5. Paso 1: Formación de Citrato La formación de Acetil CoA a Citrato es catalizada por la enzima Citrato sintasa. Se trata de una unión de cuatro carbonos (oxalacetato) con una unidad de dos carbonos (el grupo acetil del acetil CoA).
6. Paso 2: Formación de Cis-aconitato a isocitrato Se lleva a cabo la isomerización del citrato, la cual es catalizada por la enzima Aconitasa, esta enzima genera el compuesto alcohólico secundario isocitrato, que puede oxidarse.
7. Paso 3: Formación de Oxalosuccinato a alfa-cetoglutarato En esta reacción el isocitrato experimenta una deshidrogenación formando oxalosuccinato, un intermediario inestable unido a la enzima, el cual, espontáneamente es descarboxilado antes de liberar el producto. La reacción es catalizada por la enzima Isocitrato deshidrogenasa.
8. Paso 4: Formación de Succinil-CoA Esta conversión se lleva a cabo mediante el complejo de la alfa-cetoglutarato deshidrogenasa. El equilibrio de la reacción esta desplazado hacia la formación de Succinil-CoA, de forma que es prácticamente irreversible.
9. Paso 5: Formación de Succinato El SuccinilCoA se hidroliza mediante la acción de la enzima SuccinilCoAsintetasa, liberando la coenzima A y el residuo de cuatro átomos de carbono que se convierte en la molécula de ácido succinico o "succinato".
10. Paso 6: Formación de Fumarato En esta reacción participa la enzima Succinato deshidrogenasa, una oxidoreductasa que utiliza FAD como coenzima. El FAD es de mayor poder oxidante que el NAD+, y es utilizado en esta clase de proceso oxidativo, donde es necesario producir una insaturación en una cadena hidrocarbonada. Es posible producir la insaturación entre los carbonos a y b, debido a que los grupos carboxilo contiguos a éstos, debilitan los enlaces C-H.
11. Paso 7: Formación de Malato Esta etapa es catalizada por la enzima Fumarasa, una hidratasa. El agua se adiciona a la insaturación de fumarato, formando un a-hidroxiácido: el ácido málico (o malato).
12. Paso 8: Formación de Oxalacetato Esta etapa es catalizada por la enzima Malato deshidrogenasa, una oxidorreductasa que utiliza NAD+ como coenzima. El NAD+ oxida el grupo alcohol del a-hidroxiácido a grupo carbonilo para producir nuevamente el alfa-cetoácido que sirve de sustrato para el primer paso: el oxalacetato, completando de esta manera el ciclo.