1. Эпигенетическая регуляция процессов развития

3. Доимплантационное развитие человека День 2. Эмбрион в стадии дробления 4 бластомера День 3. Эмбрион на стадии дробления 8 клеток. День 4. Морула. День 5. Бластоциста День 1. Стадия зиготы

7. Эпигенетическое наследование В более общем смысле, предметом эпигенетики являются явления, связанные с развитием различных фенотипов клеток или организмов на основе одного генотипа. В более узком смысле эпигенетика - раздел генетики, который изучает наследуемые изменения активности генов во время развития организма или деления клеток. Эпигенетическое наследование - наследование паттерна экспрессии генов.

8. ДВА ВИДА ИНФОРМАЦИИ В ГЕНОМЕ Генетическая – закодированная в ДНК программа создания живого организма Эпигенетическая (Динамическая) – как, где и когда должна быть реализована генетическая информация. Каждый вид информации обеспечен своими системами: Кодирования Хранения Передачи

10. Эпигенетическая регуляция - наследственные и ненаследственные изменения в экспрессии конкретного гена без каких-либо соответствующих структурных изменений в его нуклеотидной последовательности. Эпигеном - это совокупность всех эпигенетических маркеров, обусловливающих экспрессию генов в данной клетке. Явления импринтинга, эффекта положения, особенности структурно-функциональной организации хроматина определенных хромосомных локусов, влияющих на эк с прессию генов, и РНК-интерференция классифицируются как эпигенетические.

12. Уровни эпигенетической регуляции 1. ДНК (геном) метилирование, повторяющиеся п оследовательности, мутации отдаленных регуляторных элементов , транспозиции генетического материала 2. РНК (транскриптом) регуляторные мотивы пре-мРНК, антисмысловые РНК, нетранслирующиеся РНК, м икро РНК, духцепочечные РНК 3. Белки (протеом) метилирование/деметилирование лизина 4, 9 и 27 гистона Н3, ацетилирование/деацетилирование гистонов

13. Метилирование ДНК Модификации гистонов

14. Метилирование ДНК и связанные с ним процессы

16. Схема метилирования и деметилирования цитозина

17. Репрессия транскрипции посредством метилирования ДНК

18. Взаимосвязь между метилированием цитозина в молекуле ДНК и ацетилированием гистонов

19. Механизмы инактивации гена в результате метилирования промоторной области 1. Метильные группы нарушают ДНК-белковые взаимодействия, выступая в большую бороздку ДНК и препятствуя связыванию специфических транскрипционных факторов. 2. Метилированные районы ДНК специфически связывают транскрипционные репрессоры. 3. Метилирование ДНК влияет на структуру хроматина .

20. Аналитические методы анализа метилирования 1. Метилчувствительная ПЦР ( NotI, EagI, SacII, HpaII, HhaI ) аналитическая ч увствительност ь - 1: 2 000 2. Метилспецифическая ПЦР Трансформация цитозина в урацил бисульфитом Na аналитическая ч увствительност ь - 1: 1 000 3. MethylLight – метилспецифическая ПЦР в реальном времени аналитическая ч увствительност ь - 1: 10 000 4 . Метилспецифическое секвенирование 5 . Биологические микрочипы

21. Метилирование ДНК в клетке контролирует все (!) генетические процессы, в том числе такие как : Транскрипция (клеточная дифференцировка) Репликация Рекомбинация Репарация Транспозиция генов Инактивация Х-хромосомы (половая дифференцировка)

25. Ферменты, осуществляющие метилирование ДНК – метилтрансферазы ( Dnmt) PCNA – домен взаимодействия с PCNA NLS – сигнал ядерной локализации RTF – домен, мишенью которого является центр репликации CXXC – цистеин-богатый домен BAH – домен, гомологичный бромодомену PWWP – домен, содержащий высококонсервативный мотив «пролин-триптофан-триптофан-пролин» ATRX – ATRX – подобный цистеинбогатый участок, содержащий C 2- C 2 цинковый палец и атипичный PHD -домен Allis C.D., Jenuwein T., 2007

29. Заболевания, связанные с нарушением процесса ремоделирования хроматина Ген Функция Фенотипические проявления Заболевания человека ДНК-метилтрансфераза 1 мыши ( Dnmt1) Поддержание статуса метилирования ДНК Гибель эмбриона мыши, потеря импринтинга, инактивация Х-хромосомы - ДНК-метилтрансфераза 1О мыши ( Dnmt1 о ) Ооцит-специфическое сохранение меток импринтинга на стадии 8-кл. зародыша Гибель эмбриона, потеря импринтинга - ДНК-метилтрансфераза 3А мыши ( Dnmt 3а ) Метилирование ДНК de novo Гибель на 4 недели жизни, нарушение сперматогенеза - ДНК-метилтрансфераза 3В мыши ( Dnmt 3В ) Метилирование ДНК de novo Эмбриолеталь, иммунодефицит, лицевые аномалии, деметилироапние и нестабильность прицентромерного гетерохроматина 1,9 и 16 хромосом Синдром ICF

30. Ген Функция Фенотипические проявления Заболевания человека Метил CpG- связывающий белок ( MECP2) Распознавание сайта метилирования ДНК Гибель зародышей мужского пола, умственная отсталость, аутизм, стереотипное движение рук Синдром Ретта Х-сцепленная хеликаза SNF2 семейства (ATRX) Часть белкового комплекса, участвующего в репрессии хроматина Тяжелая умственная отсталость у ммальчиков, микроцефалия, альфа-талассемия, лицевые, скелетныеи др. аномалии развития Синдром ά -талассемии/Х-сцепленной умственной отсталости Белок 1, подсемейство А-подобных, SWI/SNF- связанный актин-зависимый регулятор хроматина Часть белкового комплекса, участвующего в ремоделированиихроматина Спондилоэпифизарная дисплазия, Т-клеточный иммунодефицит, дисфункция почек Костноиммунная дисплазия, тип Шимке Рибосомная S6 киназа (RSK2) Фосфорилирование гистоновых белков Умственная отсталость, макроцефалия, отставание в росте, лицевые и скелетные аномалии Синдром Коффина-Лаури

31. Геномный импринтинг - эпигенетический механизм регуляции экспрессии гомологичных генов в процессе развития организма в зависимости от родительского происхождения гена, хромосомы или генома. Эпигенотип (импринт) - совокупность модификаций, которые по-разному маркируют родительские аллели и обеспечивают моноаллельный характер экспрессии импринтированных генов на хромосомах отцовского или материнского происхождения. Импринтированный ген - ген, который дифференциально экспрессируется в зависимости от материнского или отцовского происхождения. Импринтированные гены в диплоидной клетке млекопитающих обычно экспрессируются только с одного аллеля.

33. Геномный импринтинг (ГИ) – дифференциальная модификация отцовского и материнского генетического материала в процессе созревания гамет, следствием чего являются различия в экспрессии родительских аллелей как в процессе раннего эмбриогенеза, так и взрослых особей

34. Частичный пузырный занос Андрогенез (мужской партеногенез) - диплоидный, хромосомы только отцовского происхождения Гиногенез (женский партеногенез) диплоидный, хромосомы женского происхождения 10 н.б.

35. Характерные черты импринтированных генов 1. Кластеризация. Общие черты кластеров: 1) гены распределены на достаточно большом расстоянии; 2) наличие в кластере генов, экспрессирующихся только с отцовской или материнской хромосомы; 3) наличие генов, которые продуцируют не кодирующую РНК. 2. Консервативность импринтинга. Характер импринтинга генов H19, IGF2, p57KIP и SNRPN идентичен у человека и мыши. 3. Асинхронность репликации ДНК импринтированных генов. Импринтированные гены имеют асинхронную репликацию, показанную в кластерах импринтированных генов с использованием гибридизации in situ. Но временной характер репликации может варьировать в различных клетках, подобно мозаичному эффекту положения.

36. 4. Онтогенетическая и тканевая регуляция импринтинга. KvLQT1 экспрессируется с материнского аллеля во всех тканях кроме сердца; E6-AP - экспрессируется биаллельно во всех тканях, а в мозге - только с материнского аллеля; IGF2 имеет отцовскую экспрессию в большинстве тканей, но оба аллеля экспрессируются в определенных структурах в течение развития мозга и в зрелом состоянии. Кроме того, IGF2 в процессе развития экспрессируется с трех различных промоторов. 5. Импринтированные гены кодируют как белки, так и только РНК. H19 кодирует РНК, аккумулирующуюся в больших количествах в течение развития фетальных тканей мезодермального и эндодермального происхождения. XIST. Транскрипция гена с инактивированной отцовской Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях заставляет предполагать регуляторную роль импринтированной РНК. IPW, PAR-SN, PAR1 и PAR5 экспрессируются с отцовской хромосомы и дают только РНК.

37. Целый ряд заболеваний по характеру наследования и проявлениям может возникать вследствие импринтинга. Синдром Вильямса с тяжелыми проявлениями - делеция 7q11.23 материнской хромосомы ; Болезнь Гиршпрунга - мутация гена RET (10q11.2) материнского происхождения ; НФ 2 с тяжелым течением - мутация гене SCH (22q12) материнского происхождения ; Шизофрения в более тяжелых формах наследуется по отцовской линии ; Синдром де Ланге (3q26) может быть связан с материнским импринтингом ; Семейная гипертрофическая кардиомиопатия в основном передается по материнской линии ; Spina bifida в два раза чаще передается матерями, чем отцами ; Псориаз проявляется в более тяжелой форме, если наследуется от отца ; Синдром Туретта и поликистоз почек проявляются раньше и в более тяжелых формах, если наследуются от матери ; Эпилепсия в более тяжелой форме наследуется от матери.

39. Нерасхождение хромосом в мейозе

40. Механизмы формирования ОРД

42. ОРД по целым хромосомам или их фрагментам выявлены при анализе наследственной патологии и у человека . материнская ОРД по хромосоме 2 => признаки дисэмбриогенеза и отставание в развитии; отцовская ОРД по длинному плечу хромосомы 6(q23 - q24) => неонатальный диабет; материнская ОРД по короткому плечу хромосомы 7 ( GRB10) => синдром Сильвера – Рассела; материнская ОРД по хромосоме 14 => гипотония, черепно-лицевые аномалии, акромикрия, сколиоз, задержка физического, моторного и умственного развития; отцовская ОРД по хромосоме 14 => сильн ая умственн ая отсталость и скелетно- мышечные аномалии; материнская ОРД по хромосоме 16 => малый вес при рождении и врожденные аномалии; отцовская ОРД по длинному плечу хромосомы 20 ( GNAS1) => псевдогипопаратироидизм Залетаев Д.В.

43. ВОЗМОЖНЫЕ ВАРИАНТЫ ОДНОРОДИТЕЛЬСКОЙ ДИСОМИИ У ЧЕЛОВЕКА

45. Схема локуса 15 q11-q13

48. Кордоцентез Получение образцов крови от родителей для цитогенетического и ДНК-анализа УЗИ 2 уровня Нормальный кариотип и фенотип у плода Анеуплоидия Тестирование на ОРД ОРД исключена. Плацентарный мозаицизм ОРД у плода Пролонгирование беременности УЗИ с допплерометрией Профилактика ФПН и акушерских осложнений ОРД по хромосомам, для которых установлены “ болезни импринтинга ” Прерывание беременности ОРД по хромосомам, для которых исключены “ болезни импринтинга ” Биопсия хориона или плаценты Аутосомная трисомия (полная или мозаичная форма)

51. Одноклеточный эмбрион бластоциста мышь человек Мужской и женский пронуклеусы не отличаются по размеру. Исследовали 59 зигот. Только в половине (30) наблюдалось деметилировние одного пронуклеуса и интенсивное метилирование другого. В остальных зиготах – одинаковая интенсивность сигнала 2005

52. Алгоритм исследования 1 2 Приготовление препаратов и их QFH окрашивание Получение видео-изображения, идентификация хромосом Получение видеоизображения тех же метафазных пластинок 4 Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов с помощью АТ-5-МеС 3

53. 1-клеточная стадия развития эмбриона человека QFH 5-MeC репликация 6 часов сперматозоиды 5-MeC QFH Метафазная пластинка яйцеклетки метилированная хроматида недометилированная хроматида гипометилированная хроматида

54. 5-MeC QFH 1-клеточная стадия развития эмбриона человека Метафазные пластинки из трех пронуклеусов перед первым митотическим делением

55. Совмещенная кариограмма метафазных хромосом из лимфоцита взрослого индивида (столбец слева) и триплоидного одноклеточного эмбриона человека (столбец справа), цифрами обозначены номера хромосом Метафазные хромосомы из лимфоцита и 1-клеточного эмбриона QFH 5-MeC

56. 2-клеточная стадия развития эмбриона человека Совмещенные кариограммы метафазных хромосом из бластомеров двух 2-клеточных эмбрионов человека QFH 5-MeC

57. Пассивное деметилирование Пассивное деметилирование- зависимое от репликации Механизмы деметилирования зигота Два бластомера расхождение хроматид репликация в отсутствие метилазной активности активное деметилирование репликация в отсутствие метилазной активности пассивное деметилирование репликация в отсутствие метилазной активности расхождение хроматид репликация в отсутствие метилазной активности метилированная хроматида недометилированная хроматида гипометилированная хроматида

58. 5-6 клеточная стадия развития эмбриона человека Совмещенные кариограммы метафазных хромосом из двух бластомеров 5-клеточного эмбриона человека, цифрами обозначены номера хромосом 5-MeC QFH

59. Возможные варианты расхождения хроматид репликация Бластомер 2-клеточного эмбриона Схема митотической сегрегации хромосом с различным статусом метилирования хроматид и и и и и и и и 1) 2) 3) 4) метилированная хроматида недометилированная хроматида гипометилированная хроматида

60. 6 клеток 7 клеток 8 клеток Совмещенные кариограммы метафазных хромосом из бластомеров 6, 7 и 8 клеточных эмбрионов человека

61. 8 кл. М-сегментация Сопоставление сегментной локализации 5-метилцитозинобогащенной ДНК (хромосома слева) и G -исчерченности (хромосома справа). Различные оттенки зеленого, белый и красный отражают интенсивность флуоресценции, оцененную в баллах. Совмещенная кариограмма метафазных хромосом из бластомера 8-клеточного эмбриона человека QFH 5-MeC

62. Статус метилирования приценторомерного гетерохроматина хромосом 1,9,16 из бластомеров эмбрионов человека

63. QFH -сегментация и распределение 5- M е C на метафазных хромосомах из ФГА-стимулированных лимфоцитов Совмещенная кариограмма Гомологичные хромосомы ( QFH ) Гомологичные хромосомы (A Т - 5МеС )

64. Посттрансляционные модификации гистонов

73. Структура нуклеосомы 2 х Н3 2 х Н4 2 х Н2А 2 х Н2В

74. Механизм эффекта модификаций гистонов описан тремя моделями:

76. НАТ – белки, которые могут ацетилировать лизиновые остатки всех четырех коровых гистонов, но различные ферменты обладают отличающейся специфичностью к выбору субстрата, хотя каждый белок редко имеет специфичность только к одному сайту. Первое основное семейство НАТ – GNAT ( Gcn 5 related acetyltransferase ) – основным субстратом которых является гистон Н3. Второе основное семейство НАТ – MYST – в качестве основного субстрата-Н4. Третье семейство – CBP / p 300 – ацетилируют Н3 и Н4 и являются самыми неспецифическими. HDAC , удаляющих ацетильные группы, большое количество. Они входят в три каталитических группы: Type I , Type II и Type III (или Sir 2-родственные белки – требуют наличие кофактора NAD)

78. Фосфорилирование гистонов Увеличение экспрессии генов коррелирует с фосфорилированием остатка серина в 10м положении гистона Н3 (Н3 S 10). Обнаружены много киназ, для которых этот сайт является мишенью, включая Msk 1/2 дрозофилы и его гомолог Rsk 2 у млекопитающих, и SNF 1 у S . cerevisiae . фосфорилирование определенных остатков связано с конденсацией хромосом в течение как митоза, так и мейоза

80. Метилирование лизинов Осуществляют лизиновые метилтрансферазы - НКМТ SET -домен Кофактор - S -аденозил- L -метионин 6 наиболее хорошо описанных сайтов метилирования: на гистоне Н3 ( К4 , К9, К27, К36 , К79 ) на гистоне Н4 (К20) Деметлирование лизинов LSD 1 удаляет метильные группы с Н3К4 JHDM1 – H3K36me1 и me2, JHDM2A – H3K9m1 и me2, JHDM 3 A – H 3 K 36 me 3, JMJD 2 A – H 3 K 9 me 3.

81. Метилирование Н3К79. Связано с кодирующими регионами активных генов Фермент, который метилирует Н3К79 – hDOTIL Необходимо для элонгации транскрипции Белок Set 2 – метилтрансфераза, способная метилировать Н3К36. Подавляет внутреннюю инициацию. Репрессор индуцибельных генов Метилирование Н3К36. Связано с эухроматином и активными или потенциально активными генами. Осуществляет метилтрансфераза Set 1. РНК полимераза II , PAF -комлекс необходимы для установления Н3К4. Метилирование Н3К4.

84. Метилирование аргинина вовлечено как в активацию - PRMT1 – H4R3 , PRMT4/CARM1 – H3R2, H3R17, H3R26 , - так и в репрессию транскрипции - PRMT 5 - H 3 R 8 и H 4 R 3 Метилирование аргининов Деиминирование аргининов PAD 14 превращает аргинин в цитруллин

86. Группа 1 – небольшие химические модификации, группа 2 – большие химические модификации. Роль в транскрипции Сайты модифицирования Группа 1 ацетилирование активация Н3 (К9, К14, К18, К56) Н4 (К5, К8, К12, К16) Н2А (?) Н2В (К6, К7, К16, К17) фосфорилирование активация Н3 ( S10) метилирование активация Н3 (К4, К36, К79) репрессия Н3 (К9, К27) Н4 (К20) Группа 2 убиквитинирование активация Н2В (К123) репрессия Н2А (К119) сумоилирование репрессия Н3 (?) Н4 (К5, К8, К12, К 16) Н2А (К126) Н2В (К6, К7, К16, К17)

88. Компенсация дозы генов

90. 2. Инактивация Х хромосомы включает в себя различные уровни эпигенетической регуляции. Высокий уровень Н3К27 me 3 требуется Х i в раннем развитии, но не в соматических клетках; CpG -метилирование необходимо только на поздних стадиях 3. Некоторые гены избегают инактивации Х хромосомы. 4. Х-инактивация контролируется центром инактивации Xic . центр инактивации – Xic некодирующая РНК Xist ( X inactive specific transcript ) некодирующая РНК Tsix

92. Ключевой регион, регулирующий инактивацию Х хромосомы обозначен зеленым. Фланкирующие гены – серым. Xite и DXPas34 –регуляторы экспрессии Tsix .