mm) Junior
  • 15. GS 454 de ROCHE: Como funciona ¿Cúantas muestras se pueden secuenciar por run? GS FLX+ Junior 454 Gaskets 70.000-100.000 N= (GxC)/Mbp por región PTP N= num de muestras que puedo secuenciar en un run G= tamaño de lo que quiero secuenciar C= Coverage (C= N * L / G) Multiplexar (MIDS; Tamaño Multiplexar (MIDS; Tamaño amplicón; Primer) amplicón; Primer)
  • 16. GS FLX/Junior 454 Workflow gDNA, DNA plasmídico, RNA 1.Calidad & Cantidad Material de partida 2. Construcción Librería 3. Amplificación mediante emPCR 4. Secuenciación Datos Obtenidos
  • 17. 1. Calidad & Cantidad Material de partida 1.1 Calidad mediante Chips Bioanalyzer; gel agarosa gDNA, DNA plasmídico, RNA 1.2 Cuantificación mediante Picogreen (gDNA, amplicones) o Ribogreen (RNA) y = 34,577x - 61,596 R2 = 0,9994 20000 15000 Fluorescence 10000 . 5000 0 0 200 400 600 Lam bda DNA (ng/m L) Fluorímetro FLx800
  • 18. GS FLX/Junior 454 Workflow gDNA, DNA plasmídico, RNA 1.Calidad & Cantidad Material de partida 2. Construcción Librería 3. Amplificación mediante emPCR 4. Secuenciación Datos Obtenidos
  • 19. 2. Construcción Librería Librería Shotgun Librería Pair-End Fragmentación Librería cDNA Selección Tamaño Ligación Adaptadores Librería Amplicones gDNA, DNA plasmídico PCR con Fusion Primers RNA Adaptador A (44 bases): Adaptador B (44 bases) Fusion Primers Primer Primer Adaptador A Target 4 4 Amplificación Primer Amplificación Primer nucleótidos Secuenciación nucleótidos Secuenciación “Key” Biotina “Key” Adaptador B Target
  • 20. 2. Construcción Librería: Fragmentación gDNA Librerías Shotgun Rotura utilizando nitrógeno a alta presión NEBULIZACIÓN Nebulize DNA genómico Fragmentos de DNA de doble cadena 2.1 bar (30psi) Librerías Pair-End Fuerzas de rotura hidrodinámicas HYDROSHEAR gDNA Orificio fragmentado gDNA
  • 21. 2. Construcción Librería: Fragmentación RNA Librerías cDNA RNA Rando First Strand m Synthesis Primers Solución de Fragmentación de Second Strand Synthesis RNA Fragmentos de cDNA de doble cadena
  • 22. 2. Construcción Librería: Selección fragmentos gDNA Nebulizado: AMPure beads DNA 7500 Lab Chip SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization) DNA 7500 LabChip 300pb-1000pb 50pb-1000pb gDNA fragmentado con Hydroshear: RNA Pico 6000 LabChip Electroelución 500pb-600 nt Tamaño medio de 500-600 nt (dep. del contenido en GC) Menos del 10% ≤ 300 nt, no adaptor dimers Conc >0.2 ng/μl (Ribogreen ®)
  • 23. 2. Construcción Librería Inmobilización Fragmentos y aislamiento de la Librería: AB Melt Solution BA BB AA  4 tipos de productos resultan de la ligación  Los productos con Biotina (AB, BA, BB) se unen a bolas magnéticas que llevan estreptavidina. Los products AA son lavados y eliminados.  Mediante Melt Solution (NaOH0.1N) las cadenas no biotiniladas de cada fragmento de dsDNA son aisladas. Ambas cadenas de los fragmentos BB quedarán unidas a las bolas. Sólo se aislan cadenas de DNA sencilla AB constituyendo la librería.
  • 24. 2. Construcción Librería: Q&Q Librería Molecules/μl =  Num de Avogadro es 6.022x1023 (moléculas/mole)  328.3x109 (gramos/mole) es peso molecular medio de nts.  Perfil típico de una librería ssDNA (Agilent 2100 RNA Pico 6000 LabChip): Tamaño medio de 500-800 bp  Cuantificación mediante Ribogreen  Dilución de trabajo para emPCR
  • 25. GS FLX/Junior 454 Workflow gDNA, DNA plasmídico, RNA 1.Calidad & Cantidad Material de partida 2. Construcción Librería 3. Amplificación mediante emPCR 4. Secuenciación Datos Obtenidos
  • 26. 3. Amplificación mediante emPCR Reacción de emPCR: High-speed shaker -1 starting effective fragment per microreactor - ~106 microreactors per ml - All processed in parallel (Amplificación clonal)
  • 27. 3. Amplificación mediante emPCR Recuperación de beads después de la emPCR: Rotura y Recuperación Contaje 65%, 85% óptimo DNA-beads/ml % Recuperación= x100 Input beads Enrequecimiento de beads con DNA: Melt 5-20% óptimo Unión de Primer Adición de bolas Melt DNA-beads/ml dsDNA marcado con Biotina a magnéticas con x100 % Enrequecimiento= bolas de captura con estreptavidina Input beads ssDNA
  • 28. emPCR Titulación sólo para GS FLX Antes de la emPCR: ¿Cuántas copias de librería por Beads de captura son óptimas? 1. Procesar 4 tubos emulsiones Tubo Moléculas de Librería por Vol Librería Bead de Captura (cpb) Diluida 1 2 1.2 µl 2 4 2.4 µl 3 8 4.8 µl 4 16 9.6 µl 2. Recuperación y enrequecimiento de cada tubo 3. Contaje de las beads enriquecidas 4. Escoger el ratio copia/bead con aproximadamente un 8% de enrequecimiento
  • 29. GS FLX/Junior 454 Workflow gDNA, DNA plasmídico, RNA 1.Calidad & Cantidad Material de partida 2. Construcción Librería 3. Amplificación mediante emPCR 4. Secuenciación Datos Obtenidos
  • 30. 4. Secuenciación Gaskets Metal coated PTP reduces crosstalk 29 μm well diameter (20/bead) 3,400,000 wells per PTP
  • 31. 4. Secuenciación Secuenciación mediante síntesis Química basada en la pirosecuenciación  Polimerasa añade nucleótidos (dATP)  Se libera pirofosfato (PPi)  Sulfurilasa crea ATP a partir del PPi Sulfurylase Luciferasa hidroliza ATP Luciferase Luciferina y usa luciferina para producir luz. Light + oxyluciferin
  • 32. 4. Secuenciación Flujo de Reactivos  Nucleotides are flowed sequentially across the PTPone at a time (200 cycles à 4 bases)  Pyrophosphate signal generation upon complimentary nucleotide incorporation —dark otherwise  The CCD camera is generating a image after every flow  The signal strength is proportional to the number of nucleotides incorporated
  • 35. Especificaciones Sistemas GS FLX & GS Junior GS Junior System GS FLX+ System
  • 36. El futuro de la secuenciación 454
  • 37. Programa del curso  De Sanger hacia NGS  454 de Roche  Cómo funciona  Flujo de trabajo de la tecnología  Comparación con otros Sistemas NGS  Aplicaciones de las tecnologías de ultrasecuenciación.  Estudio de quasiespecies virales mediante análisis de amplicones.  Secuenciación de genomas “de novo”.  Metagenómica  RNAseq  Aplicaciones de los arrays de captura de secuencia:  Análisis de exomas  Estudio de mutaciones en leucemia mediante arrays de captura de secuencia.  Análisis de datos de ultrasecuenciación (UEB)
  • 38. Comparación con otros Sistemas NGS 2ª NGS 3ª NGS ABI Illumina ROCHE Illumina ABI Roche 3ª NGS Cuadro resumen de las posibles combinaciones de estrategias en las diferentes plataformas de NGS
  • 39. Comparación Plataformas NGS GS FLX 454 HiSeq 2000-Illumina ABI SOLID 5500xl   Chemistry based on  Chemistry based on Chemistry based on pirosequencing reversible terminators sequencing by ligation  Sample amplified by  Sample amplified by  Sample amplified by emulsion PCR solidphase amplification emulsion PCR  Read length 2x100 bp  Read length 50-100 bp  Read length 250-500 bp  3 billions reads per run  100-500 million reads per run  >1 million reads per run  600 Gb of sequence  50-100 Gb of sequence  400-600 Mb of sequence  2-11 days run  4-8 days run  ~10 hours run
  • 40. Comparación Plataformas secuenciación EQUIPO ROCHE GS FLX ILLUMINA HISEQ ABI 5500XL 454 2000 SOLID Coste del equipo 450.000 $ 690.000 $ 251.000 $ Coste de los reactivos 6.200 $ 23.470 $ 10.503 $ por run* Coste por Mb 12 $ 0,07 $ 0,04 $ Fuente: http://www.molecularecologist.com/next-gen-fieldguide/
  • 43. Comparación Plataformas secuenciación Next Generation Genomics: World Map of High-throughput Sequencers
  • 44. Ejemplos de Genomas humanos secuenciados Nature Reviews Genetics 11, 31-46 (January 2010)
  • 45. Comparación Plataformas secuenciación 1ª Generación 2ª Generación
  • 46. 3ª Generación Secuenciación SCIENCE Vol 323 2 JANUARY 2009 Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules John Eid,* Adrian Fehr,* Jeremy Gray,* Khai Luong,* John Lyle,* Geoff Otto,* Paul Peluso,* David Rank,* Primo Baybayan, Brad Bettman, Arkadiusz Bibillo, Keith Bjornson, Bidhan Chaudhuri, Frederick Christians, Ronald Cicero, Sonya Clark, Ravindra Dalal, Alex deWinter, John Dixon, Mathieu Foquet, Alfred Gaertner, Paul Hardenbol, Cheryl Heiner, Kevin Hester, David Holden, Gregory Kearns, Xiangxu Kong, Ronald Kuse, Yves Lacroix, Steven Lin, Paul Lundquist, Congcong Ma, Patrick Marks, Mark Maxham, Devon Murphy, Insil Park, Thang Pham, Michael Phillips, Joy Roy, Robert Sebra, Gene Shen, Jon Sorenson, Austin Tomaney, Kevin Travers, Mark Trulson, John Vieceli, Jeffrey Wegener, Dawn Wu, Alicia Yang, Denis Zaccarin, Peter Zhao, Frank Zhong, Jonas Korlach, Stephen Turner. Press Release Pacific Biosciences Announces Early Access Customers for Its Single Molecule Real Time System Eleven Leading Companies Support Launch of Third-generation DNA Sequencing MENLO PARK, Calif., Feb 23, 2010 Pacific Biosciences, a private company developing a disruptive technology platform for real- time detection of biological events at single molecule resolution, today announced the 10 institutions that have purchased its Single Molecule Real Time (SMRT(TM)) DNA sequencing system http://www.pacificbiosciences.com as part of the company's early access program in North America.
  • 47. Programa del curso  De Sanger hacia NGS  454 de Roche  Cómo funciona  Flujo de trabajo de la tecnología  Comparación con otros Sistemas NGS  Aplicaciones de las tecnologías de ultrasecuenciación.  Estudio de quasiespecies virales mediante análisis de amplicones.  Secuenciación de genomas “de novo”.  Metagenómica  RNAseq  Aplicaciones de los arrays de captura de secuencia:  Análisis de exomas  Estudio de mutaciones en leucemia mediante arrays de captura de secuencia.  Análisis de datos de ultrasecuenciación (UEB)
  • 48. PAUTAS PARA EL DISEÑO EXPERIMENTAL DE UN ESTUDIO DE ULTRASECUENCIACIÓN Pautes para el Diseño experimental de un estudio de ultrasecuenciación
  • 49. UCTS WORKFLOW Researcher Statistics and Bioinformatics UCTS (UEB) EXPERIMENTAL DESIGN QUALITY SAMPLES COLLECTION RESULTS CHECKING EXPERIMENTS SAMPLE PROCESSING DATA ANALYSIS SEQUENCING UEB UCTS Others
  • 50. Programa del curso  De Sanger hacia NGS  454 de Roche  Cómo funciona  Flujo de trabajo de la tecnología  Comparación con otros Sistemas NGS  Aplicaciones de las tecnologías de ultrasecuenciación.  Estudio de quasiespecies virales mediante análisis de amplicones.  Secuenciación de genomas “de novo”.  Metagenómica  RNAseq  Aplicaciones de los arrays de captura de secuencia:  Análisis de exomas  Estudio de mutaciones en leucemia mediante arrays de captura de secuencia.  Análisis de datos de ultrasecuenciación (UEB)
  • 51. Fin